CN102898521A - 抗β-干扰素单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗β-干扰素单克隆抗体，由由保藏号为CCTCC NO：C201121的杂交瘤细胞株产生。与β-干扰素SEQ ID No 1特异结合后，对β-干扰素具有中和作用。该抗β-干扰素单克隆抗体可用于对β-干扰素亲和层析纯化和ELISA检测。

Description

抗β-干扰素单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种抗β-干扰素单克隆抗体，该抗体能与β-干扰素功能域结合，对β-干扰素具有中和作用，及其在纯化和体外检测中的应用。

背景技术

β-干扰素(interferon-β，IFN-β)是一种分子量为20,500Dalton的I型膜糖蛋白，含有166个氨基酸。经基因工程重组制备的IFN-β的等电点为pH8.9。IFN-β对蛋白酶敏感，在pH2条件下即使用56℃处理10min仍能保持稳定。IFN-β不仅作为一种广谱的抗病毒和免疫调节剂，还具有抗肿瘤细胞生长作用。其在抗病毒方面的广谱性主要体现在如：抗DNA病毒、痘病毒、疱疹病毒、人***瘤病毒、巨细胞病毒、腺病毒、RNA病毒、正粘病毒和逆转录病毒等等。在免疫调节方面，其可以调节TH1与TH2平衡，促进B细胞产生抗体，诱导MHC I类分子和MHC II分子的表达以及增强巨噬细胞Fc受体的表达，促进巨噬细胞和NK细胞的杀伤能力。IFN-β还能抑制Daudi、WISH和K562等多种肿瘤来源的细胞增殖。

机体内的IFN-β主要由成纤维细胞产生。临床治疗所用的IFN-β主要是通过基因工程经由大肠杆菌(E.coli)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)以及酵母细胞表达获得。临床上，重组IFN-β(rIFN-β)主要用于自身免疫性疾病的治疗，如：经FDA批准的，在多发性硬化症(MS)的治疗方面取得了公认的治疗效果。IFN-β治疗MS是基于它的免疫调节作用，包括IFN-β对IFN-γ合成的抑制作用。IFN-β正尝试用于类风湿关节炎、牛皮

、糖尿病、病毒感染以及肿瘤治疗等领域，并初步显示其具有良好的应用前景。

对基因工程表达产生的IFN-β常规纯化方法是先经超滤浓缩和硫酸盐盐析，再经羧甲基交联葡聚糖(BioGel P150)层析精制，也可采用快流蓝层析柱(BlueSepharose 6Fast flow column)进行快速高效纯化。但是这些方法制得产品的纯度仍不高，

在IFN-β治疗中会使机体产生抗IFN-β抗体，这些IFN-β抗体对IFN-β具有中和作用，会导致IFN-β治疗效果降低，进而需要不断增加剂量。几乎所有的生物药物，尤其是细胞因子类药物均产生同样的问题，这给生物制药蒙上一层阴影。事实上，蛋白质类型的生物药物使用以后所产生的抗体是结合抗体，这种结合抗体可以影响生物药物的药效，也可以没有影响或影响不大，而当结合抗体具有与生物药物的功能部位结合效能时，则称为中和抗体，一旦中和抗体产生将极大影响生物药物的药效，所以制备具有中和作用的单克隆抗体，组成竞争ELISA方法用于检测患者体内的中和抗体对评判蛋白质类基因药物在体内的药效有实际意义，但目前并没有存在此种单克隆抗体。

目前市场上也尚未见有针对IFN-β功能域的ELISA检测试剂盒，所见不多的ELISA检测试剂盒中所用的抗体通常是针对整个IFN-β分子。

发明内容

针对上述缺陷，本发明的提供了一种抗β-干扰素单克隆抗体，该抗体能与β-干扰素功能域结合，对β-干扰素具有中和作用。其可用于评价β-干扰素治疗效果和体外检测。

本发明的另一个目的在于提供一种抗β-干扰素单克隆抗体在β-干扰素体外检测中的应用，从而监测IFN-β在用药期间针对IFN-β的中和抗体的产生状况，定量测定IFN-β在机体内的浓度变化和评判IFN-β治疗过程中的免疫反应及其治疗效果。

