CN102911882B

CN102911882B - 一株红冬孢酵母及其在制备类胡萝卜素和单细胞蛋白中的应用

Info

Publication number: CN102911882B
Application number: CN201210411624.3A
Authority: CN
Inventors: 陈育如; 赵乙萱; 孙欢; 刘军利; 卫民
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: CN102911882A

Abstract

本发明涉及一种红冬孢酵母菌(RhodosporidiumKratochvilovae)菌株及其应用。所说的红冬孢酵母菌株保藏编号为：CGMCC No.6365。该菌株可以发酵纤维素热解液和内醚糖，用于生产类胡萝卜素和单细胞蛋白。将内醚糖或纤维素热解液制成增养基，在一定装液量和转化温度下，培养一定时间得到含类胡萝卜素的菌体（单细胞蛋白）。本发明利用红冬孢酵母菌株发酵纤维素类生物质的高温热解产物得到类胡萝卜素和单细胞蛋白，是对纤维素生物质的有效利用方法之一，可将来源丰富的底物转化为附加值更好的产物，变废为宝，有着良好的经济、环境和社会应用前景。

Description

一株红冬孢酵母及其在制备类胡萝卜素和单细胞蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及以廉价纤维素类生物质为原料发酵产高价值产品的方法，具体涉及利用红冬孢酵母菌株(Rhodosporidium Kratochvilovae)发酵纤维素热解液和内醚糖产类胡萝卜素和单细胞蛋白。

背景技术

纤维素类生物质是地球丰富与廉价的大宗资源。农作物秸杆、林业废弃物、废纸工业等废弃物、城市纤维类固体废弃物等等都是纤维素生物质的廉价来源。纤维素生物质的有效利用，不仅有潜力解决全球能源危机，还可以消除这些物质随意弃置带来的环境污染。

目前生物质主要的处理方法有酸解、酶解和热化学转化法(Mckendry P. Energy production from biomass(part2):conversion technologies[J]. Bioresource technology, 2002, 83:47-543)等，通过这些手段将生物质转化为可以为人们利用的生物燃料、化学化工产品等。纤维素生物质热化学转化技术主要有气化、热解和液化等(Lin Y C , George W H. The critical role of heterogeneous catalysis in lignocellulosic biomass conversion[J]. 2009,2(1):68-80)。热解是在完全无氧或含氧量极小因而氧化反应程度极为有限情况下的热降解反应(Bridgwater A V. Renewable fuels and chemicals by thermal processing of biomass[J]. Chemical Engineering journal, 2003, 91:87-102)( Lappas A.A. Samolada M.C. Iatridis D.K. Voutetakis S.S. Vasalos I.A. Biomass pyrolysis in a circulating fluid bed reactor for the production of fuels and chemicals[J]. Fuel, 2002, 81: 2087-2095)。热解技术被认为是热化学转化技术的核心技术(Demirbas A. Biomass resource facilities and biomass conversion processing for fuels and chemicals[J]. Energy conversion ＆Management 2001, 42:1357-1378)，其与稀酸水解法、同步糖同化法相比，不但缩短原料处理时间，而且提高了糖的得率，降低了生产成本(任普鲜. 蒋剑春. 杨秀山. 刘军利. 木质纤维素快速热解产物生产燃料乙醇研究进展[J]. 生物质化学工程，2009，43(3)：47-51)。纤维素生物质高温热解主要还原糖产物为内醚糖。

内醚糖（Levoglucosan，1,6-脱水-β-D吡喃葡萄糖，简称LG），纤维素生物质热解液的主要成分。庄绪亮等研究发现，黑曲霉和土曲霉有脱水内醚糖的同化作用。经过诱变，筛选到一株能转化内醚糖为柠檬酸的菌株Aspergillu niger CBX-209，但转化率只达到87.5%( Zhuang XL , Zhang HX, Yang J Z et al.preparation of Levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acid fermentation[J]. Bioresource Technology, 2001,79:63-66)。

余志晟以脱水内醚糖为唯一碳源对中国三大菌库(CGMCC，ACCC，CICC)的89菌株进行了同化测试，1株Sporobolomyces，1株Rhodotorula，4株Rhizopus，1株Monascus有内醚糖的同化能力。对自然界319份土样进行了同化和发酵内醚糖微生物的筛选表明：在77份土样中可观察到有明显的微生物生长。其中Liopmyces siarkeyi对内醚糖的利用达到了64.12%(余志晟纤维素热解产物内醚糖的微生物同化与乙醇发酵测试[J]. 中国农学通报，2011,27(6):342-349)。虽然余志晟的研究中提到了深红酵母（Rhodotorula rubra, CGMCC 菌种号2.530)有能利用内醚糖的能力，但未报到具体的转化率和转化后得到什么产物。本发明筛选到的红冬孢酵母(Rhodosporidium Kratochvilovae)与深红酵母(Rhodotorula rubra)为不同种，经研究发现，培养仅4天后，红冬孢酵母菌株对内醚糖的同化率约为98.7%，单细胞蛋白25.4g/L, 类胡萝卜素467.6ug/g.

