CN102884183B - 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化 - Google Patents

趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化 Download PDF

Info

Publication number
CN102884183B
CN102884183B CN201180011774.9A CN201180011774A CN102884183B CN 102884183 B CN102884183 B CN 102884183B CN 201180011774 A CN201180011774 A CN 201180011774A CN 102884183 B CN102884183 B CN 102884183B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amylase
variant
acid
starch
alpha
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201180011774.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102884183A (zh
Inventor
C.安德森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN102884183A publication Critical patent/CN102884183A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102884183B publication Critical patent/CN102884183B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/14—Multiple stages of fermentation; Multiple types of microorganisms or re-use of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，所述变体在钙耗竭条件或低pH时稳定性或活性提高。

Description

趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及在酸性pH和/或存在强螯合剂的情况下，与其亲本酶相比具有改进的稳定性的α-淀粉酶的变体。此外，本发明涉及编码所述变体的核酸、产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。
发明背景
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在几个已知应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化(例如在高果糖糖浆的制备中或者作为从淀粉产生乙醇的一部分)中的工业使用具有悠久的历史。α-淀粉酶的这些以及其它应用是已知的，并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
最先使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，也称作Termamyl，其已经得到广泛表征并且已经确定了这个酶的晶体结构。碱性淀粉酶，如AA560(SEQ ID NO:2)，其披露于WO 00/60060中，形成了特殊的α-淀粉酶组，其已经用于洗涤剂中。已经对很多这些已知的细菌淀粉酶进行了修饰，从而改善它们在特定应用中的功能。
Termamyl和很多高效α-淀粉酶的活性都需要钙。在Termamyl的晶体结构中，发现在α-淀粉酶结构中有四个钙原子通过带负电的氨基酸残基配位结合。对于钙的需要在存在强螯合化合物的应用中是不足之处，如在洗涤剂中或从全谷物产生乙醇的过程中，其中使用α-淀粉酶水解包含大量天然螯合剂如肌醇六磷酸(盐)的植物材料。
已知对钙不敏感的淀粉酶，例如，EP 1022334和WO 03/083054中披露的α-淀粉酶，和具有UNIPROT:Q03657中所披露序列的环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)α-淀粉酶，但是在多种应用中进行淀粉水解和淀粉去除时，这些淀粉酶不及对钙敏感的淀粉酶。
因此，提供与其亲本酶相比钙敏感性降低的钙敏感α-淀粉酶的变体是有益的。
发明内容
本发明涉及亲本Termamyl-样α-淀粉酶的分离的变体，其在对应于SEQID NO:2的氨基酸1-485中的位置163、188、205、208和209的两个、三个、四个或五个位置包含改变，其中所述改变独立地为
(i)紧邻所述位置下游的氨基酸的***，
(ii)占据所述位置的氨基酸的缺失，和/或
(iii)占据所述位置的氨基酸的取代，和
其中所述变体具有α-淀粉酶活性。
本发明的变体进一步包含一个或多个其它取代。
此外，所述分离的变体可以包含已知可改善α-淀粉酶性能的其他改变，包括对应于氨基酸183和184的缺失和在位置186、193、195、202、206、214、244、452、474和475中一个或多个位置的取代，并且每个位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
本发明的变体与亲本α-淀粉酶相比，钙敏感性降低。
本发明还涉及编码变体α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的多肽的分离的核苷酸序列，和包含所述核苷酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞。
还提供用于制备本发明的变体的方法。
本发明还涉及包含本发明的变体的组合物，特别是洗涤剂添加剂组合物、洗涤剂组合物、用于手动或自动洗涤餐具的组合物或用于手动或自动洗涤衣物的组合物。此外，本发明涉及根据本发明的α-淀粉酶变体用于洗涤和/或餐具洗涤、织物退浆和淀粉液化的用途。本发明还涉及使用本发明的变体产生乙醇或其它化学品的方法。
发明详述
定义
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
改进的pH稳定性：术语“改进的pH稳定性”在本文中定义为在特定pH温育一段时间后显示酶活性保留的变体酶，所述pH可降低亲本酶的酶活性。改进的pH稳定性还可以产生在这种pH条件下能更好地催化反应的变体。
分离的变体：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
亲本酶：本文使用的术语“亲本”α-淀粉酶指对其进行修饰，例如，取代，***，缺失，和/或截短而产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。这个术语还指与变体进行比较和比对的多肽。亲本可为天然存在(野生型)的多肽，或可为通过任何适当手段制备的变体。例如，亲本蛋白质可为天然存在的多肽的变体，其经过修饰或者在氨基酸序列中发生改变。亲本还可为等位变体，其为由占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任一种编码的多肽。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gapextension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL (NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
变体：术语“变体”在本文中定义为在多肽的一个或多个特定位置包含一个或多个氨基酸残基的一个或多个改变，如取代、***、缺失和/或截短的α-淀粉酶。
野生型酶：术语“野生型”α-淀粉酶表示由天然存在的微生物，如在自然界中发现的酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。
变体命名规则
在本发明中，采用α-淀粉酶变体中氨基酸残基位置的特定编号方式。例如，通过比对已知α-淀粉酶的氨基酸序列，可以用氨基酸位置编号命名任何α-淀粉酶酶中的任何氨基酸残基。
使用源于SEQ ID NO:2中披露的α-淀粉酶氨基酸序列的编号***，与大量其它α-淀粉酶的氨基酸序列比对，可以表示结构同源性区域中α-淀粉酶中的氨基酸残基的位置。
在描述本发明的多种α-淀粉酶变体时，为便于提述，适用下述命名法。在所有情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变用加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突变，分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。在详明特定位置(其中根据实际的亲本可以由不同氨基酸占据所述位置)的氨基酸取代的情况中，原始氨基酸可以表示为X或Xaa。例如“X226A”意指占据位置226的氨基酸用A或Ala取代，与原始序列(亲本序列)中占据位置226的氨基酸无关。
缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法：原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失用加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
***。对于氨基酸***，使用下述命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新***氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面***赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的***表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新***氨基酸#1、新***氨基酸#2，等等]。例如，在位置195的甘氨酸后面***赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这种情况下，通过向***的氨基酸残基前面的氨基酸残基位置编号加小写字母来对***的氨基酸残基编号。因此在上述实例中序列为：
  亲本：   变体：
  195   195 195a 195b
  G   G-K-A
简并标识。对于简并标识，当***与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基时，命名方法中的简并性上升。例如，上述实例中甘氨酸后面***的甘氨酸表示为“G195GG”。如果位置194存在的是丙氨酸，相同的实际变化也可表示为“A194AG”：
  亲本：   变体：
  编号I：   194 195   194 195 195a
  序列：   A-G   A-G-G
  编号II：   194 194a 195
这些实例对于技术人员显而易见，并且因此标识“G195GG”和这类***的相应的标识意欲包含这些等同的简并标识。
如果亲本多肽和/或变体中出现重复的氨基酸序列区段，等同的简并标识增加，并且当除***之外的改变如缺失和/或取代列出时，等同的简并标识也增加。例如，来自位置194-97的序列“AGAG”中两个连续氨基酸“AG”的缺失可写成“A194*+G195*”或“A196*+G197*”：
  亲本：   变体：
  编号I：   194 195 196 197   194 195
  序列：   A-G-A-G   A-G
  编号II：   196 197
多个修饰。包含多个修饰的变体用加号(“+”)分隔，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和195分别用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala,Ser,Thr+Arg170Gly,Ala,Ser,Thr”表示下述变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Gly+Arg170Ser”、“Tyr167Gly+Arg170Thr”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、“Tyr167Ala+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Ser”、“Tyr167Ala+Arg170Thr”、“Tyr167Ser+Arg170Gly”、“Tyr167Ser+Arg170Ala”、“Tyr167Ser+Arg170Ser”、“Tyr167Ser+Arg170Thr”、“Tyr167Thr+Arg170Gly”、“Tyr167Thr+Arg170Ala”、“Tyr167Thr+Arg170Ser”，和“Tyr167Thr+Arg170Thr”。
这种命名法具体与修饰相关，所述修饰涉及取代、***或缺失具有特定通用性质的氨基酸残基。这些修饰称为保守氨基酸修饰。保守修饰的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳族氨基酸组(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸组(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，以及反向交换(Taylor,1986,Journal of Theoretical Biology119:205-218;compbio.dundee.ac.uk/papers/amas/amas3d.html)。
亲本α-淀粉酶
亲本α-淀粉酶原则上可以是任何α-淀粉酶，由所述酶理想地制备在低pH具有改进的稳定性的变体。α-淀粉酶已知源自多种生物体，包括细菌，如来自芽孢杆菌属的菌种，例如，地衣芽孢杆菌；来自真菌的菌种，如米曲霉(Aspergillusoryzae)(TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus niger)；来自植物如大麦和来自哺乳动物。亲本α-淀粉酶原则上可为与来源无关的任何所述α-淀粉酶。
Termamyl-样α-淀粉酶
公知由芽孢杆菌属菌种产生的很多α-淀粉酶，它们在氨基酸水平以及结构水平高度同源。例如，已经发现包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(商业上可作为TermamylTM得到)与包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloquefaciens)α-淀粉酶为约81%同源，而与包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶为约60%同源。其它同源的α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属菌种NCIB12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的菌株的α-淀粉酶(其全部在WO95/26397中详细描述)，以及由Tsukamoto等,1988,Biochemical and BiophysicalResearch Communications 151:25-31所述的SP#707α-淀粉酶。
另外的同源α-淀粉酶包括由EP 0252666中所述的地衣芽孢杆菌菌株(ATCC 27811)产生的α-淀粉酶，和WO 91/00353和WO 94/18314中鉴定的α-淀粉酶。其它商业的Termamyl-样α-淀粉酶包含在以下述商品名销售的产物中：OptithermTM和TakathermTM(可由Solvay获得)；MaxamylTM(可由Gist-brocades/Genencor获得)，Spezym AATM和Spezyme Delta AATM，SpezymeFRED(可由Genencor获得)，和KeistaseTM(可由Daiwa获得)，PurastarTM ST5000E，PURASTRATM HPAM L(来自Genencor Int.)。
由于在这些α-淀粉酶之间发现的基本同源性，将它们视为属于同类α-淀粉酶，即“Termamyl-样α-淀粉酶”类型。
因此，在本文中，术语“Termamyl-样α-淀粉酶”意指α-淀粉酶，其在氨基酸水平表现为与TermamylTM(即，包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)基本同源。换言之，Termamyl-样α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列，和WO 95/26397的SEQ ID NO:1或2或Tsukamoto等(1988)中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶，或者黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)淀粉酶，WO 2005/001064中所述的AMY1048，或者具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的α-淀粉酶TS-22；或者具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的α-淀粉酶TS-23，如J.Appl.Microbiology,1997,82:325-334(SWALL:q59222)中所述；或者源自芽孢杆菌属菌种KSM-AP1378(FERMBP-3048)的具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的α-淀粉酶，如WO 97/00324中所述，或者源自芽孢杆菌属菌种A7-7的具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的α-淀粉酶，如WO 02/10356所述，或者具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的噬纤维菌属(Cytophaga)α-淀粉酶，如Jeang等,2002,Appl.Environ.Microbiol.68:3651-3654所述，或者源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(Spezyme Xtra)，其具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；或由EP 0252666中所述地衣芽孢杆菌菌株(ATCC 27811)产生的α-淀粉酶或WO 91/00353和WO94/18314中披露的α-淀粉酶或i)其与至少一个所述氨基酸序列显示出至少60%，优选至少70%，更优选至少75%，甚至更优选至少80%，特别地至少85%，特别优选至少90%，甚至特别更优选至少95%同源性，更优选至少97%，更优选至少99%同源性，和/或ii)与针对至少一种所述α-淀粉酶产生的抗体显示免疫交叉反应性，和/或iii)由可与编码上述α-淀粉酶的DNA序列杂交的DNA序列编码，所述α-淀粉酶明显地分别来自本申请的SEQ ID NO:1、3和5和WO 95/26397的SEQ ID NO:4和5。
在一个优选的实施方案中，亲本Termamyl-样α-淀粉酶是SEQ ID NO:10(WO 95/26397的SEQ ID NO:2)，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:2，其中包括下述的任一个：[SEQ  ID NO:10]+R181*+G182*，[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+N195F；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+M202L；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+N195F+M202L；[SEQID NO:10]+D183*+G184*+R181Q；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K；[SEQ ID NO:8]+I181*+G182*；[SEQ ID NO:8]+I181*+G182*+N193F；[SEQ ID NO:8]+I181*+G182*+M200L；[SEQ ID NO:8]+I181*+G182*+N193F+M200L；[SEQ IDNO:10]+D183*+G184*；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+N195F；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+M202L；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+N195F+M202L；[SEQ ID NO:10]+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K。
[SEQ ID NO:8]+I181*+G182*+N193F”意指将具有SEQ ID NO:8的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶进行如下突变：在位置I181和G182的缺失和在位置193由Asn(N)至Phe(F)的取代。
亲本杂合α-淀粉酶
亲本α-淀粉酶可为杂合α-淀粉酶，即，α-淀粉酶，其包含源自至少两个α-淀粉酶的部分氨基酸序列的组合。
亲本杂合α-淀粉酶可为一种α-淀粉酶，其根据氨基酸同源性和/或免疫交叉反应性和/或DNA杂交(如上所定义的)可以确定为属于Termamyl-样α-淀粉酶家族。在这种情况下，杂合α-淀粉酶通常由至少一部分Termamyl-样α-淀粉酶和选自微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的Termamyl-样α-淀粉酶或非Termamyl-样α-淀粉酶的一个或多个其它α-淀粉酶的部分组成。
