CN102920737B - 用于解酒的蜂花粉水提取物***片 - Google Patents

Abstract

用于解酒的蜂花粉水提取物***片，涉及从蜂花粉水提取物制备***片的工艺技术领域。主要由以蜂花粉水提取方法取得的分子量小于5000D的蜂花粉水提取物的冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆、硬脂酸镁和薄荷脑组成。本发明对于解酒效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。

Description

用于解酒的蜂花粉水提取物***片

技术领域

本发明涉及从植物，特别是从蜂花粉水提取物制备***片的工艺技术领域。

背景技术

我国是世界上酿酒最早的国家，酒文化渗透于社会许多文化中，早已成为日常生活必不可少的一部分。随着人民物质、文化和生活水平的提高，过量饮酒已成为世界性的社会公共卫生问题，由此而发生的酒精性肝炎的发生率亦不断增长，在我国已成为继病毒性肝炎后的第二大肝病；由于文化、历史或个人嗜好等原因，完全消除不良饮酒习惯尚需要整个社会的长期努力。

酒性热而气壮，饮酒过度，酒毒蓄积，肝脾胃诸多脏器受损而致气阴两伤。中医治疗当以清解酒毒、清热化痰、益气养阴为主；美国FDA批准了3个用于酒精中毒治疗的药物，即纳曲酮、阿坎酸和托毗酯。动物试验和临床研究中发现，如乌苯美司、尼莫地平、依米丁等也具有一定程度改善酒精中毒的作用。蜂花粉水提取物具有很多调节生理代谢作用的活性成分，具有清热解毒，预防脂肪肝，抑制肝细胞恶化，降低肝癌发病率等作用。通过对蜂花粉解酒分子作用机理的研究，为研发新的解酒类药物具有深远价值。

目前的植物解酒制剂大致包括以五加科植物为代表的乙醇吸收抑制剂，以葛根、葛花为代表的肝脏代谢促进剂，后者因其兼具保肝作用而更受重视；另外，枳棋子能够通过激活与酒精代谢相关的酶类，来加速机体乙醇和乙醛的分解，也能对各种化学性肝损伤起到一定的预防和治疗效果，是一类醒酒保肝的良药。

酒精性肝病发病率呈逐年递增趋势，由饮酒造成的肝脏疾病日益严重，因此找到高效、安全的解决方法刻不容缓，通过研究解酒护肝主要通过以下几种途径可以达到：

1、通过提高乙醇脱氢酶（ADH）、醛脱氢酶（ALDH）活性达到解酒护肝作用

 目前关于解酒药物的研究多集中于提高ADH活性方面，包括胃ADH的首过代谢(FPM)及肝脏ADH的氧化代谢。胃粘膜是酒精代谢的第一道屏障，胃粘膜受损，可导致进入血液中毒素增加，加重乙醇在人体内的生物利用度，所以提高胃中ADH活性，加强乙醇在胃中的首过代谢，可减轻对肝脏的负荷。在单次少量饮酒的情况下，先吃药再饮酒，可提高肝中ADH活性，迅速降解乙醇，有效阻止乙醇的吸收，降低血醇浓度，以达到解酒的目的。葛根、葛花、枳棋子是中国传统医学最具代表性的解酒类药物。经研究发现，它们发挥解酒作用的有效成分是黄酮类物质，在枳黄方对酒精性肝损伤大鼠胃ADHmRNA的影响实验中，枳黄方被证实可以提高酒精在胃的首过代谢从而减轻酒精对肝脏造成的负荷。枳黄方和清肝活血方均可提高肝组织ADH的活性及mRNA的表达。长期大量饮酒的情况下，导致肝中ADH活性下降，乙醇则主要通过CYP2E1代谢，但此途径会产生大量的乙醛和活性氧，活性氧使氧化还原状态失衡，产生氧化应激反应诱发肝脏组织损伤。因此，对于长期酗酒者而言，提高其ADH活性可减缓由CYP2E1代谢产生的氧化应激，也可起到保护肝脏的作用。如上述所述的枳黄方和清肝活血方可以起到解酒作用，同时也能起到护肝作用。另外，乙醛是酒精性肝损伤的主要因素之一，其代谢缓慢且毒性大。研究发现枳棋子水提液干预后的急性酒精中毒大鼠肝组织ADH、ALDH活性比模型组均显著增高，表明枳棋子水提液能够有效增强急性酒精中毒大鼠肝组织ADH、ALDH活性，从而加速乙醇在肝脏内的氧化分解代谢，降低其毒性代谢产物对肝脏的毒性作用，达到一定的护肝效果。然而，仅提高ADH、ALDH活性并不能减缓乙醇在体内代谢的毒性作用，还应对乙醇代谢全过程相关的关键酶，如CYP2E1、CAT进行***研究，保证乙醇、乙醛的彻底代谢及体内氧化还原状态的平衡。

2、通过减缓氧化应激作用达到解酒护肝作用

 如上所述，乙醇在肝脏中代谢的3个途径均会产生自由基与活性氧，引发氧化应激反应，诱发肝脏组织发生以脂肪变为主要特征的损伤。与氧化应激相关的因子有：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）。MDA的含量体现脂质过氧化水平，SOD及GSH-PX的活性体现清除活性氧的能力，它们是解酒护肝研究中的常用指标。肝脏中存在着抗氧化***与促氧化***的平衡，摄入酒精后此平衡就会被打破，SOD及GSH-PX的活性降低。因此保护体内抗氧化***的活性、清除体内自由基对防治由氧化应激所致的肝损伤具有重要意义。目前有关膳食与药物对乙醇代谢影响和抗ALD的研究表明：红茶中的抗氧化成分可抑制乙醇代谢过程中导致的机体内酶***及非酶***的抗氧化活性降低，有助于机体维持正常的氧化还原状态。发酵大麦提取物中的酚类物质可清除由乙醇脱氢酶***及CYP2E1***产生的自由基及活性氧，减缓氧化应激反应导致的肝损伤，百里香和生姜的水提取物可有效降低肝脏中促氧化物质的含量并提高抗氧化物质的水平。

