CN102892289B - 包含单萜的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于纯化纯度大于约98.5％(w/w)的单萜或倍半萜烯的方法。所述方法包括衍生化单萜(或倍半萜烯)以产生单萜(或倍半萜烯)衍生物、分离所述单萜(或倍半萜烯)衍生物和从衍生物中释放所述单萜(或倍半萜烯)的步骤。包含纯度大于约98.5％(w/w)的单萜(或倍半萜烯)的药物组合物也包括在本发明的范围中。所述纯化的单萜可用于治疗疾病例如癌症。本发明的单萜(或倍半萜烯)可以单独施用，或可以与放疗法或其它治疗剂例如化疗剂联合施用。

Description

包含单萜的药物组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年3月3日提交的美国临时申请第61/310,231号的权益。
发明领域
本发明涉及单萜或倍半萜烯组合物。特别地，本发明涉及使用纯度大于约98.5％(w/w)的单萜(例如(S)-紫苏醇)或倍半萜烯治疗神经***肿瘤。
发明背景
恶性神经胶质瘤，中枢神经***(CNS)癌症的最常见形式，当前被认为是基本上不能治愈的。在各种恶性神经胶质瘤之中，间变性星形细胞瘤(III级)和多形性胶质母细胞瘤(GBM；IV级)具有特别差的预后，这是由于它们的侵略性生长和对当前可用治疗的抗性。恶性神经胶质瘤的现有标准化治疗由外科手术、电离放疗法和化疗法组成。不管医学上的最新进展，过去的50年在恶性神经胶质瘤的预后上并未看到任何明显改善。Wen等Malignantgliomas in adults.New England J Med.359：492-507，2008。Stupp等Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide forglioblastoma.New England J Med.352：987-996，2005。
恶性神经胶质瘤差的预后的主要原因是难以向大脑递送足够量的化疗剂。通向大脑的药物通道受到血脑屏障(BBB)的限制。最终到达大脑的药物浓度被肝首过代谢和尿***进一步地降低。因此，经常需要侵入性外科手术，例如肿瘤切除术、立体定向注射抗肿瘤药物、或放置对流增强药物递送的导管。
药物的鼻内递送提供了新的绕过血脑屏障并直接向CNS快速递送药物试剂的非侵入性疗法。鼻内施用的药物在几分钟内到达脑的实质组织、脊髓和/或脑脊髓液(CSF)。除通过嗅束和三叉神经递送之外，在动物研究中出现了治疗药物也通过鼻腔脉管***地递送。Hashizume等的New therapeutic approach for brain tumors：intranasal delivery of telomerase inhibitor GRN163.Neuro-oncology10：112-120，2008。Thorne等的Delivery of insulin-like growthfactor-1 to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminalpathways following intranasal administration.Neuroscience 127：481-496，2004。治疗剂的鼻内递送可以提供用于治疗其它类型癌症例如肺癌、***癌、***癌、造血***癌症和卵巢癌等的***方法。
紫苏醇(POH)，天然存在的单萜，已经被认为是抗各种癌症的有效试剂，所述癌症包括CNS癌症、***癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤和结肠癌。Gould，M.的Cancer chemoprevention and therapyby monoterpenes.Environ Health Perspect.1997 June；105(Suppl 4)：977-979。口服的紫苏醇已经被用于国家癌症研究所主办的最近的I期实验。虽然口服的紫苏醇不会引起严重的不良反应，但它通常耐受性很差，主要因为胃肠道副作用。此外，它的抗癌症效力是有限的。因此，口服紫苏醇的使用被终止了。Ripple等的Phase I clinicaland pharmacokinetic study of perillyl alcohol administered four timesa day.Clinical Cancer Res 6：390-6，2000。
为了最小化口服POH的胃肠道副作用和提供直接向中枢神经***递送POH的方法，巴西弗罗米嫩塞(Fluminese)大学的ClovisFonseca博士研究了一种用于向恶性脑肿瘤直接鼻内递送POH的POH鼻用制剂(见下文)。Da Fonseca等的Anaplasticoligodendroglioma responding favorably to intranasal delivery ofperillyl alcohol：a case report and literature review，Surgical  Neurology(2006)66：611-615。这种与溶剂鸡尾酒相混合的商品级POH制剂已经递送给150位具有复发性恶性神经胶质瘤的患者，其具有最少的副作用和六个月50％的无疾病进展存活率。DaFonseca等的Correlation of tumor topography and peritumoral edemaof recurrent malignant gliomas with therapeutic response to intranasaladministration of perillyl alcohol.Invest New Drugs 2009，Jan 13。
纯度为85％至96％的商品级紫苏醇通常是由天然产物纯化的，或通过合成修饰天然产物例如β-蒎烯(从松树中提取的)。不可避免地，通过这些途径得到的紫苏醇被其异构体和其他杂质污染，所述异构体和其他杂质具有类似的物理化学性质，以及因此极其难以通过常规纯化方法例如分馏或色谱法从紫苏醇中去除。紫苏醇的异构体和其他杂质可能对紫苏醇的期望治疗特性是潜在抑制的。
因此，仍然存在制备高纯度紫苏醇和在CNS癌症例如恶性神经胶质瘤以及其它侵袭性脑肿瘤的治疗中使用这种材料的需要。纯化的紫苏醇可以单独或与其它治疗方法包括放疗法、标准化疗法和外科手术联合施用。还可以通过包括鼻内、口服、用于肺递送的口腔气管和经皮的各种途径施用。
发明简述
本发明提供一种纯化(S)-紫苏醇的方法，其包括下述步骤：(a)衍生化包含(S)-紫苏醇的混合物以形成紫苏醇衍生物，其中所述紫苏醇衍生物具有至少一种允许它从所述混合物中分离出来的特性；(b)利用所述用于分离的特性从混合物中分离所述紫苏醇衍生物；(c)从来自步骤(b)的所述紫苏醇衍生物中释放出所述(S)-紫苏醇；和，(d)离析来自步骤(c)的所述(S)-紫苏醇。所述(S)-紫苏醇具有大于约98.5％(w/w)，大于约99.0％(w/w)，或大于约99.5％(w/w)的纯度。在某些实施方案中，所述混合物进一步包含天然产物衍生的或其它的杂质。紫苏醇衍生物的所述特性可以是形成结晶，因此步骤(b)的分离可以是通过结晶。步骤(b)的分离也可以是通过色谱法。所述紫苏醇衍生物可以是紫苏醇酯。在一个实施方案中，所述紫苏醇酯是苯甲酸酯，例如3，5-二硝基苯甲酸酯。
本发明还包括(S)-紫苏醇，其中(S)-紫苏醇具有大于约98.5％(w/w)，或大于约99.0％(w/w)，或大于约99.5％(w/w)的纯度。
本发明进一步提供包含纯度大于约98.5％(w/w)的(S)-紫苏醇的药物组合物。所述(S)-紫苏醇可以具有大于约98.5％(w/w)的纯度。所述药物组合物可以含有从约0.1％(w/w)到约100％(w/w)的(S)-紫苏醇。此外，所述药物组合物可以包含化疗剂，以及至少一种药物学上可接受的赋形剂。所述化疗剂可以是DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、酶抑制剂、受体拮抗剂、治疗性抗体或疫苗。在某些实施方案中，所述化疗剂是二甲基-塞来昔布(DMC)、伊立替康(CPT-11)、替莫唑胺或咯利普兰。所述药物组合物可以单独施用，或在放疗法之前、期间或之后或化疗剂施用之前、期间或之后施用。施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下和肌肉注射。所述药物组合物可以通过鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、定量吸入器(MDI)、压力定量吸入器、吹药器、鼻内吸入器、鼻腔喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶或双向装置来鼻内施用。所述药物组合物可以以凝胶、膏剂、鼻腔乳剂、洗剂、乳膏剂、鼻棉塞或生物粘附条的形式来鼻内施用。
本发明进一步提供治疗癌症的方法，其包括向哺乳动物递送治疗有效量的纯度大于约98.5％(w/w)的(S)-紫苏醇的步骤。所述(S)-紫苏醇可以与治疗剂例如化疗剂混合或共配制。所述癌症可以是神经***的肿瘤，例如胶质母细胞瘤或其它肿瘤。
本发明提供一种制品(例如试剂盒)，其包含为鼻内施用而配制的(S)-紫苏醇和用于鼻内施用(S)-紫苏醇的装置，其中所述(S)-紫苏醇具有大于约98.5％(w/w)的纯度。所述装置可以是鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、定量吸入器(MDI)、压力定量吸入器、吹药器、鼻内吸入器、鼻腔喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶或双向装置。所述制品可以进一步包含阐明(S)-紫苏醇是用来治疗癌症例如胶质母细胞瘤的印刷品。所述印刷品可以进一步阐明所述(S)-紫苏醇将单独施用，或与放疗法、外科手术或化疗剂联合施用。
还提供了一种抑制细胞生长的方法，其包括用有效量的纯度大于约98.5％(w/w)的(S)-紫苏醇接触所述细胞的步骤。所述接触可以在体外或体内发生。所述细胞可以是神经胶质瘤细胞、脑膜瘤细胞、垂体腺瘤细胞、肺癌细胞、***癌细胞、***癌细胞、造血癌细胞、黑素瘤细胞、或卵巢癌细胞。所述细胞可以是抗替莫唑胺的细胞或癌症干细胞。
本发明的组合物和方法可用来降低或抑制血管生成。本发明组合物和方法可以降低或抑制促血管生成细胞因子的产生，所述促血管生成细胞因子包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL8)。
本发明的组合物和方法可用来增加细胞旁通透性，例如内皮细胞或上皮细胞的细胞旁通透性。本发明的组合物和方法可用来增加血脑屏障通透性。
附图说明
图1显示光学显微图像，表明用纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇(以下称为“纯化POH”或“纯化(S)-紫苏醇”)以及购买自Sigma Chemicals的纯度约96％的(S)-紫苏醇处理后的人恶性神经胶质瘤细胞A172的形态变化。与来自Sigma Chemicals的商业(S)-紫苏醇(图1A和1B)相比，在用纯化(S)-紫苏醇处理后的A172神经胶质瘤细胞中(图1C)观察到增加的细胞毒性。
图2显示用纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇较之来自SigmaChemicals的纯度约96％的商品级(S)-紫苏醇在人恶性神经胶质瘤细胞U87上进行的MTT细胞毒性试验的结果。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的细胞用作对照。纯化(S)-紫苏醇与Sigma(S)-紫苏醇之间在细胞毒性效果上的差别比在(S)-紫苏醇纯度上的差别大得多。参见以下实施例的详述。
图3A显示MTT细胞毒性试验的结果，表明纯化POH杀死U251、U87、LN299和A172人神经胶质瘤细胞的效力。
图3B显示MTT细胞毒性试验的结果，表明纯化POH杀死U251人神经胶质瘤细胞(对替莫唑胺敏感的)和U251抗替莫唑胺细胞的效力。U251/TR1和U251/TR2是指两种抗替莫唑胺的U251细胞系。
图3C显示在U251人神经胶质瘤细胞(对替莫唑胺敏感的)和U251抗替莫唑胺的细胞(U251/TR1)上进行的集落形成试验的结果。
图4A和4B显示在用纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇单独处理、仅放疗法处理、或纯化(S)-紫苏醇加放疗法处理的A172(图4A)、U251人恶性神经胶质瘤细胞和B16-F1黑素瘤细胞(图4B)上进行的集落形成试验的结果。在全部三条细胞系中，纯化(S)-紫苏醇加放疗法联合获得了协同的细胞毒性。
图5A显示MTT细胞毒性试验的结果，表明DMC或与纯化POH联合的DMC杀死U251、LN229和U87人神经胶质瘤细胞中的效力。
图5B显示MTT细胞毒性试验的结果，表明奈非那韦(NFV)或与纯化POH联合的NFV杀死U251人神经胶质瘤细胞的效力。
图5C显示MTT细胞毒性试验的结果，表明TMZ或与纯化POH联合的TMZ杀死U251人神经胶质瘤细胞的效力。