因此，亲本杂合α-淀粉酶可以包含源自至少两个Termamyl-样α-淀粉酶，或者来自至少一个Termamyl-样和至少一个非Termamyl-样细菌α-淀粉酶，或者来自至少一个Termamyl-样和至少一个真菌α-淀粉酶的部分氨基酸序列的组合。部分氨基酸序列来源的Termamyl-样α-淀粉酶可为，例如本文提述的那些特定Termamyl-样α-淀粉酶中的任何一个。
例如，亲本α-淀粉酶可以包含源自地衣芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶的C-末端部分，和源自解淀粉芽孢杆菌菌株或嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶的N-末端部分。例如，亲本α-淀粉酶可以包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的C-末端部分的至少430个氨基酸残基，并且可以，例如，包含a)对应于具有SEQID NO:6中所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基的氨基酸区段和对应于具有SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基的氨基酸区段，或b)对应于具有SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的68个N-末端氨基酸残基的氨基酸区段和对应于具有SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的415个C-末端氨基酸残基的氨基酸区段。
在一个优选的实施方案中，亲本Termamyl-样α-淀粉酶是杂合Termamyl-样α-淀粉酶，其与SEQ ID NO:4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶同一，只是(成熟蛋白质的)N-末端35个氨基酸残基被SEQ ID NO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)的成熟蛋白质的N-末端33个氨基酸残基替代。所述杂合体可以进一步具有下述突变：H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (使用SEQ ID NO:4中的编号)，称作LE174。
非Termamyl-样α-淀粉酶可为，例如，真菌α-淀粉酶，哺乳动物或植物α-淀粉酶或细菌α-淀粉酶(不同于Termamyl-样α-淀粉酶)。这类α-淀粉酶的特定实例包括米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKAα-淀粉酶，黑曲霉(A.niger)酸性α-淀粉酶，枯草芽孢杆菌α-淀粉酶，猪胰脏α-淀粉酶和大麦α-淀粉酶。所有这些α-淀粉酶具有阐明的结构，其与本文提述的典型的Termamyl-样α-淀粉酶的结构有显著差异。
上文提及的真菌α-淀粉酶，即，源自黑曲霉和米曲霉的α-淀粉酶，在氨基酸水平高度同源，并且通常被视为属于α-淀粉酶的相同家族。源自米曲霉的真菌α-淀粉酶商业上可以商品名FungamylTM得到。
此外，当提述Termamyl-样α-淀粉酶的具体变体(本发明的变体)时-以常规方式-通过提述特定Termamyl-样α-淀粉酶的氨基酸序列中的特定氨基酸残基的修饰(例如，缺失或取代)，可理解的是其中涵盖在等同位置(如根据各个氨基酸序列之间最佳氨基酸序列比对所确定的)修饰的另一种Termamyl-样α-淀粉酶的变体。
本发明的一个优选变体是来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(作为亲本Termamyl-样α-淀粉酶)的变体，例如，上文提述的变体之一，如具有SEQ IDNO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。
变体
本发明涉及亲本Termamyl-样α-淀粉酶的分离的变体α-淀粉酶，其在对应于亲本α-淀粉酶中的选自下组的位置的位置包含两个、三个、四个或五个氨基酸改变：163、188、205、208和209；所述改变独立地为
(i)紧邻所述位置下游的氨基酸的***，
(ii)占据该位置的氨基酸的缺失，和/或
(iii)占据该位置的氨基酸的取代，
其中所述变体具有α-淀粉酶活性，并且与亲本α-淀粉酶相比具有降低的钙敏感性，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
变体可为天然或非天然变体，其中天然变体应理解为由并非人类操作对象的天然存在的生物体分离的α-淀粉酶。非天然变体是已经由其天然副本(counterpart)，亲本α-淀粉酶，使用技术如野生型生物体的突变和变体α-淀粉酶的分离、涉及编码亲本α-淀粉酶的核酸的分离和操作的技术或编码所述酶的核酸的变体的化学合成，通过人类干预而进行修饰的变体。很多这种技术在本领域中可以使用，并且技术人员了解这类技术能用于本发明中。
本发明的变体一般使用至少一个分离步骤分离，并且因此本发明不在其天然环境中应用天然酶。
根据本发明的变体具有比其亲本α-淀粉酶针对钙耗竭较不敏感的益处，但同时它们保持了亲本α-淀粉酶的性能特征。在钙耗竭环境和/或酸性条件下，在特定α-淀粉酶的活性和/或稳定性中证明了对钙的敏感性。钙耗竭环境出现在α-淀粉酶的很多已知应用中，如在存在强螯合剂结合金属离子，特别是钙离子时，例如，在洗涤剂中，此时通常包括强螯合剂，因为其对洗涤过程的有益效果，或者在存在包括天然螯合剂如植酸(盐)或柠檬酸(盐)的植物材料的条件下。这种强螯合剂会与竞争钙离子，并且在一定程度上能夺取钙敏感α-淀粉酶结构中结合的钙离子，结果降低钙敏感α-淀粉酶的稳定性或活性。
酸性条件也可影响钙敏感α-淀粉酶的稳定性或活性。人们相信低pH可导致与敏感α-淀粉酶中钙离子配位的氨基酸残基的质子化，结果是它们不再能够结合钙，而结果是损失稳定性和/或活性。作为α-淀粉酶暴露于酸性条件的应用实例，可提及α-淀粉酶在消化疾病的治疗中的用途，如WO2006/136161中披露的，以及在饲料中的用途。
因此，本发明的变体具有至少一项下述性质：在存在强螯合剂的情况下改进的稳定性和/或活性和/或在低pH改进的稳定性和/或活性，并且可以理解的是，在本说明书和权利要求中，具有降低的钙敏感性的变体在存在强螯合剂的情况下具有改进的稳定性和/活性和/或在低pH具有改进的稳定性和/或活性。
可以使用本领域已知的方法估计螯合剂强度，如Anal.Biochem.314:227-234(2003)和JAOCS 61(9):1475-1478(1984)中披露的方法。作为可用于这种试验中的强螯合剂的实例可提及EGTA(乙二醇四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、DTMPA(二亚乙基三胺-五-亚甲基膦酸)和HEDP(1-羟基乙-1,1-二基双(膦酸))。技术人员能选择可用于确定α-淀粉酶的钙敏感性的其它强螯合剂。
在本发明中，亲本Termamyl-样α-淀粉酶的分离的变体在两个、三个、四个或五个位置包含改变，所述位置对应于亲本α-淀粉酶中选自下组的位置：163、188、205、208和209，其中改变独立地为
(i)紧邻所述位置下游的氨基酸的***，
(ii)占据该位置的氨基酸的缺失，和/或
(iii)占据该位置的氨基酸的取代，
其中所述变体具有α-淀粉酶活性；并且每个位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
优选地，所述变体在三个位置，更优选四个位置，甚至更优选五个位置，并且最优选六个位置包含改变，所述位置对应于亲本α-淀粉酶中选自下组的位置：163、188、205、208和209，使用SEQ ID NO:2进行编号。
改变可以选自：
X163A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V,W，Y，优选为X163Q或X163N；
X188A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V,W，Y，优选为X188N；
X205A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V,W，Y，优选为X205N；
X208A,C,D,E，F，G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T，V,W,Y，优选为X208F或X208Y；和
X209A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V,W,Y，优选为X209S或X209N。
优选的变体包含突变D163Q+D188N+D209N,S  或突变D163Q,N+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W。
变体可以进一步在亲本α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基中包含其它改变。
优选的进一步改变包括用具有SEQ ID NO:9的环状芽孢杆菌α-淀粉酶的相应氨基酸或芽孢杆菌属菌种KSM-K38α-淀粉酶SEQ ID NO:11的相应氨基酸取代亲本α-淀粉酶的B-结构域中的一个或多个氨基酸的改变。在亲本α-淀粉酶的B-结构域中特定氨基酸残基在SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中缺失的情况下，优选的改变是特定氨基酸的缺失。技术人员了解所述用SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11中相应的氨基酸取代亲本α-淀粉酶的B-结构域中的氨基酸残基仅与两个氨基酸序列中存在差异的位置有关。因此，这一组中可能的改变的数目依赖于特定的亲本α-淀粉酶和亲本α-淀粉酶与具有SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11中所示序列的α-淀粉酶之间的序列同一性。
发明人已经发现这些进一步的改变使变体与亲本α-淀粉酶相比具有甚至更低的钙敏感性。
α-淀粉酶的B-结构域在本领域中公知，并且本领域中已知的用于鉴定B-结构域的方法也可以用于本发明。可以通过结构分析确定α-淀粉酶的B-结构域，如通过使用结晶技术鉴定给定α-淀粉酶的结构域结构。例如，Machius等,1995,j.Mol.Biol.4:545-559和Machius等,1998,Structure 6:281-292，将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的B-结构域鉴定为残基104-204；Brzozowski等,2000,Biochemistry39:9099-9017将由解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸1-300和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸残基301-483组成的杂合α-淀粉酶中的B-结构域鉴定为残基104-205；Suvd等,2001,J.Biochem.129:461-468鉴定了嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的B-结构域，而Nonaka等(2008)鉴定了来自芽孢杆菌属菌种KSM-K38的α-淀粉酶的B-结构域。
对给定α-淀粉酶确定B-结构域的可选方法是给定α-淀粉酶和B-结构域已经确定的α-淀粉酶的氨基酸序列的序列比对。比对两个序列并且就本发明而言，与B-结构域已经确定的α-淀粉酶中的B-结构域序列对齐的给定α-淀粉酶序列中的序列可以视为给定α-淀粉酶的B-结构域。这个方法特别适合于得不到三维结构的α-淀粉酶。然而，对于根据α-淀粉酶的三维结构确定B-结构域的α-淀粉酶，在通过比对确定的B-结构域与根据结构确定的B-结构域不同时，应该优先使用通过后一种方法确定的B-结构域。
本发明的变体甚至可以包含其他本领域已知的可提高α-淀粉酶性能的改变。例如根据WO 94/18314和WO 94/02597的教导，将可氧化的氨基酸残基用不可氧化的氨基酸残基取代，从而改进氧化条件下(例如，在存在漂白剂的情况下)酶的稳定性，所述文献通过提述并入本文。
根据WO 96/23873的教导，可以在对应于SEQ ID NO:2中的R181+G182或T183+G184的位置引入两个氨基酸的缺失，所述文献通过提述并入本文。
可以引入本发明的变体的其它有益的取代可见于WO 99/23211、WO01/66712、WO 02/10355和WO 2006/002643，所述文献全部通过提述并入本文。
作为优选的其它改变的实例可提及D183*+G184*，G186A,Y,T，T193F，N 195F，M202L,I,T，S,A，I206F，Y，V214I，S244A,D,E,N,Q,W，T452H,Y，G474R，G475R，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。技术人员可理解能从其它α-淀粉酶开始鉴定并进行相应的改变。
本发明的变体中氨基酸取代的数目包含优选少于60个取代，更优选少于55个取代，更优选少于50个取代，更优选少于45个取代，更优选少于40个取代，更优选少于35个取代，更优选少于30个取代，更优选少于25个取代，更优选少于20个取代，更优选少于15个取代，最优选少于10个取代。
本发明的变体优选与其亲本α-淀粉酶至少70%相同，更优选与其亲本α-淀粉酶至少75%相同；更优选与其亲本α-淀粉酶至少80%相同，更优选与其亲本α-淀粉酶至少85%相同，更优选与其亲本α-淀粉酶至少90%相同，更优选与其亲本α-淀粉酶至少95%相同，并且最优选与其亲本α-淀粉酶至少98%相同。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但是低于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但是低于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但是低于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但是低于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但是低于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99％，但是低于100%的序列同一性。
在一个优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:2中所披露的序列的α-淀粉酶。在这个实施方案中，根据本发明的优选的取代选自：D163Q,N，D188N，D205N，M208Y和D209N。
SEQ ID NO:2的B-结构域中的改变包括改变：A113E，M116V，V117F，R118K，A119V，V120I，N123D，N126D，N128T，Q129K，G133E，D134P，Y135F，T136E，A139G，D144T，N150D，T151Q，H152Y，N154S，R158N，W159S，Y160E，V165T，W167F，Q169A，S170R/K，R171E/G，K172E，L173R，N174*，N175T，R176G，I177V，Y178F，K179R，F180I，R181A，D183E，G184N，A186K，W189E，E190N，T193D，N195F，Y203F，E212D，V214R和N215R。
作为已知可以增加α-淀粉酶性能的其它改变的实例可提及：D183*+G184*，G186A,Y或T，T193F，N195F，M202X优选L,I,T,S或A，I206F或Y，V214I，S244A,D,E，N,Q或W，T452H或Y，G474R和G475R。
根据这个实施方案优选的变体包括：
D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G182A+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；
N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G183N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+H408W+N409D+D432N+A434P；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+D163N+R181A+G182A+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+D163N+R181A+G183N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+H408W+N409D+D432N+A434P；
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+D163N+R181A+G182A+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；
D188N+D209S；
D163N+D188N+D209S；
D163N+D188N+D205N+D209S；
D163N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D207N+D209S；
D163N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；和
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S。
在另一个优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:10中所披露的序列的SP722。在这个实施方案中，根据本发明的优选的取代选自：D163Q,N，D188N，D205N，M208Y和D209N。
SEQ ID NO:10的B-结构域中的改变包括改变：A113E，N116V，V117F，L118K，A119V，V120I，N123D，N126D，N128T，Q129K，G133E，D134P，Y135F，T136E，A139G，D144T，N150D，T151Q，D154S，R158N，W159S，Y160E，V165T，W167F，Q169A，S170R或K，R171E或G，Q172E，F173R，Q174*，N175T，R176G，I177V，Y178F，K179R，F180I，R181A，D183E，G184N，A186K，W189E，E190N，S193D，N195F，Y203F，V206I，E212D，V214R和N215R。
作为已知可增加α-淀粉酶的性能的其它改变的实例可提及：D183*+G184*，A186Y或T，S193F，N195F，M202X，优选为L，I,T,S或A，I206L或F，V214I，S244A,E或Q，H452Y，G474R和G475R。
作为根据这个实施方案的优选变体的实例可提及：
D188N+D209S；
D163N+D188N+D209S；
D163N+D188N+D205N+D209S；
D163N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D207N+D209S；
D163N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；和
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S。
在另一个优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:8中所披露的序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。在这个实施方案中，优选的取代选自：D162Q,N，D186N，D203N，M206Y和D207N。
SEQ ID NO:8的B-结构域中的改变(其中氨基酸用来自具有序列SEQ ID NO:9的α-淀粉酶的相应氨基酸取代，或者在不存在相应氨基酸的情况下的缺失)包括改变：D105N，G108A，G112E，W115V，V116F，D117K，A118V，V119I，N122D，S124N，N127T，Q128K，G132E，T133P，Y134F，Q135E，A138G，D143T，N149D，T150Q，R157N，W158S，Y159E，V164T，W166F，E168A，S169K，R170G，K171E，L172R，S173T，R174G，I175V，Y176F，K177R，F178I，R179A，I181E，G182N，A184K，W187E，E188N，T191D，Y201F，L204I和E210D。
已知可增加α-淀粉酶性能的其它改变的实例为：I181*+G182*，A184Y/T，N191F，N193F，M200X优选L,I,T，S或A，L204F，M206Y，V212I，S242A,D,E,N或Q，H296Y，G474R和G475R。
根据这个实施方案的优选变体的实例包括：
D207N+D186N；
D207N+D186N+D162N；
D207N+D186N+D162N+D203N；
D207N+D186N+D162N+D203N+M206Y；
D207N+D186N+D162N+D203N+M206Y+D 105N；
D207N+A184K+W187E；
D162N+A184K+D186N+D207N；
D207N+A184K+W187E+D186N；
D207N+A184K+W187E+D186N+D162N；
D207N+A184K+W187E+D186N+D162N+D203N；
D207N+A184K+W187E+D186N+D162N+D203N+M206Y；和
D207N+A184K+W187E+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105N。