本发明的又一个目的在于提供一种抗β-干扰素单克隆抗体在β-干扰素分离纯化中的应用，该抗体能与β-干扰素功能域结合，能显著提高对β-干扰素的分离效率。IFN-β由166个氨基酸组成，其N-末端的15个氨基酸被认为是功能域，序列见SEQ ID No 1。本发明所述的抗β-干扰素单克隆抗体，其能与SEQ ID No 1专一性结合，对IFN-β具有中和作用(见表3)。

本发明的一实施方式为保藏号为CCTCC NO：C201121的杂交瘤细胞株制得的腹水型β-干扰素单克隆抗体的效价可达5×10^-6以上。

本发明的另一实施方式，单克隆抗体为属于IgG₂、IgG₁或IgG₃亚型。单克隆抗体轻链均为κ型。

本发明的另一实施方式，单克隆抗体用于β-干扰素的亲和层析。

本发明的另一方面，一种β-干扰素的ELISA检测方法，包括抗β-干扰素单克隆抗体。

本发明的另一实施方式，抗β-干扰素单克隆抗体结合或固定于酶标板。

本发明的另一实施方式，抗β-干扰素单克隆抗体上结合有标记物，所述的标记物选自于酶标记物、化学发光、同位素和荧光标记物之一。

本发明的另一方面，抗β-干扰素单克隆抗体在制备IFN-β药物中作为纯化试剂的应用。

本发明的另一方面，抗β-干扰素单克隆抗体在制备IFN-βELISA试剂盒中的应用。

杂交瘤技术为本领域技术人员制备单克隆抗体所熟知，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，使得融合细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。该技术一般包括三个步骤：(一)细胞融合和筛选；(二)培养基培养和筛选，以及(三)细胞克隆和培养。

本发明使用常用的杂交瘤技术制备抗β-干扰素单克隆抗体，包括按照常规免疫方法(如：腹腔、皮下和静脉)，在皮内注射蛋白抗原(如：人源β-干扰素)免疫哺乳动物，将免疫动物的脾细胞与同种系来源的骨髓瘤细胞融合。本发明中，使用Balb/c小鼠为免疫动物，Balb/c小鼠的SP2/0细胞为骨髓瘤细胞，然后将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，经过HAT选择性培养基选择性培养和经过3次以上反复克隆有限稀释、间接ELISA交叉性筛选以及病毒中和试验，获得4株可稳定分泌抗IFN-β功能域单抗的杂交瘤细胞株，分别为Ab-BI1(IFN-β-6F8C6C7F10)、Ab-BI2(IFN-β-6F8D6G7H2)、Ab-BI3(IFN-β-6F8C11G7B9)和AbBI4(IFN-β-8H2C7B7C5A5)，其亚型分别为IgG₂、IgG₂、IgG₁和IgG₃，轻链均为κ型，保藏于上海交通大学医学院上海市免疫学研究所，其中细胞株Ab-BI1保藏于位于中国典型培养物保藏中心，相应的保藏号为CCTCC NO：C201121。本发明的抗原来源：

(一)Rebif(Betaseron产品，Lot：NA3711A)：系经基因工程由E.coli表达产物，IFN-β含量为30μg/ml，其中含有15mg BSA作为稳定剂。

(二)AVONEX^TM(Biogen Inc产品，Lot：POO91U)：系经基因工程由中国仓鼠卵巢细胞表达产物，IFN-β含量为30μg/ml，其中含有15mg BSA作为稳定剂。