3、通过抑制NF-κB活化和下调COX-2表达减轻脂质过氧化和炎症反应

 最新研究表明，氧化应激使NF-κB、COX-2活化，NF-κB是一种调控炎症和免疫反应、细胞凋亡以及感染与应激反应的一种转录因子，COX-2是经刺激迅速产生的诱导酶，是炎症反应的中心环节。COX-2及其合成产物可以通过干扰脂肪、糖类及蛋白质的代谢，加重肝脏的氧应激和促进多种细胞因子的释放，从而参与肝脏的脂肪变性、肝脏炎症、纤维化等病理变化。对此两因子探索，已成为研究乙醇代谢造成肝损伤的新着眼点。茶多酚、枳黄方均可通过抑制大鼠体内NF-κB的活化和下调COX-2表达的作用机制，减轻脂质过氧化和炎症反应，实现保护肝组织的目标。

4、通过降低内毒素水平及CD-14表达

 血浆中内毒素水平升高也是引起ALD的重要因素，但现代的解酒护肝制品中，研究关于制品如何影响内毒素水平的甚少，双环醇作为中国自主研制的新型抗肝炎药物，已用于治疗慢性病毒肝炎。最新研究表明，双环醇可降低血浆内毒素水平及下调CD-14表达，具有保护酒精性肝损伤的作用，防治ALD的形成。因此，可通过降低内毒素水平及CD-14表达，从抑制Kupffer细胞活化角度实现保护肝脏组织的作用。

 综上所述，ALD的发病机制与多种因素有关，主要包括：乙醇代谢过程中的关键酶，如ADH、ALDH、CYP2E1、CAT；氧化应激影响因子，如MDA、SOD、GSH-PX；信号传导关键核因子，如NF-κB、COX-2；内毒素水平及其受体CD-14表达等。

 因此，关于解酒护肝作用机制的研究也应围绕这些关键因素展开。同时，中国解酒护肝药品、保健品中多以中草药为主，有关膳食成分的开发很少，因此根据中医学“药食同源”的理念，从膳食中寻找到高效无毒害的解酒护肝成分具有创新意义，也为多靶点协同抗ALD的营养干预和药物开发提供了理论依据，而经过我们研究发现蜂花粉能够有效缓解酒精对肝脏的损伤作用，解酒效果明显，其解酒分子机制与其较强的调节多种具有解酒作用的基因有关，有望开发为一种减轻酒精化学性肝损伤的保健食品。

蜂花粉是由蜜蜂采集蜜粉源植物的雄蕊，经加工而携带回巢的团状物，其营养成分十分丰富，不仅含有丰富的蛋白质、糖类、脂类、维生素、有机酸、矿物质、核酸，还含有酶和其他生物活性物质。蜂花粉常用于保健食品和营养食品，对其化学成分进行研究，进而开发更多品种的蜂花粉产品，充分利用蜂花粉资源，是当今的一个发展方向。蜂花粉是植物的精华，被誉为“最完全的营养品”、“浓缩的营养库”， 被认为是21世纪最有前景的食物资源。

我国的蜂花粉资源极为丰富，产量大，种类多，但蜂花粉产品却较少，申报的保健品只有2 0多种，如何开发新型功能性食品，是很值得研究与探讨。然而，研究并掌握蜂花粉的蛋白质、灰分、水分和维生素c含量等关键理化指标的变化规律，仍是现在研究的热点；随着人们对花粉营养品需求量的增加，我国花粉的基础研究和应用研究将不断深入，必将会给人类创造更多的价值。近年，花粉在药品、食品、保健食品、化妆品领域都有一些进展；比如，花粉治疗***炎、肿瘤、肝炎、心血管疾病，以及花粉多糖硫酸酯化、花粉代谢、花粉药物载体、花粉重组蛋白、花粉发酵食品、花粉防腐剂、超临界CO2萃取的花粉油等研究，我国蜂花粉的开发具有广阔市场。  

蜂花粉是中国医学宝库中的药食兼用花粉品种，作为中国传统药材，其药食兼用的历史已逾数千年，从2400年前的《神农本草经》、《本草纲目》到今天的《中华人民共和国药典》中均有记载，在民间更是以其神奇的功效被奉为“仙药”。经过我们最新的研究发现在花粉中还存在一类具有促进酒精代谢的物质，对促进机体解酒方面具有显著作用。目前我国随着经济的腾飞，各种各样的应酬越来越多，由于饮酒诱发的多种疾病的发病率逐年提高，酗酒诱发的身体健康问题已经成为影响现代人生活质量的重要方面。

现代研究证明，花粉多糖能够提高机体T淋巴细胞和巨噬细胞的数量和功能，提高血清免疫蛋白G水平，增强机体免疫功能，从而起到抑瘤和抗癌作用，并且能够有效阻止放疗、化疗损伤，保护机体。蜂花粉中黄酮类物质、多酚类化合物、类胡萝卜素等多种抗氧化因子，能够互相协同发挥抗氧化作用；蜂花粉以其高效的抗氧化活性，在防治人类患有与自由基损伤相关的疾病以及在抗衰老方面起着重要的作用；因此，蜂花粉是一种相当理想具有抗氧化作用的功能性食品。蜂花粉营养全面，成分极其复杂，含有生命所需的全部营养物质和多种生物活性物质，有调节免疫功能、促生长、抗疲劳、防衰老、软化血管、降血脂、促造血、美容和瘦身等多种生物学功能，对细胞免疫、体液免疫均有明显的增强作用，但利用蜂花粉解酒方面研究仍然是空白。

经过研究发现人们在大量饮酒的同时也摄取了大量的食物，特别是高油高脂性食物使人胃呈高饱腹状态，其胃容物的排空一般需要2小时左右，如果同时服用解酒药物，由于服用量与胃容物相比相差太悬殊，很难发挥作用而失效，但如果采用大剂量的解酒药物，又会受到胃容量的限制而无法实施，所以饭后使用的解酒药物最好采用不经过胃的方式。