其它优选的亲本α-淀粉酶包括：WO 2005/001064中的SEQ ID NO:2，具有序列SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，具有SEQ ID NO:6的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，源自芽孢杆菌属菌种的菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶，其所有在WO 95/26397中详细描述，以及由Tsukamoto 等,1988,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,151:25-31所述的#707α-淀粉酶和源自KSM-Ap 1378并在WO 94/26881中描述的α-淀粉酶。
核苷酸序列
克隆编码α-淀粉酶的DNA序列
使用本领域公知的各种方法，可以从产生目的α-淀粉酶的任何细胞或微生物分离编码亲本α-淀粉酶的DNA序列。首先，使用来自产生待研究α-淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列已知，可以合成同源的带标记寡核苷酸探针，并用于从由目的生物体制备的基因组文库鉴定编码α-淀粉酶的克隆。任选地，使用较低严格性的杂交和洗涤条件，可将包含与已知α-淀粉酶基因同源的序列的带标记寡核苷酸探针用作探针来鉴定编码α-淀粉酶的克隆。
鉴定编码α-淀粉酶的克隆的另一种方法涉及将基因组DNA片段***表达载体，如质粒中，用得到的基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性细菌，然后将转化的细菌涂布在包含α-淀粉酶底物的琼脂上，从而鉴定表达α-淀粉酶的克隆。
或者，可以通过已建立的标准方法，例如，由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)方法或由Matthes等(1984)所述的方法合成制备编码酶的DNA序列。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体中。
最后，DNA序列可为混合的基因组和合成来源的，混合的合成和cDNA来源的或混合的基因组和cDNA来源的，根据标准技术，通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的片段而制备(适当地，片段对应于完整DNA序列的各个部分)。还可以使用特异性引物，例如US 4,683,202或Saiki等(1988)中所述，通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列。
定点突变
一旦分离到编码α-淀粉酶的DNA序列，并鉴定了突变的理想位点，可以使用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含理想的突变位点侧翼的核苷酸序列；在寡核苷酸合成过程中***突变的核苷酸。在特定的方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中产生DNA的单链缺口，其跨接(bridging)编码α-淀粉酶的序列。然后，将携带理想突变的合成核苷酸退火至单链DNA的同源部分。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填补剩余缺口并使用T4连接酶连接构建体。这种方法的具体实例如Morinaga等(1984)中所述。US 4,760,025披露通过对盒进行微小改变而引入编码多个突变的寡核苷酸。然而，通过Morinaga方法能在任一次操作中引入甚至更多种的突变，因为能够引入各种长度的大量寡核苷酸。
另一种将突变引入编码α-淀粉酶的DNA序列的方法如Nelson和Long (1989)中所述。方法涉及3个步骤，使用化学合成的DNA链作为PCR反应的引物之一而产生包含理想的待导入突变的PCR片段。根据PCR产生的片段，可以通过用限制性内切酶剪切分离携带突变的DNA片段，并将其重新***表达质粒。
同源性(同一性)
可以通过两个序列之间的同一性程度确定同源性，说明第一个序列和第二个序列之间的偏差。通过本领域已知的计算机程序如GCG程序包(上述)中提供的GAP，可以合适地确定同源性。因此，可以使用Gap GCGv8，采用同一性的默认评分矩阵和下述默认参数：GAP产生罚分5.0和GAP延伸罚分0.3，分别用于核酸序列比较，而GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1，分别用于蛋白质序列比较。GAP使用Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453的方法，进行比对并计算同一性。
可以使用Termamyl和Termamyl-样α-淀粉酶之间的结构比对鉴定其它Termamyl-样α-淀粉酶中等同/相应的位置。获得所述结构比对的一个方法是使用来自GCG软件包的Pile Up程序，使用缺口罚分的默认值，即，缺口产生罚分3.0和缺口延伸方法0.1。其它结构比对方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等,1987,FEBS Letters 224:149-155)和反向穿线(Huber等,1998,ProteinScience 7(1):142-149)。α-淀粉酶的性质ii)，即，免疫交叉反应性，可以使用针对相关Termamyl-样α-淀粉酶的至少一个抗原表位或与其有反应性的抗体测试。所述抗体，其可为单克隆或多克隆，可以通过本领域已知的方法产生，例如，如Hudson等,Practical Immunology,第3版(1989),Blackwell ScientificPublications所述。可以使用本领域已知的测定法确定免疫交叉反应性，所述方法的实例为Western印迹或射线免疫扩散测定法，例如，Hudson等,1989中所述。在这个方面，已经发现了分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、4、6或8的α-淀粉酶之间的免疫交叉反应性。
杂交
可以根据目的α-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列，适当地制备用于表征Termamyl-样α-淀粉酶的寡核苷酸探针。
测试杂交的适当条件包括在5xSSC中预浸渍并在~40°C在20%甲酰胺、5xDenhardt溶液、50mM磷酸钠，pH 6.8和50mg变性的声处理的小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，然后在补加100mM ATP的相同溶液中在~40°C杂交18小时，然后在2xSSC、0.2%SDS中于40°C洗涤滤膜三次，共30分钟(低严格性)，优选50°C(中等严格性)，更优选65°C(高严格性)，甚至更优选~75°C(非常高严格性)。关于杂交方法的更多细节可见于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,1989。
在本发明中，“源自”不仅意指由或可由目的生物体的菌株产生的α-淀粉酶，还指由分离自这种菌株的DNA序列编码和在用所述DNA序列转化的宿主生物中产生的α-淀粉酶。最后，所述术语意指α-淀粉酶，其由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码，并且其具有鉴定目的α-淀粉酶的性质。所述术语也意指亲本α-淀粉酶可以是天然存在的α-淀粉酶的变体，即，变体，其是天然存在的α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基修饰(***、取代、缺失)的结果。
变体α-淀粉酶的产生
可以使用本领域公知的方法产生本发明的变体α-淀粉酶。通常地，提供编码亲本α-淀粉酶的DNA序列，并且使用本领域已知的技术在核酸序列中产生理想的改变。
为编码本发明理想变体α-淀粉酶的产生的DNA序列提供适当的调控序列，如启动子、终止子、活化位点、核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点等，并将其引入适当的宿主细胞中。最后在导致根据本发明的变体α-淀粉酶表达的条件下使包含所述DNA的宿主细胞生长。
所有这些技术在本领域中已知，并且在本领域平均从业人员的技术水平之内，所述人员可以使用公知教科书，如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,1989中披露的技术规定产生本发明的给定变体α-淀粉酶的适当方法。
关于变体α-淀粉酶的制备的进一步教导可见于WO 2006/002643，所述文献通过提述并入本文，并且技术人员理解这种教导也适用于本发明。
组合物
本发明还涉及包含α-淀粉酶变体和至少一种其它酶的组合物。其它酶选自下组：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶，支链淀粉酶，和/或其它可在商业过程中与α-淀粉酶联合使用的酶。其它酶还可以是另一种α-淀粉酶。这类酶在淀粉加工、糖转化、醇和其它有用的终产物的发酵、商业洗涤剂和清洁辅助用品、去污、纤维处理或脱浆等中为本领域所知。
使用α-淀粉酶变体的方法-工业应用
本发明的变体具有可用于多种工业应用中的宝贵性质。具体地，所述变体可以用于洗涤剂中，特别是洗衣洗涤剂组合物和餐具洗涤洗涤剂组合物，硬表面清洁组合物，和用于对织物、纤维或衣物脱浆，纸浆和纸的生产，啤酒制造，乙醇生产，和淀粉转化过程。
α-淀粉酶变体可用于淀粉过程，具体为淀粉转化，特别是淀粉的液化(参见，例如，美国专利No.3,912,590，EP 252730和EP 063909，WO 99/19467，和WO 96/28567，其通过提述全部并入本文)。还涵盖用于淀粉转化目的的组合物，其可以除本发明的变体之外还包含AMG、支链淀粉酶和其它α-淀粉酶。
此外，所述变体特别用于由淀粉或全谷物产生甜味剂和乙醇(参见，例如，美国专利No.5,231,017，其通过提述并入本文)，如燃料、饮用和工业乙醇。
所述变体还可以用于织物、纤维和衣物的脱浆(参见，例如，WO 95/21247，美国专利4,643,736，和EP 119920，其通过提述并入本文)，啤酒制造或酿造，和在纸浆和纸生产或相关过程中。
淀粉加工
天然淀粉由微观颗粒组成，其在室温时不溶于水。当加热含水的淀粉浆时，颗粒膨胀并最终爆裂，使淀粉颗粒分布于溶液中。在这个“糊化”过程中，粘度急剧增加。因为典型工业过程中的固体水平为30-40%，所以淀粉必须稀化或“液化”，使其能进行适当加工。在当前的商业实践中，这种粘度下降主要通过酶降解而获得。
常用的淀粉-转化过程，如液化和糖化过程，如美国专利No.3,912,590、EP 252730和EP 063909所述，其通过提述并入本文。
在一个实施方案中，将淀粉降解至较低分子量碳水化合物组分如糖或脂肪替代物的转化过程包括脱支(debranching)步骤。
将淀粉转化成糖时，将淀粉解聚。这种解聚过程由例如，预处理步骤和两个或三个连续加工步骤组成，即液化过程、糖化过程，并且依赖于理想的终产物，任选地包括异构化过程。
当理想的最终糖产物是，例如，高果糖糖浆时，可以将右旋糖糖浆转化成果糖。在糖化过程之后，pH增加至6-8，优选pH 7.5的值，并且通过离子交换去除钙。然后使用，例如，固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
通常地，由全谷物生产醇(乙醇)可以分成4个主要步骤：磨制、液化、糖化和发酵。
磨制谷物以打开结构以便于进一步加工。使用的两个过程是湿磨或干磨。在干磨中，磨制完整的谷粒，并用于过程的其余部分中。湿磨能够非常好地分离胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)，并且大都在平行生产糖浆的场合使用。
在液化过程中，通过水解将淀粉颗粒溶解成大部分DP大于4的麦芽糊精。可以通过酸处理或α-淀粉酶的酶处理进行水解。酸水解用途有限。原材料可以是磨制的全谷物或淀粉加工的侧流。
在典型的酶解液化过程中，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解成更短的支链和直链单元(麦芽糊精)。酶解液化通常以三步热浆过程进行。将浆料加热至60-95°C (例如，77-86°C，80-85°C，或83-85°C)，并且加入酶。在85°C进行1-2小时的液化过程。pH通常为5.5-6.2。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，加入1mM钙(提供约40ppm游离钙离子)。在这种处理后，液化淀粉具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
然后将浆料蒸汽加热(jet-cook)至95-140°C，例如，105-125°C，冷却至60-95°C，并加入更多的酶以实现最终水解。液化过程在pH 4.5-6.5，通常在pH 5-6进行。磨制并液化的谷粒也称作醪。
在存在糖化酶如葡糖淀粉酶的情况下将含液化淀粉的材料糖化。糖化过程可以持续12-120小时(例如，12-90小时，12-60小时和12-48小时)。
然而，通常在30-65°C，通常约60°C的温度进行约30分钟至2小时(例如，30-90分钟)的预糖化步骤，然后在发酵过程中完全糖化，其称作同时糖化和发酵(SSF)。pH通常为4.2-4.8，例如，4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而是酵母和酶一起加入。
在典型的糖化过程中，通过加入葡糖淀粉酶和脱支链酶，如异淀粉酶(美国专利No.4,335,208)或支链淀粉酶，将液化过程中产生的麦芽糊精转化成右旋糖。在加入葡糖淀粉酶和脱支链酶之前，温度降至60°C。糖化过程进行24-72小时。
在加入糖化酶之前，pH降至4.5以下，并保持高温(高于95°C)，使液化α-淀粉酶失活。这个过程减少短寡糖(称作“潘糖前体”)的形成，其不能由脱支链酶正确水解。通常，约0.2-0.5%的糖化产物是支链三糖潘糖(Glc pα1-6Glcpα1-4Glc)，其不能由支链淀粉酶降解。如果来自液化的活性淀粉酶在糖化过程中仍然存在(即，未变性)，潘糖的量可以高达1-2%，其极为不理想，因为会显著降低糖化产率。
由酶促糖化产生可发酵的糖(例如，糊精、单糖，具体为葡萄糖)。这些可发酵的糖进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。此外，糖可以用作微生物发酵过程中用于产生终产物的发酵原料，所述终产物如醇(例如，乙醇和丁醇)，有机酸(例如，琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如，甘油)，抗坏血酸中间产物(例如，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如，赖氨酸)，蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在一个实施方案中，在液化过程步骤中获得的可发酵的糖用于产生醇，并且具体为乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶和发酵生物体(例如，酵母)一起加入，然后在30-40°C的温度进行所述过程。
发酵中使用的生物体依赖于理想的终产物。典型地，如果乙醇是理想的终产物，则使用酵母作为发酵生物体。在一些优选的实施方案中，产生乙醇的微生物是酵母，并且特别是酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株(美国专利No.4,316,956)。多种酿酒酵母是商业上可得到的，并且其包括但不限于FALI(Fleischmann's Yeast)，SUPERSTART(Alltech)，FERMIOL(DSMSpecialties)，RED STAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(Angel Yeast Company，China)。方法中使用的起子酵母的量是在适当时间有效产生商业上显著量的乙醇的量(例如，在少于72小时内从具有25-40%DS的底物产生至少10%乙醇)。通常以约104-约1012，优选约107-约1010个活酵母计数每mL发酵液的量提供酵母细胞。在向醪加入酵母后，通常发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度为约26-34°C，通常在约32°C，并且pH为pH 3-6，例如，约pH 4-5。
发酵可以包括，除发酵微生物(例如，酵母)之外，营养成分，和其它酶，包括肌醇六磷酸酶。酵母在发酵中的用途在本领域中公知。
在其它实施方案中，如本领域已知的，适当的发酵微生物的使用能产生发酵终产物，包括，例如，甘油，1,3-丙二醇，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，2-酮-L-古洛糖酸，琥珀酸，乳酸，氨基酸，及其衍生物。更特定地，当乳酸是理想的终产物时，可以使用乳杆菌属(Lactobacillus)菌种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是理想的终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是理想的终产物时，可以使用Pantoea citrea作为发酵微生物。上述列举的长串仅作为实例，并且本领域技术人员了解很多可用于获取理想终产物的发酵微生物。
用于从未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法
本发明涉及用于从含淀粉材料不进行含淀粉材料的糊化(即，未烹制)而产生发酵产物的方法。可以在不液化含有含淀粉材料和水的含水浆料的情况下产生发酵产物，如乙醇。在一个实施方案中，本发明的方法包括在初始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶存在下糖化(例如，磨制的)含淀粉材料，例如，粒状淀粉，从而产生能由合适的发酵生物体发酵成为发酵产物的糖。在这个实施方案中，理想的发酵产物，例如，乙醇，产生自未糊化(即，未烹制)，优选磨制的谷物谷粒，如玉米。因此，在第一个方面本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，所述方法包括使用糖源生成酶和发酵生物体，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度同时糖化和发酵含淀粉材料。在一个实施方案中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。可在发酵后，例如，通过蒸馏，任选地回收发酵产物，例如，乙醇。在发酵过程中通常存在淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其它糖源生成酶，和/或α-淀粉酶。葡糖淀粉酶和其它糖源生成酶的实例包括水解原料淀粉的葡糖淀粉酶。α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物体的实例包括酵母，例如酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在50-75°C开始糊化；糊化的确切温度依赖于特定的淀粉并且可以由技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以随着植物种类，植物种类的特定品种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的初始糊化温度可以使用Gorinstein和Lii,1992,44(12):461-466所述的方法确定为淀粉颗粒的双折射损失5%的温度。在开始进行所述方法之前，可以制备具有含淀粉材料的10-55，例如，25-45和30-40w/w%干固体(DS)的含淀粉材料(如粒状淀粉)的浆料。浆料可以包括水和/或工艺水，如釜馏物(回流)，洗涤水，蒸发浓缩物或馏分，来自蒸馏的侧线气提器水，或来自其它发酵产物装置的工艺水。因为本发明的过程在初始糊化温度以下进行，并且因此粘度没有显著增加，如果需要可使用高水平的蒸馏。在一个实施方案中，含水浆料包含约1-约70vol.%，优选15-60vol.%，特别是约30-50vol.%水和/或工艺水，如釜馏物(回流)，洗涤水，蒸发浓缩物或馏分，蒸馏的侧线气提器水，或来自其它发酵产物装置的工艺水，或它们的组合，等等。可通过将颗粒大小，优选通过干磨或湿磨，降低至0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者优选至少99%干固体转化成可溶淀粉水解物。本发明这个方面的方法在初始糊化温度以下的温度进行，意味着温度通常为30-75°C，优选45-60°C。在一个优选的实施方案中，方法在25-40°C，如28-35°C，如30-34°C，优选约32°C的温度进行。在一个实施方案中，进行所述方法使糖水平，如葡萄糖水平，保持在低水平，如6w/w%以下，如约3w/w%以下，如约2w/w%以下，如约1w/w%以下，如约0.5w/w%以下，或约0.25w/w%以下，如约0.1w/w%以下。通过简单地使用调整量的酶和发酵生物体可实现糖的这种低水平。本领域的技术人员能容易地确定使用的酶和发酵生物体的剂量/量。还可以选择酶和发酵生物体的用量，以保持发酵液中麦芽糖的低浓度。例如，麦芽糖水平保持在约0.5w/w%以下，如约0.2w/w%以下。本发明的方法可以在pH约3-约7，优选pH 3.5-6，或者更优选pH 4-5进行。在一个实施方案中，发酵进行6-120小时，具体为24-96小时。
用于从糊化含淀粉材料产生发酵产物的方法
在这个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物，特别是乙醇的方法，所述方法包括液化步骤和顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉酶材料产生发酵产物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在存在α-淀粉酶变体的情况下液化含淀粉材料，或；
(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的液化材料；
(c)使用发酵生物体发酵。