(三)IFN-β功能域抗原(Best Inter)：采用核酸抽提试剂盒从人成纤维细胞中抽提RNA，使用生命技术公司提供的第一链cDNA合成试剂中的逆转录酶，以纯化的总RNA或mRNA作模板，运用试剂盒提供的寡聚核苷酸dT引物合成cDNA。采用由Gene Bank DNA文件中查到的IFN-β功能域基因序列，以标准PCR方法从cDNA中扩增IFN-β功能域基因，通过质粒转染酵母菌，并通过抗菌培养筛选转染酵母菌进行发酵表达。表达得到的IFN-β功能域抗原(Best Inter)经亲和层析纯化、经特异性鉴定以后备用。

一种本发明所述抗β-干扰素单克隆抗体杂交瘤制备方法，包括如下步骤：

(一)动物免疫与ELISA筛选

1.动物免疫

10周龄健康雌性Balb/c小鼠2只(由上海交通大学医学院动物实验中心提供)，取商品化抗原(IFN-β，AVONEX^TM)300μg(0.3ml)，加入等量弗氏完全佐剂乳化后于小鼠腹腔、背部皮下部位免疫，每鼠每次免疫抗原总量为100μg，间隔4周加强免疫，加强免疫3-4次，再次免疫增加腹股沟肿大的***部位。融合前4天以50μg抗原溶液经无菌处理以后自尾静脉再次加强免疫。经ELISA检测抗体阳性之后处死小鼠，取脾细胞作融合用。

2.ELISA筛选

以pH 9.5，0.05mol/L碳酸盐缓冲液将IFN-β(AVONEX^TM)浓度调为400ng/ml，每孔100μl加入于酶标板反应孔内，置于4℃包被过夜，次日甩去包被上清液，用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5min，然后每孔加200μl含1％ BSA的PBS封闭液，放置室温封闭2h。倾去封闭液，同上洗涤后用透明塑封带封贴，经鉴定后放-30℃备用。以400ng/ml BSA(Sigma公司产品)与前述相同方法包被酶标板，经鉴定后放-30℃备用。同时以AVONEX^TM公司和Betaseron公司出品的IFN-β以及Sigma公司和上海市生物制品研究所出品的BSA分别包被酶联板，用于检测IFN-β阳性抗体的鉴定。

(二)细胞融合和筛选

1.细胞准备

骨髓瘤细胞制备：选用小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0(上海市免疫学研究所保种)进行扩增培养，收集对数生长期的骨髓瘤细胞，洗涤细胞，计数并调整细胞浓度为4-5×10⁵/ml，细胞悬浮于无血清1640培养液中备用。

饲养细胞制备：融合前1天取正常Balb/c小鼠，颈椎脱臼致死以后用5ml0.5％HAT-20％FCS-1640培养液注入小鼠腹腔内，轻轻挤搂腹腔以后，剖开腹膜，抽出腹腔液，离心计数腹腔巨噬细胞数量。用20％FCS(小牛血清)-1640调整细胞浓度至1×10⁵/ml，立即种到96孔培养板内，1×10⁴/0.1ml/孔。

脾细胞制备：在最后一次加强免疫后第3天，眼底静脉丛放血以后处死小鼠，取小鼠脾脏，置于无血清1640培养液中，用注射器内栓将脾脏撵碎，经尼龙网过滤制成细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清后重悬于5ml无血清1640培养液中，计数细胞浓度。

2.细胞融合

将10⁸个脾细胞悬液与10⁷个SP2/0细胞悬液(细胞数比10∶1)混合于50ml尖底离心管中，1,000rpm离心5min，倾去上清，轻弹沉降下来的细胞团块，使之完全松散。以1ml移液管吸取37℃50％PEG1ml在1min内边搅拌边加入，加完后静置90s使细胞融合，之后以37℃10ml无血清1640培养液终止融合，开始时缓慢加入(1ml/min)，而后逐渐加快，边加边搅。1,000rpm离心7min，去除上清，沉淀细胞重悬于100ml 0.5％HAT-20％FCS-1640培养液中，转入预种有饲养细胞的96孔培养板内，每孔加融合细胞0.1ml，置37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(三)阳性克隆的筛选

