CN102911265B - 一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人神经生长因子的重组变异体rhNGF及其制备方法。我们根据分子结构研究设计的人神经生长因子重组变异体(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG 10个氨基酸，多了GA二个氨基酸，此后从EFSV开始的序列同于人神经生长因子正常序列。采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA，构建工程菌进行表达，得到rhNGF融合蛋白，用羟胺切割后进行纯化即得到纯化的rhNGF，其具有天然生物活性。
Description
人神经生长因子(hNGF)是人体中一种对神经修复机能有调节作用的生物活性因子，对促进神经***的生长，损伤神经的再生具有决定性作用。目前hNGF作为药品国内外均未上市，只有我国批准了鼠源NGF临床应用，但鼠源NGF因种属差异及病毒污染的威胁而终将被重组产品替代。用基因工程生产重组人神经生长因子是唯一的途径。rhNGF具有重要临床价值，将填补国际神经修复药物的空白。我国每年有上百万神经损伤病人，市场前景可观。
我们发明了一种通过蛋白质工程改造获得的hNGF重组变异体及其制备方法。天然活性的人神经生长因子末端为Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我们通过对其分子结构的深入研究，提出了hNGF重组变异体的新结构，此重组变异体(rhNGF)的特征在于重组表达的hNGF肽段从N端第一个氨基酸开始少了S丝氨酸、S丝氨酸、S丝氨酸、H组氨酸、P脯氨酸、I异亮氨酸、F苯丙氨酸、H组氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10个氨基酸，多了G甘氨酸、A丙氨酸二个氨基酸，并从E谷氨酸、F苯丙氨酸、S丝氨酸、V缬氨酸及往后氨基酸开始符合hNGF正常序列，从总体分子量上看少了8个氨基酸。我们通过上述对hNGF进行的蛋白质工程改造以期获得药效更好、更稳定的hNGF重组突变体(rhNGF)，其为具有新结构的生物分子，以利于新药开发和临床应用。
实例说明：
1.目的基因的获得
为了获得人NGF重组变异体的cDNA，我们采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA。
全基因合成采用分段合成的方法进行。基因序列设计则根据我们的分子设计和参考文献报道的hNGF的基因序列。我们设计的hNGF基因序列的5’端含有Kpn1酶切位点及编码羟胺切割位点的序列，3’端含有Xba1酶切位点和终止密码TGA。合成基因设计序列见图1。
图1.rhNGF合成基因设计序列
2.基因序列测定
将人工合成的rhNGF的cDNA，***载体pThioHis A，用合成的测序引物进行正向测序(测序仪：ABI PRISM)。
将测序图谱用计算机读序，得到cDNA序列并翻译成对应氨基酸，结果我们设计的hNGF的cDNA和氨基酸序列一致。表明我们克隆得到的rhNGF的cDNA是正确的。
3.表达质粒的构建
将rhNGF的cDNA***pBV220中直接表达，表达产物形成不溶性的包含体，需要经过变性和复性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三对二硫键，复性很困难，导致产率很低。为了获得rhNGF的高效可溶性表达，我们把rhNGF与大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin进行融合表达，thioredoxin可以引导其后的蛋白正确折叠，呈可溶性表达，具天然生物学活性，避免了变性复性的难题。
切割方法用的是盐酸羟胺切割法。盐酸羟胺可以特异地切割蛋白中的Asn-Gly肽键，产生N端为Gly的多肽。我们发现rhNGF多肽中不含羟胺切割位点Asn-Gly，故我们选定羟胺切割位点Asn-Gly为连接点与thioredoxin融合表达rhNGF。表达的融合蛋白用羟胺切割后释放出rhNGF，其起始氨基酸为Gly，此后的氨基酸序列与rhNGF序列一致。Gly与Met性质相似，放在N端均不影响蛋白的活性，况且hNGF的N端氨基酸对活性不重要，其N端8个氨基酸在人体内首先要被水解掉以实现功能。
羟胺是人体内的正常代谢产物，盐酸羟胺成本低，切割特异性好，切割效率高，适合工业化生产。
我们选用质粒pThioHis A作为表达载体(Invitrogen公司产品)，它含有启动子Ptrcpromotor、thioredoxin前导肽及终止子aspA terminator，以及Amp抗性基因。我们将合成的rhNGF cDNA用Kpn1-Xba1双酶切后的片段***上述质粒的Kpn1-Xba1之间，构建成表达质粒pTHNGF。
宿主菌选用大肠杆菌JM109(购自Invitrogen公司)。大肠杆菌JM109的基因型为：recA1supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F’[traD36proAB+lacIqlacZΔM15]。