在一个方面，在液化步骤中还使用支链淀粉酶如家族GH57支链淀粉酶。在一个实施方案中，在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施方案中，金属蛋白酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，例如，桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在一个实施方案中，糖源生成酶是源自如下的葡糖淀粉酶：曲霉属，例如，黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamo)的菌株，，踝节菌属(Talaromyces)，特别是埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的菌株；或者阿太菌属(Athelia)，特别是罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株；栓菌属(Trametes)，例如，瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株；大纹饰孢属(Pachykytospora)的菌株，例如，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)的菌株；或白桩菇属(Leucopaxillus)，例如，大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)的菌株，例如，菌种红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的菌株；或它们的混合物。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可以顺序或同时进行。当所述方法以顺序糖化和发酵过程进行时，可以在糖化和/或发酵的过程中加入支链淀粉酶和/或金属蛋白酶，当步骤(b)和步骤(c)同时进行(SSF过程)时，可以在发酵之前或过程中加入所述酶。也可以在液化之前(预液化处理)即，在步骤(a)之前或过程中，和/或液化后(液化后处理)，即，步骤(a)之后，有利地加入支链淀粉酶和/或金属蛋白酶。在液化之前或过程中，即，步骤(a)之前或过程中，加入支链淀粉酶最有利。在发酵后可任选地，例如，通过蒸馏，回收发酵产物，如特别是乙醇。发酵生物体优选为酵母，优选酿酒酵母的菌株。在一个具体的实施方案中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包含下述步骤：
x)优选通过磨制(例如，使用锤式粉碎机)，降低含淀粉材料的颗粒大小；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施方案中，颗粒大小小于#7筛，例如，#6筛。#7筛通常用于常规的现有技术方法中。含水浆料可包含10-55w/w%干固体(DS)，例如，25-45和30-40w/w%干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至糊化温度以上，并且可以加入α-淀粉酶变体启动液化(稀化)。在一个实施方案中，浆料可以蒸汽加热以在用步骤(a)中的α-淀粉酶处理之前进一步将浆料糊化。在一个实施方案中，液化可以以三步热浆法进行。在pH 4-6，优选4.5-5.5，将浆料加热至60-95°C，优选70-90°C，如优选80-85°C，并且任选地将α-淀粉酶变体与支链淀粉酶和/或蛋白酶(优选金属蛋白酶)一起加入以启动液化(稀化)。在一个实施方案中，然后在95-140°C，优选100-135°C，如105-125°C的温度将浆料蒸汽加热约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟。将浆料冷却至60-95°C，并且加入更多的α-淀粉酶变体和任选地支链淀粉酶变体和/或蛋白酶(优选金属蛋白酶)以结束水解(二次液化)。液化过程通常在pH 4.0-6，具体在pH 4.5-5.5进行。糖化步骤(b)可以使用本领域公知的条件进行。例如，完整的糖化过程可以持续约24-约72小时，然而，一般在30-65°C，通常约60°C的温度仅进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵工艺(SSF工艺)中在发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在20-75°C，优选40-70°C，通常约60°C的温度，和在pH 4-5，通常在约pH 4.5进行。用于产生发酵产物特别是乙醇的最广泛使用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中没有糖化的保持阶段，意味着发酵生物体(如酵母)和酶可一起加入。SSF通常可以在25-40°C，如28-35°C，如30-34°C，优选约32°C的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6-120小时，具体为24-96小时。
啤酒制造
α-淀粉酶变体还可以用于啤酒制造过程和类似的发酵中；α-淀粉酶通常在淀粉糖化(mashing)过程中加入。所述过程与上文所述的磨制、液化、糖化和发酵过程基本类似。
用釜馏物处理淀粉浆料
将经磨制的含淀粉材料与水和回收的稀釜馏物合并得到含水浆料。浆料可包含15-55%ds w/w (例如20-50%，25-50%，25-45%，25-40%，20-35%和30-36%ds)。在一些实施方案中，回收的稀釜馏物(回流)为约10-70%v/v(例如，10-60%，10-50%，10-40%，10-30%，10-20%，20-60%，20-50%，20-40%以及20-30%)。
一旦将经磨制的含淀粉材料与水和回流合并，则不调整浆料的pH。此外，在向浆料加入肌醇六磷酸酶和任选地α-淀粉酶之后也不调整pH。在一个实施方案中，浆料的pH为约pH 4.5至低于约6.0(例如，pH 4.5-5.8，pH 4.5-5.6，pH 4.8-5.8，pH 5.0-5.8，pH 5.0-5.4，pH 5.2-5.5和pH 5.2-5.9)。依赖于向浆料中加入的稀釜馏物的量和包含稀釜馏物的材料的类型，浆料的pH可为约pH4.5-5.2。例如，稀釜馏物的pH可为pH 3.8-pH 4.5。
在乙醇生产过程中，可以加入酸降低啤酒池(beer well)中的pH，从而降低蒸馏前微生物污染的风险。
在一些实施方案中，向浆料加入肌醇六磷酸酶。在其它实施方案中，除了肌醇六磷酸酶，还向浆料加入α-淀粉酶。在一些实施方案中，向浆料顺序加入肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶。在其它实施方案中，同时加入肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶。在一些实施方案中，将包含肌醇六磷酸酶和任选地包含α-淀粉酶的浆料温育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时，5分钟至4小时，5分钟至2小时，和15分钟至4小时)。在其它实施方案中，在约40-115°C(例如，45-80°C，50-70℃，50-75°C，60-110°C，60-95°C，70-110℃，70-85°C和77-86°C)的温度温育浆料。
在其它实施方案中，在含淀粉材料的淀粉糊化温度以下约0-约30°C(例如，0-25°C，0-20°C，0-15°C，0-10°C和0-5°C)的温度温育浆料。在一些实施方案中，温度为约68°C以下，约65°C以下，约62°C以下，约60°C以下和约55°C以下。在一些实施方案中，温度为约45°C以上，约50°C以上，约55°C以上和约60°C以上。在一些实施方案中，将在淀粉糊化温度以下的温度温育包含肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶的浆料称作一级(1°)液化。
在一个实施方案中，磨制的含淀粉材料是谷物/玉米(corn)或买罗高粱(milo)。浆料包含25-40%DS，pH为4.8-5.2，并将浆料与肌醇六磷酸酶和任选地α-淀粉酶在60-75°C的温度温育5分钟至2小时。
目前，人们相信商业上可得到的用于液化过程的α-淀粉酶通常对于使用整粒磨制谷物在约80°C以上的温度在低于pH 5.6的pH水平通过干磨工艺产生液化的淀粉底物而言不够稳定。很多商业上可得到的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降。
在进一步液化的步骤中，使温育或预处理的含淀粉材料暴露于温度增加，如含淀粉材料的淀粉糊化温度以上约0-约45°C (例如，70-120°C，70-110°C和70-90°C)，在约pH 4.0-5.5约2分钟至约6小时(例如，2分钟至4小时、90分钟、140分钟和90-140分钟)，更优选1-2小时。可以通过常规的高温蒸汽加热***在短时间内，例如1-15分钟，增加温度。然后在约75-95°C (例如，80-90°C和80-85°C)的温度将淀粉进一步水解约15-150分钟(例如，30-120分钟)。在一个优选的实施方案中，在这些工艺步骤过程中不调整pH，并且液化醪的pH为约pH 4.0-pH 5.8(例如，pH4.5-5.8，pH 4.8-5.4和pH 5.0-5.2)。在一些实施方案中，向二级液化步骤加入第二剂量的热稳定α-淀粉酶，但是在其它实施方案中，无额外剂量的α-淀粉酶。
温育和液化步骤之后可为本领域公知的糖化和发酵步骤。
蒸馏
任选地，发酵之后，可以通过，例如，蒸馏和之后任选地进行一个或多个处理步骤，提取醇(例如，乙醇)。
在一些实施方案中，由本文提供的方法产生的乙醇的产率/得率(yield)为至少8%，至少10%，至少12%，至少14%，至少15%，至少16%，至少17%和至少18%(v/v)和至少23%v/v。根据本文提供的方法获得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇，即，可饮用的中性酒精，或工业乙醇。
副产物
发酵后留下谷粒，其通常以液体或干燥形式用于动物饲料。在进一步的实施方案中，终产物可以包括发酵共产物如蒸馏干酒糟(DDG)和蒸馏干酒糟加可溶物(DDGS)，其可以用于，例如，动物饲料。
关于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步细节为技术人员所公知。
根据本文提供的方法，糖化和发酵可以同时或分开进行。
纸浆和纸的生产
α-淀粉酶变体也可以用于由淀粉增强废纸和纸板生产木质纤维素材料，如纸浆、纸和纸板，特别地其中再制浆发生在pH 7以上并且其中淀粉酶通过对强化淀粉的降解而促进废材料的崩解。α-淀粉酶变体特别适用于从涂布淀粉的印刷纸张产生造纸纸浆的过程。所述过程可如WO 95/14807中所述进行，其包括下述步骤：
a)崩解纸张以产生纸浆，
b)在步骤a)之前、过程中或之后用淀粉降解酶处理，和
c)在步骤a)和b)之后从纸浆分离墨水颗粒。
α-淀粉酶变体也可以用于改性淀粉，其中在造纸过程中将酶改性的淀粉与碱性填料如碳酸钙、高岭土和粘土一起使用。使用α-淀粉酶变体，可以在存在填料的情况下改性淀粉，从而使整合的工艺更简单。
织物、纤维和衣物的脱浆
α-淀粉酶变体在织物、纤维或衣物脱浆方面非常有用。在织物加工业中，α-淀粉酶常规上用作脱浆过程中的辅助物以促进含淀粉浆料的去除，所述浆料在纺织过程中作为纬纱(weft yan)上的保护层。纺织后完全去除浆料覆层很重要，可以确保后续过程中获得最优结果，所述后续过程中将纤维洗涤、漂白和染色。酶法分解淀粉是优选的，因为其不涉及对纤维材料的任何有害作用。为了降低加工成本并增加工厂产量，脱浆过程有时与煮炼和漂白步骤组合。在这种情况下，通常使用非酶辅助物如碱或氧化剂来分解淀粉，因为常规的α-淀粉酶不能与高pH水平和漂白剂良好地相容。因为使用的具有相当侵略性的化学品，所以淀粉浆料非酶法分解导致一些纤维受损。因此，理想的是使用α-淀粉酶变体，因为它们在碱溶液中具有改进的性能。在将含纤维素的纤维或织物退浆时，α-淀粉酶变体可以单独使用，或者与纤维素酶组合使用。
退浆和漂白过程在本领域中公知。例如，在例如WO 95/21247、美国专利No.4,643,736、EP 119920中描述了这类过程，所述文献通过提述并入本文。
清洁过程和洗涤剂组合物
可以将α-淀粉酶变体作为洗涤剂组合物的成分加入并用于各种清洁或洗涤过程，包括洗衣和餐具洗涤。例如，所述变体可以用于WO 96/23874和WO 97/07202中所述的洗涤剂组合物中。
所述α-淀粉酶变体以常规使用的浓度并入洗涤剂中。例如，本发明的变体可以以对应于0.00001-10mg(根据纯的活性酶蛋白计算)的α-淀粉酶每升洗涤/餐具洗涤液(使用洗涤剂的常规剂量水平)的量并入。
洗涤剂组合物可以例如配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适合于污染的纤维的预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的纤维软化剂组合物，或者配制为用于常用家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。
所述洗涤剂组合物可以进一步包含一种或多种其它酶，如脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、另一种淀粉分解酶，例如，另一种α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，CGT酶，纤维素酶，甘露聚糖酶(如来自Novozymes,Denmark的MannawayTM)，果胶酶，果胶裂合酶，角质酶，和/或漆酶。
通常，选择的酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性，等)，并且酶应该以有效量存在。
可以通过加入包含一种或多种酶的多种添加剂，或者通过加入包含所有这些酶的组合的添加剂，将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，例如，分开的添加剂或组合的添加剂，可以配制为，例如，颗粒，液体，浆料等。优选的清洁添加剂配制物是颗粒，具体为无粉尘颗粒，液体，具体为稳定化液体，或浆料。
无粉尘颗粒可以如，例如，美国专利No 4,106,991和4,661,452中所披露的产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法涂覆。蜡质涂层材料的实例是平均摩尔重量1000-20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；其中醇包含12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇，脂肪酸；和脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯。在GB 1483591中给出通过流体床技术适合于本申请的成膜涂层材料的实例。可以根据已建立的方法，例如，通过加入多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定液体酶制备物。根据EP 238216中披露的方法可以制备受到保护的酶。
洗涤剂组合物可以为任何方便的形式，例如，条、片、粉末、颗粒、膏或液体。液体洗涤剂可含水，通常包含多至约70%水和0-约30%有机溶剂，或不含水。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计约0.1%-60%的水平存在。
在包括于其中时，洗涤剂通常包含约1%-约40%的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸盐，α-烯烃磺酸盐，烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)，醇乙氧基硫酸酯，仲烷基磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基-或烯基琥珀酸或肥皂。
在包括于其中时，洗涤剂通常包含约0.2%-约40%的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基多糖苷，氧化烷基二甲基胺，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可包含0-约65%的洗涤剂助剂或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，马来酸丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以包含漂白***，其可包含H2O2源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与可形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐组合。或者，漂白***可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
可以使用常规稳定剂，例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸使洗涤剂组合物的酶稳定化，并且可以如，例如，WO 92/19708和WO92/19709中所述配制组合物。
洗涤剂还可以包含其它常用洗涤剂成分如，例如，纤维调理剂，包括粘土、泡沫增强剂、抑泡剂、抗蚀剂，悬污剂、防污物再沉积剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物、晦暗抑制剂，或香料。
洗涤剂组合物可以对应于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选0.055mg酶蛋白每升洗涤液，具体为0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量包含任何酶。
本文所述的一种或多种变体酶可以另外并入WO 97/07202中披露的洗涤剂配制物中，所述文献通过提述并入本文。
本文披露的内容在下述实施例中包括更详细的细节，其不以任何方式意欲限制所要求保护的范围。因此下述实施例用于阐述，但不限制所要求保护的范围。
实施例
材料
酶
SP722：SEQ ID NO:10，可由Novozymes获得，并在WO 95/26397中披露。
AA560：SEQ ID NO:2，在WO 00/60060中披露并可由Novozymes A/S获得；在丹麦专利申请no.PA 199900490中披露；1999年1月25日保藏于DSMZ并获得DSMZ编号no.12649。
芽孢杆菌SHA273：参见WO 95/10603。
方法
常用分子生物学方法
除非另外说明，使用分子生物学的标准方法(Sambrook等(1989)；Ausubel等(1995)；Harwood和Cutting(1990))进行DNA操作和转化。
α-淀粉酶和变体的发酵
可以通过本领域公知的方法或如下进行发酵。
将携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株在含相关抗生素的LB-琼脂平板上划线，并在37°C过夜生长。
将菌落转移至500ml摇瓶中补加相关抗生素(例如10mgl氯霉素)的100mlBPX培养基中。
BPX培养基的组成：
培养物在37°C，270rpm振荡4-5天。
通过在4500rpm离心20-25分钟从发酵液去除细胞和细胞碎片。之后过滤上清以获得完全澄清的溶液。浓缩滤液并在UF-滤膜(10000截留膜)上洗涤，并将缓冲液改变为20mM乙酸(盐)pH 5.5。将UF-滤液施于S-琼脂糖F.F.上并以相同缓冲液中的0.2M NaCl分步洗脱而进行洗脱。将洗脱液针对10mM Tris,pH 9.0透析并施于Q-琼脂糖F.F.上并在6个柱体积中以0-0.3M NaCl的线性梯度洗脱。汇集包含活性(通过Phadebas测定法测量)的级分，将pH调至pH 7.5，并通过用0.5%w/vol.的活性炭处理5分钟而去除残余颜色。
确定在pH 4.0的残余活性
试剂等
缓冲液：50mM柠檬酸(盐)，pH 4，0.05%Triton-X100
制备500mM储液。
稳定性缓冲液：50mM碳酸盐缓冲液(NaHCO3)，pH 8，1mM CaCl2，0.05%Triton-X100
样品制备
在20000rpm将样品离心2分钟。需要时可在稳定性缓冲液中稀释样品。
温育
-100微升制备的样品
-加至(Ad)1000微升缓冲液
在35°C温育并在0、20和48小时后取出20微升等分试样于200微升冷的稳定性缓冲液中。这些可以保存于冰上用于后面的活性确定。
测定法
使用Phabedas测定法测量残余活性，参见下面的规程。
钙-和pH-依赖的稳定性测量
通常，使用pH 6.0-6.2作为液化pH运行工业液化过程，并加入40ppm游离钙以改进在95°C-105°C的稳定性。制备了本文提出的一些取代以改进以下条件下的稳定性
1.pH低于pH 6.2时和/或
2.游离钙水平低于40ppm。
两种不同的方法可用于测量由目的α-淀粉酶中不同的取代获得的稳定性的改变：
方法1.在降低的pH，pH 5.0，在存在5ppm游离钙的情况下测量稳定性的一种测定法。
在下述条件下温育10微克变体：0.1M乙酸(盐)溶液，pH调至pH 5.0，包含5ppm钙和5%w/w普通玉米淀粉(不含钙)。温育在95°C水浴中进行30分钟。
方法2.在不含游离钙并且pH维持在pH 6.0时测量稳定性的一种测定法。这种测定法测量钙敏感性的下降：
在下述条件下温育10微克变体：0.1M乙酸(盐)溶液，pH调至pH 6.0，包含5%w/w普通玉米淀粉(不含钙)。温育在95°C水浴中进行30分钟。
α-淀粉酶活性的测定法
1.Phadebas测定法
通过使用片为底物的方法确定α-淀粉酶活性。Phadebas片(淀粉酶测试，由Pharmacia Diagnostic提供)包含交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并制成片状。
对于每个单次测量，将一片悬浮于含5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，用NaOH将pH调至目的值)的管中。在目的温度在水浴中进行测试。将待测试的α-淀粉酶在x ml 50mMBritton-Robinson缓冲液稀释。将1ml这种α-淀粉酶溶液加入5ml 50mMBritton-Robinson缓冲液中。通过α-淀粉酶水解淀粉得到可溶的蓝色片段。所得的蓝色溶液的吸光度，其在620nm处用分光光度法测量，是α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在温育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度为620nm处0.2-2.0吸光度单位。在这个吸光度范围内，活性和吸光度呈线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调整酶的稀释度以符合这个标准。在特定的一组条件下(温度，pH，反应时间，缓冲液条件)，1mg给定的α-淀粉酶将水解定量的底物并产生蓝色。在620nm测量颜色强度。在给定条件组下，测量的吸光度与目的α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)成正比。