类胡萝卜素所以具有重要的经济价值，是因其不仅具有预防癌症和心血管疾病的功能，可以广泛的用于医药、食品和化妆品等领域(王岁楼. 刘凤珠. 高建奇. 红酵母类胡萝卜素发酵助剂的筛选及应用[J]. 食品与生物技术，2002,21(1):1-5.)，作为光合作用的辅助色素，类胡萝卜素还参与执行光能传递和物质转化，具有抗光敏作用、淬灭自由基等重要的生理生态功能(张坤生. 张亮. 吕晓玲. 陈晓娟. 红酵母色素抗氧化性质的研究[J]，食品科学，2004,25(3):61-63)。

从植物和盐藻中提取天然类胡萝卜素受地域条件、原料来源、提取得率等限制，生产成本较高(王岁楼，张鑫. 高产类胡萝卜素红酵母的筛选及其发酵条件[J]. 无锡轻工大学学报，2001, 20(3), 252-256) 。

红冬孢酵母属，是一类具有较高经济价值的酵母菌属，该类菌不仅可以用来降解棉酚，使棉籽粕达到使用标准(高峰. 林海晶. 一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用，中国专利，CN102154129A)。还可以用来生产D-氨基酸氧化酶，头孢烯类抗生素的起始物质(廖国祯，红冬孢属D-氨基酸氧化酶，中国专利，CN1243877A)。

本发明提供的方法，利用红酵母发酵经济廉价的纤维素类生物质产类胡萝卜素具有营养要求简单，发酵周期短(1-7天)，生产速度快，菌体无毒，营养丰富等等优点。

纤维素类生物质原料来源广泛，费用低廉。本发明利用红冬孢酵母菌株将廉价的生物质转化为高经济价值的类胡萝卜素，是纤维素类生物质变废为宝，即具有良好的环境效益和社会效益。

发明内容

本发明旨在提供一种红冬孢酵母菌株(Rhodosporidium Kratochvilovae)及利用该菌发酵纤维素生物质高温热解产物得到类胡萝卜素的方法。

本实验组筛选得到一株红色酵母菌对内醚糖有较高同化率，同时可产类胡萝卜素和单细胞蛋白。

本发明所述的红冬孢酵母(Rhodosporidium Kratochvilovae)菌株，它的保藏编号为：CGMCC No.6365。

本发明还公开了红冬孢酵母菌(Rhodosporidium Kratochvilovae) CGMCC No.6365在生产类胡萝卜素和单细胞蛋白中的应用。

一种用红冬孢酵母菌(Rhodosporidium Kratochvilovae) CGMCC No.6365生产类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法，是将红冬孢酵母菌株接种到含内醚糖的发酵液中，发酵后，得到酵母菌体，菌体即为单细胞蛋白；菌体中含类胡萝卜素，分离纯化得类胡萝卜素。

上述方法中，将红冬孢酵母菌株接种到含有0.2-50%内醚糖的发酵液，转化1-5天，红冬孢酵母菌株对内醚糖的转化率为90-100%.

上述方法中，所述的含内醚糖的发酵液的配方为浓度单位为(W/W)：0.2-50%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉、pH为3.0-7.0。其中内醚糖浓度优选1-5%，pH值优选5.0-6.0。

另一种用红冬孢酵母菌(Rhodosporidium Kratochvilovae) CGMCC No.6365生产类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法，是将红冬孢酵母菌株接种到以纤维素热解液配置好的发酵液中发酵后，得到酵母菌体，菌体即为单细胞蛋白；菌体中含类胡萝卜素，分离纯化得类胡萝卜素。

所述的纤维素是木材纤维素、竹材纤维素或秸秆纤维素。

所述的纤维素热解液配置好的发酵液的配方为浓度单位为(W/W):0.2-50%的热解液、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉、pH为3.0-7.0。

将红冬孢酵母菌株接种到内醚糖或纤维素热解液配置的的发酵培养基，发酵后，得到大量的菌体，将菌体用盐酸破壁2h后，丙酮萃取可得到类胡萝卜素。

类胡萝卜素的测量方法为将浸提液适当稀释后用分光光度计在475nm下测量吸光值，按下式计算类胡萝卜素的含量。类胡萝卜素的含量(ug/g)=A_λmax×D×V/0.16×W，式中：Aλmax—最大吸收波长475nm下的吸光度，V—提取所用有机溶剂的总体积9（ml），D—浸提液稀释倍数，W—干酵母菌体重量，0.16—类胡萝卜素的消光系数。

实验中所提到菌粉制备方法是使用常规的液体或固体发酵即可得到菌粉。

实验中所提到的热解液是由本实验室制得，具体是将秸秆、竹子、木材等农业废料在100℃的条件下烘干并粉碎，利用管式炉热解反应器（主要由管式炉热解器、电加热器、温控仪、冷凝和真空***组成）在高温条件下进行热解，收集冷凝得到的组分即为热解液。