图6显示用纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇处理后的A172、A375、U251人恶性神经胶质瘤细胞和B16-F1黑素瘤细胞的碘化丙啶(PI)染色法结果，表明(S)-紫苏醇增加细胞旁通透性。
图7A显示测定跨膜电阻(TEER)以确定细胞旁通透性的实验方案。
图7B显示(S)-紫苏醇降低了TEER，对应于增加了细胞旁通透性。在这些实验中，脑内皮细胞(BEC)用作血脑屏障的体外模型。每组中TEER随着时间的增加对应于培养中细胞的饱和度(confluency)的增加。与仅有介质相比，当用0.03％POH处理、0.01％POH处理和0.02％POH处理细胞20小时时TEER降低了。
图8显示(S)-紫苏醇增加了上皮细胞的细胞旁通透性。采用不同浓度的纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇过夜处理Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)的单层上皮细胞。然后将荧光素标记抗体加入到所述细胞。再根据荧光测定穿过所述细胞单层的标记抗体的量。
图9显示ELISA试验的结果，表明POH处理降低U87人神经胶质瘤细胞中细胞因子IL-8(图9A)和VEGF的分泌(图9B)。用POH处理细胞48小时之后进行ELISA。
图10显示表明POH诱导内质网(ER)应激的蛋白质印迹结果。POH上调了U251、U87和A172人神经胶质瘤细胞中ER应激标记物葡萄糖调控蛋白78(GRP78)和细胞凋亡标记物CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)的水平。对不同的蛋白质印迹通路的处理如下：1：未处理；2：0.5mM纯化POH；3：1.5mM纯化POH；4：0.5mM Sigma POH；5：1.5mM Sigma POH；6：0.5mM Wako POH；7：1.5mM Wako POH；8：阳性对照(DMC 40uM)。Sigma POH是购买自Sigma Chemicals的POH。Wako POH是购买自SigmaChemicals的POH。在细胞溶解之前，采用不同的试剂处理或模拟处理细胞20小时。
图11显示用Sigma POH(1.5mM；“S”)、纯化(S)-紫苏醇(1.5mM；“G”)处理TMZ敏感的U251和抗TMZ(U251/TR1，U251/TR2)的细胞20小时或未处理(对照；“C”)之后进行的蛋白质印迹。所述结果表明葡萄糖-调节蛋白78(GRP-78)和细胞凋亡标记物CHOP的水平增加，其显示处理之后内质网(ER)应激增强。Sigma POH是购买自Sigma Chemicals的POH。
图12显示U251神经胶质瘤细胞用Sigma POH或纯化POH处理24小时之后进行的蛋白质印迹。所述结果表明POH处理降低了K-Ras和H-Ras的表达。
图13显示MTT细胞毒性试验的结果，表明POH杀死USC-02胶质母细胞瘤癌症干细胞系的效力。所述癌症干细胞比神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)或正常干细胞(mSVZ：小鼠SVZ干/祖细胞)对POH更敏感。
图14显示MTT细胞毒性试验的结果，表明神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)比正常脑细胞(脑内皮细胞(BEC)和星形胶质细胞)对POH更敏感。
图15A显示MTT细胞毒性试验的结果，表明癌症干细胞USC-04比神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)对POH更敏感。
图15B显示MTT细胞毒性试验的结果，表明癌症干细胞USC-04比神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)对DMC更具抗性。维拉帕米(Verapamil)用作药物外排泵蛋白例如P-糖蛋白的抑制剂。所述结果表明癌症干细胞的DMC抗性不是因为通过P-糖蛋白的药物外排。
图16显示球形成试验(SFA)的结果，表明POH降低胶质母细胞瘤癌症干细胞(USC04)中形成球的数量。采用不同浓度的POH(0-1.5mM)培育USC04细胞6天。
图17显示POH降低胶质母细胞瘤癌症干细胞中H-ras的产生。用POH处理两种胶质母细胞瘤癌症干细胞系(USC-02，USC-04)24小时。USC-02和USC-04是两种从来自两位不同患者的胶质母细胞瘤组织中分离出的独立的原发癌症干细胞系。
图18显示在不同细胞系上的POH IC50值的对比。在这些测试的细胞系之中，癌症干细胞(USC-02细胞)对POH最敏感。正常细胞包括正常干细胞mSVZ(小鼠SVZ干细胞)、脑内皮细胞(BEC)和星形胶质细胞，对POH最有抗性。
发明详述
本发明提供从紫苏醇异构体(包括对映异构体)及其它杂质中纯化紫苏醇的方法，所述紫苏醇异构体(包括对映异构体)及其它杂质通常在由天然产物和/或合成来源生产紫苏醇时就伴随着紫苏醇。紫苏醇可以通过衍生化紫苏醇以产生结晶衍生物例如它的3，5-二硝基苯甲酸酯来纯化。然后通过适合的技术例如常规结晶或制备型色谱法，可将所述紫苏醇衍生物从其伴随的污染物(无论所述污染物是否也以衍生物存在或不以衍生物存在)中分离。然后所述纯化的紫苏醇衍生物能够转化成纯度大于约98.5％(w/w)的紫苏醇。所述纯化紫苏醇可以单独向受试者施用，或可以与其它试剂一起共同施用。例如，所述纯化紫苏醇可用来使癌症患者对放疗法或化疗法敏感。与可商购的(S)-紫苏醇相比，所述纯化(S)-紫苏醇显示在细胞试验及其他治疗试验模型中不成比例增强的活性。
本发明提供制备单萜或倍半萜烯的纯化形式的方法。所述单萜(或倍半萜烯)通过下述步骤纯化：(a)衍生化包含单萜(或倍半萜烯)的混合物以形成单萜(或倍半萜烯)衍生物，其中所述单萜(或倍半萜烯)衍生物具有至少一种允许其从所述混合物中分离出的特性；(b)利用所述用于分离的特性从混合物中分离出单萜(或倍半萜烯)衍生物；(c)从来自步骤(b)的单萜(或倍半萜烯)衍生物中释放单萜(或倍半萜烯)；和，(d)离析来自步骤(c)的单萜(或倍半萜烯)。所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以具有大于约98.5％(w/w)、约99.0％(w/w)或约99.5％(w/w)的纯度。在某些实施方案中，所述混合物进一步包含天然产物衍生的或其它的杂质。
单萜(或倍半萜烯)衍生物的所述特性可以是形成结晶，因而步骤(b)中的分离可以是通过结晶。所述单萜(或倍半萜烯)通过下述步骤纯化：(a)衍生化单萜(或倍半萜烯)以形成单萜(或倍半萜烯)衍生物；(b)使单萜(或倍半萜烯)衍生物结晶；(c)分离步骤(b)的单萜(或倍半萜烯)衍生物晶体；(d)将分离的单萜(或倍半萜烯)衍生物转化为单萜(或倍半萜烯)；和(e)离析单萜(或倍半萜烯)。
从混合物中分离单萜(或倍半萜烯)衍生物还可以通过现有技术已知的其它适合的分离技术，包括但不限于，色谱法、吸附、离心、倾析、蒸馏、电泳、蒸发、萃取、浮选、过滤、沉淀、沉降。***-分离方法。于2010年2月11日检索，来源于URL：http://en.wikipedia.org/wiki/Separation_of_mixtures。用于从混合物中分离所述衍生物的单萜(或倍半萜烯)衍生物的所述特性，可以是其与混合物中其他组分的物理化学特性不同的任何物理化学特性。所述物理化学特性包括，但不限于，溶解性、极性、分配系数、亲合力、粒径、水力直径和电荷。可以制备单萜(或倍半萜烯)衍生物，其中所述衍生物具有至少一种与它的异构体、结构变异体或存在于原材料中的污染物的特性不同的特性。色谱法可以是任何适合的制备型色谱法，包括但不限于，气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)、亲合色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和反相色谱法。
在一个实施方案中，单萜可以是(S)-紫苏醇，以及所述衍生化反应可以包括酯化。例如，(S)-紫苏醇可以采用3，5-二硝基苯甲酸酯衍生物制备。
本发明进一步提供纯度大于约98.5％(w/w)、大于约99.0％(w/w)或大于约99.5％(w/w)的单萜(或倍半萜烯)组合物。
所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以配制成药物组合物，其中所述单萜(或倍半萜烯)以约0.01％(w/w)至约100％(w/w)、约0.1％(w/w)至约80％(w/w)、约1％(w/w)至约70％(w/w)、约10％(w/w)至约60％(w/w)或约0.1％(w/w)至约20％(w/w)的量存在。此外，所述药物组合物可以含有治疗剂，例如化疗剂。所述治疗剂可以溶于紫苏醇。所述组合物可以单独施用，或可以与放疗法或其他药物(例如化疗剂)一起共同施用，以治疗疾病例如癌症。在其它试剂施用之前或之后施用单萜(或倍半萜烯)的治疗可以是顺序的。或者，试剂可以同时施用。施用途径可以变化，可以包括吸入、鼻内、口服、经皮、静脉内、皮下或肌内注射。
本发明还提供治疗疾病例如癌症的方法，其包括向患者递送治疗有效量的通过本发明方法制备的纯化单萜(或倍半萜烯)的步骤。
本发明组合物可以含有一种或多种类型的单萜(或倍半萜烯)。单萜包括由两个异戊二烯单元组成并且分子式为C10H16的萜烯。单萜可以是线性的(非环的)或含有环的。通过生物化学改性例如单萜氧化或重排产生的类单萜、单萜或类单萜的药学上可接受的盐，也包括在本发明中。单萜和类单萜的例子包括紫苏醇(S(-)和R(+))、焦磷酸香叶酯、罗勒烯、月桂烯、香叶醇、柠檬醛、香茅醇、香茅醛、芳樟醇、蒎烯、萜品醇、萜品烯、柠檬烯、松油烯、水芹烯、萜品油烯、松油烯-4-醇(或茶树油)、蒎烯、萜品醇、萜品烯；诸如p-伞花烃的类萜，其源自于单环萜诸如薄荷醇、百里香酚和香芹酚；双环类单萜诸如樟脑、冰片和桉树脑。
单萜可以是通过碳骨架结构来区分，且可以被分为非环的单萜(例如月桂烯、(Z)-和(E)-罗勒烯、芳樟醇、香叶醇、橙花醇、香茅醇、月桂烯醇、香叶醛、柠檬醛a、橙花醛、柠檬醛b、香茅醛等)、单环单萜(例如柠檬烯、松油烯、水芹烯、萜品油烯、薄荷醇、香芹醇等)、双环单萜(例如蒎烯、桃金娘烯醇、桃金娘烯醛、马鞭草烷醇、马鞭烷酮、松香芹醇、蒈烯、桧烯、莰烯、侧柏烯等)和三环单萜(例如三环萜)。参见Encyclopedia of Chemical  Technology，Fourth Edition，Volume 23，page 834-835。
本发明的倍半萜烯包括由三个异戊二烯单元组成并且分子式为C15H24的萜烯。倍半萜烯可以是线性的(非环的)或含有环的。通过生物化学的改性诸如倍半萜烯的氧化或重排产生的类倍半萜，也包括在本发明中。倍半萜烯的例子包括法尼醇、法尼醛、法尼酸(farnesylic acid)和橙花叔醇。
纯化的单萜(或倍半萜烯)采用衍生的单萜(或倍半萜烯)制备，其可以通过结晶从其伴随的污染物(例如其异构体)中分离。结晶和纯化还可以提高单萜(或倍半萜烯)的手性纯度。
单萜(或倍半萜烯)的衍生物包括，但不限于，单萜(或倍半萜烯)的酯、醇、醛和酮。单萜(倍半萜烯)醇可以被衍生成酯、醛或酸。单萜(或倍半萜烯)的衍生物可以通过本领域技术人员已知的化学反应来再生所述单萜(或倍半萜烯)。例如，单萜(或倍半萜烯)的酯可以水解来生成单萜(或倍半萜烯)。
在一个实施方案中，单萜(或倍半萜烯)采用单萜(或倍半萜烯)的酯纯化。所述纯化方法包括下述步骤：(a)衍生化单萜(或倍半萜烯)以产生单萜(或倍半萜烯)的酯；(b)使单萜(或倍半萜烯)的酯结晶；(c)分离步骤(b)的单萜(或倍半萜烯)的酯的晶体；(d)将单萜(或倍半萜烯)的酯转化为单萜(或倍半萜烯)；和(e)离析单萜(或倍半萜烯)。
本发明的单萜(或倍半萜烯)醇的酯可以由无机酸或有机酸衍生得到。无机酸包括，但不限于，磷酸、硫酸和硝酸。有机酸包括，但不限于羧酸例如苯甲酸、脂肪酸、乙酸和丙酸。单萜(或倍半萜烯)醇的酯的例子包括，但不限于，羧酸酯(例如苯甲酸酯、脂肪酸酯(例如棕榈酸酯和亚油酸酯)、乙酸酯、丙酸酯(或丙酸甲酯)和甲酸酯)、磷酸酯、硫酸酯和氨基甲酸酯(例如N，N-二甲氨基碳酰)。***-酯。由URL：http://en.wikipedia.org/wiki/Ester检索到。
在一个实施方案中，所述衍生物是苯甲酸酯，包括，但不限于3，5-二硝基苯甲酸酯、4-硝基苯甲酸酯、3-硝基苯甲酸酯、4-氯苯甲酸酯、3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯和4-甲氧基苯甲酸酯、羟基苯甲酸的酯诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、己基、庚基和苄基的酯。(参见，例如***-苯甲酸酯，http://commons.wikimedia.Org/wiki/Category：Benzoate_esters)。
可用于本发明的单萜的具体例子是紫苏醇(通常缩写为POH)。本发明的紫苏醇组合物可以含有(S)-紫苏醇、(R)-紫苏醇、或(S)-紫苏醇和(R)-紫苏醇的混合物。