2.可选方法
通过使用PNP-G7底物的方法确定α-淀粉酶活性。PNP-G7，其为对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷的缩写，是可以由内切淀粉酶切割的块状(blocked)寡糖。切割后，试剂盒中包括的α-葡糖苷酶消化底物以释放黄色的游离PNP分子，并因此能够通过可见光分光光度法在λ＝405nm (400-420nm)测量。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim制造(目录号1054635)。
为了制备底物，向5ml缓冲液(BM1442309)加入一瓶底物(BM 1442309)。为了制备α-葡糖苷酶，向45ml缓冲液(BM1442309)加入一瓶α-葡糖苷酶(BM1462309)。通过将5mlα-葡糖苷酶溶液与1ml底物混合而产生工作溶液。
通过将20微升酶溶液转移至96孔微量滴定板并在25°C温育而进行测定。加入200微升工作溶液，25°C。混合溶液并预温育1分钟，每隔15秒测量OD 405nm处的吸收值，共历时3分钟。
时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件组下目的α-淀粉酶的比活性(活性每mg酶)成正比。
3. 淀粉酶活性测定法
还可以通过使用底物的方法确定α-淀粉酶活性。Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)中的底物是玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉，其是用FL染料标记达到淬灭荧光的程度的玉米淀粉。
将一个含有约1mg冻干底物的小瓶溶于100微升50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶漩涡振荡20秒并在室温置于暗处，间歇混合直至溶解。然后加入900微升100mM乙酸(盐)，0.01%(w/v)X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5，彻底漩涡振荡并在室温保存于暗处直至使用。通过在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01%(w/v)X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释10倍得到浓度为100微克/ml的底物而制备底物工作溶液。温育后立即将酶在100mM乙酸(盐)，0.01%(W/v)X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5中稀释至浓度为20ng酶蛋白/mL。
对于测定，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶在黑色384孔微量滴定板中混合10秒。在15分钟之内每分钟于25°C测量一次每孔中的荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)，并计算荧光强度针对时间的图线的斜率作为Vmax。图线应该是线性的，并且已经调整了残余活性测定法使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
实施例1：变体的制备
使用亲本α-淀粉酶AA560+Δ(D183+G184)+N195F+R118K+R320K+R458K(披露于WO 01/66712中)，构建下述变体：
1.D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W；
2.D163N+R181A+G182A+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；
3.N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
4.D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P；
5.D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W
实施例2：测量在pH 4.0的残余活性
测量亲本淀粉酶和实施例1中制备的5个变体在pH 4.0的残余活性。所有测量都作为两次确定进行。结果用初始活性的百分比表示。
获得下述结果，证明本发明的变体在pH 4.0的改进的稳定性：
  0小时   20小时   48小时
  亲本α-淀粉酶   100%   35%   25%
  变体1   100%   65%   34%
  变体2   100%   80%   70%
  变体3   100%   87%   85%
  变体4   100%   88%   84%
  变体5   100%   97%   96%
实施例3：与强螯合剂温育后的残余活性
在存在强螯合剂的情况下温育亲本α-淀粉酶和实施例1中所述的变体5。
为了与螯合剂温育，制备下述混合物：
100微升250mM EDTA或100微升10%DTPA
100微升酶制剂
用缓冲液加至1000微升。
在35°C将样品温育18小时，并使用上文所述的PNP-G7方法确定活性。
  亲本  变体5
  DTPA   6%  42%
  EDTA   15%  79%
结果明确地显示本发明的变体比亲本α-淀粉酶对强螯合剂的存在更有抗性。
实施例4：测量在pH 3.0的残余活性
在pH 3.0在35°C将实施例1中所述的变体5和亲本α-淀粉酶温育18小时，并使用上文所述的PNP-G7试验确定残余活性。
  亲本  变体5
  pH 3   1%  79%
结果显示与亲本α-淀粉酶相比，本发明的变体在pH 3也具有改进的稳定性。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述那些的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
本文引用多篇参考文献，其公开的内容通过提述以其整体并入本文。
在下述段中进一步限定本发明：
段1.一种分离的变体α-淀粉酶，其在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置163、188、205、208和209相对应的位置包含两个或更多个改变，其中
(a)所述变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中的任何一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性；
(b)每个改变独立地为取代、缺失或***；和
(c)所述变体具有α-淀粉酶活性。
段2.段1的变体，其与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中的任何一个具有至少80%的序列同一性。
段3.段1的变体，其与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中的任何一个具有至少90%的序列同一性。
段4.段1的变体，其与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中的任何一个具有至少95%的序列同一性。
段5.段1-4中任一个的变体，其中位置163、188、205、208和209的改变为取代。
段6.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163和188的位置包含取代。
段7.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163和205的位置包含取代。
段8.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163和208的位置包含取代。
段9.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163和209的位置包含取代。
段10.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188和205的位置包含取代。
段11.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188和208的位置包含取代。
段12.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188和209的位置包含取代。
段13.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置205和208的位置包含取代。
段14.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置205和209的位置包含取代。
段15.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置208和209的位置包含取代。
段16.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188和205的位置包含取代。
段17.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188和208的位置包含取代。
段18.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188和209的位置包含取代。
段19.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188、205和208的位置包含取代。
段20.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188、205和209的位置包含取代。
段21.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置205、208和209的位置包含取代。
段22.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188、205和208的位置包含取代。
段23.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188、205和209的位置包含取代。
段24.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置188、205、208和209的位置包含取代。
段25.段1-4中任一个的变体，其在对应于位置163、188、205、208和209的位置包含取代。
段26.段1-25中任一个的变体，其中所述改变选自：X163Q,N，X188N，X205N，X208Y和X209N,S。
段27.段1-26中任一个的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变：在对应于位置183和184的位置的缺失，和对应于选自下组位置的位置的取代：186、193、195、202、206、214、244、452、474和475。
段28.段1-27中任一个的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变：X181*+X182*，X182*+X183*，X183*+X184*，X185K，X167W，X202L/T，X203Y，X167W+X168E+X169E+X170R，X51T+X109G+X203Y，X109G+X203Y，X189W，X189W+x190E+x193T，X190E，X193T，X303K，X303K+x305R+x306D+X409N+X432N+X434D，X305R，X306D，X409N，X432N，X434D。
段29.段1-28中任一个的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变：A113E，N116V，V117F，L118K，A119V，V120I，N123D，N126D，N128T，Q129K，G133E，D134P，Y135F，T136E，A139G，D144T，N150D，T151Q，D154S，R158N，W159S，Y160E，V165T，W167F，Q169A，S170K，R171G，Q172*，F173E，Q174R，N175T，R176G，I177V，Y178F，K179R，F180I，R181A，D183E，G184N，A186K，W189E，E190N，S193T/D，N195F，Y203F，V206I，E212D，V214R和N215R。
段30.段1-29中任一个的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变：D183*+G184*，G186A,Y,T，T193F，N195F，M202L,I,T,S,A，I206F,Y，V214I，S244A,D,E,N,Q,W，T452HY，G474R，G475R。
段31.段1-30中任一个的变体，其选自下组：
D188N+D209S；
D163N+D188N+D209S；
D163N+D188N+D205N+D209S；
D163N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D207N+D209S；
D163N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S；
D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S；
D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181AG182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+H408W+N409D+D432N+A434P；
N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；和
D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W。
段32.段1-31中任一个的变体，其选自下组：
D188N+D209S
D163N+D188N+D209S
D163N+D188N+D205N+D209S
D163N+D188N+D205N+M208F+D209S
D207N+D209S
D163N+D207N+D209S
D163N+D188N+D207N+D209S
D163N+D188N+D199N+D207N+D209S
D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S
D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S
D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+D209S
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+M208F+D209S
D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S
D163N+R181AG182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S
D163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S。
段33.段1-32中任一个的变体，其选自下组：
D207N+D186N
D207N+D186N+D162N
D207N+D186N+D162N+D203N
D207N+D186N+D162N+D203N+M206Y
D207N+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105N
D207N+A184K+T187E
D207N+A184K+T187E+D186N
D207N+A184K+T187E+D186N+D162N
D207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N
D207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206Y
D207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206Y+D 105N。
段34.一种洗涤剂组合物，其包含段1-33中任一个的变体和表面活性剂。
段35.一种组合物，其包含段1-33中任一个的变体和选自下组的一种或多种酶：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶，纤维二糖水解酶，和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如，木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
段36.段1-33中任一个的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
段37.段1-33中任一个的变体用于织物脱浆的用途。
段38.段1-33中任一个的变体用于产生烘培产物的用途。
段39.段1-33中任一个的变体用于液化含淀粉材料的用途。
段40.产生液化淀粉的方法，其包括用段1-33中任一个的变体液化含淀粉材料。
段41.产生发酵产物的方法，其包括
(a)用段1-33中任一个变体液化含淀粉材料以产生液化醪；
(b)将液化醪糖化以产生可发酵的糖；和
(c)在存在发酵生物体的情况下发酵可发酵的糖。
段42.段41的方法，其中用所述变体和支链淀粉酶，例如，GH57支链淀粉酶液化含淀粉材料。
段43.段42的方法，其中支链淀粉酶获得自高温球菌属(Thermococcus)，包括高温球菌属菌种AM4(Thermococcus sp.AM4)，高温球菌属菌种HJ21(Thermococcus sp.HJ21)，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)；Thermococcus kodakarensis，海滨高温球菌(Thermococcus litoralis)和Thermococcus onnurineus的菌株；或来自火球菌属(Pyrococcus)，如Pyrococcus abyssi和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株。
段44.段41-43中任一个的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。
段45.段44的方法，其中所述金属蛋白酶获得自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
段46.产生发酵产物的方法，其包括将淀粉底物与段1-33中任一个的变体、葡糖淀粉酶和发酵生物体接触。
段47.段41-46中任一个的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如，乙醇和丁醇)，有机酸(例如，琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如，甘油)，抗坏血酸中间物(例如，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如，赖氨酸)，蛋白质(例如，抗体及其片段)。
段48.编码段1-33中任一个变体的分离的多核苷酸。
段49.包含段48的多核苷酸的核酸构建体。
段50.包含段49的核酸构建体的表达载体。
段51.包含段49的核酸构建体的宿主细胞。
段52.一种产生变体的方法，其包括：
a.在适合α-淀粉酶表达的条件下培养段51的宿主细胞；和
b.从培养基回收所述变体。
段53.用段48的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
段54.一种制备亲本α-淀粉酶的变体的方法，其包括下述步骤：
a.提供编码亲本α-淀粉酶的核酸，
b.在所述核酸序列中引入改变而在两个、三个、四个或五个位置产生编码的氨基酸残基的改变，所述位置对应于亲本α-淀粉酶中选自下组的位置：163、188、205、208和209；所述改变独立地为
(i)紧邻所述位置下游的氨基酸的***，
(ii)占据所述位置的氨基酸的缺失，和/或
(iii)占据所述位置的氨基酸的取代，
c.任选地，在核酸序列中引入其它改变，使亲本α-淀粉酶的B-结构域中的一个或多个氨基酸残基改变成SEQ ID NO:9中的相应氨基酸残基；
d.任选地在核酸序列中引入其它改变，使编码的氨基酸残基产生选自下组的改变：X183*+X184*，X186A,Y,T，X193F，X195F，M202L,I,T,S,A，X206F,Y，X214I，X244A,D,E,N,Q,W，X452H,Y，X474R和X475R；
e.在合适的宿主生物体中表达改变的核酸序列；和
f.回收变体α-淀粉酶，
其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
段55.段54的方法，其中b中的改变选自：X163Q,N，X188N，X205N，X208Y和X209N,S。
段56.段54或55的方法，其中亲本α-淀粉酶是Termamyl-样α-淀粉酶。
段57.段56的方法，其中亲本α-淀粉酶选自具有SEQ ID NO:2、4、6、8或10的α-淀粉酶，或源自芽孢杆菌属菌种NCIB 12289、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶，和由Tsukamoto等,1988,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 151:25-31所述的#707α-淀粉酶，或与这些中的一种的氨基酸序列具有至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少约97%序列同一性的α-淀粉酶。