1.HAT培养基选择性培养

融合后的细胞在0.5％HAT-20％FCS-1640培养液中培养1-2周，定时观察细胞生长情况。一周后，在倒置显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。当有克隆出现后及时把培养液体系换成HT培养液。当克隆细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。

2.ELISA检测

以包被有IFN-β抗原ELISA检测试剂盒和包被有BSA的ELISA检测试剂盒分别对上述细胞上清液进行测定。每孔加入100μl待检杂交瘤细胞上清，于37℃孵育1.5h。倾去未结合样品，洗涤后每孔加入1∶1000(体积比)稀释的羊抗鼠IgG-HRP结合物100μl，于37℃孵育1小时。将多余的酶结合物洗去，同上洗涤。每孔加入100μl的酶底物反应液(OPD-H₂O₂)，室温显色10-30min后，每孔加入50μl的终止液(2mol/L H₂SO₄)终止。用酶标仪495nm测OD值，IFN-β包被孔A值大于阴性孔2倍以上且BSA包被孔阴性者作为阳性，及时进行克隆化培养。

(四)杂交瘤细胞的克隆化培养

采用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化。

1.克隆当天制备饲养细胞，接种96孔板内，0.1ml/孔(2×10⁴/孔)。

2.阳性细胞从培养板内轻轻冲洗下，计数。

3.用培养液连续稀释细胞悬液成10个细胞/ml和3个细胞/ml，分别接种到加有饲养细胞的96孔板内，0.1ml/孔。

4.10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。

5.测得有抗体活性的阳性细胞孔时，同上再克隆，共进行3次。

经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出4株能稳定分泌抗IFN-β的杂交瘤细胞株，分别为Ab-BI1、Ab-BI2、Ab-BI3和Ab-BI4，详见表1。

表1.细胞单克隆率以及单克隆抗体阳性率

以IFN-β(AVONEX^TM)为包被抗原，用间接ELISA法检测本发明所述的4株杂交瘤细胞制备抗IFN-β单克隆抗体，经检测未纯化腹水型抗体的效价可达5×10^-6以上，经Protein A Sepharose-4B柱层析纯化后的腹水型单克隆抗体的效价可达5×10^-7。该抗IFN-β单克隆抗体与IFN-α和IFN-γ无交叉反应，并对IFN-β具有中和作用。

本发明所述的抗IFN-β单克隆抗体能应用于IFN-β亲和层析过程中，有效提高制备IFN-β产品纯度。

以本发明所述的抗IFN-β单克隆抗体，或固定，或结合于酶标板表面用于ELISA检测，也可以在抗体上结合标记物(如：化学发光、酶标记物、同位素或荧光标记物)用于ELISA检测。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明采用IFN-β单克隆抗体亲和层析法，因其抗体与IFN-β结合的特异性，可以显著提高提取IFN-β的效率。在IFN-β治疗中会使机体产生抗IFN-β抗体，这些IFN-β抗体对IFN-β具有中和作用，会导致IFN-β治疗效果降低，进而需要不断增加剂量。采用针对IFN-β功能域且具有中和特性的IFN-β单克隆抗体而建立的竞争实验，可以快速检测经IFN-β治疗以后机体针对IFN-β的中和抗体产生状况，评价IFN-β治疗效用。采用IFN-β单克隆抗体建立的夹心ELISA方法可以定量检测机体体液中IFN-β水平，评判IFN-β在体内的药效浓度和药物生物利用度。

针对IFN-β功能域的抗体可以用于监测IFN-β应用后中和抗体产生的动态变化及其信号转导和调节机制。也可以用于监测活性IFN-β在体内留存浓度。

本发明所得的四种抗IFN-β单克隆抗体，经Protein A Sepharose-4B柱层析纯化后的腹水型单克隆抗体的效价可达5×10^-7，其与IFN-α和IFN-γ无交叉反应。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1抗IFN-β单克隆抗体的效价测定