紫苏醇可以通过下述步骤纯化：(a)衍生化包含紫苏醇的混合物以形成紫苏醇衍生物，其中所述紫苏醇衍生物具有至少一种允许它从所述混合物中分离出的特性；(b)利用所述用于分离的特性从混合物中分离出所述紫苏醇衍生物；(c)从来自步骤(b)的所述紫苏醇衍生物中释放出紫苏醇；和(d)离析来自步骤(c)的所述紫苏醇。在某些实施方案中，所述混合物进一步包含天然产物衍生的或其它的杂质。
紫苏醇可以利用本发明的方法用紫苏醇衍生物纯化。所述衍生物包括紫苏醇酯、紫苏醛(perillic aldehyde)、二氢紫苏酸(dihydroperillic acid)和紫苏酸。紫苏醇的衍生物还可以包括它的氧化的和亲核/亲电加成的衍生物。美国专利公开第20090031455号；美国专利第6,133,324号和第3,957,856号。化学文献(CASScifinder search output file，retrieved January 25，2010)中已报道了紫苏醇的衍生物的许多例子。
在一个具体的例子中，紫苏醇通过下述步骤纯化：(a)衍生化紫苏醇以产生紫苏醇酯；(b)使所述紫苏醇酯结晶；(c)(例如从母液中)分离步骤(b)的紫苏醇酯晶体；(d)转化分离的紫苏醇酯以生成紫苏醇；和(e)离析紫苏醇。紫苏醇的衍生物可用于通过本领域技术人员已知的化学反应再生紫苏醇。例如，紫苏醇的酯诸如3，5-二硝基苯甲酸酯，可以水解生成紫苏醇。
在某些实施方案中，紫苏醇的酯或醚可以通过使紫苏醇与酰基氯或烷基氯反应来制备，所述酰基氯或烷基氯的化学结构显示如下。
对于所述酯化反应，紫苏醇对酰基氯(或烷基氯)的摩尔比率可以为约1∶1至约1∶2，约1∶1至约1∶1.5，包括例如约1∶1.05、约1∶1.1、约1∶1.2、约1∶1.3或约1∶1.4。适合的反应溶剂包括，但不限于，二氯甲烷、二***、二异丙醚和甲基叔丁基醚。所述反应可以在约-5℃至约50℃或约-5℃至25℃的温度下进行。可包括在所述反应中的适合的碱可以包括但不限于有机碱，例如三乙胺、双-异丙胺、N，N’-二异丙基乙胺、丁胺、甲醇钠、甲醇钾和叔丁醇钾。因此，生成的酯是3，5-二硝基苯甲酸酯、4-硝基苯甲酸酯、3-硝基苯甲酸酯、4-氯苯甲酸酯、3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯、4-甲氧基苯甲酸酯和三苯甲基酯。所述化学反应的细节描述于以下实施例中。
可结晶的单萜(或倍半萜烯)衍生物可以通过结晶或制备型色谱法纯化。通过冷却原料流或添加降低期望产物的溶解度以使其形成晶体的沉淀剂，经常以极其纯净的形式从液态原料流中结晶分离产物。为了发生结晶，溶液必须是过饱和的。这是指所述溶液必须含有比它在平衡(饱和溶液)条件下将含有的溶质实体更多的溶解的溶质实体。这可以通过多种方法实现，例如1)溶液冷却；2)加入第二种溶剂以降低溶质的溶解度(被称为反溶剂或赶出(drown-out)的技术)；3)化学反应；和4)pH的改变。也可以使用溶剂蒸发、球形结晶、分级结晶、分级冻结过程和其它适合的方法。Mersmann，A.的Crystallization Technology Handbook.Edition2(2001)，由CRC出版社出版。Myerson等的Crystallization As a  Separations Process(ACS Symposium Series)(1990)，由AmericanChemical Society出版。
在一个具体的例子中，紫苏醇的3，5-二硝基苯甲酸酯的结晶如下进行。用二氯甲烷萃取含有3，5-二硝基苯甲酸酯的水层，并用水洗涤。通过硫酸钠干燥含有3，5-二硝基苯甲酸酯的有机层。然后过滤并浓缩所述有机层。所得残余物最终从二异丙醚母液中结晶出来。母液是结晶固体上面的液体部分，因而能够与晶体分离。从母液中分离晶体可以利用任何适合的技术进行，所述技术包括但不限于过滤(有或没有压力和/或真空的辅助)、离心和倾析。
用于紫苏醇的苯甲酸酯结晶的适合溶剂包括，但不限于，酮溶剂(诸如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、正丁酮和叔丁基酮)；腈溶剂(诸如乙腈和丙腈)；卤化溶剂(诸如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷和氯仿)；酯(诸如乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯和乙酸叔丁酯)；醚(诸如二***、二异丙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃和1，4-二噁烷)；烃溶剂(诸如己烷、环己烷、甲苯和二甲苯)；以及其混合物。在一个实施方案中，溶剂含有甲基叔丁基醚。如果需要，苯甲酸酯在甲基叔丁基醚(7-10倍体积)中的溶解可以在高温下进行以达到期望的浓度。进一步地，可以进行活性炭处理以从含有苯甲酸酯的溶液中去除有色杂质，或减少重金属含量(如果存在)，或去除任何杂质。从生成的反应混合物中结晶可以通过将所述反应混合物冷却到约25℃至约0℃的较低温度来进行。晶体的分离可以通过去除溶剂然后冷却反应混合物来进行。溶剂可以通过适合的技术去除，所述技术包括利用旋转蒸发器诸如Buchi旋转蒸发仪在真空下蒸发。晶体可以通过任何常规技术诸如通过重力或吸力过滤来从反应混合物中离析。在一个实施方案中，苯甲酸酯可以通过过滤来离析，和如果需要时，可以进一步用溶剂洗涤。苯甲酸酯可以通过任何常规技术诸如在盘式干燥器、真空干燥器或空气烘箱中来干燥。干燥可以在约30℃至约60℃的温度下在真空烘箱中进行。
因此，可结晶的单萜(或倍半萜烯)衍生物的纯度和单萜(或倍半萜烯)的纯度可以进一步通过重结晶来提高。可以使用各种技术，诸如单溶剂重结晶、多溶剂重结晶、热过滤重结晶，以及现有技术中众所周知的其它适合的重结晶技术。***-重结晶，由URL：http:/en.wikipedia.org/wiki/Recrystallization(chemistry)检索到。
例如，美国专利第Re.32,241号描述了一种仪器，其使组分在含有所述组分的材料向下流到那里时在冷却表面上结晶。美国专利第4,666,456号描述了化合物从液体混合物中连续部分结晶，其中所述混合物经由冷却区级联进料。美国专利第5,127,921号提供了一种多阶段重结晶过程，其包括通过调节晶体和母液回流原料的量来控制回流比条件。
紫苏醇的纯度可以大于约98.5％(w/w)，大于约99％(w/w)，大于约99.5％(w/w)，或大于约99.9％(w/w)。
在某些实施方案中，本发明的化合物含有一个或多个手性中心。术语“纯度”还可以包括手性纯度。单萜(或倍半萜烯)的立体异构体的纯度是指所述立体异构体的化学纯度和/或手性纯度。例如，(S)-紫苏醇的纯度可以同时包括(S)-紫苏醇的化学纯度和手性纯度。单萜(或倍半萜烯)立体异构体的手性纯度可以大于约98.5％(w/w)，大于约99％(w/w)，大于约99.5％(w/w)，或大于约99.9％(w/w)。
(S)-紫苏醇的手性纯度可以大于约98.5％(w/w)，大于约99％(w/w)，大于约99.5％(w/w)，或大于约99.9％(w/w)。在某些实施方案中，本发明的(S)-紫苏醇的比旋光度可以为-87.95°至-91.9°，所述比旋光度在22℃下，样品在甲醇中的浓度为1g/ml的条件下测定((S)-紫苏醇的比旋光度的例子参见表1)。
表1根据旋光度评估的紫苏醇样品的手性纯度
单萜(或倍半萜烯)的纯度可以通过气相色谱法(GC)或高压液相色谱法(HPLC)来分析。用于分析单萜(或倍半萜烯)的纯度和确定杂质存在的其它技术包括，但不限于，核磁共振(NMR)谱、质谱法(MS)、GC-MS、红外光谱(IR)和薄层色谱(TLC)。WHOSpecifications and Evaluations for Public Health Pesticides：Malathion，World Health Organization，2003。手性纯度可以通过手性GC或旋光度的测量来评估。
或者，单萜(或倍半萜烯)可以通过除使衍生物结晶以外的方法来纯化。例如，在衍生物具有与存在于原材料中的其异构体、结构变异体或污染物的物理化学特性不同的物理化学特性(例如溶解度或极性)的情况下，可以制备单萜(或倍半萜烯)衍生物。因此，单萜(或倍半萜烯)衍生物可以通过现有技术已知的适合的分离技术诸如制备型色谱法，与单萜(或倍半萜烯)分离。
在贮存之后，所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以是稳定的。例如，在大约5℃下贮存至少3个月之后，本发明的组合物可以含有大于约98.5％(w/w)，大于约99％(w/w)，大于约99.5％(w/w)，或大于约99.9％(w/w)的单萜(或倍半萜烯)。在25℃和60％相对湿度下贮存至少3个月之后，本发明的组合物可以含有大于约98.5％(w/w)，大于约99％(w/w)，大于约99.5％(w/w)，或大于约99.9％(w/w)的单萜(或倍半萜烯)。
本发明还提供使用单萜(或倍半萜烯)治疗疾病诸如癌症或其它神经***紊乱的方法。单萜(或倍半萜烯)可以单独施用，或与放疗法、外科手术或化疗剂联合施用。所述单萜或倍半萜烯还可以与抗病毒剂、消炎剂或抗生素共同施用。所述试剂可以是同时或顺序施用。单萜(或倍半萜烯)可以在其他活性剂施用之前、期间或之后施用。
所述单萜(或倍半萜烯)还可以用作溶剂或渗透强化剂来将治疗剂递送到受损部位。例如，单萜(或倍半萜烯)可以用作溶剂或渗透促进剂以将化疗剂递送到肿瘤细胞。所述单萜或倍半萜烯还可以用作疫苗的溶剂，其可以通过任何适合的途径诸如鼻内递送。
单萜(或倍半萜烯)可以用于治疗神经***癌症，诸如恶性神经胶质瘤(例如星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤)、视网膜母细胞瘤、纤维性星形细胞瘤(I级)、脑膜瘤、脑转移瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、颅底脑膜瘤和颅底癌症。本文中使用的术语“神经***肿瘤”是指受试者具有神经***细胞恶性增殖的病症。
可通过所述单萜(或倍半萜烯)组合物治疗的癌症包括，但不限于，肺癌、耳、鼻和喉的癌、白血病、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、乳腺癌、***癌、***癌、造血***癌症、卵巢癌、基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；***癌；***；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；***癌；消化***的癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头部和颈部的癌症；胃癌；上皮内瘤；肾癌；喉癌；包括急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病的白血病；肝癌；包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤的淋巴瘤；骨髓瘤；纤维瘤、成神经细胞瘤；口腔(例如唇、舌、口和咽)癌；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸***癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿***癌症，以及其它癌和肉瘤。美国专利第7,601,355号。
本发明还提供治疗CNS紊乱的方法，所述CNS紊乱包括但不限于，诸如阿尔茨海默病(Alzheimer’s)、帕金森病(Parkinson’s)的原发性退行性神经***紊乱，心理疾病、精神病和抑郁症。治疗可以由单独使用纯化单萜或倍半萜烯，或联合使用目前用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病或心理疾病的药物组成。例如，纯化单萜或倍半萜烯可以用作溶剂，其用于吸入目前用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病或心理疾病的药物。
所述单萜或倍半萜烯可以与放疗法联合使用。在一个实施方案中，本发明提供采用放疗法***细胞诸如恶性神经胶质瘤细胞的方法，其中所述细胞用有效量的单萜诸如紫苏醇治疗，然后进行放疗法。单萜治疗可以在放疗法之前、期间和/或之后。例如，所述单萜或倍半萜烯可以连续施用，从放疗法开始之前一星期开始，并且在放疗法完成之后持续两个星期。美国专利第5,587,402和5,602,184号。
本发明的单萜或倍半萜烯可以与至少一种治疗剂联合使用，所述治疗剂包括但不限于，化疗剂、免疫治疗剂和抗体(例如单克隆抗体)。可与纯化单萜或倍半萜烯联合使用的抗癌剂可以具有一项或多项以下对癌细胞或受试者的效果：细胞死亡；减少的细胞增殖；减少的细胞数量；细胞生长的抑制；细胞凋亡；坏死；有丝***灾难；细胞周期停滞；变小的细胞大小；减少的细胞***；降低的细胞存活率；减少的细胞代谢；细胞损害或细胞毒性的标记物；细胞损害或细胞毒性诸如肿瘤收缩的间接指示物；提高的受试者存活率；或与不希望有的、不需要的或异常的细胞增殖有关的标记物的消失。美国专利公开第20080275057号。
本发明还包括单萜(或倍半萜烯)和至少一种治疗剂的混合物和/或共制剂，所述治疗剂包括但不限于化疗剂。