Claims (29)

1.一种α-淀粉酶变体，其亲本α-淀粉酶是AA560+Δ(D183+G184)+N195F+R118K+R320K+R458K，所述AA560的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，
其中所述变体的氨基酸改变选自下组：
D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G182A+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W；
N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P；
D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W。
2.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1的变体和表面活性剂。
3.一种组合物，其包含权利要求1的变体和选自下组的一种或多种酶：β-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和普鲁兰酶。
4.一种组合物，其包含权利要求1的变体和选自下组的一种或多种酶：β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶。
5.权利要求1的变体用于洗涤的用途。
6.权利要求1的变体用于餐具洗涤的用途。
7.权利要求1的变体用于织物脱浆的用途。
8.权利要求1的变体用于产生烘培产物的用途。
9.权利要求1的变体用于液化含淀粉材料的用途。
10.产生液化淀粉的方法，其包括用权利要求1的变体液化含淀粉材料。
11.产生发酵产物的方法，其包括
(a)用权利要求1的变体液化含淀粉材料以产生液化醪；
(b)将液化醪糖化以产生可发酵的糖；和
(c)在存在发酵生物体的情况下发酵可发酵的糖。
12.权利要求11的方法，其中用所述变体和普鲁兰酶液化含淀粉材料。
13.权利要求11的方法，其中用所述变体和GH57普鲁兰酶液化含淀粉材料。
14.权利要求12的方法，其中普鲁兰酶获得自高温球菌属(Thermococcus)或来自火球菌属(Pyrococcus)。
15.权利要求12的方法，其中普鲁兰酶获得自高温球菌属菌种AM4(Thermococcus sp.AM4)、高温球菌属菌种HJ21(Thermococcus sp.HJ21)、Thermococcus barophilus、Thermococcus gammatolerans、热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)、Thermococcus kodakarensis、海滨高温球菌(Thermococcus litoralis)、Thermococcus onnurineus的菌株、或来自Pyrococcusabyssi和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株。
16.权利要求11-15中任一个的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶。
17.权利要求11-15中任一个的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。
18.权利要求17的方法，其中所述金属蛋白酶获得自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株。
19.权利要求17的方法，其中所述金属蛋白酶获得自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株。
20.权利要求17的方法，其中所述金属蛋白酶获得自桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
21.产生发酵产物的方法，其包括将淀粉底物与权利要求1的变体、葡糖淀粉酶和发酵生物体接触。
22.权利要求11-15中任一个的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇、有机酸、糖醇、抗坏血酸中间物、氨基酸、蛋白质。
23.权利要求11-15中任一个的方法，其中所述发酵产物选自下组：乙醇、丁醇、琥珀酸、乳酸、甘油、葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、赖氨酸、抗体及其片段。
24.编码权利要求1的变体的分离的多核苷酸。
25.包含权利要求24的多核苷酸的核酸构建体。
26.包含权利要求25的核酸构建体的表达载体。
27.包含权利要求25的核酸构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞不是能够生长为转基因植物的植物细胞。
28.一种产生变体的方法，其包括：
a.在适合α-淀粉酶表达的条件下培养权利要求27的宿主细胞；和
b.从培养基回收所述变体。
29.用权利要求24的多核苷酸转化的植物细胞，其中所述植物细胞不能够生长为转基因植物。
CN201180011774.9A 2010-01-04 2011-01-04 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化 Expired - Fee Related CN102884183B (zh)