1.腹水型抗IFN-β单克隆抗体的制备及抗体纯化

一、腹水型单克隆抗体的制备

取繁殖过的雌性Babl/c小鼠于腹腔内注射0.5ml医用液体石蜡油，7～10d后将上述经扩大培养的4株杂交瘤细胞分别注入Babl/c小鼠腹腔内，细胞注射浓度为2×10⁷cell/鼠，每一细胞株注射3只小鼠。10～14d后收集腹水，腹水产量为4～10mL/只，2000rpm离心，5min，取上清备纯化和鉴定

二、单克隆抗体的纯化

采用50％硫酸铵盐析法对腹水型单克隆抗体进行粗提，采用Protein ASepharose-4B柱对腹水型单克隆抗体进行精制(沈关心，周汝麟主编，现代免疫学实验技术，第2版，湖北科学技术出版社，1998：51)，精制抗体置-80℃保存。

2.抗IFN-β单克隆抗体的效价测定

以IFN-β(AVONEX^TM)为包被抗原，用间接ELISA法检测由4株杂交瘤制备而成的腹水型单克隆抗体效价，步骤如下：

1)用稀释缓冲液将腹水型单克隆抗体依次稀释成体积比为1∶100、1∶1,000、1∶10,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶50,000,000、1∶100,000,000，设3个复孔，共11个稀释梯度(10^-2-10^-8)。

2)以IFN-β(AVONEX^TM)包被酶标板，抗原包被浓度为1μg/ml，经检测腹水抗体效价，未纯化腹水型抗体的效价可达5×10^-6，经Protein A Sepharose-4B柱层析纯化后的腹水型单克隆抗体的效价可达5×10^-7。

实施例2IFN单克隆抗体的鉴定

一、单克隆抗体筛选和亚类鉴定的结果及效价测定

采用罗氏公司Ig亚类测定试剂盒，根据试剂盒要求对被测样本作适当稀释，检测上述4株高阳性杂交瘤细胞的培养上清中所含单克隆抗体Ig类别，鉴定结果分别为IgG₂、IgG₂、IgG₁和IgG₃，其轻链均为κ型；用间接ELISA法检测由4株杂交瘤制备而成的腹水型单克隆抗体效价，ELISA包被抗原为IFN-β(AVONEX^TM)。

间接ELISA法检测腹水型单克隆抗体效价的步骤如下：

1)用稀释缓冲液将腹水型单克隆抗体依次稀释成体积比为1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶50000、1∶100000、1∶500000、1∶1000000、1∶5000000、1∶10000000、1∶50000000、1∶100000000，设3个复孔，共11个稀释梯度(10^-2～10^-8)。

2)以IFN-β(AVONEX^TM)包被酶标板，抗原包被浓度为1μg/ml，采用间接ELISA法检测腹水抗体效价，未纯化腹水型抗体的效价可达5×10^-6，经Protein ASepharose-4B柱层析纯化后的腹水型单克隆抗体的效价可达5×10^-7。

二、单克隆抗体的特性鉴定

1、一般性质

经紫外分光比色测定蛋白浓度，腹水型单克隆抗体Ab-BI1、Ab-BI2、Ab-BI3和Ab-BI4所产生的单抗蛋白质定量分别为36.22g/L、32.71g/L、29.68g/L和32.36g/L。ELISA检测结果表明，杂交瘤细胞培养上清液和腹水中单抗均能与IFN-β(Biogen Inc和Betaseron公司产品)特异性结合，而不与BSA(Sigma和上海生物制品研究所产品)结合(表2)。

表2.阳性克隆抗IFN-β单克隆抗体特异性鉴定(A₄₉₅值)