***片，是一类不经过胃消化，直接通过口腔粘膜吸收进入血液，采用在口腔中可溶解的物质为主要包衣材料进行包衣而制成的片剂。可防止酸性及酶对某些药物的破坏或防止药物对胃的强烈刺激性。

经过本发明人的多年研究发现这类物质存在蜂花粉中呈水溶性状态，因而分离提取特别困难，最近我们成功分离出来，并做了蜂花粉解酒相关分子机理的研究工作，找到其发挥作用的关键基因，其解酒效果非常理想，为此，提出该发明专利申请。

发明内容

本发明目的在于发明一种能高效解酒的蜂花粉水提取物***片。

本发明包括以蜂花粉水提取方法取得的分子量小于5000D的蜂花粉水提取物的冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆、硬脂酸镁和薄荷脑组成。

所述冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆、硬脂酸镁和薄荷脑酒精溶液分别占***片总质量的50～85%、5～20%、5～25％、0.2～0.4%、0.1～0.4%。

蜂花粉是由蜜蜂采集蜜粉源植物的雄蕊，经加工而携带回巢的团状物，其营养成分十分丰富，不仅含有丰富的蛋白质、糖类、脂类、维生素、有机酸、矿物质、核酸，还含有酶和其他生物活性物质。蜂花粉水提液能够在基因水平上发挥解酒的药理作用，本发明人的研究已经基本解决了其解酒的分子机理，为此，提出申请本发明专利。

经试验，本发明采用蜂花粉水提取物冻干粉作为解酒原料，冻干粉中总蛋白含量0.25-2%，含水量低于8%，无副作用，而且费用低廉，简单易行。本发明产品优点是蜂花粉中用于解酒的水提取物可以通过舌下粘膜直接吸收、并迅速进入血液，避免胃酸对其的破坏，治疗效果更理想。

经过研究发现蜂花粉中有许多生物活性物质在胃中易被胃酸破坏，而通过舌下粘膜可以直接吸收，所以制作***片可以更好地保护生物活性物质免遭破坏，提高产品的使用效果。

附图说明

图1为自然健康对照组肝脏组织切片图。

图2为自然健康对照组肾脏组织切片图。

图3为灌胃白酒模型组肝脏组织切片图。

图4为灌胃白酒模型组肾脏组织切片图。

图5为灌胃***片组肝脏组织切片图。

图6为灌胃***片组肾脏组织切片图。

具体实施方式

本发明所谓蜂花粉是指如茶花粉、油菜花粉、荷花粉等等经过蜜蜂采收的花粉。

一、制备蜂花粉解酒水提取物冻干粉：

1、蜂花粉除杂、干燥，使含水量下降到4～8%。

2、采用气流粉碎破壁的方式将蜂花粉破壁。

3、以常压常纯净水浸泡已经破壁的蜂花粉，同时以低频超声波处理10～40分钟，控制超声提取液的温度在10～40℃。

4、以8000～15000转冷冻离心法除去固体杂质，取上清液。

5、将所述上清液在1～5℃的环境温度下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量为5000D以下的蜂花粉水溶性物质。

6、将上述蜂花粉水提物冷冻干燥24～48小时制备含水量低于8%的蜂花粉水提物的冻干粉。

二、制备蜂花粉解酒***片：

1、制粒工艺：

将山梨糖醇配成10～30%的溶液备用。

将沸腾锅预热到40～60℃后，先将冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆加入沸腾锅内，按照下表参数设置，打开蠕动泵喷山梨糖醇溶液进行制粒。制粒结束后加入硬脂酸镁和薄荷脑酒精溶液混合均匀，低温干燥备用。

典型的几种质量配比表：（单位：kg）

	冻干粉	山梨糖醇	淀粉浆	硬脂酸镁	薄荷脑酒精溶液
						配比1	85	8	6.4	0.3	0.3
配比2	80	6	13.5	0.3	0.2
						配比3	70	9	20.6	0.2	0.2

生产工艺参数：

参数	进风温度	出风温度	引风频率	蠕动泵	雾化压力
						喷浆时	60-80℃	40-60℃	40Hz	200rpm	0.2MPa
喷浆后	65-80℃	50-60℃	35Hz	200rpm	0.2MPa

（2）压片工艺：采用ZP1100压片机（29冲）进行压片实验，工艺参数：转速30～40转/分；工作压力7～15kN；片重0.4～0.6g。

三、应用：

（一）试验对象：

灌胃22周龄的Wistar清洁级雄性大鼠，体重344.43±38.49；自然对照组大鼠每天按体重1%灌胃纯净水；模型组大鼠每天按体重1%灌胃二锅头制模型；灌胃***片实验组大鼠每天按体重1%灌胃二锅头后8小时灌胃***片。

（二）实验组采用空腹灌胃本发明含片的方式进行实验，使用剂量：

灌胃制剂：按大鼠口服***片40～80mg/天，连接服用30～60天。

（三）对比结果：

1、试验组大鼠肝脏和肾脏组织切片结果比较：

（1）将自然对照组肝脏和肾脏组织切片，见图1、2。

从图1、2可见雄性大白鼠肝脏肝细胞结构清晰呈多边形，肝血窦明显，肝细胞索排列整齐，肝细胞中没有明显的脂肪空泡；肾脏组切片中肾小球结构清楚，肾小球囊间隙明显适中，没有明显损伤。

（2）将灌胃白酒模型组肝脏和肾脏组织切片，见图3、4。

从图3、4可见肝细胞边界不清，变圆内有空泡，肝血窦受压变窄，肝索排列紊乱；肾小球结构不清楚，损伤严重，肾小球囊变形。

（3）灌胃蜂花粉水提液***片肝脏和肾脏组织切片，见图5、6。

从图5、6可见肝脏肝小叶结构清晰, 肝血窦分布均匀，肝细胞呈多边形,排列整齐；肾脏肾小球结构明显改善，肾小球囊间隙明显，存在明显肾小球修复过的痕迹。

2、空腹灌胃本发明含片干预后对试验组大鼠主要血液生化指标比较分析。

采用麻醉腹主动脉采血，取血清后由东芝全自动血液生化检测仪检测主要血液生化指标。

比较分析如下表：

组别	自然组	模型组	***片组
				ALT	73.00±16.67	91.25±29.33	64.29±15.39
ALP	102.50±11.90	146.75±21.70	90.43±6.83
				LDH	962.75±96.05	909.75±326.58	1523.86±430.29
CHO	1.23±0.08	1.52±0.26	1.27±0.16
				TG	1.25±0.18	1.84±0.37	1.11±0.25
BUN	5.89±0.65	4.78±0.71	5.11±0.54
				ALB	15.50±0.43	14.88±0.53	16.09±0.54