附图说明

图1 红冬孢酵母菌显微照片。

图2 2%内醚糖发酵液发酵前的HPLC图。

图3 2%内醚糖发酵液发酵后的HPLC图（96h）。

图4 10%纤维素热解液发酵前的HPLC图。

图5 10%纤维素热解液发酵后的HPLC图（96h）。

具体实施方式

本发明结合具体的实验和数据为本发明进一步说明，举例是为了说明本发明的过程，而非仅限于实施例。以下实施例所说的菌粉或菌液均指红冬孢酵母菌(Rhodosporidium Kratochvilovae) CGMCC No.6365。

菌的筛选：

在南京师范大学仙林校区选取有机质丰富的土壤，于无菌水中制成悬浮液，取悬浮液上层澄清部分在1%(W/W)内醚糖、2%(W/W)琼脂平板上涂布。

30℃条件下培养，1天可以长出菌落，菌落形态红色湿润，圆形，凸起，显微镜下观察为单细胞，圆形或椭圆形。挑取平板上长出的菌，接种于含有2%（W/W）内醚糖的液体发酵培养基中，30℃、180rpm条件下培养1-7天，取样HPLC检测，证明该菌株确有同化内醚糖的能力，命名为ZS1。将该菌株经18SrDNA序列测定及进化树构建，结合其他理化性质，鉴定该菌为红冬孢酵母菌Rhodosporidium Kratochvilovae.该菌在显微镜下照片（400倍）如图1所示。

本发明中红冬孢酵母菌Rhodosporidium Kratochvilovae.于2012年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为红冬孢酵母菌Rhodosporidium Kratochvilovae 保藏编号是CGMCC No.6365。

实施例1：

配制0.2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为0.2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为100%，类胡萝卜素的量231.7ug/g，单细胞蛋白产量11.2g/L.

实施例2：

配制50%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为50%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养6天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为90%，类胡萝卜素的量529.3ug/g，单细胞蛋白的量32.4g/L.

实施例3:

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为94.6%，内醚糖同化前后如图2和3所示。类胡萝卜素的量467.6ug/g，单细胞蛋白25.4g/L。

实施例4：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入0.1%的红冬孢酵母菌粉，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量112.7ug/g，单细胞蛋白的量5.68g/L.

实施例5：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入10%的红冬孢酵母菌粉，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量467.6ug/g，单细胞蛋白的量25.4g/L.

实施例6：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入5%的红冬孢酵母菌粉，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量318ug/g，单细胞蛋白的量19.8g/L.

实施例7：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入10%的红冬孢酵母菌液，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量434.1ug/g，单细胞蛋白的量22.8g/L.

实施例8：

配制2%（W/W）、pH为3.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入10%的红冬孢酵母菌粉，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量198ug/g，单细胞蛋白的量4.78g/L.

实施例9：

配制2%（W/W）、pH为7.0，内醚糖为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉。接入10%的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量394ug/g，单细胞蛋白的量21.3g/L.

实施例10：

配制木材热解液为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为10%木材热解液、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉，pH5.0接入10%的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为43%，内醚糖的同化前后如图4和5所示。类胡萝卜素的量201.3ug/g，单细胞蛋白的量7.87g/L .

.实施例11：

配制木材热解液为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为0.2%木材热解液、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉，pH5.0接入10%的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量113ug/g，单细胞蛋白的量4.24g/L.

实施例12：

配制木材热解液为发酵底物的发酵液培养基，具体的配方为50%木材热解液、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉，pH5.0接入10%的红冬孢酵母菌，30℃，180rpm动态培养4天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量267.4ug/g，单细胞蛋白的量8.26g/L .

实施例13：

与实施例10基本相同，只是将木材热解液替换为竹材热解液。

实施例14：

与实施例13基本相同，只是将竹材热解液替换为秸秆热解液。

Claims

1.一种红冬孢酵母(Rhodosporidium Kratochvilovae)菌株，菌种保藏编号为CGMCC No.6365。

2.一种用权利要求1所述红冬孢酵母菌CGMCC No.6365生产类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法，其特征在于是将红冬孢酵母菌株接种到含内醚糖的培养液中，发酵后得到酵母菌单细胞蛋白；菌体中富含类胡萝卜素，可进一步分离纯化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是将红冬孢酵母菌株接种到含有重量百分比浓度为0.2-50%的内醚糖培养液中，转化1-5天，红冬孢酵母菌株对内醚糖的转化率为90-100%。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养液的配方为：0.2-50%内醚糖、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉、pH为3.0-7.0；配方中各组分的浓度单位为重量百分比。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是内醚糖浓度为1-5%，pH为5.0-6.0。

6.一种用权利要求1所述红冬孢酵母菌CGMCC No.6365生产类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法，其特征在于是将红冬孢酵母菌株接种到用纤维素热解液配制的培养液中发酵，得到含类胡罗卜素的酵母菌体单细胞蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是其中所述的纤维素是木材纤维素、竹材纤维素或秸秆纤维素。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于培养液的配方为:0.2-50%的热解液、1%蛋白胨、0.1%KH₂PO₄、0.04%MgSO₄、0.01%FeSO₄、0.3%酵母粉、pH为3.0-7.0；配方中各组分的浓度单位为重量百分比。