注：A～D行为4个阳性克隆；G行为进口标准IFN-β单克隆抗体(0.5μg/ml)；H行为培养液对照；

第1列为IFN-β(Biogen Inc产品)包被；第2列为BSA(国产)包被；第3列为IFN-β(Betaseron)包被；

2、单克隆抗体特异性鉴定

采用间接ELISA方法检测抗IFN-β单克隆抗体分别与原核细胞表达的IFN-β(Rebif)、真核细胞表达的IFN-β(Best-Inter)和哺乳动物细胞表达的IFN-β(AVONEX^TM)特异性反应：以上述IFN-β分别按50ng/孔的浓度包被酶标板，分别与抗IFN-β单克隆抗体(均1∶10²体积比稀释起)于37℃反应1.5h，再与酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)于37℃反应1h。最后用OPD-H₂O₂显色。采用ELISA方法检测抗IFN-β单克隆抗体分别与IFN-βIFN-α和IFN-γ是否具有交叉反应：分别取IFN-α(上海市生物制品研究所产品)和IFN-γ(第二军医大学产品)按50ng/孔包被酶标板，分别与4株抗IFN-β单克隆抗体(均1∶40体积比稀释)于37℃作用1.5h，再与酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)于37℃作用1h。最后用OPD-H₂O₂显色。

经检测，我们所制备的抗IFN-β单克隆抗体与IFN-β具有良好的特异性结合效价，与三种不同来源IFN-β的反应其抗体效价均达到10⁶以上，AVONEX^TM最高，Best-Inter次之，Rebif相对较低。与IFN-α和IFN-γ反应A值均小于0.100，说明我们所制备的抗IFN-β单克隆抗体与IFN-α和IFN-γ无交叉反应。

3、单克隆抗体中和特性的鉴定

人IFN-β可以抵抗许多病毒感染，包括疱疹病毒-6(HHV-6)、VSV病毒等。观察IFN-β对病毒感染的抵抗能力可以评价IFN-β抗病毒活性，以抗IFN-β抗体作用IFN-β(Rebif、AVONEX^TM以及Best-Inter)，则可进一步评价抗体中和IFN-β抗病毒活性。

采用Wish细胞或Jurkat细胞按5000个细胞/100μl/孔的浓度加入到96孔细胞培养板内，然后加入连续稀释的IFN-β以及IFN-β+抗IFN-β抗体，细胞经37℃，24h培养后，用Wish细胞或HHV-6进行攻击，2d后用台盼蓝染色细胞，计算存活细胞数，观察IFN-β对细胞保护作用以及抗体对IFN-β抗病毒中和作用。

实验结果显示，IFN-β具有抵抗VSV病毒对Wish细胞的攻击作用，Ab-BI1、Ab-BI2、Ab-BI3和Ab-BI4等4株抗IFN-β单克隆抗体具有中和IFN-β抗病毒作用(表3)。

表3IFN-β对Wish细胞病毒攻击的保护和抗体阻断作用

实施例3IFN单克隆抗体的初步应用

IFN单克隆抗体用于纯化酵母菌发酵表达的IFN生物制剂

由上海市免疫学研究所构建的rhIFN-β表达载体1pPICZaIFNS1-X33，经B.BRAUN公司15L发酵罐制备重组人IFN-β，含有rhIFN-β的发酵液预经25％硫酸铵和55％硫酸铵盐析，获取rhIFN-β粗制品以后再用由Ab-BI1偶联活化的Sepharose 4B纯化，并与蓝谱层析(Blue S6FF)纯化方法进行比较。

(1)免疫亲和层析：按活化的Sepharose 4B说明书要求连接Ab-BI1，填装至内径2.5cm，柱长10cm的层析柱，柱平衡以后，取经硫酸铵粗制的rhIFN-β溶液上样，上样量为50ml，流速1ml/min，流出液反复上样2次，然后连接至Pharmacia公司的蛋白纯化***，用含15％甘油、0.15mol/L NaCl的50mmol/L、pH6.0磷酸钾缓冲液洗柱至基线为零，然后再改成蛋白洗脱液洗柱，收集于试管内，每管4ml，收集峰值蛋白溶液装于透析袋中透析、浓缩至5ml备鉴定。