经SPSS统计，模型组谷丙转氨酶（ALT）与灌胃蜂花粉***片组差异极显著；转氨酶广泛存在组织细胞内，尤以肝、心肌、脑、肾等组织中活性最强，正常时血浆含量很低，ALT主要存在于肝脏，当肝组织病损时ALT大量释放入血可引起血中转氨酶升高。本实验灌胃***片组血清转氨酶活力很低，说明***片对肝脏的修复作用效果很强。

健康人血清ALP主要来自肝脏和骨骼，肝脏中的ALP与物质的转运和***有关。而2型糖尿病患者由于胰岛素分泌障碍或胰岛素抵抗，造成糖代谢障碍，同时也导致脂类代谢的障碍及在肝内沉积，甚至形成脂肪肝，而使肝脏受损引起血清ALP水平的升高。经SPSS统计，模型组碱性磷酸酶与其它二实验组差异极显著；说明蜂花粉***片能够改善肝细胞损伤，降低碱性磷酸酶水平，碱性磷酸酶（ALP）的上升与肝细胞的损伤密切相关，说明本实验模型组大鼠酗酒对肝细胞伤害很严重，而灌胃***片后能够改善长期酗酒引起的不良反应，减轻肝脏损伤。

经SPSS统计，自然对照组和模型组乳酸脱氢酶（LDH）与灌胃本发明***片组差异极显著；乳酸脱氢酶是糖酵解的关键酶，灌胃蜂花粉水提液***片后乳酸脱氢酶水平很高，说明与促进糖酵解密切相关，也就是说在本实验条件下本发明***片具有较强的促糖酵解作用，利于肝脏解酒及糖代谢。

2型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍为主要特征的一类疾病，其中胰岛β细胞的丢失和功能障碍在疾病的发生和发展中起决定性作用。近年来的研究表明，胆固醇代谢与胰岛β细胞功能密切相关。正常情况下，胰岛β细胞可以通过其表面表达的一系列受体和转运分子来控制细胞内胆固醇的摄入和流出，使得细胞内胆固醇的含量维持在一个动态平衡。胰岛β细胞内胆固醇代谢出现紊乱后，可以通过多种途径影响β细胞的糖代谢，最终诱导β细胞凋亡。因此，胆固醇代谢紊乱可能是导致2型糖尿病患者β细胞功能障碍的一个新机制。经SPSS统计，模型组胆固醇（CHO）与其它二个实验组差异显著，说明酗酒是导致高胆固醇血症的罪魁祸首，而灌胃本发明***片具有显著改善作用，显著下调由于酗酒引起的胆固醇水平升高，对预防由于长期酗酒诱发2型糖尿病的发生有重要意义。

近年来高甘油三酯（HTG）所致的脂毒性已引起广泛关注，其可引起并加重胰岛素抵抗（IR），使胰岛素的生物学效应降低。肝脏通过参与糖原合成、糖原分解和糖异生在维持血糖稳定中起着直接而重要的作用，特别是葡萄糖-6-磷酸酶在肝糖生成中起关键作用，肝脏胰岛素抵抗还表现为脂代谢异常，如甘油三酯释放增加和肝脏脂肪变性。经SPSS统计，模型组甘油三酯（TG）与自然对照组差异显著，与灌胃本发明***片组差异极显著；从实验情况，模型组出现血清高甘油三酯水平，说明酗酒是产生高甘油三酯血症的主要原因之一，是诱发2型糖尿病的致病因素之一；而服用本发明***片对由于酗酒诱发的甘油三酯代谢异常具有很好的调控作用。

尿素浓度除受肾脏影响外，还易受饮食中蛋白质和机体代谢状态的影响，如高蛋白饮食、胃肠功能不良等。因肾脏有强大的储备能力和代偿能力，在肾小球受损早期或轻度受损时，血中尿素氮仍可维持在正常水平，只有在严重肾小球损害，一般肾小球滤过率降低50％以下时，血尿素氮浓度才明显升高。经SPSS统计，模型组尿素氮与自然对照组差异显著；在本实验条件下，模型组大鼠由于过量酗酒，醉酒严重，导致采食量下降和蛋白质代谢障碍，使得尿素氮不升反降，是所有实验组中最低的，而灌胃本发明***片实验组，对蛋白质的代谢有改善作用，尿素氮水平呈上升势头。

经SPSS统计，模型组白蛋白水平与灌胃本发明***片组差异极显著，从白蛋白水平变化能够发现灌胃***片能够对由于长期酗酒造成白蛋白水平低下具有调控作用，即能够改善机体蛋白代谢水平。

以上结果表明：本发明含片对由于酗酒引起的大鼠肝脏脂肪变有相当大的治疗作用，从血液生化指标和肝脏组织切片来看，本发明含片的改善作用是非常明确的。

3、本发明含片干预后对试验组大鼠肝脏代谢中主要基因表达变化比较分析，如下表：

通过基因芯片技术研究发现长期酗酒的模型组大鼠肝脏表达基因中许多影响重要代谢途径（比如与解酒相关基因、脂肪代谢相关基因、肝脏损伤修复基因）关键基因的表达均表现出不利于机体正常代谢的状况，而灌胃***片干预后这种基因表达的变化得到了很好的修正，从下例表中我们不难发现这种类似于“纠错”表达的能力正体现出灌胃***片对由于长期酗酒形成的肝脏代谢障碍、组织损伤的修复具有很强的改善作用，通过我们的研究从基因水平发现灌胃***片能够有效地解酒，改善肝脏的代谢机能。

3.1灌胃***片干预后对肝脏内与糖脂代谢相关的关键基因表达的影响

组别

Dci

Ehhadh

Fasn

Fbp2

LpL

Scd

Scd1

模型组/自然组

↓3.72

↓2.74

↑4.86

↓4.57

↓2.82

↑5.04

↑5.65

***片组/模型组

↑3.52

↑2.96

↓2.67

↑2.41

↑3.26

↓7.79

↓8.42

注：表中，↓3.72表示Dci基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调3.72倍，↑3.52表示Dci基因灌胃***片组与模型组的表达比上调3.52倍。