化疗剂包括，但不限于，DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、长春花生物碱(vincalkaloids)、紫杉烷、埃博霉素、酶抑制剂、受体拮抗剂、治疗性抗体、酪氨酸激酶抑制剂、硼放射增敏剂(即万珂)和化疗联合疗法。
在一个实施方案中，本发明提供采用化疗法***细胞诸如恶性神经胶质瘤细胞的方法，其中所述细胞用有效量的单萜诸如紫苏醇处理，然后进行化疗法。单萜处理可以在化疗法之前、期间和/或之后。
DNA烷化剂是现有技术众所周知的并用于治疗各种肿瘤。DNA烷化剂的非限制性例子是氮芥诸如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(异环磷酰胺、曲磷胺)、苯丁酸氮芥(马法兰、松龙苯芥)、苯达莫司汀、尿嘧啶氮芥和雌氮芥；亚硝基脲诸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(司莫司汀)、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀和链脲霉素；烷基磺酸盐诸如白消安(甘露舒凡、苏消安)；氮杂环丙烷诸如卡波醌、噻替派、三乙撑亚胺苯醌、三乙撑蜜胺；肼(甲基苄肼)；三氮烯诸如氮烯咪胺和替莫唑胺；六甲蜜胺和二溴甘露醇。
拓扑异构酶I抑制剂的非限制性例子包括喜树碱衍生物，所述喜树碱衍生物包括如Pommier Y的(2006)Nat.Rev.Cancer 6(10)：789-802和美国专利公开第200510250854号中描述的CPT-11(伊立替康)、SN-38、APC、NPC、喜树碱、拓扑替康、依喜替康甲磺酸盐、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康、鲁比替康、silatecan、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f和MAG-CPT；原小檗碱生物碱及其衍生物包括如Li等的(2000)Biochemistry 39(24)：7107-7116和Gatto等的(1996)Cancer Res.15(12)：2795-2800中描述的小檗红碱和甲氧檗因；邻二氮杂菲衍生物包括如Makhey等的(2003)Bioorg.Med.Chem.11(8)：1809-1820中描述的苯并[i]菲啶、两面针碱和花椒宁碱(fagaronine)；如Xu的(1998)Biochemistry37(10)：3558-3566中描述的Terbenzimidazole和其衍生物；和蒽环类化合物衍生物包括如Foglesong等的(1992)Cancer Chemother. Pharmacol.30(2)：123-125，Crow等的(1994)J.Med. Chem.37(19)：3191-3194和Crespi等的(1986)Biochem.Biophys.Res. Commun.136(2)：521-8描述的阿霉素、柔红霉素和米托蒽醌。拓扑异构酶II抑制剂包括，但不限于依托泊苷和替尼泊苷。拓扑异构酶I和II双重抑制剂包括，但不限于，如Denny and Baguley的(2003)Curr.Top.Med.Chem.3(3)：339-353描述的圣特平(Saintopin)和其它萘并萘二酮(Naphthecenediones)、DACA和其它吖啶-4-羧酰胺、茚托利辛和其它苯并吡啶并吲哚、TAS-I03和其它7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、XR 11576和其它苯并吩嗪、XR 5944和其它二聚化合物、7-氧-7H-二苯并[f，ij]异喹啉和7-氧-7H-苯并[e]萘嵌间二氮杂苯(Perimidines)和蒽-氨基酸共轭物。一些试剂抑制拓扑异构酶II并具有DNA嵌入活性诸如，但不限于，蒽环类化合物(阿柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星)和蒽二酮(米托蒽醌和匹杉琼)。
内质网应激诱导剂的例子包括，但不限于二甲基-塞来昔布(DMC)、奈非那韦、塞来昔布和硼放射增敏剂(即万珂(硼替佐米))。
铂基化合物是DNA烷化剂的亚类。此类试剂的非限制性例子包括卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、赛特铂、阿罗铂(Aroplatin)、洛铂和JM-216。(参见McKeage等的(1997)J.Clin. Oncol.201：1232-1237，并且总的来说，参见CHEMOTHERAPYFOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM，CURRENT THERAPY ANDNOVEL APPROACHES，in Series Basic and Clinical Oncology，Angioli等.Eds.，2004)。
“FOLFOX”是用于治疗结肠直肠癌的一种联合治疗类型的缩写。它包括5-FU、奥沙利铂和甲酰四氢叶酸。与此治疗有关的信息可以在国家癌症研究所的网站(cancer.gov)上得到，上次访问于2008年1月16日。
“FOLFOX/BV”是用于治疗结肠直肠癌的一种联合治疗类型的缩写。此治疗包括5-FU、奥沙利铂、甲酰四氢叶酸和贝伐单抗。此外，“XELOX/BV”是用于治疗结肠直肠癌的另一联合治疗，其包括被称为卡培他滨(希罗达)的5-FU的前药与奥沙利铂和贝伐单抗联合。与这些治疗有关的信息可以从国家癌症研究所的网站(cancer.gov)上或国家综合癌症网络的网站(nccn.org)上得到，上次访问于2008年5月27日。
抗代谢物试剂的非限制性例子包括基于叶酸的试剂，即二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如氨蝶呤、甲氨蝶呤和培美曲塞；胸苷酸合酶抑制剂，诸如雷替曲塞、培美曲塞；基于嘌呤的试剂，即腺苷脱氨酶抑制剂，诸如喷司他丁、诸如硫鸟嘌呤和巯嘌呤的巯基嘌呤，卤化/核苷酸还原酶抑制剂，诸如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨，或鸟嘌呤/鸟苷：巯基嘌呤诸如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的试剂，即胞嘧啶/胞苷：去甲基化剂诸如阿扎胞苷和地西他滨，DNA聚合酶抑制剂诸如阿糖胞苷，核苷酸还原酶抑制剂诸如吉西他滨，或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合酶抑制剂诸如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等同物包括其前药、类似物和衍生物，诸如例如在Papamicheal(1999)The Oncologist 4：478-487中所描述的5’-脱氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷(doxifluroidine))、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶(呋氟脲嘧啶)、卡培他滨(希罗达)、S-I(MBMS-247616，由替加氟和两个调节器，5-氯-2，4-二羟基吡啶和氧嗪酸钾组成)、雷替曲噻(拓优得)、诺拉曲特(诺拉曲塞(Thymitaq)，AG337)、LY231514和ZD9331。
长春花生物碱的例子包括但不限于长春花碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨。
紫杉烷的例子包括但不限于多西他赛、莱龙泰素(Larotaxel)、奥他赛(Ortataxel)、紫杉醇和替司他赛(Tesetaxel)。埃博霉素的例子是伊沙匹隆(iabepilone)。
酶抑制剂的例子包括但不限于法尼基转移酶抑制剂(替吡法尼(tipifamib)；CDK抑制剂(阿伏昔地(Alvocidib)、塞利西利(Seliciclib))；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)；磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷；咯利普兰)；IMP脱氢酶抑制剂(噻唑呋林)；和脂肪氧合酶抑制剂(马索罗酚)。受体拮抗剂的例子包括但不限于ERA(阿曲生坦)；类视黄醇X受体(蓓萨罗丁)；和性类固醇(睾内酯)。
治疗性抗体的例子包括但不限于，抗HER1/EGFR(西妥昔单抗、帕尼单抗)；抗HER2/neu(erbB2)受体(曲妥珠单抗)；抗EpCAM(卡妥索单抗(Catumaxomab)、依决洛单抗)；抗VEGF-A(贝伐单抗)；抗CD20(利妥昔单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗)；抗CD52(阿仑单抗)；和抗CD33(吉姆单抗(Gemtuzumab))。美国专利第5,776,427和7,601,355号。
酪氨酸激酶抑制剂的例子包括但不限于，ErbB:HER1/EGFR的抑制剂(埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、舒尼替尼、来那替尼(Neratinib))；HER2/neu的抑制剂(拉帕替尼、来那替尼)；第III类RTK:C-kit的抑制剂(阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼)，FLT3抑制剂(来他替尼(Lestaurtinib))，PDGFR抑制剂(阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼)；和VEGFR抑制剂(凡德他尼、司马沙尼、西地尼布、阿西替尼、索拉非尼)；bcr-abl抑制剂(伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼)；Src抑制剂(博舒替尼)和Janus激酶2抑制剂(来他替尼)。
西妥昔单抗是抗EGFR抗体的一个例子。它是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的人/鼠嵌合型单克隆抗体。在此将生物等效抗体鉴定为修饰抗体和那些结合EGFR抗原的相同表位并产生基本上相当的生物反应的那些抗体，所述生物反应诸如阻止EGFR的配体结合、阻止EGFR受体的活化和引起中断的细胞发育的EGFR通路下游信号的阻塞。
“拉帕替尼”(Tykerb)是EGFR和erbB-2双重抑制剂。已经在许多临床试验中研究了拉帕替尼作为抗癌单一疗法，以及与曲妥珠单抗、卡培他滨、来曲唑、紫杉醇和FOLF1R1(伊立替康、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸)联合。目前正对转移性***癌、头颈癌、肺癌、胃癌、肾癌和膀胱癌的口服治疗进行第III阶段测试。拉帕替尼的化学等同物是小分子或化合物，所述小分子或化合物是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或者可选的HER-1抑制剂或HER-2抑制剂。已经发现几种TKI具有有效的抗癌活性并已经证实或在临床试验中。这样的例子包括但不限于，凡德他尼(ZD6474)、易瑞沙(吉非替尼)和特罗凯(埃罗替尼)、甲磺酸伊马替尼(STI571；格列卫)、埃罗替尼(OSI-1774；特罗凯)、卡奈替尼(CI 1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼碱(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、索坦(SUI 1248)和来氟米特(SU101)。拉帕替尼的生物等同物是其肽、抗体或抗体衍生物，所述肽、抗体或抗体衍生物是HER-1抑制剂和/或HER-2抑制剂。这种例子包括但不限于人源化抗体曲妥珠单抗和赫塞汀。
PTK/ZK是靶向所有VEGF受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、c-KIT和c-Fms的具有广泛特异性的“小”分子酪氨酸激酶抑制剂。Drevs(2003)Idrugs 6(8)：787-794。PTK/ZK是通过抑制结合VEGF的所有已知受体的活性来阻断血管形成和***生成的靶向药物，所述受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。PTK/ZK的化学名称是1-[4-氯苯胺]-4-[4-吡啶基甲基]酞嗪琥珀酸盐或1-酞嗪基胺，N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-丁二酸酯(butanedioate)(1∶1)。PTK/TK的同义词和类似物被认为是瓦他拉尼碱、CGP79787D、PTK787/ZK222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK787A、VEGFR-TK抑制剂、ZK 222584和ZK。
