CN102911201A

CN102911201A - 一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺

Info

Publication number: CN102911201A
Application number: CN2012104109377A
Authority: CN
Inventors: 魏山山; 刘代成
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: CN102911201B

Abstract

本发明公开了一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，步骤如下：（1）取干南极磷虾，加入正己烷，搅拌提取3次，合并提取液，旋转蒸发，得虾油；（2）向虾油中加入丙酮，搅拌提取6次，合并滤液，旋转蒸发，得含磷脂的油状样品液；（3）制备层析柱；（4）取步骤（2）所得含磷脂的油状样品液1.5～3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿-甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液；（5）将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，即得磷脂酰胆碱标准品，经高压液相分析检测，PC纯度≥98%。本发明制备了南极磷虾磷脂酰胆碱标准品，为未来南极磷虾深加工产品的检测做出了贡献。

Description

一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺

技术领域

本发明涉及一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺。

背景技术

南极磷虾（Euphausia superba）又名大磷虾或南极大磷虾，是一种生活在南冰洋的南极洲水域的磷虾。南极磷虾资源丰富，据估计最高有数亿吨之巨可捕量，是世界现有渔业产量的1倍以上，具有巨大的开发和利用潜力。世界主要渔业国家为日本和波兰。产品在日本主要用作为料理，而世界上其他地方则作为动物饲料及鱼饵。在世界海洋渔业资源普遍衰退的背景下，南极磷虾资源日益受到世界各国关注。

据报道，南极磷虾中含有丰富的磷脂成分，磷脂中富含被称为“抗脂肪肝因子”的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,缩写PC，又称卵磷脂），其对脂肪肝、脂肪代谢障碍、动脉硬化症、皮肤病以脑血管、心血管等微血管疾病有效；还能防止高血压、治疗皮肤干癣。磷脂酰胆碱可直接作为注射剂使用，更是脂肪输液的乳化剂。磷脂酰胆碱也可用来作为脂质体，如一些毒性较强的药物如抗癌药物顺铂的包被载体，能使抗癌药物顺利通过以磷脂作为构成成份的细胞膜。我国治疗肝病的珍贵药物“肝得健”即是以磷脂酰胆碱为主要成分。此外，磷脂酰胆碱在高级涂料，高级化妆品、农药、杀虫剂、纺织品、石油制品（如橡胶）、电子工业等方面也具有不同的优良用途。

我国南极磷虾现已进入探捕阶段，约1～2年后开始大量捕捞，届时面临的主要问题是南极磷虾的深加工利用。国外对南极磷虾的加工主要是制备南极磷虾虾油，其中磷脂含量约占40%，磷脂酰胆碱是虾油磷脂的主要成分，虾油有可能成为最佳的磷脂酰胆碱加工的原料，生产南极磷虾虾油，生产南极磷虾磷脂酰胆碱，均需要定性定量检测PC的含量。检测过程中需要南极磷虾PC的标准品标定。制备南极磷虾PC标准品是未来南极磷虾深加工产品检测的关键。PC标准品本身也是一种产品。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，步骤如下：

（1）取干南极磷虾（含水量为8%～10%）100g，加入500～600ml的正己烷，20～35℃下搅拌提取3次，每次提取1h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并提取液（约1350～1700ml），在30～45℃，-0.07～-0.09Mpa下旋转蒸发，得虾油（约4.5～5.5g）；

（2）向步骤（1）所得的虾油中加入5～7倍（指质量体积倍数，即1g物料加入5～7ml液体，下同）的丙酮，20～35℃下搅拌提取6次，每次提取0.5h，提取液过滤，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液（约135～210ml），在30～40℃，-0.07～-0.09Mpa下旋转蒸发，得含磷脂的油状样品液；

（3）层析柱的制备：称取65～75g硅胶，110～120℃下活化6～10h；向硅胶中加入3倍氯仿（质量体积倍数），搅拌成浆状；采用湿法装柱法将硅胶装入到3×30cm²层析柱中，静置，使硅胶充分沉降至体积稳定不变；

（4）取步骤（2）所得含磷脂的油状样品液1.5～3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿：甲醇=1：1～2（体积比）洗脱液洗脱，流速为2～3ml/min，按每份100～300ml收集洗脱液；

（5）将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得磷脂酰胆碱标准品（约8～12mg），经HPLC检测，磷脂酰胆碱的纯度≥98%。

所述南极磷虾磷脂酰胆碱（PC）的薄层层析定性检测方法为：

薄层层析使用GF254硅胶薄层板，展开剂为氯仿：甲醇：水：乙胺=14：6：0.6：5（V：V：V：V），展距为6cm，取各洗脱液的浓缩液点样，展毕后晾干，放入溴百里酚蓝染液缸中染色12秒；取出后晾干，将干燥后的薄层板放在薄层扫描仪上观察：PC的Rf值为0.37。

