CN102901797A - 一种猪饲料有效磷仿生评定法 - Google Patents
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Abstract
一种猪饲料有效磷仿生评定法，采用单胃动物仿生消化***测定饲料磷体外消化率，包括如下步骤：透析袋前处理、胃肠道的模拟消化液以及缓冲液配制、上机操作和有效磷的测定；称取饲料样品于装有透析袋的模拟消化器中，加入缓冲液和模拟消化液，设置消化参数，进行模拟消化过程，消化结束采用钼蓝比色法测定磷的含量。本发明使用实时动态的消化产物分离技术，通过单胃动物仿生消化***自动控制体外消化过程，提高测试结果的重演性和精度。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪饲料有效磷仿生评定法，特别是涉及一种在动物体外条件下模拟饲料中磷在猪胃肠道内被消化、吸收后有效磷的测定方法。
背景技术
磷(Phosphorus)是动植物体内的必需矿物元素，是继蛋白质和能量之外的第三昂贵的饲料原料（Lei等，2000；Novak等，2000；Fan等，2001；霍启光，2002）。客观、准确评定各种饲料原料的生物学效价是动物营养需要量研究、优化饲料配方的基础，是提高畜禽日粮利用率、降低日粮成本及养殖业节能减排的决策依据。饲料磷生物学效价的评定方法主要有体内法（in vivo）和体外法（in vitro）。体内法耗资、费力、费时，***误差和偶然误差影响因素多，不同时空条件下的测值重演性、可比性差不能满足研究和生产应用所需。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，各国营养学家都有诸多研究报道。近年来，饲料磷的体外评定技术在国际上越来越受到关注，从而推动了相关研究的快速发展，其中以Zyla等（1995）和Liu等（1997，1998）所建立的方法应用最为广泛。然而这些体外法大都以三角瓶、试管、透析管等简单实验器材为基础，由于大量的人工操作引入的***误差所得结果可重复性和精度较差。
发明内容
本发明的技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种猪饲料有效磷仿生评定法，提高了试验结果的重演性和精度。
本发明的技术解决方案如下：一种猪饲料有效磷仿生评定法，包括步骤如下：
（1）将透析袋剪成23～27cm的小段，在1.5～2.5%碳酸氢钠和pH=8.0的0.5～1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠的溶液中将透析袋煮沸10min，用蒸馏水彻底清洗透析袋后，再将透析袋放在pH=8.0的0.5～1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠的溶液中煮沸10min；待溶液冷却后4℃保存；透析袋使用前用去离子水彻底清洗；
（2）制备胃和小肠缓冲液和模拟消化液；
（3）将缓冲液放入单胃动物仿生消化***中，并把处理好的透析袋固定在所述模拟消化器上；
（4）准确称取1～2g粉碎过40目筛的饲料样品置于装有透析袋的模拟消化器中；
（5）往透析袋中加入模拟胃液；
（6）将所述的模拟消化器置于单胃动物仿生消化***中，设置胃和小肠阶段模拟消化的参数，开始进行胃阶段模拟消化；
（7）胃阶段消化结束后，用加酶器在模拟消化器中分别准确地加入碳酸氢钠及小肠液，在单胃动物仿生消化***中的继续完成小肠阶段的模拟消化；
（8）待猪饲料样品胃和小肠阶段模拟消化结束后，采用钼蓝比色法测定磷的含量。
所述步骤（2）中胃缓冲液为：pH为2.0的85～90mmol/L氯化钠和6～8mmol/L氯化钾溶液。
所述步骤（2）中小肠缓冲液为：pH为6.3～6.6的190～196mmol/L乙酸钠，97～108mmol/L氯化钠和14～16mmol/L氯化钾溶液。
所述步骤（2）中模拟胃液为：pH 2.0，738～1475 U/mL胃蛋白酶。
所述步骤（2）中模拟小肠液为：pH 6.3～6.6，57～76 U/mL胰蛋白酶、7～10 U/mL糜蛋白酶、186～264 U/mL淀粉酶。
所述步骤（2）中所使用的缓冲液和模拟消化液中消化酶的活性、缓冲液中离子浓度以及pH值均来自于大量动物实验数据，使体外模拟的条件均有体内数据佐证，从而摆脱了以往体外法选取参数的随意性。
所述步骤（6）中胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间1～2h。
所述步骤（7）中小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间5～16h。
上述步骤（6）和（7）中胃和小肠阶段模拟消化参数以体外磷消化率最大化为原则，通过反复体外试验论证，得出的最佳测定饲料有效磷的仿生消化参数。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明克服了传统体外消化法在消化过程中无法实现产物实时分离的缺陷，使用实时动态的消化产物分离技术，结合目前体外法测定有效磷的方法，通过单胃动物仿生消化***中自动控制体外消化过程，基本排除了由于人工操作引入的***误差，提高了试验结果的重演性和精度。
附图说明
图1为本发明实现的流程图；
图2为本发明单胃动物仿生消化***和模拟消化器连接示意图；其中1.为透析袋，2.为模拟消化器，3.为单胃动物仿生消化***，4.为胃缓冲液瓶，5.为小肠缓冲液瓶，6.为加酶器，7.为计算机处理***；