可用于与纯化单萜或倍半萜烯联合的化疗剂还可以包括安吖啶、曲贝替定、类视黄醇(阿利维A酸、维甲酸)、三氧化二砷、天冬酰胺消耗物(天冬酰胺酶/培门冬酶)、塞来昔布、地美可辛、伊利司莫、依沙芦星、乙环氧啶、氯尼达明、硫蒽酮、丙脒腙、米托坦、奥利默森、替西罗莫司和伏立诺他。
本发明的组合物和方法可用来降低Ras蛋白的水平。Ras家族是涉及细胞信号转导的小GTP酶的蛋白家族。Ras信号的活化引起细胞生长、分化和生存。ras基因的突变可以永久活化它，并且即使不存在胞外信号，也会在细胞内部引起不适当的传导。因为这些信号引起细胞生长和***，异常的Ras信号能够最终导致肿瘤生成和癌症。在20-25％的所有人类肿瘤中和高达90％的特定肿瘤类型中发现了Ras的活化突变。Goodsell DS(1999).Downward J.，“Themolecular perspective：the ras oncogene”.Oncologist 4(3)：263-4.(January 2003)。“Targeting RAS signalling pathways in cancertherapy”.Nat.Rev.Cancer 3(1)：11-22。Ras家族成员包括，但不限于HRAS；KRAS；NRAS；DIRAS1；DIRAS2；DIRAS3；ERAS；GEM；MRAS；NKIRAS1；NKIRAS2；NRAS；RALA；RALB；RAP1A；RAP1B；RAP2A；RAP2B；RAP2C；RASD1；RASD2；RASL10A；RASL10B；RASL11A；RASL11B；RASL12；REM1；REM2；RERG；RERGL；RRAD；RRAS；和RRAS。Wennerberg K，Rossman KL，DerCJ(March 2005).“The Ras superfamily at a glance”.J Cell.Sci.118(Pt 5)：843-6。
本发明的组合物和方法可用来增加细胞旁通透性，例如内皮细胞或上皮细胞的细胞旁通透性。本组合物和方法可用来增加血脑屏障通透性。
本发明的组合物和方法可用来降低或抑制血管生成。所述组合物和方法可以减少或抑制促血管生成细胞因子的产生，包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL8)。
所述纯化单萜或倍半萜烯可以与血管生成抑制剂联合使用。血管生成抑制剂的例子包括，但不限于，血管抑素、血管酶(angiozyme)、抗凝血酶III、AG3340、VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体)、巴马司他、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、BMS-275291、CAI、2C3、HuMV833血管能抑素、卡托普利、羧胺***、软骨源抑制剂(CDI)、CC-5013、6-O-(氯乙酰基-羰基)-烟霉醇、COL-3、康普立停、康普立停A4磷酸盐、达肝素、EMD 121974(西仑吉肽)、内皮抑素、埃罗替尼、吉非替尼(易瑞沙)、染料木素、氢溴酸常山酮、Id1、Id3、IM862、伊马替尼甲磺酸盐、IMC-IC11诱导蛋白10、干扰素α、白细胞介素12、熏草菌素A、LY317615或AE-941、马立马司他、mspin、乙酸甲羟孕酮(medroxpregesterone acetate)、Meth-1、Meth-2、2-甲氧雌甾二醇(2-ME)、新伐司他、骨桥蛋白裂解产物(oteopontin cleaved product)、PEX、色素上皮生长因子(pgment epithelium growth factor)(PEGF)、血小板因子4、催乳素片段、多育曲菌素-相关蛋白(PRP)、PTK787/ZK 222584、ZD6474、重组人血小板因子4(rPF4)、网状内皮***刺激素、角鲨胺、SU5416、SU6668、SU11248苏拉明、紫杉醇、替康兰(Tecogalan)、萨力多胺、凝血栓蛋白、TNP-470、肌钙蛋白-1、血管抑制因子、VEG1、VEGF-Trap和ZD6474。
血管生成抑制剂的非限制性例子还包括，酪氨酸激酶抑制剂，诸如酪氨酸激酶受体抑制剂Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)、表皮衍生的生长因子的抑制剂、成纤维细胞衍生的生长因子的抑制剂、或血小板衍生的生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整合蛋白阻断剂、戊聚糖多硫酸酯、血管紧张素II拮抗剂、环加氧酶抑制剂(包括非甾体抗炎药(NSAID)诸如阿斯匹林和布洛芬，以及选择性环加氧酶-2抑制剂诸如塞来昔布和罗非昔布)，和甾类抗炎药(诸如皮质类固醇、盐皮质激素、***、强的松、强的松龙、甲基强的松龙(methylpred)、倍他米松)。
其它调节或抑制血管生成并且也可以与本发明的化合物联合使用的治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解***的试剂。此类调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解途径的试剂的例子包括，但不限于，肝素、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(亦称活性凝血酶可活化纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂)。美国专利公开第20090328239号。美国专利第7,638,549号。
本发明还提供提高免疫调节治疗反应的方法，其包括在免疫调节治疗之前或期间将细胞暴露于有效量的单萜或倍半萜烯例如紫苏醇的步骤。优选的免疫调节试剂是细胞因子，例如白介素、淋巴激活素、单核因子、干扰素和趋化因子。
本发明进一步提供其中纯化单萜(或倍半萜烯)用作溶剂或渗透强化剂的组合物。在一方面，所述单萜是紫苏醇。以下提供所述治疗剂的例子。所述组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、共溶剂或其它渗透强化剂。
在一个实施方案中，所述组合物含有以下组分：治疗剂；至少约0.03％(v/v)的单萜(或倍半萜烯)例如紫苏醇；至少约2.6％(v/v)的共溶剂，所述共溶剂可以是1.3％(v/v)的多元醇例如甘油或其等同物；和至少约1.3％(v/v)的乙醇或其等同物。
其它可与所述纯化单萜(或倍半萜烯)一起使用的渗透强化剂包括，但不限于，甘油的脂肪酸酯例如癸酸甘油酯、辛酸甘油酯、月桂酸甘油酯、油酸甘油酯；异山梨醇、蔗糖、聚乙二醇的脂肪酸酯；己酰乳酸(caproyllactylic acid)；月桂醇聚醚-2；月桂醇聚醚-2乙酸酯；月桂醇聚醚-2苯甲酸酯；月桂醇聚醚-3羧酸；月桂醇聚醚-4；月桂醇聚醚-5羧酸；油醇聚醚-2；甘油焦谷氨酸酯油酸酯；甘油油酸酯；N-月桂酰肌氨酸；N-十四酰肌氨酸；N-辛基-2-吡咯烷酮；月桂氨基丙酸；聚丙二醇-4-月桂醇聚醚-2；聚丙二醇-4-月桂醇聚醚-5-二甲基月桂酰胺；月桂酰二乙醇胺(DEA)、十二烷焦谷氨酸酯(LP)、甘油单月桂酸酯(GML)、甘油单辛酸酯、甘油单癸酸酯、甘油单油酸酯(GMO)和山梨醇单月桂酸酯。多元醇或乙醇可以作为渗透强化剂或共溶剂。另外的渗透强化剂参见美国专利第5,785,991；5,843,468；5,882,676；和6,004,578号。
共溶剂是现有技术众所周知的，其包括，但不限于，甘油、聚乙二醇(PEG)、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇等等。
所述组合物可以通过现有技术已知的任何方法施用，包括，但不限于，鼻内、口服、经眼、腹内、吸入、静脉内、ICV、脑池内注射或输液、皮下、植入、***内、舌下、尿道(例如尿道栓)、皮下、肌肉、静脉内、经皮、直肠、舌下、粘膜、眼内、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和***施用。局部制剂可以是凝胶、膏剂、乳膏剂、气雾剂等的形式；鼻内制剂可以喷雾剂或滴剂形式递送；经皮制剂可以通过透皮贴剂或离子透入法施用；吸入制剂可以利用喷雾器或类似装置施用。组合物还可以采用片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂、溶液、悬浮液、酏剂、气雾剂，或任何其它合适的组合物的形式。
为了制备这种药物组合物，根据常规药物配合技术，可以将一种或多种纯化单萜(或倍半萜烯)与药学上可接受的载体、助剂和/或赋形剂混合。可用于所述组合物的药学上可接受的载体包括任何标准化药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。所述组合物可以另外含有固体药物赋形剂例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固态赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油类，所述油类包括石油、动物、植物或合成来源的那些油类，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是注射溶液用液体载体，包括水、盐水、葡萄糖水和乙二醇。载体、稳定剂和助剂的例子，参见E.W.Martin编辑的Remington’s Pharmaceutical Sciences，(Mack PublishingCompany，18th ed.，1990)。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。
如在本文中使用的术语“治疗有效量”是足以治疗特定紊乱或疾病的量，或者，足以获得治疗紊乱或疾病的药理学反应的量。测定最有效施用方式和剂量的方法可以随着用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。治疗剂量通常可以被滴定以优化安全性和功效。单次或多次施用可以根据治疗医生选择的剂量水平和方式来进行。本领域技术人员能够容易确定施用试剂的合适剂量制剂和方法。例如，所述组合物以约0.01mg/kg至约200mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg、或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用。当在本文中描述的化合物与另一试剂或疗法共同施用时，所述有效量可以小于所述试剂单独使用时的有效量。
所述发明还提供如上所述的用于鼻内施用的组合物。同样地，所述组合物可以进一步包含渗透强化剂。Southall等.Developmentsin Nasal Drug Delivery，2000。所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以以液体形式例如溶液、乳剂、悬浮液、滴剂，或固体形式例如粉末、凝胶或膏剂鼻内施用。递送鼻内药物的装置是现有技术众所周知的。可以利用下述装置进行鼻腔药物递送，所述装置包括，但不限于，鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、雾化器、鼻腔喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶、喷雾器、定量吸入器(MDI)、压力定量吸入器、吹药器和双向装置。可以计量所述鼻腔递送装置以向鼻腔施用精确有效剂量的量。所述鼻腔施用装置可用于单一单元递送或多单元递送。在具体的实例中，来自Kurve Technology(Bethell，Washington)的ViaNase Electronic Atomizer可用于本发明(http://www.kurvetech.com)。本发明的化合物还可以通过管、导管、注射器、包装尾(packtail)、纱布、鼻塞或通过粘膜下层输液递送。美国专利公开第20090326275、20090291894、20090281522和20090317377号。
所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以利用标准方法配制成气雾剂。所述单萜(或倍半萜烯)可以与溶剂一起配制或不与溶剂一起配制，以及与载体一起配制或不与载体一起配制。所述制剂可以是溶液，或可以是含有一种或多种表面活性剂的水性乳剂。例如，可以由带有适合推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳氢化合物、压缩空气、氮气、二氧化碳或其它合适气体的加压容器来制备气雾喷雾器。可以通过提供阀门来确定剂量单位以递送计量的量。泵送喷雾分配器可以分配计量的剂量或具有特定的粒径或液滴尺寸的剂量。如在本文中使用的术语“气雾剂”是指处于气体中的细小固体颗粒或液体溶液滴的悬浮液。具体地说，气雾剂包括单萜(或倍半萜烯)滴的气载悬浮液，其可以在任何适合装置例如MDI、喷雾器或弥雾机中生成。气雾剂还包括悬浮在空气或其它载气中的本发明组合物的干粉组合物。Gonda(1990)Critical Reviews  in Therapeutic Drug Carrier Systems6：273-313.Raeburn等，(1992)Pharmacol.Toxicol.Methods 27：143-159。