3.1.1  Dci：十二氯烷辅酶Aδ异构酶，反烯酰辅酶A异构酶，线粒体，参与脂代谢，脂肪酸β氧化。

本实验条件下酗酒模型组与自然对照组比下调十二氯烷辅酶Aδ异构酶基因的表达3.72倍，说明模型组大鼠长期酗酒会通过下调该基因，使线粒体脂肪酸β氧化能力减弱，加强肝脏脂肪变。

本实验条件下灌胃***片组与模型组比上调了该基因3.52倍，会促进肝脏组织的脂肪酸β氧化，对防治酗酒引起的脂肪肝有积极意义。

3.1.2  Ehhadh：双功能过氧化物酶（peroxisomalbifunctionalenzyme）、烯酰辅酶A水合酶，过氧化物酶体，参与脂代谢，脂肪酸代谢。过氧化物酶体是饱和／不饱和的极长链脂肪酸进行β氧化的唯一场所，D-3羟脂酰CoA脱水酶／D-3羟脂酰CoA脱氢酶即D-双功能蛋白（D-BP）是首次报道的参与过氧化物酶体脂肪酸β氧化的一种酶，在多不饱和脂肪酸、2-甲基支链脂肪酸和D-异构体羟基脂肪酸的β氧化中起着至关重要的作用。糖尿病状态下血浆极长链脂肪酸和多不饱和脂肪酸水平的升高是否与过氧化物酶体脂肪酸β氧化，特别是D-BP活性的改变有关。真核细胞的线粒体和过氧化物酶体都进行脂肪酸的β氧化，碳链长度小于20个碳的脂肪酸主要在线粒体内β氧化供能，而碳链长度大于2O个碳的饱和／不饱和极长链脂肪酸、二甲基支链脂肪酸及胆汁酸合成代谢中间产物主要在过氧化物酶体中氧化，生成的中短链脂肪酸然后转入线粒体彻底氧化。过氧化物酶体脂肪酸β氧化途径的第二步和第三步反应，即烯脂酰CoA经水合、脱氢生成3-酮脂酰CoA的反应，由一种具有烯脂酰CoA水合酶／3-羟脂酰CoA脱氢酶活性的双功能蛋白催化，已经证实过氧化物酶体中存在两种双功能蛋白：L-双功能蛋白(L-BP)和D-双功能蛋白。L-BP催化反式烯酰CoA转化为L型3-羟脂酰CoA，进而脱氢为3-酮脂酰CoA；而D-BP催化反式烯酰CoA水合生成的中间产物为D型3-羟脂酰CoA，并以其为底物催化其脱氢。底物专一性研究表明，L-BP主要在饱和脂肪酸、非支链脂肪酸的氧化中起作用；而D-BP不仅是唯一与多不饱和脂肪酸、2-甲基支链脂肪酸的烯脂酰CoA氧化有关的酶，而且对D-BP缺陷病人的研究还发现，D-BP也是参与极长链直链脂肪酸，例如二十四烷酸β氧化的主要酶。在肝脏中D-BP与L-BP的含量几乎相等，每克蛋白质中大约含2．5mg，说明两种双功能蛋白在肝细胞的过氧化物酶体脂肪酸β氧化中起同等重要的作用。高等生物体内有两种多功能酶具有L-3-羟脂酰CoA脱氢酶活性，分别是存在于过氧化物酶体中的L-BP，和线粒体中具有烯酰CoA水合酶／L-3-羟脂酰CoA脱氢酶／3-酮脂酰CoA硫解酶活性的三功能蛋白。已知，糖尿病时线粒体和过氧化物酶体的脂肪酸β氧化活性是同时增加的，研究发现，糖尿病大鼠肝过氧化物酶体脂肪酸β氧化活性与肝L-3-羟脂酰CoA脱氢酶活性也同时升高，说明糖尿病时线粒体和过氧化物酶体直链饱和脂肪酸、L-异构体羟基脂肪酸的β氧化增强；但是，有研究观测到D-BP的蛋白量和酶活性显著降低，因而多不饱和脂肪酸、支链脂肪酸和D-异构体长链羟基脂肪酸的β氧化很可能减弱，导致不饱和极长链脂肪酸的中间产物D-异构体、支链脂肪酸的堆积。这一发现与观察到的Ⅱ型糖尿病患者血浆极长链脂肪酸和花生四烯酸水平明显升高的现象相符，提示D-BP活性降低可能是造成糖尿病时血浆脂肪酸谱异常的原因之一。

本实验条件下酗酒模型组与自然对照组比下调双功能过氧化物酶基因的表达2.74倍，说明模型组大鼠长期酗酒会通过下调该基因，使过氧化物酶体和线粒体中脂肪酸β氧化能力减弱，促进肝脏脂肪变，是长期酗酒诱发肝脏脂肪变的主要分子机制之一。

本实验条件下灌胃***片组与模型组比上调了双功能过氧化物酶基因2.96倍，会促进肝脏组织过氧化物酶体和线粒体中的脂肪酸β氧化，对防治酗酒引起的脂肪肝有积极意义，是***片防治长期酗酒诱发肝脏脂肪变的主要分子机制之一。

3.1.3  Fasn：脂肪酸合成酶，参与脂肪酸生物合成。哺乳动物中，脂肪酸合成酶在脂肪酸合成中起着至关重要的作用，负责乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸（棕榈酸酯）的所有催化步骤，基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶多寡对控制动物体脂沉积具有重要的意义。

本实验条件下模型组长期酗酒使肝细胞中脂肪酸合成酶基因与自然对照组比表达上调4.86倍，说明：模型组能够使脂肪酸合成酶合成增加是导致肝细胞脂肪过量沉积的罪魁祸首，造成脂肪肝发生首要因素。

本实验条件下灌胃***片组与模型组下调脂肪酸合成酶的基因表达2.67倍，说明：***片组可以通过减少脂肪酸合成酶的合成，减少肝组织脂肪酸合成，对缓解肝脏脂肪变意义重大。