(2)蓝谱亲和层析：蓝谱亲和层析柱内径×长为2.5cm×10cm，连接到Pharmacia公司的蛋白纯化***，用含15％甘油、0.15mol/L NaCl的50mmol/L、pH6.0磷酸钾缓冲液平衡，取2L发酵液用2mol/L NaOH调节pH至7.2以后上样，流速为3ml/min，流出液重复上样二次，用含15％甘油、1mol/L NaCl的20mmol/L、pH6.0磷酸钾缓冲液洗柱至基线稳定，再改用50％乙酰乙二醇洗脱IFN-β，收集至预加有2ml基础液的试管内，收集峰值蛋白段液体，透析、浓缩后备鉴定。

(3)免疫亲和层析和蓝谱亲和层析结果比较：经SDS-PAGE电泳分析，免疫亲和层析和蓝谱亲和层析样本均显示为高纯度的单一反应条带。免疫亲和层析比蓝谱亲和层析回收率高(表4)。

表4rhIFN-β纯化前后蛋白浓度的比较

实施例4IFN单克隆抗体初步用于ELISA试剂盒的制备

以免疫亲和层析得到的抗IFN-β抗体(Ab-BI1)以100～1000ng/ml的浓度按常规方法包被96孔酶联板，采用PBL BIOMEDICAL LABORATORIES(以下简称PBL)制造的IFN-β-ELISA检测试剂盒内IFN-β标准品、酶标记物、底物显色***、洗涤溶液等试剂进行实验，并同时与PBL制造的IFN-β-ELISA检测试剂盒作实验比照。标准曲线IFN-β浓度范围为5000～10000pg/ml。检验以我们获得的抗IFN-β抗体包被96孔酶联板取代PBL IFN-β-ELISA检测试剂盒包被板的试验效果，证实我们制造的抗IFN-β单克隆抗体可用于制备IFN-β-ELISA检测试剂盒。实验显示，由Ab-BI1包被浓度800ng/ml时，IFN-β标准抗原浓度为9000pg/ml时，其A450值可以达到1.70以上，可以满足临床实验室检验要求。实验结果见表5。

表5Ab-BI1包被板与PBL检测效果比较

序列表

<110>抗β-干扰素单克隆抗体及其应用

<120>上海市免疫学研究所

<130>LBJ.HF.9011

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>32

<212>PRT

<213>HLA-DW4+gp110偶联肽

<400>1

Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1                 5                 10                  15

Claims (10)

1.一种抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体与β-干扰素SEQ ID No 1特异结合。

2.一种抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201121的杂交瘤细胞株产生。

3.根据权利要求2所述的抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CCTCC NO：C201121的杂交瘤细胞株制得的腹水型β-干扰素单克隆抗体的效价可达5×10^-6以上。

4.根据权利要求1或2所述的抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体为属于IgG₂、IgG₁或IgG₃亚型。

5.根据权利要求1或2所述的抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体轻链均为κ型。

6.根据权利要求1或2所述的抗β-干扰素单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体用于β-干扰素的亲和层析。

7.一种β-干扰素的ELISA检测方法，包括权利要求1或2所述的抗β-干扰素单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的β-干扰素的ELISA检测方法，其特征在于所述的抗β-干扰素单克隆抗体结合或固定于酶标板。

9.根据权利要求7所述的β-干扰素的ELISA检测方法，其特征在于所述的抗β-干扰素单克隆抗体上结合有标记物，所述的标记物选自于酶标记物、化学发光、同位素和荧光标记物之一。

10.根据权利要求1或2所述的抗β-干扰素单克隆抗体在制备IFN-βELISA试剂盒中的应用。