所述纯化单萜(或倍半萜烯)可以以例如微球形式的粉末通过鼻腔吹药器递送到鼻腔。所述单萜(或倍半萜烯)可以吸附至固体表面例如载体。所述粉末或微球可以以干燥的、空气可分散的(air-dispensable)形式施用。所述粉末或微球可以储存在吹药器的容器中。或者，所述粉末或微球可以装填成胶囊剂例如明胶胶囊，或其它适合于鼻腔施用的单剂量单元。
所述药物组合物可以通过在鼻腔中直接放置所述组合物来递送到鼻腔，例如以凝胶、膏剂、鼻腔乳剂、洗剂、乳膏剂、鼻棉塞、点滴器或生物粘附条的形式。在某些实施方案中，例如为了提高吸收，希望延长药物组合物在鼻腔中的停留时间。因此，药物组合物可以任选地与生物粘性聚合物、树胶(例如黄原胶)、壳聚糖(例如高纯度阳离子型多糖)、果胶(或任何像凝胶一样稠化或当施加到鼻粘膜时乳化的碳水化合物)、微球(例如淀粉、白蛋白、右旋糖酐、环糊精)、明胶、脂质体、卡波姆(carbamer)、聚乙烯醇、藻酸盐、***胶、壳聚糖和/或纤维素(例如甲基或丙基；羟基或羧基；羧甲基或羟丙基)一起配制。
含有所述纯度单萜(或倍半萜烯)的组合物可以通过口服吸入进入呼吸道(也就是肺)施用。
用于可吸入试剂的典型递送***包括雾化吸入器、干粉吸入器(DPI)和定量吸入器(MDI)。
喷雾器装置产生高速空气流，使液体形式的治疗剂以雾的形式喷出。所述治疗剂配制成液体形式，例如合适大小的颗粒的溶液或悬浮液。在一个实施方案中，所述颗粒是微粉化的。术语“微粉化”定义为具有约90％或更多的直径小于约10微米的颗粒。适合的喷雾器装置是商业上提供的，例如，由PARI GmbH(Starnberg，德国)提供。其它喷雾器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)以及在例如美国专利第7,568,480和6,123,068号，和WO97/12687中公开的那些。所述单萜(或倍半萜烯)可以配制成水溶液或液体悬浮液以用在喷雾器装置中。
DPI装置通常以自由流动的粉末形式施用治疗剂，所述粉末可以分散在患者吸气期间的气流中。使用外部能量来源的DPI装置也可以用于本发明。为了得到自由流动的粉末，治疗剂可以与适合的赋形剂(例如乳糖)一起配制。例如，通过将颗粒大小为约1微米至100微米的干燥乳糖与单萜(或倍半萜烯)的微粉化颗粒混合再干混，可以制得干粉制剂。或者，单萜可以不与赋形剂一起配制。将制剂装入干粉分配器，或装入与干粉递送装置一起使用的吸入盒或胶囊中。商业上提供的DPI装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，N.C.)(参见，例如美国专利第5,035,237号)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利第6,378,519号)；Turbuhaler(AstraZeneca，Wilmington，Del.)(参见，例如美国专利第4,524,769号)；和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利第4,353,365号)。适合的DPI装置的进一步实例在美国专利第5,415,162，5,239,993和5,715,810号以及其中的参考文献中描述。
MDI装置通常利用压缩的推进剂气体释放出测定量的治疗剂。用于MDI施用的制剂包括在液化推进剂中的活性成分的溶液或悬浮液。推进剂的例子包括氢氟烷烃(HFA)例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷(HFA 227)，和氯氟烃例如CCl3F。用于MDI施用的HFA制剂的其他组分包括共溶剂，例如乙醇、戊烷、水，和表面活性剂例如去水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油。(参见，例如美国专利第5,225,183号，EP0717987，和WO 92/22286)。将制剂装入气溶胶筒，所述气溶胶筒构成MDI装置的一部分。美国专利第6,006,745和6,143,227号中提供了为与HFA推进剂一起使用而特别开发的MDI装置的例子。制备适合制剂和适合于吸入剂量的装置的方法的例子参见美国专利第6,268,533、5,983,956和6,221,398号，以及WO 99/53901、WO 00/61108、WO 99/55319和WO 00/30614。
为了通过吸入法递送，所述单萜(或倍半萜烯)可以包封在脂质体或微胶囊中。脂质体是由双层脂质膜和含水内部组成的囊泡。所述脂质膜可以由磷脂制成，所述磷脂的例子包括卵磷脂例如蛋黄素和溶血卵磷脂，酸性磷脂例如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，和鞘磷脂例如磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂。或者，可以添加胆固醇。微胶囊是包有包衣材料的颗粒。例如，所述包衣材料可以由成膜聚合物、疏水的增塑剂、表面活性剂或/和润滑剂含氮聚合物的混合物组成。美国专利第6,313,176和7,563,768号。
由于它们具有容易渗透真皮的能力，单萜也可以单独或与其它化疗剂联合通过局部施用用于治疗局部癌症例如***癌或黑素瘤。作为经皮递送试剂，单萜也可以与***或止痛药联合用于止痛药的经皮递送。
本发明还提供如上所述的用于经眼施用的组合物。同样地，所述组合物可以进一步包含渗透强化剂。对于经眼施用而言，在本文描述的组合物可以配制成溶液、乳剂、悬浮液等。各种适用于将化合物施用于眼睛的工具是现有技术已知的。具体的非限制性例子在美国专利第6,261,547；6,197,934；6,056,950；5,800,807；5,776,445；5,698,219；5,521,222；5,403,841；5,077,033；4,882150和4,738,851号中描述。
所述单萜(或倍半萜烯)可以单独或与其它药物联合给予以用于上述疾病的短期或长期治疗。所述组合物可以施用于哺乳动物，优选人类。哺乳动物包括，但不限于，鼠科动物、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、狗、猫、家畜、运动型动物(sport animals)、宠物、马和灵长类动物。
本发明进一步提供一种制品(例如试剂盒)，所述制品包含配制的用于鼻内施用的纯化单萜(或倍半萜烯)，以及用于纯化单萜(或倍半萜烯)鼻内施用的装置。用于鼻内施用的装置可以是鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、定量吸入器(MDI)、压力定量吸入器、吹药器、鼻内吸入器、鼻腔喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶或双向装置。所述制品可以含有说明纯化单萜(或倍半萜烯)是用于治疗疾病例如癌症或其它神经***紊乱的印刷品。所述印刷品可以阐明所述单萜(或倍半萜烯)可以单独或与放疗法、外科手术或化疗剂联合施用。单萜或倍半萜烯还可以与抗病毒剂、抗炎剂或抗生素共同施用。所述试剂可以同时或顺序施用。
本发明还提供在体外、从体外到体内(ex vivo)或在体内抑制细胞生长的方法，其中使细胞例如癌细胞与有效量的在本文中描述的纯化单萜(或倍半萜烯)接触。本发明的组合物和方法可用来抑制对化疗剂有抗性的细胞的生长。例如，本发明的组合物和方法可用来抑制抗替莫唑胺的细胞的生长。
病态的细胞或组织例如高增殖的细胞或组织可以通过用有效量的本发明的组合物接触所述细胞或组织来处理。所述细胞例如癌细胞，可以是原发性癌细胞，或可以是能从组织库例如美国菌种保藏中心(ATCC)中获得的培养细胞。所述病态细胞可以是全身性癌症、神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、或来自全身性癌症的CNS转移、肺癌、***癌、***癌、造血***癌症或卵巢癌的细胞。所述细胞可以来自于脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。美国专利公开第2004/0087651号。Balassiano等.(2002)Intern.J.Mol.Med.10：785-788。Thorne，等.(2004)Neuroscience 127：481-496。Fernandes，等.(2005)Oncology Reports13：943-947。Da Fonseca，等.(2008)Surgical Neurology 70：259-267。Da Fonseca，等.(2008)Arch. Immunol.Ther.Exp.56：267-276。Hashizume，等.(2008)Neuroncologv 10：112-120。
癌症干细胞(CSC)或肿瘤起始细胞是具有干细胞特性例如自我复制的未成熟细胞。然而，自我复制在CSC中被加剧。Reya等.，Stemcells，cancer，and cancer stem cells.Nature.2001，414(6859)：105-11。另外，神经胶质瘤CSC对化疗和放疗有抗性。Bao等，Glioma stemcells promote radioresistance by preferential activation of the DNAdamage response.Nature.2006，444(7120)：756-60.Rich等，Chemotherapy and cancer stem cells.Cell Stem Cell.2007；1(4)：353-5。本发明的组合物和方法可用来抑制癌症干细胞的生长，所述癌症干细胞包括但不限于，胶质母细胞瘤癌症干细胞。
本发明组合物的体外效力可以利用现有技术众所周知的方法测定。例如，可以通过MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物]细胞毒性试验来分析本发明的单萜(或倍半萜烯)和/或治疗剂的细胞毒性。MTT试验基于以下原理：被新陈代谢活性细胞吸收的MTT(四氮唑盐)，其中被新陈代谢成可通过光谱读数的蓝色甲瓒(formazon)产物。J.of Immunological Methods 65：5563，1983。可以通过集落形成试验研究本发明的单萜(或倍半萜烯)和/或治疗剂的细胞毒性。VEGF分泌和IL-8分泌的抑制的功能性分析可以通过ELISA进行。可以通过标准化的碘化丙啶(PI)染色法和流式细胞术研究所述的单萜(或倍半萜烯)和/或治疗剂引起的细胞周期阻断。通过博伊登室(Boyden chambers)可以研究侵袭抑制。在此试验中，将一层重组的基底膜——基质胶(Matrigel)涂敷到趋化作用过滤器上，作为博伊登室中细胞迁移的屏障。只有具有侵袭能力的细胞能够穿过所述基质胶屏障。其它试验包括，但不限于细胞活性试验、凋亡试验和形态学试验。
具体实施方式
以下实施例仅为说明本发明提供，而不限制本发明。
实施例1：通过3，5-二硝基苯甲酸酯的(S)-紫苏醇的纯化
(S)-紫苏醇可以直接由天然产物纯化，或通过天然产物的合成改性例如氧化和重排β-蒎烯(从松树中提取的)而得到(示意图1)。
示意图1
(S)-紫苏醇的这种来源不可避免地被目标化合物的异构体污染，所述异构体在物理化学特性上非常类似，因而难以通过常规的纯化方法例如分馏或色谱法除去。
在该实施例中，为了从来自天然产物和/或合成来源的通常伴随(S)-紫苏醇的污染物中纯化(S)-紫苏醇，首先将紫苏醇衍生成它的3，5-二硝基苯甲酸酯，其通过常规结晶来与污染物分离。一旦所述衍生的(S)-紫苏醇已经通过结晶纯化，其然后就可以被水解以还原成纯化的(S)-紫苏醇(示意图2)。用这种方法制备的纯化(S)-紫苏醇具有大于约99％的纯度。
示意图2
3，5-二硝基苯甲酸4-(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯(化合物3)的合成
在0.25小时内将三乙基胺(12.2mL，87.5mmol)加入到(S)-紫苏醇(1，89.5％10.0g，58.7mmol)在二氯甲烷(70ml)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌所述反应混合物30分钟。在0.5小时内加入3，5-二硝基苯甲酰氯(化合物2，14.23g，61.7mmol)溶于二氯甲烷(30mL)的溶液，同时保持温度在15℃以下。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(75mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(50mL)萃取水层。用水(2×100mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(25g)干燥。浓缩过滤的有机层，所得残余物从二异丙醚(200mL)中结晶，从而得到纯化合物3(重量：14.45g)。浓缩母液至其体积的一半，得到2.1g二次产物。(总收率：81.2％，根据HPLC的纯度：99.4％)
3，5-二硝基苯甲酸4-(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯(化合物3)的水解