3.1.4  Fbp2：果糖 - 1,6 - 二磷酸酶2，糖异生的调节酶，催化水解果糖-1,6 - 二磷酸为果糖 - 6 - 磷酸和无机磷。参与糖代谢、糖异生。

本实验条件下模型组长期酗酒使肝细胞中Fbp2基因与自然对照组比表达下调4.57倍，说明：模型组能够通过下调该基因的表达，使模型组糖异生能力下降，与加重脂肪肝相一致。

本实验条件下灌胃***片组与模型组上调Fbp2基因表达2.41倍，说明：***片组可以通过上调Fbp2基因表达，促进肝细胞的糖异生水平，缓解肝细胞脂肪变。

3.1.5  LpL：脂蛋白脂肪酶，参与脂肪酸代谢，是脂肪代谢的关键酶之一。LpL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LpL无活性，经糖基化后，才转化成活性LpL。存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白使酶保持一种无活力的浓缩状态，由肝素刺激后血浆中得到活化的LpL，分布在含三酰甘油的脂蛋白中，主要是分解乳糜微粒和极低密度脂蛋白的三酰甘油，并结合和附着在这些脂蛋白残粒中，可能作为肝摄取这些颗粒的信号。LpL作用于脂蛋白，主要分解脂蛋白中的三酰甘油，是血浆中清除三酰甘油的限速酶，并促使脂蛋白转移胆固醇、磷脂和载脂蛋白。LpL还具有增加乳糜微粒结合到LP受体上的能力，促进乳糜微粒摄取。

本实验条件下模型组与自然对照组比下调脂蛋白脂肪酶基因表达2.82倍，说明：模型组会使脂蛋白脂肪酶含量下降，导致三酰甘油分解减少，加速模型组大鼠肝脏脂肪变。

本实验条件下灌胃***片组与模型组比表达上调3.26倍，说明：***片组能够使实验组大鼠肝细胞中脂蛋白脂肪酶合成增加，有利于肝细胞分解脂肪，减轻肝脏脂肪变。

3.1.6  Scd：固醇辅酶A脱饱和酶，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)能在脂肪酸碳链cis-9位置引入双键，是催化乳脂cis-9，trans-11CLA和trans-7，cis-9 CLA合成的关键酶。

3.1.7  Scd1：固醇辅酶A脱饱和酶1，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd -1)是单不饱和脂肪酸生物合成的限速酶，在脂肪酸代谢中起中心调节作用，也是瘦素（Leptin）作用的目的基因之一。瘦素与糖尿病、肥胖、脂肪肝有着密切关系，是近年来代谢性疾病的热点领域之一。2型糖尿病患者，常常伴有胰岛素抵抗、高瘦素血症，同时约50%的2型糖尿病患者存在脂肪肝。Scd -1是催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转变的关键酶，与肥胖、脂肪性肝脏病变和胰岛素抵抗等一系列的代谢综合征的发生、发展密切相关，因而研究Scd -1的表达、调控可能为临床脂代谢紊乱相关疾病的诊断和治疗效果的监测提供了一个十分重要的实验室指标，在临床医学中有广阔的应用前景。因Scd -1主要存在于内质网膜，目前对体内Scd -1的检测主要采用测定血脂不饱和指数(不饱和脂肪酸／饱和脂肪酸比值)或通过分子生物学方法对细胞内Scd -1mRNA表达水平进行检测。综上所述，Scd -1在能量代谢中起了重要的作用。通过对Scd -1和能量代谢关系的研究，可以更清楚的了解Scd -1在能量代谢中的机制，从而为临床靶向调节能量代谢和避免脂毒性，预防或治疗肥胖、脂肪性肝脏病变及糖尿病等一系列代谢综合症提供基础。

本实验条件下酗酒模型组与自然对照组比上调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达5.04倍、固醇辅酶A脱饱和酶1（SCD-1）上调5.65倍，说明：二基因表达上调是造成酒精性脂肪变的最主要分子机理之一，防治脂肪肝的发生是解酒过程中最关键的病理指标，处理方式有效性就在于是否能够控制脂肪肝，模型组上调了二基因，而模型组肝脏切片显示模型组大鼠出现了严重的脂肪肝，甚至达到肝纤维化的状态。

本实验条件下灌胃***片组与模型组比下调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达7.79倍，下调固醇辅酶A脱饱和酶1（Scd-1）基因表达8.42倍，说明：***片组对酗酒的不良习惯所形成的脂肪肝具有显著的改善作用，并且与肝脏切片的结果一致，这一改变是蜂花粉***片防治脂肪肝主要的分子机理之一。

3.2灌胃***片后对肝脏内与肝损伤、修复相关的关键基因表达的影响

组别	Il7r	Pla2g2a	Tgfb2	Tnfsf10
					解酒模型组/自然组	↓2.75	↑2.76	↑3.63	↑2.92
***片组/酒模型组	↑4.58	↓2.45	↓5.68	↓2.82

注：表中，↓2.75表示Il7r基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调2.75倍，↑4.58表示Il7r基因灌胃***片组与模型组的表达比上调4.58倍。

3.2.1  Il7r：白细胞介素7，受体，参与调控DNA重组，免疫应答，细胞表面受体信号连接传导，抗微生物体液应答。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组下调了白细胞介素7基因2.75倍，说明：模型组大鼠由于长期酗酒会导致肝细胞免疫应答能力下降，下调白细胞介素7基因的表达就是意味着会加重肝细胞的炎症反应，会促进肝细胞脂肪变和纤维化的进程。

本实验条件下***片组与模型组比上调白细胞介素7基因4.58倍，说明：***片干预后，通过上调白细胞介素7基因的表达加强肝细胞的免疫应答能力，缓解肝脏炎症反应，对防治由于长期酗酒引起的脂肪肝和纤维化有积极意义。

3.1.2  Pla2g2a：磷脂酶A2，基2A，钙依赖，参与脂分解代谢，对细胞膜有破坏作用，上调该基因会加重肝脏细胞膜的破坏，加重肝损伤。

本实验条件下模型组长期酗酒使肝细胞中Pla2g2a基因与自然对照组比表达上调2.76倍，说明：长期酗酒能够通过上调Pla2g2a基因表达，加重对肝细胞膜的破坏，导致血清转氨酶的上升。