图3为本发明中不同饲料原料总磷透过率与无机磷透过率的比较。
具体实施方式
如图1所示，本发明具体操作方法可以如下方式实施：
（1）将透析袋剪成25cm左右的小段，在2%碳酸氢钠和pH=8.0的1mmol/L乙二胺四乙酸二钠的溶液中将透析袋煮沸10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋后，将透析袋放在pH=8.0的1mmol/L乙二胺四乙酸二钠的溶液中煮沸10min。待溶液冷却后4℃保存。透析袋使用前用去离子水彻底清洗。
（2）制备胃和小肠缓冲液和模拟消化液。
（21）胃的缓冲液：pH为2.0的85mmol/L氯化钠和6mmol/L氯化钾溶液。
（22）小肠的缓冲液：pH为6.3的190mmol/L乙酸钠，97mmol/L氯化钠和14mmol/L氯化钾溶液。
（23）模拟胃液：pH 2.0，738 U/mL胃蛋白酶溶液。
（24）模拟小肠液：pH 6.3，57 U/mL胰蛋白酶、7 U/mL糜蛋白酶、186 U/mL淀粉酶溶液。
（3）如图2所示，将步骤（21）中胃的缓冲液和步骤（22）中小肠的缓冲液分别加入到单胃动物仿生消化***3中胃缓冲液瓶4和小肠缓冲液瓶5中，把处理好的透析袋1固定在所述模拟消化器2上。
（4）准确称取1g粉碎过40目筛的饲料样品置于装有透析袋1的模拟消化器2中。
（5）往透析袋1中加入步骤（23）的模拟胃液；
（6）将所述模拟消化器2置于单胃动物仿生消化***3中，使用计算机7设置胃和小肠阶段模拟消化的参数。胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间1h。小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间5h。并开始进行胃阶段模拟消化；
（7）胃阶段消化结束后，用加酶器6在模拟消化器2中分别准确地加入2mL碳酸氢钠及步骤（24）的模拟小肠液，在单胃动物仿生消化***3中的继续完成小肠阶段的模拟消化；
（8）待猪饲料样品胃和小肠阶段模拟消化结束后，采用钼蓝比色法测定磷的含量。
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
实施例不同饲料原料总磷透过率与无机磷透过率的比较。
准确称取1g饲料样品置于装有透析袋的模拟消化器中，同时测定饲料水分含量，每种饲料称取5份样品。往透析袋中加入20mL胃液（含738 U/mL胃蛋白酶）。将模拟消化器置于单胃动物仿生消化***中，开始试验。胃阶段消化结束后，用加酶器在每个模拟消化器中分别加入2mL碳酸氢钠及2mL模拟小肠液，使小肠液中含57U/mL胰蛋白酶、7U/mL糜蛋白酶、186U/mL淀粉酶，在单胃动物仿生消化***中的继续完成小肠阶段的模拟消化。待样品消化结束后，采用钼蓝比色法测定消化残渣有机磷和透析液无机磷的含量。不同饲料原料有机磷透过率与无机磷透过率的比较如图3所示。
不同饲料原料磷的体外消化吸收形式不同，玉米和豆粕的体外无机磷的消化率显著低于麦麸（P<0.05）；玉米和豆粕的体外有机磷的消化率显著高于麦麸（P<0.05）。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于实现步骤如下：
（1）透析袋的前处理；
（2）胃和小肠缓冲液和模拟消化液的制备；
（3）将缓冲液放入单胃动物仿生消化***中，并把处理好的透析袋固定在所述模拟消化器上；
（4）准确称取饲料样品置于装有透析袋的模拟消化器中；
（5）往透析袋中加入模拟胃液；
（6）将所述模拟消化器置于单胃动物仿生消化***中，设置胃和小肠阶段模拟消化的参数，开始进行胃阶段模拟消化；
（7）胃阶段模拟消化结束后，用加酶器在模拟消化器中分别准确地加入碳酸氢钠及小肠液，在单胃动物仿生消化***中的继续完成小肠阶段的模拟消化；
（8）待饲料样品进行胃和小肠阶段模拟消化结束后，采用钼蓝比色法分别测定磷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（2）中胃缓冲液为：pH为2.0的85～90mmol/L氯化钠和6～8mmol/L氯化钾溶液。
3.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（2）中小肠缓冲液为：pH为6.3～6.6的190～196mmol/L乙酸钠，97～108mmol/L氯化钠和14～16mmol/L氯化钾溶液。
4.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（2）中模拟胃液为：pH 2.0，738～1475U/mL胃蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（2）模拟小肠液为：pH 6.3～6.6，57～76U/mL胰蛋白酶、7～10U/mL糜蛋白酶、186～264U/mL淀粉酶。
6.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（6）中胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间1～2h。
7.根据权利要求1所述的一种猪饲料有效磷仿生评定法，其特征在于：所述步骤（7）中小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，缓冲液流速120mL/min，消化时间5～16h。
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