将质粒pTHNGF转化入大肠杆菌JM109，即构成工程菌pTHNGF/JM109。将其保存于15％甘油中，冷冻于-70℃，即为原始种子库。
4.rhNGF工程菌的检定
4.1细菌形态、培养特征、生理生化特性
从原始种子库中取一支甘油保存的pTHNGF/JM109工程菌，接种在LBA培养基中，37℃摇荡培养16小时，再以10％的比例接种到LBA培养基中(LB+0.1mg/ml Amp)，继续培养3小时，以此为种子液进行以下各项检查：
4.1.1细菌形态
用种子液涂布玻片后，革兰氏染色并镜检。工程菌为革兰氏阴性，菌体为直杆状，边缘清晰，两端钝圆，大小基本一致，未见其它杂菌污染。
4.1.2培养特征
用种子液划线LBA平板，37℃培养20小时，肉眼可见：菌落为圆形，边缘光滑，菌落饱满，表面湿润、光滑，呈乳白色，基质未见色素产生。
4.1.3生理生化特性
能利用葡萄糖、乳糖、甘油作为碳源，不能利用果糖、肌醇。吲哚反应为阳性。V.P.反应呈阴性，不水解明胶。
4.2抗生素抗性特征
未转化的宿主菌BL21在LB培养基上生长，在LBA培养基上不生长(Amp：0.1mg/ml)。
转化后的工程菌pTHNGF/JM109在LB培养基和LBA培养基上都生长良好。
表明工程菌pTHNGF/JM109具有氨苄青霉素的抗性。
4.3质粒酶切图谱分析
从上述种子液中提取质粒pTHNGF，进行酶切鉴定。用KpnI-XbaI及KpnI-PstI均可切出370bp的小带，用EcoRI-PstI可切出约340bp的小带，酶切鉴定结果均符合质粒设计，说明质粒pTHNGF构建正确。
4.4工程菌的表达与表达产物的获得
将pTHNGF/JM109种子液以1％的比例接种于LBA培养基中，37℃生长至OD600约为0.5，加入IPTG至1mM作为诱导剂，37℃诱导5小时，收获菌体，洗涤后取样裂解，进行SDS-PAGE电泳分析。可见诱导后的菌体在26kD处比空白对照多出一条浓的蛋白带，与要表达的rhNGF融合蛋白分子量26kD大小相等，经薄层扫描，该条带占菌体总蛋白的10-20％左右。
对表达的菌体进行超声破菌，并高速离心。将沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳。可见表达的rhNGF融合蛋白集中在上清中，即以可溶形式表达，具天然活性，不需要经过变性和复性。
经过渗透压释放的方法，将大肠杆菌细胞内的可溶rhNGF融合蛋白大部分释放到缓冲液中，羟胺切割后，经Ni螯合层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化，即得到纯化的rhNGF。
5.表达产物结构确证资料
5.1特异性鉴别实验
纯化的rhNGF产品做免疫印迹鉴定，结果与抗hNGF抗体呈阳性反应。表明本产品与抗hNGF抗体发生免疫反应。
5.2N末端氨基酸序列分析
对纯化的rhNGF进行N端氨基酸序列分析，测序结果表明N端15个氨基酸序列为：
Gly-Ala-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asp-Ser-Val-Ser-Val-Trp-Val-Gly
即N端氨基酸序列与设计符合。
6.活性测定
采用鸡胚背根神经节法测定，具体为以DMEM为母液，在含20％鸡血浆和15％鸡胚浸液的培养基中，利用伊莎褐鸡胚腰椎背根神经节，在终浓度为30ng/ml的NGF的刺激下，培养36h。经检测，纯化的rhNGF其生物学活性与鼠源神经生长因子活性在一个数量级，达105u/mg以上。
通过以上步骤，我们对hNGF进行了蛋白质工程改造，以期获得药效更好、生物活性更稳定的hNGF重组突变体(rhNGF)，以利于人神经生长因子的作用机制研究和临床应用。
Claims (4)
1.一种人神经生长因子重组变异体(rhNGF)，其特征在于由氨基酸序列GAEFSV CDSVSVWVG DKTTATDIK GKEVMVLGE VNINNSVFK EYFFETKCR DPNPVDSGC RGIDSKHWN SYCTTTHTF VKALTMDGK EAAWRFIRI DTACVCVLS RKAVR组成。
2.根据权利要求1所述人神经生长因子重组变异体的制备方法，其特征在于，选用质粒pThioHis A作为表达载体，其含有启动子Ptrc promotor、thioredoxin前导肽及终止子aspA terminator，以及Amp抗性基因；将合成的rhNGF cDNA用Kpnl-Xbal双酶切后的片段***上述质粒的Kpnl-Xbal之间，构建成表达质粒pTHNGF。
3.根据权利要求1所述人神经生长因子重组变异体的制备方法，其特征在于，选定Asn-Gly为连接点与thioredoxin融合表达rhNGF，再用盐酸羟胺特异地切割融合蛋白中的Asn-Gly肽键，产生N端为Gly的rhNGF多肽。
4.根据权利要求1所述人神经生长因子重组变异体的制备方法，其特征在于，纯化是用渗透压方法将大肠杆菌细胞内的可溶rhNGF融合蛋白大部分释放到缓冲液中，经羟胺切割后，用Ni螯合层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化即得到。
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