本实验条件下灌胃***片组与模型组比下调Pla2g2a基因表达2.45倍，说明：***片组可以通过下调Pla2g2a基因表达，减轻对肝细胞膜的破坏，促进肝细胞损伤的修复。

3.2.3  Tgfb2：转化生长因子β2，参与细胞死亡，正调控进程，调控细胞增殖，调控免疫应答，多巴胺生物合成。研究证实，细胞因子中只有Tgf-β能刺激HSC合成胶原纤维，而其他细胞因子则只刺激HSC增殖。肝纤维化形成过程中，KC通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的Tgf-β，其不仅能够促进HSC转化为成纤维细胞，促进HSC的激活，而且能增强ECM的合成，抑制其降解。同时Tgf-β可以增加HSC上PDGF受体的表达，促进HSC自分泌Tgf-β、PDGF，明显抑制活化HSC的凋亡。PDGF和Tgf-β构成了活化HSC的自分泌循环，是HSC的持续激活的重要机制。 

本实验条件下模型组与自然对照组比，Tgfb2基因的表达上调了3.63倍，说明：长期酗酒导致肝细胞损伤，上调Tgfb2基因的表达，刺激HSC合成胶原纤维，促进肝纤维化的形成，与切片结果一致。

本实验条件下以***片干预后实验组与干预前模型组比，Tgfb2基因的表达下调了5.68倍，说明：本发明含片可以通过下调该基因表达防治肝纤维化的进程，对维护肝细胞正常代谢机能意义重大。

3.2.4  Tnfsf10：肿瘤坏死因子超族，成员10，参与引导细胞凋亡，正调控NF-κB级联。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Tnfsf10基因的表达上调了2.92倍，说明：长期酗酒通过上调Tnfsf10基因的表达，正调控NF-κB级联，促进肝细胞内脂质过氧化和炎症反应，加重肝纤维化的进程。

本实验条件下以***片干预后实验组与干预前模型组比，Tnfsf10基因的表达下调了2.82倍，说明：本发明含片能够通过下调Tnfsf10基因的表达，抑制大鼠体内NF-κB的活化，减轻肝细胞内脂质过氧化和炎症反应，缓解肝细胞发生脂肪变和纤维化，起到保护肝组织的目标。

3.3  ***片干预后对肝脏内与控制正常活动相关的关键基因表达的影响

组别

Igfbp6

Irs2

Irs3

Prlr

Socs2

Srd5a1

解酒模型组/自然组

↓3.16

↓21.42

↑2.47

↑12.62

↓33.58

↑4.0

***片组/酒模型组

↑2.15

↑2.36

↓3.52

↓9.78

↑8.84

↓4.15

注：表中，↓3.16表示Igfbp6基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调3.16倍，↑2.15表示Igfbp6基因灌胃***片组与模型组的表达比上调2.15倍。

3.3.1  Igfbp6：***结合蛋白6，调控细胞生长，信号转导，负调控细胞增殖。上调有利于Igf1发挥作用，对防治脂肪肝和肝脏纤维化有很好作用。

研究已证实，IGFs与肝纤维化、肝硬化的形成发展有关。目前已分离出两种IGFs即IGF-l和IGF-2。它们以自分泌、旁分泌和内分泌的方式作用于靶器官。几乎所有内分泌的IGF-l或IGF-2在体液中均与***结合蛋白（IGFBPs）形成相对分子质量为150kb或50kb的复合物。IGF-l是由70个氨基酸残基组成的单链多肽，主要在肝脏合成，是机体广泛存在的细胞有丝***和分化成熟的促进剂，影响许多器官内细胞的生长、分化及代谢的调节。IGF-l的上述功能是通过IGF-l受体（IGF-lR）介导的，IGF-l与IGF-lR结合的有效性受IGFBPs的调节。刘立新等研究显示，***结合蛋白6（IGFBP6）在IGF-βl诱导活化的HSC-T6中表达明显增强，提示IGF及其受体参与肝纤维化的形成。由于IGFBPs与IGFs具有高亲和力且能够调节IGFs的生物活性，这些结合蛋白的诱导产生亦能影响肝纤维化的发生发展。然而另有研究表明，IGF-1具有体内抗肝纤维化的作用，可抑制HSC的活化，其可能与提高超氧化物歧化酶及过氧化氢酶的活性，提高肝细胞清除自由基的能力，减少HS活化的刺激因素等有关。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组大鼠下调了***结合蛋白6基因3.16倍，说明：模型组通过下调***结合蛋白6基因的表达，促进了肝细胞脂肪变和纤维化。

本实验条件下***片组与模型组比上调***结合蛋白6基因2.15倍，说明：***片干预后可以通过上调该基因的表达，减缓或防治肝细胞纤维化的进程，对防治酒精性脂肪肝有积极意义。

3.3.2  Irs2：胰岛素受体底物2，Irs2在肝脏和胰腺β细胞表达，参与葡萄糖代谢，信号转导，正调控细胞增殖，Irs2蛋白表达下调使PI3-K活性减低，会加重肝胰岛素抵抗。使用基因敲除技术已证实Irs2基因的缺陷可导致胰岛素抵抗，Kubota等发现，敲除Irs2后，肝脏表现出明显胰岛素抵抗，而对骨骼肌的胰岛素敏感性无作用。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组下调了胰岛素受体底物2基因21.42倍，说明：模型组大鼠由于酗酒导致胰岛素受体底物2基因下调了21.42倍，必然使胰岛素受体底物合成大受影响，显然会影响到肝细胞对胰岛素反应的敏感性，促使模型组产生胰岛素抵抗，诱发一系列代谢综合征，最终形成脂肪肝，是长期酗酒诱发胰岛素抵抗的关键分子机理之一。

本实验条件下以***片干预后与模型组比，上调了Irs2基因的表达2.36倍，说明：灌胃本发明***片可通过上调Irs2基因的表达来改善肝细胞对胰岛素反应的敏感性，本发明***片可以起到一定的缓解胰岛素抵抗作用。