在0.25小时内，将氢氧化钠水溶液(3.23g，80.0mmol，溶于28mL水中)加入到3，5-二硝基-苯甲酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲酯(14.0g，40.4mmol)在甲醇(140mL)中的冰***液。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。在真空下浓缩甲醇，将所得残余物悬浮在水(60mL)中，用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。用水(2×100mL)洗涤有机层，再用盐水(15％，100mL)洗涤，然后通过硫酸钠(30g)干燥。在真空下浓缩过滤的有机层，得到纯(S)-紫苏醇(重量：5.84g，产率：95％，根据GC的纯度：99.4％)。
实施例2：3，5-二硝基苯甲酸4-(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯(化合物3)的合成和通过制备型色谱法的纯化
在0.25小时内，将三乙基胺(5.3mL，38.0mmol)加入到(S)-紫苏醇(89.5％5.0g，29.3mmol)在二氯甲烷(40ml)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在0.5小时内加入3，5-二硝基苯甲酰氯(7.43g，32.2mmol)溶于二氯甲烷(15mL)的溶液，同时保持温度在15-20℃之间。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(40mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(25mL)萃取水层。用水(2×50mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(20g)干燥。在真空下浓缩过滤的有机层，得到通过柱色谱法纯化的残余物。层析柱尺寸如下：直径：2.5cm，高度：30cm，二氧化硅：200目。用己烷∶乙酸乙酯(98∶2，200mL)洗脱层析柱，接着用己烷∶乙酸乙酯(95∶5)洗脱。基于馏分(溶剂体系；己烷∶乙酸乙酯(90∶10))的TLC分析，合并己烷∶乙酸乙酯(95∶5)馏分，并在真空下浓缩，得到固体(重量：7.9g，产率：78％)。
实施例2：4-硝基苯甲酸4(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯的合成(示意图3)
示意图3
在0.25小时内，将三乙基胺(5.92mL，42.4mmol)加入到(S)-紫苏醇(5.0g，32.8mmol)在二氯甲烷(30ml)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在0.5小时内加入4-硝基苯甲酰氯(6.39g，34.4mmol)溶于二氯甲烷(30mL)的溶液，同时保持温度在15℃以下。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(50mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(25mL)萃取水层。用水(2×50mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(20g)干燥。浓缩过滤的有机层，得到油(重量：8.9g，产率：90％)。
实施例3：4-氯苯甲酸4(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯的合成(示意图4)
示意图4
在0.25小时内，将三乙基胺(2.85mL，20.5mmol)加入到(S)-紫苏醇(2.5g，16.4mmol)在二氯甲烷(25mL)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在0.5小时内加入4-氯苯甲酰氯(3.01g，17.2mmol)溶于二氯甲烷(10mL)的溶液，同时保持温度在15℃以下。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(30mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(25mL)萃取水层。用水(2×30mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(15g)干燥。浓缩过滤的有机层，得到油(重量：3.8g，产率：81.7％)。
实施例4：3，4，5-三甲氧基苯甲酸4(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯的合成(示意图5)
示意图5
在0.25小时内，将三乙基胺(2.85mL，20.5mmol)加入到(S)-紫苏醇(2.5g，16.4mmol)在二氯甲烷(25mL)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在0.5小时内加入3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯(3.97g，17.2mmol)溶于二氯甲烷(10mL)的溶液，同时保持温度在15℃以下。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(30mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(25mL)萃取水层。用水(2×30mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(15g)干燥。浓缩过滤的有机层，得到油(重量：4.8g，产率：84.6％)。
实施例5：4-三甲氧基苯甲酸4(S)-异丙烯基环己-1-烯基甲酯的合成(示意图6)
示意图6
在0.25小时内，将三乙基胺(2.97mL，21.3mmol)加入到(S)-紫苏醇(2.5g，16.4mmol)在二氯甲烷(25ml)中的混合物中，同时保持温度在15℃以下。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在0.5小时内加入4-甲氧基苯甲酰氯(2.94g，17.2mmol)溶于二氯甲烷(10mL)的溶液，同时保持温度在15℃以下。将反应混合物升温到室温，然后搅拌3小时。用水(30mL)使反应混合物终止反应，分离有机层。用二氯甲烷(25mL)萃取水层。用水(2×30mL)洗涤合并的有机层，再通过硫酸钠(15g)干燥。浓缩过滤的有机层，得到油(重量：4.1g，产率：87％)。
实施例6体外的紫苏醇功能试验
利用形态学试验、采用MTT定量分散细胞的细胞毒性的细胞毒性试验和集落形成试验(CFA)，在浓度650μM或1.3mM下，将纯度大于98.5％的(S)-紫苏醇与购买自Sigma Chemicals(纯度96％)的商业(S)-紫苏醇进行对比。形态学试验表明纯化的(S)-紫苏醇(纯度大于98.5％)和来自Sigma的(S)-紫苏醇(纯度96％)在12小时内都具有对A172恶性神经胶质瘤细胞的细胞毒活性。两种药物均诱导细胞变圆并从板上脱离(图1)。MTT试验显示，纯化的(S)-紫苏醇显示出比纯度较小的来自Sigma的(S)-紫苏醇更好的对U87人恶性神经胶质瘤细胞的细胞毒性(图2)。
纯化的(S)-紫苏醇和Sigma(S)-紫苏醇之间在细胞毒效果上的数值差异比在(S)-紫苏醇纯度上的数值差异大得多。与Sigma(S)-紫苏醇相比，纯化的(S)-紫苏醇的纯度增加约为2.6％；纯化(S)-紫苏醇的细胞毒特性增加了约125％。
图3A显示MTT细胞毒性试验的结果，表明纯化的POH杀死各种人神经胶质瘤细胞的效力，所述人神经胶质瘤细胞包括U251、U87、LN299和A172细胞。图3B显示使用对替莫唑胺(TMZ)敏感的U251神经胶质瘤细胞和抗替莫唑胺的U251细胞系(U251/TR1和U251/TR2)，使用纯度约98.7％的纯化POH进行的24小时内的MTT细胞毒性试验的结果。纯化POH能有效杀死U251人神经胶质瘤细胞(对替莫唑胺敏感的)和抗替莫唑胺的U251细胞。图3C所示的集落形成试验也表明纯化POH对抗替莫唑胺的U251细胞的效力。
此外，POH显示出抑制了神经胶质瘤侵袭穿过Boyden基质胶室，这表明其还具有抗侵袭性。
发现POH是抗血管生成的，因为POH抑制了神经胶质瘤细胞的促血管生成细胞因子血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL8)的产生。POH对VEGF分泌和IL-8分泌抑制的功能试验已经通过ELISA试验完成(图9)。POH已被证明能抑制G1细胞周期停滞。Pyrko等.The unfolded protein response regulatorGRP78/BiP as a novel target for increasing chemo sensitivity inmalignant gliomas.Cancer Res 67(20)：9809-16，2007。POH处理之后的细胞周期分析将使用标准化碘化丙啶(PI)染色法和流式细胞术来进行。此外，其可以克服神经胶质瘤细胞分泌的转化生长因子β-2(TGFβ-2)的免疫抑制功能。
用Sigma POH或纯化POH处理U251神经胶质瘤细胞24小时，然后进行蛋白质印迹。结果(图12)表明POH处理降低了K-Ras和H-Ras的表达。
实施例7：体外的POH和放疗法的联合
使用集落形成试验，纯度大于98.5％的纯化(S)-POH被评估为人A172神经胶质瘤细胞的辐射增敏剂。在2、5或10Grays(Gy)剂量的放射之前，用325μM或650μM POH处理细胞。POH显示在杀死细胞上与放疗法协同起作用(图4A)。这在另一人神经胶质瘤细胞系(U251)以及黑素瘤细胞系(B16-F1)中得到证实(图4B)。
实施例8：体外的紫苏醇与化疗剂的联合
用POH联合替莫唑胺(TMZ)一起处理细胞之后，进行细胞毒性试验，在恶性神经胶质瘤的处理中使用标准化烷化剂。POH和TMZ在细胞毒性上至少是相加的(或协同的)(图5C)。在抗TMZ的细胞系中也可以看到这种效果。
类似地，根据在各种人神经胶质瘤细胞系(图5A)上的MTT细胞毒性试验和集落形成试验确定，POH与二甲基-塞来昔布(DMC)至少是相加的(或协同的)。根据MTT细胞毒性试验(图5B)确定，POH与奈非那韦(NFV)至少是相加的(或协同的)。Pyrko等.HIV-1 protease inhibitors nelfinavir and atazanavir inducemalignant glioma death by triggering endoplasmic reticulum stress.Cancer Res 67(22)：10920-10928，2007。
还测试了POH与咯利普兰的联合，咯利普兰是被证明是引起神经胶质瘤细胞分化和细胞凋亡的IV型磷酸二酯酶。当用咯利普兰单独处理细胞时，仅在加入高浓度的咯利普兰(例如1mM)之后的48小时以后才出现细胞凋亡。在短得多的时间内，即加入所述药物6小时之后，出现了由咯利普兰和POH协同杀死细胞。Chen等.The type IV phosphodiesterase inhibitor rolipram inducesexpression of the cell cycle inhibitors p21 Cip 1 and p27Kip1，resulting in growth inhibition，increased differentiation，andsubsequent apoptosis of malignant A-12 glioma cell s.Cancer Biology  &Therapy，Vol.1：3，268-276，2003。
实施例9：POH增加细胞旁通透性和ER应激
图6显示了A172、A375、U251人恶性神经胶质瘤细胞和B16-F1黑素瘤细胞的碘化丙啶(PI)染色法的结果。与0.04％TritonX(阳性对照)相比，650μM纯度大于98.5％的POH更大程度增加了细胞旁通透性。
进行跨膜电阻(TEER)试验以评估POH增加细胞旁通透性的能力(图7A)。在这些实验中，脑内皮细胞(BEC)用作体外的血脑屏障模型。图7B显示了POH降低了TEER，这表明POH处理增加了细胞旁通透性。与仅用介质相比，用0.03％POH处理、0.01％POH处理和0.02％POH处理细胞20小时时TEER降低了。每组中TEER随着时间的增加对应于培养中细胞饱和度的增大。
图8显示了纯化(S)-紫苏醇增加了上皮细胞的细胞旁通透性。该结果表明纯化(S)-紫苏醇可以增加BBB通透性。在细胞培养平板的每个孔中接种2.5×105Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)细胞并培养5天。在接种之后3天和用POH处理之前24小时更换细胞培养基。用不同浓度的纯度大于98.5％的纯化(S)-紫苏醇过夜处理单层MDCK细胞。然后将荧光素标记抗体加入到细胞中并培育2小时。再根据荧光测定穿过细胞单层的标记抗体的量。