Applications Claiming Priority (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10150063 2010-01-04
EP10150062 2010-01-04
EP10150063.5 2010-01-04
EP10150062.7 2010-01-04
US30409210P 2010-02-12 2010-02-12
US61/304,092 2010-02-12
US33393010P 2010-05-12 2010-05-12
US61/333,930 2010-05-12
US35477510P 2010-06-15 2010-06-15
US35481710P 2010-06-15 2010-06-15
US61/354,775 2010-06-15
US61/354,817 2010-06-15
US35523010P 2010-06-16 2010-06-16
US61/355,230 2010-06-16
US36253610P 2010-07-08 2010-07-08
US61/362,536 2010-07-08
PCT/EP2011/050074 WO2011080353A1 (en) 2010-01-04 2011-01-04 Stabilization of alpha-amylases towards calcium depletion and acidic ph

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102884183A CN102884183A (zh) 2013-01-16
CN102884183B true CN102884183B (zh) 2015-09-16

Family

ID=44246932

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180011774.9A Expired - Fee Related CN102884183B (zh) 2010-01-04 2011-01-04 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化
CN201180012225.3A Active CN103068975B (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α‑淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸
CN2011800122249A Pending CN102918148A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶
CN2011800122287A Pending CN102918149A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶
CN2011800122319A Pending CN102918150A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180012225.3A Active CN103068975B (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α‑淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸
CN2011800122249A Pending CN102918148A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶
CN2011800122287A Pending CN102918149A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶
CN2011800122319A Pending CN102918150A (zh) 2010-01-04 2011-01-04 α-淀粉酶

Country Status (12)

Country Link
US (15) US8435577B2 (zh)
EP (6) EP3101127B1 (zh)
JP (1) JP2013516166A (zh)
CN (5) CN102884183B (zh)
AU (1) AU2011203460B2 (zh)
BR (1) BR112012016318A2 (zh)
CA (2) CA2785924A1 (zh)
DK (2) DK3101127T3 (zh)
MX (4) MX349630B (zh)
RU (1) RU2012133453A (zh)
WO (5) WO2011080352A1 (zh)
ZA (1) ZA201204839B (zh)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2785924A1 (en) 2010-01-04 2011-07-07 Novozymes A/S Alpha-amylases
WO2012088303A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Novozymes North America, Inc. Processes for producing fermentation products
US20140038876A1 (en) * 2011-02-16 2014-02-06 Novozymes A/S Detergent Compositions Comprising Mettaloproteases
EA201490568A1 (ru) 2011-09-06 2014-06-30 Новозимс А/С Варианты глюкоамилазы и кодирующие их полинуклеотиды
ES2638669T3 (es) 2011-10-11 2017-10-23 Novozymes A/S Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que las codifican
IN2014CN03467A (zh) 2011-10-11 2015-10-16 Novozymes North America Inc
MX355356B (es) 2011-10-17 2018-04-17 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
CN103890170B (zh) 2011-10-17 2018-02-02 诺维信公司 α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3246404B1 (en) * 2011-10-28 2019-02-27 Danisco US Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
EP2785847B1 (en) 2011-12-02 2017-07-26 Novozymes A/S Liquefaction process with selected alpha-amylases and proteases
ES2935920T3 (es) 2012-03-30 2023-03-13 Novozymes North America Inc Procesos de elaboración de productos de fermentación
EP4209595A1 (en) 2012-03-30 2023-07-12 Novozymes North America, Inc. A method of dewatering whole stillage
HUE057894T2 (hu) * 2012-06-08 2022-06-28 Danisco Us Inc Alfa-amiláz változatok javított aktivitással keményítõpolimereken
JP2015534456A (ja) * 2012-08-16 2015-12-03 ダニスコ・ユーエス・インク アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓ）由来のαアミラーゼ及びイソアミラーゼを糖化に使用する方法
US9902946B2 (en) 2013-01-03 2018-02-27 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
BR112015021647B1 (pt) * 2013-03-11 2023-04-25 Danisco Us Inc Variantes recombinantes de alfa-amilase e composições de detergente compreendendo as mesmas
EP4159854A1 (en) 2013-05-29 2023-04-05 Danisco US Inc Novel metalloproteases
US20160160202A1 (en) 2013-05-29 2016-06-09 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
EP3260538B1 (en) 2013-05-29 2021-04-14 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3004342B1 (en) 2013-05-29 2023-01-11 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
CN114634921A (zh) * 2013-06-06 2022-06-17 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
PL3013967T3 (pl) 2013-06-24 2022-03-21 Novozymes A/S Sposoby odzyskiwania oleju z procesów wytwarzania produktów fermentacji i sposoby wytwarzania produktów fermentacji
US11939552B2 (en) 2013-06-24 2024-03-26 Novozymes A/S Process of recovering oil
PL3019025T3 (pl) 2013-06-26 2018-05-30 Novozymes A/S Sposób wytwarzania kompozycji paszy
EP3910057A1 (en) 2013-12-13 2021-11-17 Danisco US Inc. Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
TR201906371T4 (tr) 2013-12-13 2019-05-21 Danisco Inc Bacillus türlerinin serin proteazları.
WO2015095046A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers
EP3083705B1 (en) 2013-12-18 2020-09-30 DuPont Industrial Biosciences USA, LLC Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers
WO2015094714A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Proteases in grain processing
EP3105256A1 (en) 2014-02-14 2016-12-21 E. I. du Pont de Nemours and Company Poly-alpha-1,3-1,6-glucans for viscosity modification
ES2734726T3 (es) 2014-03-11 2019-12-11 Du Pont Poli alfa-1,2-glucano oxidado como reforzante de detergente
JP6585698B2 (ja) 2014-03-21 2019-10-02 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のセリンプロテアーゼ
CN106459944B (zh) * 2014-06-12 2022-04-12 诺维信公司 α-淀粉酶变体
EP3158043B1 (en) 2014-06-19 2021-03-10 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US9714403B2 (en) 2014-06-19 2017-07-25 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US20170233710A1 (en) 2014-10-17 2017-08-17 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3212783A1 (en) 2014-10-27 2017-09-06 Danisco US Inc. Serine proteases
WO2016069569A2 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
DK3212662T3 (da) 2014-10-27 2020-07-20 Danisco Us Inc Serinproteaser
WO2016069557A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
DK3212781T3 (da) 2014-10-27 2019-12-16 Danisco Us Inc Serinproteaser
US20180334696A1 (en) 2014-12-23 2018-11-22 E I Du Pont De Nemours And Company Enzymatically produced cellulose
US10647946B2 (en) 2015-05-08 2020-05-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3964575A3 (en) * 2015-05-08 2022-09-28 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3872174B1 (en) 2015-05-13 2023-03-01 Danisco US Inc. Aprl-clade protease variants and uses thereof
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
ES2962329T3 (es) 2015-06-09 2024-03-18 Danisco Us Inc Encapsulados de estallido osmótico
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
WO2016205755A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2017015329A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
BR112018009050A8 (pt) 2015-11-05 2019-02-26 Danisco Us Inc mananases de paenibacillus e bacillus spp.
JP7364331B2 (ja) 2015-11-05 2023-10-18 ダニスコ・ユーエス・インク パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種マンナナーゼ
JP7045313B2 (ja) 2015-11-13 2022-03-31 ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・フォー，インコーポレイテッド 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物
JP2019504932A (ja) 2015-11-13 2019-02-21 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物
EP3374488B1 (en) 2015-11-13 2020-10-14 DuPont Industrial Biosciences USA, LLC Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
WO2017100720A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
BR112018012020A2 (pt) 2015-12-18 2018-12-04 Danisco Us Inc polipeptídeos com atividade de endoglucanase e usos dos mesmos
CA3006991A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Novozymes A/S Process of extracting oil from thin stillage
JP2019518440A (ja) 2016-05-03 2019-07-04 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
WO2017191160A1 (en) * 2016-05-03 2017-11-09 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding the same
EP3845642B1 (en) 2016-05-05 2023-08-09 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
CA3022121A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 Novozymes A/S Variant polypeptides with improved performance and use of the same
MX2018014768A (es) 2016-05-31 2019-03-06 Danisco Us Inc Variantes de proteasa y sus usos.
EP4151726A1 (en) 2016-06-17 2023-03-22 Danisco US Inc Protease variants and uses thereof
EP3535365A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Danisco US Inc. Laundry detergent composition
US10889836B2 (en) 2016-11-23 2021-01-12 Novozymes A/S Yeast for ethanol production
EP3548615A1 (en) * 2016-11-29 2019-10-09 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US11946081B2 (en) 2016-12-21 2024-04-02 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
CN110312795A (zh) 2016-12-21 2019-10-08 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
EP3601515A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Danisco US Inc. Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
CN110809624A (zh) 2017-06-30 2020-02-18 丹尼斯科美国公司 低团聚的含酶颗粒
WO2019036721A2 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Danisco Us Inc VARIANTS OF ALPHA-AMYLASES
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
MX2020005724A (es) 2017-12-08 2020-08-13 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
EP3720955B1 (en) * 2017-12-08 2023-06-14 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
MX2020006518A (es) 2017-12-21 2020-10-28 Danisco Us Inc Gránulos de fusión en caliente, que contienen enzimas, que comprenden un desecante termotolerante.
BR112020016068A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-08 Danisco Us Inc. Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima
WO2019161227A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
PL239536B1 (pl) * 2018-04-06 2021-12-13 Univ Przyrodniczy W Lublinie Sposób jednostopniowego upłynniania natywnej skrobi
US10305704B1 (en) * 2018-06-07 2019-05-28 Texas Instruments Incorporated Decision feedback equalization with independent data and edge feedback loops
US20210214703A1 (en) 2018-06-19 2021-07-15 Danisco Us Inc Subtilisin variants
WO2019245705A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
BR112021000369A2 (pt) * 2018-07-11 2021-04-13 Novozymes A/S Processos para produção de produtos de fermentação
WO2020047215A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
CN113166682A (zh) 2018-09-27 2021-07-23 丹尼斯科美国公司 用于医疗器械清洁的组合物
US20210355469A1 (en) * 2018-10-12 2021-11-18 Danisco Us Inc Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
WO2020112599A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
EP3976776A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
US20220306968A1 (en) 2019-06-06 2022-09-29 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
WO2021037895A1 (en) * 2019-08-27 2021-03-04 Novozymes A/S Detergent composition
CN115135768A (zh) * 2020-01-17 2022-09-30 嘉吉公司 发酵方法
WO2022047149A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
EP4217478A2 (en) * 2020-09-22 2023-08-02 Basf Se Alpha-amylase variants
EP4284906A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Danisco US Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
CN117616120A (zh) 2021-06-30 2024-02-27 丹尼斯科美国公司 变体脂肪酶及其用途
CN113584075B (zh) * 2021-08-31 2024-01-02 浙江大学 一种利用转基因大豆生产α-淀粉酶的方法及表达载体
CN117916354A (zh) 2021-09-03 2024-04-19 丹尼斯科美国公司 用于清洁的衣物洗涤组合物
WO2023039270A2 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Danisco Us Inc. Bioactive-containing granules
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
CN115125226B (zh) * 2022-07-26 2024-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 高比活淀粉酶突变体
CN115336742B (zh) * 2022-08-18 2024-03-29 南京财经大学 一种杏鲍菇3d打印油墨及其制备方法和应用、杏鲍菇3d打印食品的制备方法
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1436232A (zh) * 2000-03-08 2003-08-13 诺维信公司 具有改变的特性的变体
CN101010429A (zh) * 2004-07-05 2007-08-01 诺维信公司 具有改变特性的α－淀粉酶变异体
CN101363017A (zh) * 1995-02-03 2009-02-11 诺维信公司 淀粉酶变体