3.3.3  Irs3：胰岛素受体底物3，Irs3在肝脏和胰腺β细胞表达，参与葡萄糖代谢，目前研究普遍认为Irs3可以结合在胰岛素受体上，对Irs1、Irs2起负性调节作用。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组上调了胰岛素受体底物3基因2.47倍，说明：模型组通过上调Irs3基因表达，促使肝细胞合成更多负调控胰岛素受体底物2的胰岛素受体底物3，进一步加重肝细胞的胰岛素抵抗，加重代谢综合征，促进脂肪变，是长期酗酒诱发胰岛素抵抗的关键分子机理之一。

本实验条件下以***片干预后与模型组比，下调了Irs3基因的表达3.52倍，说明：灌胃本发明***片可通过下调Irs3基因的表达，缓解肝细胞的胰岛素抵抗，提高肝细胞对胰岛素的敏感性，减轻肝细胞脂肪变。

3.3.4  Prlr：催乳素受体，参与类固醇生物合成，抗细胞凋亡，细胞表面信号转导，激活酪氨酸激酶，JAK2蛋白。PRL通过与靶细胞膜表面的催乳素受体相结合，启动JAK2／STAT5信号传导途径，最终激活反式作用因子STAT5。现代研究证明肝脏是机体合成免疫效应分子的主要部位之一，JAK/STAT信号通路的许多成员在肝组织中表达不正常的JAK/STAT信号转导可导致多种肝损伤。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组上调了催乳素受体基因12.62倍，说明：模型组通过上调催乳素受体基因，最终激活反式作用因子STAT5，使JAK/STAT信号通路转导受阻，导致肝损伤的发生。

本实验条件下以***片干预后与模型组比，下调了催乳素受体基因的表达9.78倍，说明：灌胃本发明***片可通过下调催乳素受体基因，改善JAK/STAT信号转导通路，对修复损伤的肝脏组织有利。

3.3.5  Socs2：细胞因子信号转导抑制因子2，1997年由Starr R等发现，根据4O个氨基酸的Socs框命名。目前已发现这类负调节分子有6种，多数成员参与JAK／STAT通路的负反馈调节。该家族有8个成员含SH2结构域，即CIS和Socs -1～7，这个结构直接与磷酸酪氨酸相互作用，是Socs家族起抑制作用的关键。Socs 2作用广泛，对脂肪沉积、骨骼肌发育、中枢神经***作用、免疫应答，癌症发生都有重要作用。另外Socs 2能调节胰岛素、催乳素等激素分泌，并对GH／1GF、胰岛素、白介素等细胞因子信号通路起促进或抑制作用。多种细胞因子通过复杂的信号网络调控细胞和机体内脂肪代谢的平衡，目前多数研究集中生长激素（GH）对脂代谢的影响，而Socs 2是生长激素信号通路的关键负反馈抑制因子。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Socs2基因的表达下调了33.58倍，说明：长期酗酒会造成肝细胞内的代谢“刹车”调控***严重失灵，必然会对肝细胞内正常的脂代谢和胰岛素作用产生影响，形成代谢障碍，最终促使肝细胞脂肪变，是长期酗酒诱发胰岛素抵抗的关键分子机理之一。

本实验条件下以本发明***片干预后与干预前模型组比，Socs2基因的表达上调了8.84倍，说明：本发明含片可以通过提高Socs2基因的表达，修复由于酗酒导致的肝细胞内“刹车”调控***失灵，对改善肝细胞脂肪代谢和胰岛素作用具有重要意义。

3.3.6  Srd5a1：类固醇5α还原酶，α肽1，分布内质网、微粒体，3-C-5α类固醇4脱氢酶，参与细胞信号转导，性别决定，细胞分化。能催化睾酮转化为另一种雄激素—二氢睾酮，故在性分化及雄激素生理中发挥重要作用，该酶具有Srd5a 1、2两个异构体。主要表达于皮肤和脂肪组织及肝脏，可催化绝大部分第4，5位碳原子上非饱和类固醇的还原反应，使有活性的糖皮质激素（GC）转化为无活性的代谢产物。研究发现，糖皮质激素作用不仅与血循环中GC水平相关，还与组织局部有生理活性的GC浓度密切相关。肝脏中增强的Srd5a1活性导致血清皮质醇（COR）清除率增加，进而代偿性下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）活性增强，COR分泌增加，进一步导致腹型肥胖及MS（MS指一系列代谢紊乱和心脑血管危险因素在同一个体上的聚集，即为肥胖、高血压、血脂异常及糖耐量异常等多种代谢异常临床体征的征候群）。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Srd5a1基因的表达上调了4.0倍，说明：模型组通过提高Srd5a1基因表达增强Srd5a1活性导致血清皮质醇清除率增加，使得模型组出现MS，最终使肝细胞发生脂肪变。

本实验条件下以***片干预后与干预前模型组比，Srd5a1基因的表达下调了4.15倍，说明：本发明***片能够通过下调该基因表达，改善由于酗酒所带来的代谢综合征，这从另一方面解释了蜂花粉***片为什么可以防治代谢综合征的原因。

总之，通过以上试验表明本发明产品能够有效参与机体解酒过程，有效防治脂肪在肝脏的产生和堆积。目前我国在蜂花粉解酒方面研究刚刚起步，通过实验，发现蜂花粉水提液对解酒作用效果好，为开发解酒的药物提出新思路。蜂花粉是我国传统保健产品，能提高肝细胞活性，改善多种血液生化指标，预防由于长期酗酒引起的脂肪肝，对维护和提高我国民众的酗酒的保健具有重大意义。蜂花粉可以作为针对解酒的首选保健品，加以推广和应用。

Claims (1)

1.用于解酒的蜂花粉水提取物***片，其特征在于主要由以蜂花粉水提取方法取得的分子量小于5000D的蜂花粉水提取物的冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆、硬脂酸镁和薄荷脑组成；所述冻干粉、山梨糖醇、淀粉浆、硬脂酸镁和薄荷脑酒精溶液分别占***片总质量的50～85%、5～20%、5～25％、0.2～0.4%、0.1～0.4%。

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