POH还通过与胞质蛋白相互作用诱导内质网(ER)应激。POH上调了包括U251、U87和A172细胞的各种人神经胶质瘤细胞系中ER应激标记物葡萄糖调控蛋白78(GRP78)和细胞凋亡标记物CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)的水平(图10)。GRP78是其水平响应应激而增加的抗凋亡蛋白。CHOP是细胞凋亡的促凋亡蛋白(proapoptotic protein)信号。Pyrko等.The unfolded proteinresponse regulator GRP78/BiP as a novel target for increasing chemosensitivity in malignant gliomas.Cancer Research 67(20)：9809-16，2007。
用Sigma POH(1.5mM)或纯化的POH(1.5mM)处理对TMZ敏感的U251细胞和抗TMZ的细胞(U251/TR1，U251/TR2)20小时，然后进行蛋白质印迹。结果显示，Sigma POH和纯化POH增加了葡萄糖-调节蛋白78(GRP-78)和细胞凋亡标记物CHOP的表达，这表明处理之后内质网(ER)应激增加(图11)。
实施例10：POH有效地杀死癌症干细胞
图13显示MTT试验的结果，所述试验使用用POH处理48小时的胶质母细胞瘤癌症干细胞系USC-02、神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)或正常干细胞(mSVZ：小鼠SVZ干/祖细胞)。与神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)或正常干细胞(mSVZ：小鼠SVZ干/祖细胞)相比，所述癌症干细胞对POH更敏感。图14显示神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)比正常干细胞(脑内皮细胞(BEC)和星形胶质细胞)对POH更敏感。图15A显示MTT细胞毒性试验的结果，表明癌症干细胞USC-04(USC-04的EC50为0.3mM)比神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)对POH更敏感。图15B显示MTT细胞毒性试验的结果，表明癌症干细胞USC-04(USC-04的EC50为78μM)比神经胶质瘤肿瘤细胞(U251细胞)对DMC更具有抗力。维拉帕米用作药物外排泵蛋白例如P-糖蛋白的抑制剂。结果表明癌症干细胞的DMC抗性不是因为通过P-糖蛋白的药物外排。
图16显示球形成试验(SFA)的结果，表明POH降低了胶质母细胞瘤癌症干细胞(USC04)中形成球的数量。采用不同浓度的POH(0-1.5mM)培育USC04细胞6天。
图17显示POH降低胶质母细胞瘤癌症干细胞中H-ras的产生。用POH处理两种胶质母细胞瘤癌症干细胞系(USC-02，USC-04)24小时。USC-02和USC-04是两种从来自两位不同患者的胶质母细胞瘤组织中分离出的独立的原发癌干细胞系。
实施例11：体内动物研究
将由实施例1的方法制备的纯化POH放入鼻腔吸入器(例如，来自Kurve Technology(Bethell，Washington)的ViaNase ElectronicAtomizer)。来自Kurve Technology的鼻内递送***能够精确地递送预定的药物体积(例如，0.2-6mL)。所述装置作为肺喷雾器以同样的方式负载和清洁。所述装置能够在小型试验中将药物递送到动物或人的嗅区。
使用雄性无胸腺nu/nu小鼠(6-8周大)进行该研究。如下建立啮齿动物皮下/颅内神经胶质瘤模型。用***(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的腹膜内注射麻醉(anesthesized)六至八周大的无胸腺nu/nu小鼠。就该颅内神经胶质瘤模型而言，将小鼠放入头部立体定位架(Harvard Apparatus)中，并将局部麻醉剂(0.2cc的0.25％利多卡因)注射到右额头皮中。在冠状缝水平的右额颅骨中用刀片制造一个小切口，并用钻头制造一个小开口。将神经胶质瘤细胞(1×105细胞/10μl)例如U-87人神经胶质瘤细胞，装入标刻度的汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)中。将针尖精确放置到鼠的右额叶，使用控制推动将细胞从汉密尔顿注射器中缓慢地注入。注射完成之后，移开注射器和针，并且封合伤口。
手术植入两周之后，将小鼠分成4组(6个小鼠/组)，再分别用以下药物处理：只有盐水滴剂(对照)、来自Sigma的粗的POH(0.03％，50ul/滴，每个鼻孔一滴)、POH(纯化到纯度大于98.5％；0.03％，50ul/滴，每个鼻孔一滴)，以及TMZ(5mg/kg，口服强饲法(oral gavage))。TMZ作为阳性对照。
采集大脑，测定肿瘤尺寸。通过跟踪小鼠直到它们显现出神经功能缺损，绘制存活曲线。我们的经验是，未处理小鼠存活到植入之后约四周，用TMZ处理的小鼠存活多达8周。
我们还使用了具有免疫功能的同源大鼠模型，其中将RG2大鼠神经胶质瘤细胞(1×105细胞/10ul)注入到Fisher 344大鼠的右额叶中。大鼠被分成与上面相同的4组。我们还利用该大鼠RG2模型检验了POH的抗侵袭性，因为RG2细胞能够自由地迁移，从而侵入到大鼠实质中。
实施例12：患者研究
在巴西的最近临床研究中，在患有复发性恶性神经胶质瘤的患者的鼻内递送紫苏醇导致疾病的消退或稳定化，其中140位经治疗患者中的50％获得了6个月的无疾病进展期，且几位患者获得了多至3年的病情缓解。此外，所述治疗的副作用几乎不存在。DaFonseca等.Correlation of tumor topography and peritumoral edema ofrecurrent malignant gliomas with therapeutic response to intranasaladministration of perillyl alcohol.Invest New Drugs 2009，Jan 13。
我们将纯化的POH(具有大于98.5％的纯度)鼻内递送到患恶性神经胶质瘤的患者。为了研究POH是否能够直接递送到脑肿瘤细胞，通过向患者递送11C标记的POH和随后的正电子发射断层扫描(PET)图像来研究纯化POH的分布。然后患者经历有限的使用逐步增加的POH吸入剂量的治疗试验。采用三个组逐步增加地给患者服药，每组接收0.05％(w/v)、1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)的鼻内纯化POH(具有大于98.5％的纯度)。目前在巴西使用的是2％(w/v)。递送通过ViaNase鼻腔吸入器进行，并且每天施用三次。PET图像分析。鼻内吸入5-10mCi的11C-POH制剂后，利用Siemens Biograph TruePoint HD PET/CT扫描仪扫描十位患有病理证实的恶性神经胶质瘤的患者。静态显象将在吸入后30分钟在覆盖住头颅的单人床位置上采用10分钟采集开始。随后的连续采集每30分钟间隔发生一次，持续2小时，以确定在大脑和肿瘤组织中渐进的积累。取决于患者的依从性以及剩余和积聚活性的水平，我们将尝试成像超过2小时。所有患者的共同记录的PET/CT图像将与对照增强MRI研究进行对比，以确定活性累积与增强模式的关联。
本发明的范围不受上文中具体显示和描述的内容所限制。本领域技术人员将认识到所描述的材料、构造、结构和尺寸的示例存在合适的替换物。在本发明说明书中引用并讨论了大量参考文献，包括专利和各种出版物。提供这些参考文献的引证和讨论仅仅为了阐明本发明的描述，并非承认任何参考文献都是本文中描述的本发明的现有技术。所有在本说明书中引用和讨论的参考文献均以其全部内容通过引用结合到本文。本领域技术人员将明白在本文中描述的内容的变形、修改及其他实施而不背离本发明的精神和范围。虽然已经展示和描述了本发明的某些实施方案，但是可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行变化和修改，这对本领域技术人员来说是显而易见的。提供上述说明书和附图中陈述的主题仅仅为了举例说明而不是作为限制。

Claims (35)

1.一种纯化(S)-紫苏醇的方法，包括以下步骤：
(a)衍生化包含(S)-紫苏醇的混合物以形成紫苏醇衍生物，其中所述紫苏醇衍生物是苯甲酸酯且具有至少一种允许它从所述混合物中分离出的特性；
(b)利用所述用于分离的特性从所述混合物中分离所述紫苏醇衍生物；
(c)从来自步骤(b)的所述紫苏醇衍生物中释放出(S)-紫苏醇；和，
(d)离析来自步骤(c)的所述(S)-紫苏醇，
其中来自步骤(d)的所述(S)-紫苏醇具有大于98.5％(w/w)的纯度。
2.权利要求1的方法，其中所述紫苏醇衍生物的所述特性是形成结晶，以及其中步骤(b)中的分离是通过结晶。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的分离是通过色谱法。
4.权利要求1的方法，其中所述苯甲酸酯是3,5-二硝基苯甲酸酯。
5.权利要求1的方法，其中所述混合物进一步包含天然产物衍生的或其它的杂质。
6.一种包含(S)-紫苏醇的药物组合物，其中所述(S)-紫苏醇的纯度大于98.5％(w/w)。
7.权利要求6的药物组合物，其中在所述药物组合物中所述(S)-紫苏醇为0.1％(w/w)至100％(w/w)。
8.权利要求6的药物组合物，其进一步包含化疗剂。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述化疗剂选自DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、酶抑制剂、受体拮抗剂和治疗性抗体。
10.权利要求8的药物组合物，其中所述化疗剂是二甲基-塞来昔布(DMC)、伊立替康(CPT-11)、替莫唑胺或咯利普兰。
11.权利要求6的药物组合物，其中所述药物组合物在放疗法之前、期间或之后施用。
12.权利要求6的药物组合物，其中所述药物组合物在化疗剂施用之前、期间或之后施用。
13.权利要求6的药物组合物，其中所述药物组合物通过吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内方式施用。
14.权利要求6的药物组合物，其中所述纯度是手性纯度。
15.(S)-紫苏醇在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述(S)-紫苏醇具有大于98.5％(w/w)的纯度。
16.权利要求15的用途，其中所述癌症是神经***的肿瘤。
17.权利要求16的用途，其中所述肿瘤是胶质母细胞瘤。
18.权利要求15的用途，其中所述药物与放疗法联合施用。
19.权利要求15的用途，其中所述药物与化疗剂联合施用。
20.权利要求19的用途，其中所述化疗剂选自DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、酶抑制剂、受体拮抗剂和治疗性抗体。
21.权利要求19的用途，其中所述化疗剂是二甲基-塞来昔布(DMC)、伊立替康(CPT-11)、替莫唑胺或咯利普兰。
22.权利要求15的用途，其中所述(S)-紫苏醇通过吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内的方式递送。
23.权利要求15的用途，其中所述(S)-紫苏醇与治疗剂混合或共配制。
24.权利要求23的用途，其中所述治疗剂是化疗剂。
25.一种包含配制的用于鼻内施用的(S)-紫苏醇和用于鼻内施用(S)-紫苏醇的装置的制品，其中所述(S)-紫苏醇具有大于98.5％(w/w)的纯度。
26.权利要求25的制品，其中所述制品是试剂盒。
27.权利要求25的制品，其中所述装置是鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、定量吸入器(MDI)、压力定量吸入器、吹药器、鼻内吸入器、鼻腔喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶或双向装置。
28.权利要求25的制品，其进一步包含印刷品，其中所述印刷品阐明所述(S)-紫苏醇用于治疗癌症。
29.权利要求28的制品，其中所述印刷品进一步阐明所述(S)-紫苏醇是单独施用，或与放疗法、外科手术或化疗剂联合施用。
30.权利要求28的制品，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。
31.(S)-紫苏醇在制备抑制细胞生长的药物中的用途，其中所述(S)-紫苏醇具有大于98.5％(w/w)的纯度。
32.权利要求31的用途，其中所述细胞是神经胶质瘤细胞、脑膜瘤细胞、垂体腺瘤细胞、肺癌细胞、***癌细胞、***癌细胞、造血癌细胞或卵巢癌细胞。
33.权利要求31的用途，其中所述细胞是抗替莫唑胺的细胞。
34.权利要求31的用途，其中所述细胞是癌症干细胞。
35.权利要求31的用途，其中用有效量的(S)-紫苏醇接触所述细胞，且所述接触是在体外或体内。
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