所述南极磷虾磷脂酰胆碱（PC）的HPLC定量检测方法为：

采用美国（waters）HPLC仪，2489紫外光检测器，Sepax HP-silica（4.6×250mm 5um）色谱柱，以甲醇作流动相，流速1ml/min，柱温35℃，检测波长206nm，进样量10ul，PC出峰时间为6～7分钟，检测纯度98%～98.9%。

本发明首先用正己烷从干的南极磷虾中提取出虾油，经丙酮提取除杂质，采用硅胶柱层析分离纯化南极磷虾PC标准品，经高压液相分析检测，PC纯度≥98%。

本发明制备了南极磷虾磷脂酰胆碱标准品，为未来南极磷虾深加工产品的检测做出了贡献。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品

步骤为：

（1）干南极磷虾100g，加入正己烷600ml，20℃下搅拌提取3次，每次1h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液（1700ml），在30℃，-0.08Mpa下旋转蒸发除去正己烷，得虾油5.5g。

（2）向上述制备的虾油中加入丙酮30ml，25℃下搅拌提取6次，每次提取0.5h，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液（180ml），滤液在30℃，-0.08Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。

（3）称取硅胶（200～300目）65g，110℃活化6h，向硅胶中加入195ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱（3×30cm²）中，静置，使硅胶充分沉降至硅胶体积稳定不变。

（4）取步骤（2）制备的样品液1.5ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿：甲醇=1：1（体积比）洗脱液洗脱，流速为2.5ml/min，按每份100ml收集洗脱液，浓缩。薄层层析定性鉴定洗脱液组分，将具有单一PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品8mg，经HPLC检测，PC纯度为98%。

南极磷虾磷脂酰胆碱（PC）的薄层层析定性检测方法为：

南极磷虾磷脂酰胆碱（PC）的HPLC定量检测方法为：

采用美国（waters）HPLC仪。，2489紫外光检测器，Sepax HP-silica（4.6×250mm 5um）色谱柱，以甲醇作流动相，流速1ml/min，柱温35℃，检测波长206nm，进样量10ul，PC出峰时间为6～7分钟，检测纯度98%～98.9%。

实施例2制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品

步骤为：

（1）干南极磷虾100g，加入正己烷500ml，25℃下搅拌提取3次，每次1h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液（1350ml），在45℃，-0.07Mpa下旋转蒸发除去正己烷，得虾油4.5g。

（2）向制备的虾油中加入丙酮22.5ml，20℃下搅拌提取6次，每次提取0.5h，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液（135ml），滤液在40℃，-0.07Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。

（3）称取硅胶（200～300目）68g，115℃活化8h，向硅胶中加入204ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱（3×30cm²）中，静置，使硅胶充分沉降至硅胶体积稳定不变。

（4）取步骤（2）制备的样品液2ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿：甲醇=1：1.5洗脱液洗脱，流速为2ml/min，按每份300ml收集洗脱液，浓缩，薄层层析定性鉴定洗脱液组分。将具有单一PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品10mg，经HPLC检测，PC纯度为98.5%。

实施例3制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品

步骤为：

（1）干南极磷虾100g，加入正己烷550ml，35℃下搅拌提取3次，每次1h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液（1500ml），在35℃，-0.09Mpa下旋转蒸发除去正己烷，得虾油5g。

（2）向制备的虾油中加入丙酮35ml，35℃下搅拌提取6次，每次提取0.5h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液（210ml），滤液在40℃，-0.09Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。

（3）称取硅胶（200～300目）75g，120℃活化10h，向硅胶中加入225ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱（3×30cm²）中，静置，使硅胶充分沉淀至体积稳定不变。

（4）取步骤（2）制备的样品液3ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿：甲醇=1：2洗脱液洗脱。流速为3ml/min每份200ml，收集洗脱液，浓缩，薄层层析定性鉴定洗脱液组分。将具有单一PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品12mg。经HPLC检测，PC纯度为98.9%。

Claims

1.一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，其特征在于：步骤如下：

（1）取干南极磷虾100g，加入500～600ml的正己烷，20～35℃下搅拌提取3次，每次提取1h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并提取液，在30～45℃，-0.07～-0.09Mpa下旋转蒸发，得虾油；

（2）向步骤（1）所得的虾油中加入5～7倍的丙酮，20～35℃下搅拌提取6次，每次提取0.5h，提取液过滤，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液，在30～40℃，-0.07～-0.09Mpa下旋转蒸发，得含磷脂的油状样品液；

（3）层析柱的制备：称取65～75g硅胶，110～120℃下活化6～10h；向硅胶中加入3倍氯仿，搅拌成浆状；采用湿法装柱法将硅胶装入到3×30cm²层析柱中，静置，使硅胶充分沉降至体积稳定不变；

（4）取步骤（2）所得含磷脂的油状样品液1.5～3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿：甲醇=1：1～2洗脱液洗脱，流速为2～3ml/min，按每份100～300ml收集洗脱液；

（5）将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，即得磷脂酰胆碱标准品。

2.根据权利要求1所述的一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，其特征在于：所述硅胶为200～300目的硅胶。