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3912590A (en) 1973-01-03 1975-10-14 Novo Industri As Procedure for liquefying starch
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
US4316956A (en) 1980-02-06 1982-02-23 Novo Industri A/S Fermentation process
US4335208A (en) 1980-03-11 1982-06-15 Novo Industri A/S Saccharification of starch hydrolysates
FR2498783B1 (fr) 1981-01-23 1988-03-04 Decis Mario Dispositif de controle automatique de presence
JPS57174089A (en) 1981-04-20 1982-10-26 Novo Industri As Chain dividing enzyme product
FR2543181B1 (fr) 1983-03-22 1985-07-26 Ugine Kuhlmann Procede ameliore de desencollage-blanchiment simultane des tissus
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
JPS62104580A (ja) * 1985-10-30 1987-05-15 Kunio Yamane 高耐熱性酵素発現ｄｎａ
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
DK311186D0 (da) 1986-06-30 1986-06-30 Novo Industri As Enzymer
ES2052565T3 (es) 1986-07-09 1994-07-16 Novo Nordisk As Un procedimiento para licuar una suspension de almidon o granos amilaceos.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DK0410498T3 (da) 1989-06-29 1999-03-22 Genencor Int Mutante mikrobielle alfa-amylaser med øget termisk, syre og/eller alkalisk stabilitet
PT97110B (pt) 1990-03-23 1998-11-30 Gist Brocades Nv Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
EP0583420B1 (en) 1991-04-30 1996-03-27 The Procter & Gamble Company Built liquid detergents with boric-polyol complex to inhibit proteolytic enzyme
US5231017A (en) 1991-05-17 1993-07-27 Solvay Enzymes, Inc. Process for producing ethanol
ATE444356T1 (de) 1992-07-23 2009-10-15 Novozymes As Mutierte -g(a)-amylase, waschmittel und geschirrspülmittel
CZ293163B6 (cs) 1993-02-11 2004-02-18 Genencor International, Inc. Mutanta alfa-amylázy, její použití, kódová DNA pro tuto mutantu, vektor pro expresi, hostitelské buňky, čisticí prostředek a prostředek pro zkapalnění škrobu
CN1062906C (zh) 1993-05-19 2001-03-07 花王株式会社 液化碱性α－淀粉酶、其制备方法及含有它的洗涤剂组合物
CN1189558C (zh) 1993-10-08 2005-02-16 诺沃奇梅兹有限公司 淀粉酶变体
DK131193D0 (zh) 1993-11-23 1993-11-23 Novo Nordisk As
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
MY111537A (en) 1994-02-02 2000-07-31 Novo Nordisk As A combined desizing and bleaching process.
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
CN1326994C (zh) 1994-03-29 2007-07-18 诺沃奇梅兹有限公司 碱性芽孢杆菌淀粉酶
DK0765394T3 (da) 1994-06-03 2001-12-10 Novozymes As Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse
AU2705895A (en) 1994-06-30 1996-01-25 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
CN100419076C (zh) 1995-02-03 2008-09-17 诺沃奇梅兹有限公司 设计具有预定特性的α－淀粉酶突变体的方法
KR19980702782A (ko) 1995-03-09 1998-08-05 혼 마가렛 에이. 녹말 액화 방법
US5736499A (en) 1995-06-06 1998-04-07 Genencor International, Inc. Mutant A-amylase
JP3025627B2 (ja) 1995-06-14 2000-03-27 花王株式会社 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子
JP4068142B2 (ja) 1995-08-11 2008-03-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規の脂肪分解酵素
CN1217742A (zh) 1996-03-07 1999-05-26 普罗格特-甘布尔公司 含有改进的淀粉酶的洗涤剂组合物
US5763385A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
US6197070B1 (en) * 1996-05-15 2001-03-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping
CA2208946A1 (en) 1997-06-26 1998-12-26 The Sir Mortimer B. Davis - Jewish General Hospital Attenuated human immunodeficiency virus vaccine
DE69840577D1 (de) 1997-10-13 2009-04-02 Novozymes As MUTANTEN DER alpha-AMYLASE
EP1027428B1 (en) 1997-10-30 2010-12-01 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants
AU6188599A (en) 1998-10-26 2000-05-15 Novozymes A/S Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells
US6403355B1 (en) 1998-12-21 2002-06-11 Kao Corporation Amylases
CN100532561C (zh) 1999-03-22 2009-08-26 诺沃奇梅兹有限公司 新的葡糖淀粉酶及编码它的核酸序列
AU3419300A (en) * 1999-03-30 2000-10-23 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
DK2011864T3 (en) 1999-03-31 2015-04-07 Novozymes As Polypeptides with alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding them
EP1065261A3 (en) 1999-07-01 2001-04-04 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising a retrograded starch degrading enzyme
RU2003105683A (ru) 2000-07-28 2004-08-20 Хенкель Кгаа (De) Новый амилолитический фермент из bacillus sp.а7-7(dsm12368), а также моющее и чистящее средство с этим новым амилолитическим ферментом
EP2180035A1 (en) * 2000-08-01 2010-04-28 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
JP4426716B2 (ja) 2000-10-11 2010-03-03 花王株式会社 高生産性α−アミラーゼ
AU2002210380A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
US7323336B2 (en) 2001-02-21 2008-01-29 Verenium Corporation Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
DE60234523D1 (de) * 2001-05-15 2010-01-07 Novozymes As Alpha-amylasevariante mit veränderten eigenschaften
ATE375388T1 (de) 2001-07-27 2007-10-15 Us Gov Health & Human Serv Systeme zur stellengerichteten in-vivo-mutagenese mit oligonukleotiden
DE10138753B4 (de) * 2001-08-07 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen
CA2515340C (en) 2003-03-06 2016-04-26 Diversa Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP1675941B1 (en) 2003-06-25 2013-05-22 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2006000020A1 (en) 2004-06-29 2006-01-05 European Nickel Plc Improved leaching of base metals
CN101128580B (zh) * 2004-12-22 2016-08-24 诺维信公司 用于淀粉加工的酶
CN101087809B (zh) * 2004-12-22 2015-01-21 诺维信公司 杂合酶
ES2543131T3 (es) * 2004-12-22 2015-08-14 Novozymes North America, Inc. Enzimas para tratamiento de almidón
ATE489404T1 (de) 2004-12-22 2010-12-15 Novozymes As Hybridenzyme, bestehend aus einer ersten endoamylaseaminosäuresequenz und einem kohlenhydratbindenden modul als zweiter aminosäuresequenz
US8841091B2 (en) * 2004-12-22 2014-09-23 Novozymes Als Enzymes for starch processing
CA2593920A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP1896057A2 (en) 2005-06-24 2008-03-12 Novozymes A/S Amylases for pharmaceutical use
RU2009149405A (ru) * 2007-05-30 2011-07-10 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US) Улучшенные варианты альфа-амилазы bacillus licheniformis
JP4935542B2 (ja) * 2007-07-04 2012-05-23 富士通東芝モバイルコミュニケーションズ株式会社 移動通信システム
US7957529B2 (en) * 2007-07-23 2011-06-07 International Business Machines Corporation Procurement and audit of digital rights management event data
AR069167A1 (es) * 2007-11-05 2010-01-06 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de alfa- amilasa de bacillus licheniformis con termoestabilidad aumentada y/o dependencia de calcio disminuida
AR069168A1 (es) * 2007-11-05 2010-01-06 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de alfa -amilasas con propiedades alteradas
EP2100948A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP2283136A2 (en) 2008-04-30 2011-02-16 Danisco US Inc. New chimeric alpha-amylase variants
WO2009149130A2 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Geobacillus stearothermophilus alpha-amylase (amys) variants with improved properties
US8323945B2 (en) * 2008-06-06 2012-12-04 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from Bacillus subtilis and methods of uses, thereof
WO2010000020A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Cathrx Ltd A catheter
EP2358873B2 (en) * 2008-12-15 2018-02-21 Danisco US Inc. Hybrid alpha-amylases
US20130071913A1 (en) * 2009-12-22 2013-03-21 Novozymes A/S Use of amylase variants at low temperature
CA2785924A1 (en) * 2010-01-04 2011-07-07 Novozymes A/S Alpha-amylases
ES2565060T3 (es) * 2010-04-14 2016-03-31 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
WO2012088303A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Novozymes North America, Inc. Processes for producing fermentation products

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101363017A (zh) * 1995-02-03 2009-02-11 诺维信公司 淀粉酶变体
CN1436232A (zh) * 2000-03-08 2003-08-13 诺维信公司 具有改变的特性的变体
CN101010429A (zh) * 2004-07-05 2007-08-01 诺维信公司 具有改变特性的α－淀粉酶变异体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Protein engineering of bacterial α-amylases";Jens Erik Nielsen 等;《Biochimica et Biophysica Acta》;20001229;第1543卷(第2期);第253-274页 *
"Site-directed mutagenesis of the calcium-binding site of α-amylase of Bacillus licheniformis";Ramachandran Priyadharshini 等;《Biotechnol Lett》;20071031;第29卷(第10期);第1493-1499页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011082429A1 (en) 2011-07-07
US20160298100A1 (en) 2016-10-13
CN102918150A (zh) 2013-02-06
AU2011203460A1 (en) 2012-07-05
US8435577B2 (en) 2013-05-07
US9416355B2 (en) 2016-08-16
US20120258497A1 (en) 2012-10-11
BR112012016318A2 (pt) 2015-11-24
US9506047B2 (en) 2016-11-29
US20150225708A1 (en) 2015-08-13
CN103068975B (zh) 2018-03-20
US9809806B2 (en) 2017-11-07
CN102918148A (zh) 2013-02-06
US20160369251A1 (en) 2016-12-22
CN102918149A (zh) 2013-02-06
US20120282658A1 (en) 2012-11-08
US20170037388A1 (en) 2017-02-09
MX349630B (es) 2017-08-07
AU2011203460B2 (en) 2014-09-18
WO2011080354A1 (en) 2011-07-07
US20150044732A1 (en) 2015-02-12
US20120270267A1 (en) 2012-10-25
US11603522B2 (en) 2023-03-14
CN102884183A (zh) 2013-01-16
CN103068975A (zh) 2013-04-24
WO2011082425A3 (en) 2011-09-29
EP3101127A1 (en) 2016-12-07
EP2521774A2 (en) 2012-11-14
DK2521774T3 (en) 2016-09-26
CA2785924A1 (en) 2011-07-07
EP2521771A1 (en) 2012-11-14
US8900848B2 (en) 2014-12-02
US20130203126A1 (en) 2013-08-08
MX2012007710A (es) 2012-08-15
US20200123518A1 (en) 2020-04-23
EP3101127B1 (en) 2019-03-20
CA2786006A1 (en) 2011-07-07
MX2012007709A (es) 2012-08-15
CA2786006C (en) 2020-03-10
US9273297B2 (en) 2016-03-01
JP2013516166A (ja) 2013-05-13
US9139822B2 (en) 2015-09-22
DK3101127T3 (da) 2019-05-13
MX352023B (es) 2017-11-07
US20140075601A1 (en) 2014-03-13
US9695405B2 (en) 2017-07-04
US9394532B2 (en) 2016-07-19
EP2521772A1 (en) 2012-11-14
ZA201204839B (en) 2013-03-27
US8591969B2 (en) 2013-11-26
RU2012133453A (ru) 2014-02-20
US20120264171A1 (en) 2012-10-18
US20120264176A1 (en) 2012-10-18
EP2521773A1 (en) 2012-11-14
US20230183666A1 (en) 2023-06-15
WO2011080352A1 (en) 2011-07-07
US10550373B2 (en) 2020-02-04
EP2521775A1 (en) 2012-11-14
WO2011082425A2 (en) 2011-07-07
WO2011080353A1 (en) 2011-07-07
US20160137996A1 (en) 2016-05-19
EP2521774B1 (en) 2016-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102884183B (zh) 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化
US10563186B2 (en) Alpha-amylase variants with altered properties
RU2231547C2 (ru) Варианты альфа-амилазы
CN101128579B (zh) α-淀粉酶变体
US8617837B2 (en) Method of hydrolyzing soluble starch with an alpha-amylase variant
CN101857858A (zh) 具有改变特性的α-淀粉酶突变体
MXPA06015025A (en) Alpha-amylase variants with altered properties

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150916

Termination date: 20180104

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee