CN102884182A - 木聚糖酶变体及编码其的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亲本木聚糖酶的变体。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。
Description
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及木聚糖酶的变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。
背景技术
木聚糖，植物半纤维素的一种主要成分，是D-木糖通过β-1,4-木糖苷键连接的聚合物。木聚糖可通过酸或酶水解降解为木糖和木糖寡聚物。木聚糖的酶水解产生游离糖，而不产生用酸形成的副产物(例如呋喃)。
木聚糖酶可用于多种用途，如酶降解农业废物以供产生醇燃料，酶处理动物饲料以释放游离糖，酶处理以供在纤维素的制备中溶解纸浆(pulp)，以及在纸浆的生物漂白中的酶处理。具体而言，木聚糖酶可用于纸和纸浆工业以增强漂白的纸浆的亮度，改善纸浆的品质，减少化学纸浆漂白步骤中使用的氯的量，以及增加回收纸工艺中纸浆的游离度(freeness)。
Dumon等,2008,Journal of Biological Chemistry 283:22557-22564描述了将超热稳定性工程改造入GH11木聚糖酶。Wang和Tao,2008,BiotechnologyLetters 30:937-944公开了通过定向进化增强Thermobifida fusca木聚糖酶A的活性和碱性pH稳定性。
美国专利号5,759,840公开了修饰家族11木聚糖酶以改善嗜热性、嗜碱性和热稳定性。美国专利号7,060,482公开了修饰的木聚糖酶，其包含在对应于里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶(TrX)氨基酸序列的位置162处，或在其它木聚糖酶分子中的其等同位置处的碱性氨基酸，至少一个二硫桥，或其组合。美国专利号7,314,743公开了修饰的木聚糖酶，其具有在对应于里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的位置处的至少一个取代的氨基酸残基。WO2007/115391公开了修饰的家族11木聚糖酶，其包含在对应于里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的位置99和118处的半胱氨酸残基以形成分子内二硫键。
本发明提供了与其亲本酶相比具有改善的特性的木聚糖酶的变体。
发明内容
本发明涉及亲本木聚糖酶的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的位置处包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
本发明还涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和产生所述变体的方法。
本发明进一步涉及降解含木聚糖材料的方法，其包括用此种变体处理所述材料。
本发明还涉及处理纸浆的方法，其包括将纸浆与此种变体相接触。
本发明进一步涉及降解含木聚糖材料的方法，其包括用此种变体处理所述材料。
本发明进一步涉及产生木糖的方法，其包括将含木聚糖材料与此种变体相接触。
附图说明
图1显示质粒pTH025的限制性图。
图2显示质粒pTH153的限制性图。
图3显示一个合成多核苷酸片段的DNA序列和推导的氨基酸序列，所述片段包含克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)丝氨酸蛋白酶核糖体结合位点(PBS)和与582bp的编码去除纤维素结合域的T.fusca GH11木聚糖酶的密码子优化的基因融合的克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶信号序列(下划线表示)。
图4A和4B显示T.fusca木聚糖酶变体136的分光光度法和kappa数测量与野生型T.fusca GH11木聚糖酶在70℃和pH 9.5的比较。
图5A和5B显示T.fusca木聚糖酶变体370的分光光度法和kappa数测量与野生型T.fusca GH11木聚糖酶在70℃和pH 9.5的比较。
图6A和6B显示T.fusca木聚糖酶变体566的分光光度法和kappa数测量与野生型T.fusca GH11木聚糖酶在80℃和pH 9.5的比较。
图7A和7B显示T.fusca木聚糖酶变体564的分光光度法和kappa数测量与野生型T.fusca GH11木聚糖酶在80℃和pH 9.5的比较。
定义
木聚糖酶活性：术语“木聚糖酶”在本文中定义为催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解的1,4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本发明而言，木聚糖酶活性用0.1%AZCL-木聚糖燕麦(Megazyme Wicklow，Ireland)作为底物在0.01%
20-125mM硼酸钠pH 8.8中在50℃在595nm确定。
变体：术语“变体”意指具有木聚糖酶活性的多肽，其在一个或多个位置包含一个或多个(例如几个)氨基酸残基的改变，即取代、***和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而***意指邻接于占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
野生型：术语“野生型”木聚糖酶意指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的木聚糖酶。
亲本或亲本木聚糖酶：术语“亲本”或“亲本木聚糖酶”意指对其进行了改变以产生本发明的酶变体的木聚糖酶。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽或其变体。
分离的或纯化的：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。例如，如通过SDS-PAGE测定的，变体可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯；而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸-1至-27是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至194。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:4的氨基酸-1至-42是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至296。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至81编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸82至663。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:3的核苷酸1至126编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸127至1014。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个脱氧核糖核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL (NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
多肽片段：术语“多肽片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有木聚糖酶活性。在一个方面，片段含有至少160个氨基酸残基，例如至少170个氨基酸残基，或至少180个氨基酸残基。在另一个方面，片段含有至少255个氨基酸残基，例如至少270个氨基酸残基，或至少285个氨基酸残基。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有木聚糖酶活性的多肽片段。在一个方面，亚序列含有至少480个核苷酸，例如至少510个核苷酸或至少540个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有至少765个核苷酸，例如至少810个核苷酸或至少855个核苷酸。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制中发生的突变与亲本细胞不完全相同。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与变体相关并相对于亲本改善的特征。此类改善的特性包括但不限于热活性、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、产物特异性、在预处理的生物质存在下增加的稳定性或溶解性、在储藏条件下改善的稳定性和化学稳定性。
改善的热稳定性：术语“改善的热稳定性”意指变体在一定温度下在缓冲液中或在如那些在产物储藏/运输过程中存在的条件或类似于在变体的产业应用过程中存在的那些条件下温育一段时间之后相对于亲本显示木聚糖酶活性的保持。所述温度可为任何合适的温度，其中可观察到变体和亲本之间的热稳定性差异，例如，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，或任何其它合适温度。用于确定改善的热稳定性的pH可为任何合适的pH，例如3，3.5，4，4.55，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，或任何其它合适的pH。具有改善的热稳定性的变体相对于亲本可能会或不会显示改变的热活性概貌。举例而言，变体在升高的温度温育之后相对于亲本可具有改善的重新折叠的能力。
在一个方面，当使用合适的测定如实施例7中所述的测定比较剩余活性时，具有木聚糖酶活性的变体的热稳定性与亲本相比具有至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍，至少1.4倍，至少1.5倍，至少2倍，至少2.5倍，至少3倍，至少3.5倍，至少4倍，至少4.5倍，和至少5倍的热稳定性。
改善的热活性：术语“改善的热活性”意指变体在特定温度范围相对于亲本的温度依存性活性概貌显示改变的温度依存性活性概貌。所述温度范围可为任何合适的温度范围，其中可观察到变体和亲本之间的热活性差异。用于确定改善的热活性的pH可为任何合适的pH，例如3，3.5，4，4.55，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，或任何其它合适的pH。热活性值提供了变体在一定范围温度内在增强水解反应的催化方面的有效性的量度。变体在特定温度范围内是稳定的，并保持其活性，但随着温度增加变得较不稳定，从而活性较低。此外，由变体催化的反应的起始速率可通过温度的增加进行加速，这是通过确定变体的热活性进行测量的。热活性更高的变体会导致增强酶组合物水解底物速率方面的增加，由此减少所需的时间和/或减少活性所需的酶浓度。或者，具有较少的热活性的变体会在低于由亲本的温度依存性活性概貌所定义的亲本的最适温度的温度增强酶反应。
在一个方面，当使用合适的测定如实施例8中所述的测定比较剩余活性时，变体的热活性与亲本相比具有至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍，至少1.4倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍，至少100倍，至少125倍，至少150倍，至少175倍，和至少200倍的热活性。
改善的漂白剂增强性能：术语“改善的漂白剂增强性能”意指变体与亲本相比生成更高的Kappa数减少和从纸浆释放更多的280nm吸收材料。所述温度可为任何合适的温度，其中可观察到变体和亲本之间的漂白剂增强性能的差异，例如40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，或任何其它合适的温度。用于确定改善的漂白剂增强性能的pH可为任何合适的pH，例如3，3.5，4，4.55，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，或其它任何合适的pH。
在一个方面，使用合适的测定如实施例13中所述的测定，基于纸浆Kappa数减少，用本发明的变体处理纸浆与用亲本处理相比增加漂白剂增强性能至少0.5%，例如至少1%，至少1.5%，至少2%，至少2.5%，至少3%，至少3.5%，至少4%，至少4.5%，至少5%，至少7.5%，和至少10%。
在另一个方面，基于从纸浆释放280nm吸收材料(参见实施例13)，用本发明的变体处理纸浆与用亲本处理相比增加漂白剂增强性能至1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍，至少1.4倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，和至少10倍。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”在本文中定义为任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖骨架(其具有短糖链分支)的杂聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-***糖和/或多种寡糖，由D-木糖、L-***糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖组成。木聚糖类型的多糖可分为同木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(***)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)***木聚糖，***木聚糖和复合杂木聚糖(complexheteroxylan)。参见例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
在本发明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是8myl8chyma8ydes。
发明详述
本发明涉及亲本木聚糖酶的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的位置处包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
变体命名规则：
就本发明而言，使用公开于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的成熟多肽以确定在其他木聚糖酶中对应的氨基酸残基。将其他木聚糖酶的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J. Mol.Biol.48：443-453)(如用EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends Genet 16:276-277)的Needle程序执行，优选为3.0.0版或之后的版本)确定SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
在另一个木聚糖酶中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics 23:2947-2948)进行的多个多肽序列的比对来确证。
当其他酶与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽歧异到传统的基于序列的比较无法检测出其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及9myl9chym势(9myl9chym potential))的信息作为预测所查询序列(query sequence)结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可接着用于生成所述多肽的同源性模型，且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,ProteinEngineering.11:739-747)进行比对，且这些算法的实施可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。
在描述本发明的木聚糖酶变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表205和411位用精氨酸I取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
***。对于氨基酸***，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新***的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后***赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的***命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，***的氨基酸#1，新***的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此情况下，通过在***的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对***的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：
| 亲本: | 变体: |
| 195 | 195195a 195b |
| G | G-K-A |
多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。
不同的改变。当可在一个位置引入不同的改变时，所述不同改变由逗号分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指下述变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
亲本木聚糖酶
所述亲本木聚糖酶可为(a)多肽，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链；或(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。
在第一个方面，所述亲本与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并具有木聚糖酶活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如九个氨基酸，八个氨基酸，七个氨基酸，六个氨基酸，五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，和一个氨基酸。
所述亲本优选包含或组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个方面，所述亲本包含或组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽。在另一个方面，所述亲本包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至194，或SEQ ID NO:4的氨基酸1至296。
在一个实施方案中，所述亲本为SEQ ID NO:2的成熟多肽含有至少160个氨基酸残基，例如至少165个，至少170个，至少175个，至少180个，至少185个，或至少190个氨基酸的片段。
在另一个实施方案中，所述亲本为SEQ ID NO:4的成熟多肽含有至少250个氨基酸残基，例如至少255个，至少260个，至少265个，至少270个，至少275个，至少280个，至少285个，至少290个，或至少295个氨基酸的片段。
在另一个实施方案中，所述亲本是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的等位变体。
在第二个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下，与以下杂交：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链(全长互补物)(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码亲本。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在低至非常高的严格条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的多肽，其成熟多肽编码序列，其全长互补链，或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测与探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸82至663或SEQ IDNO:3的核苷酸127至1014。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽，或它们的片段的多核苷酸。在另一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，50℃(低严格性)，55℃(中严格性)，60℃(中-高严格性)，65℃(高严格性)，或70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第三个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的序列同一性，并编码具有木聚糖酶活性的多肽。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸82至663或SEQ ID NO:3的核苷酸127至1014。在一个实施方案中，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。
所述亲本可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的亲本由所述来源产生，或由其中***了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面，所述亲本是胞外分泌的。
所述亲本可以是细菌木聚糖酶。例如，所述亲本可为***多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)木聚糖酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、网球菌属(Dictyoglomus)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、栖热袍菌属(Thermotoga)或脲原体属(Ureaplasma)木聚糖酶。
在一个方面，所述亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus halodurans、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)或Thermotoga 14myl14chy木聚糖酶。
所述亲本可为真菌木聚糖酶。例如，所述亲本可为酵母木聚糖酶如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)木聚糖酶。例如，所述亲本可为丝状真菌木聚糖酶如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热霉属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、Humicola 14myl14chyma、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiarum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)木聚糖酶。
在另一个方面，所述亲本是Thermobifida fusca木聚糖酶，并优选为SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的Thermobifida fusca木聚糖酶或其成熟多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(D SM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品鉴定和获得所述亲本。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
所述亲本可为杂合多肽，其中一个多肽的一部分融合于另一个多肽的一部分的N端或C端。
所述亲本亦可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中一个多肽融合于另一个多肽的N端或C端。通过将编码一个多肽的多核苷酸融合于编码另一个多肽的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们处于同一阅读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science 266:776-779)。
融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J. Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48中的位点。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有木聚糖酶活性的变体的方法，所述方法包括：(a)将在对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个(几个)位置将取代引入亲本木聚糖酶，其中所述变体具有木聚糖酶活性；和(b)回收所述变体。
所述变体可使用本领域任何已知的任何诱变方法，如定位诱变、合成基因构建(synthetic gene construction)、半合成基因构建(semi synthetic geneconstruction)、随机诱变、改组(shuffling)等来制备。
定位诱变是在编码亲本的多核苷酸上的一个或多个确定位点创建一个或多个(几个)突变的技术。
定位诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定位诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行切割，然后将含有突变的寡核苷酸连接到所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和***物的粘性末端能够彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；以及Barton等,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。
定位诱变亦可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnol.19:773-776;Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290;以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.43:15-16。
任何定位诱变方法可用于本发明。有许多可用的市售试剂盒可用于制备变体。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等(2004，Nature 432:1050-1054)所述基于多通道微芯片(multiplex microchip-based)的技术，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在光可编程的(photo-programmable)微流芯片(microfluidicchip)上组装。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156;WO 95/17413;或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:145;等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定位诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面而达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定位诱变引物扩增，还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-error prone PCR)扩增。多核苷酸亚序列可随后进行改组。
变体
本发明还提供了亲本木聚糖酶的变体，其在对应于位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个(几个)位置包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
在一个实施方案中，所述变体与亲本木聚糖酶的氨基酸序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个方面，本发明的变体中的取代的数量为1-23，例如1-15，1-10，和1-5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，或23个取代。
在一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个(几个)位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的两个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的三个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的四个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的五个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的六个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的七个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的八个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的九个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十一个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十二个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十三个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十四个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十五个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十六个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十七个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十八个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十九个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十一个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十二个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的每个位置包含取代。
在一个方面，变体在对应于位置2的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置2的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ile取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I。
在另一个方面，变体在对应于位置17的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置17的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Leu取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代F17L。
在另一个方面，变体在对应于位置21的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置21的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ser取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S。
在另一个方面，变体在对应于位置28的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置28的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代E28V。
在另一个方面，变体在对应于位置38的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置38的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Tyr或Phe取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S38Y，F。
在另一个方面，变体在对应于位置41的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置41的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N41D。
在另一个方面，变体在对应于位置55的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置55的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G55D。
在另一个方面，变体在对应于位置56的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置56的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用His或Pro取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代R56H,P。
在另一个方面，变体在对应于位置57的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置57的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用His取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代R57H。
在另一个方面，变体在对应于位置60的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置60的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ser取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T60S。
在另一个方面，变体在对应于位置62的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置62的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Thr取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S62T。
在另一个方面，变体在对应于位置74的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置74的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ala或Ser取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74A,S。
在另一个方面，变体在对应于位置81的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置81的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N81D。
在另一个方面，变体在对应于位置104的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置104的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ser取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T104S。
在另一个方面，变体在对应于位置111的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置111的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ile取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T111I。
在另一个方面，变体在对应于位置121的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置121的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Tyr取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N121Y。
在另一个方面，变体在对应于位置151的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置151的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N151D。
在另一个方面，变体在对应于位置159的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置159的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Arg取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代H159R。
在另一个方面，变体在对应于位置161的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置161的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Leu取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代M161L。
在另一个方面，变体在对应于位置183的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置183的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N183D。
在另一个方面，变体在对应于位置186的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置186的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ile或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代L186I,V。
在另一个方面，变体在对应于位置188的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置188的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ala取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T188A。
在另一个方面，变体在对应于位置192的位置包含取代。在另一个方面，在对应于位置192的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Asp取代。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G192D。
在另一个方面，变体在对应于位置2和57的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2和74的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置17和81的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置17和161的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置38和104的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置38和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置38和192的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置56和60的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置74和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置17，81，和188的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置28，56，和183的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置38，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置41，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置55，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置57，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，74，159，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，17，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，57，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，55，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置17，74，81，186，和188的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，62，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，55，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，55，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，55，62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置28，38，74，121，151，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，62，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，55，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，55，62，74，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，55，62，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，28，38，62，74，111，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置21，38，55，62，74，81，和186的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的位置包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体包含一个或多个(几个)选自下组的取代：V2I，F17L，A21S，E28V，S38Y，F，N41D，G55D，R56H,P，R57H，T60S，S62T，T74A,S，N81D，T104S，T111I，N121Y，N151D，H159R，M161L，N183D，L186I,V，T188A，和G192D。
在一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+R57H。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+T74A。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+T74S。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代F17L+N81D。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代F17L+M161L。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S38Y+T104S。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S38Y+L186V。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S38F+G192D。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代R56P+T60S。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74S+L186V。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74S+L186I。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74A+L186V。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74A+L186I。
在另一个优选的方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代F17L+N81D+T188A。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代E28V+R56H+N183D。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S38Y+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代N41D+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G55D+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代R57H+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T74A+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+T74S+H159R+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+F17L+T74S+L186I。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+R57H+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+G55D+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代F17L+T74S+N81D+L186V+T188A。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S62Y+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+G55D+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+G55D+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+G55D+S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代E28V+S38Y+T74S+N121Y+N151D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+S62T+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+G55D+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V2I+E28V+S38Y+S62T+T74S+T111I+L186V。
在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V。
变体可进一步在一个或多个(几个)其它位置包含改变，例如取代、缺失或***。举例而言，变体可进一步在对应于位置19，23，84，和88的一个或多个(几个)位置包含取代。
在一个方面，在本发明的变体中进一步取代的数量为1-4，如1、2、3或4个取代。
在一个方面，变体在对应于任何位置19，23，84，和88的一个或多个(几个)位置进一步包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置19，23，84，和88的两个位置进一步包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置19，23，84，和88的三个位置进一步包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置19，23，84，和88的位置进一步包含取代。
在一个方面，变体在对应于位置19的位置进一步包含取代。在另一个方面，在对应于位置19的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Ala取代。在另一个方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的取代T19A。
在另一个方面，变体在对应于位置23的位置进一步包含取代。在另一个方面，在对应于位置23的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Pro取代。在另一个方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的取代G23P。
在另一个方面，变体在对应于位置84的位置进一步包含取代。在另一个方面，在对应于位置84的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Pro取代。在另一个方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的取代V84P。
在另一个方面，变体在对应于位置88的位置进一步包含取代。在另一个方面，在对应于位置88的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选用Thr取代。在另一个方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的取代I88T。
在另一个方面，变体在对应于位置19和23的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19和84的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置23和84的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置23和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置84和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19，23，和84的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19，23，和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19，84，和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置23，84，和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体在对应于位置19，23，84，和88的位置进一步包含取代，如上述那些。
在另一个方面，变体进一步包含一个或多个(几个)选自下组的取代：T19A，G23P，V84P，和I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+G23P。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+V84P。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G23P+V84P。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G23P+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代V84P+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+G23P+V84P。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+G23P+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+V84P+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代G23P+V84P+I88T。
在另一个优选的方面，变体进一步包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的取代T19A+G23P+V84P+I88T。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的木聚糖酶活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。亦参见Hilton等,1996,J. Biol.Chem.271:4699-4708。木聚糖酶的活性部位，或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J. Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与相关于亲本的多肽的同一性分析来推断。
所述变体可由151至160，161至170，171至180，181至190，191至200，201至210，211至220，221至230，231至240，241至250，251至260，261至270，或271至280个氨基酸组成。
多核苷酸
本发明还涉及编码任何本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸***载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其为由用于表达编码本发明的变体的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(31myl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene 69:301-315),天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/35myl35chyma35ydes-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由所选宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母32myl32chyma32ydes-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当转录时，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/32myl32chyma32ydes-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与变体编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端相连的信号肽，并且指导所述变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述变体的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的变体进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉33myl33chym、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、腐质霉属33myl33chym脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于变体N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在变体的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)变体N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达。调节***的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点***或取代编码变体的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中***包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码变体的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸***宿主细胞以增加变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明变体的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J. Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J. Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J. Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J. Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J. Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如引用于Hawksworth等,1995,见上,第171页)和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales ))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的38myl38ch壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、腐质霉属39myl39chyma、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Phlebia 39myl39chyma、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J. Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。
产生方法
本发明还涉及用于产生变体的方法，其包括：(a)在适于所述变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述变体。
使用本领域公知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述变体的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果变体分泌到营养培养基中，该变体能够从所述培养基中直接回收。如果变体不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述变体是特异性的方法来检测变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定(enzyme assay)可用于变体的活性。
变体可以通过本领域已知的方法回收。例如，变体可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
变体可以使用多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的变体，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCH Publishers,New York,1989)。
在可选的方面，不回收变体，而将表达所述变体的本发明宿主细胞作为变体的来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。优选地，所述组合物富含此种变体。术语“富含”意指所述组合物的木聚糖酶活性以例如1.1的富集因子增加。
所述组合物可包含变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、40myl40chym、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。所述其他酶可通过例如属于曲霉属，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)；镰孢属，例如杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)；腐质霉属，例如特异腐质霉(Humicola insolens)或Humicola 40myl40chyma；或木霉属，例如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)的微生物产生。
所述组合物可依照本领域已知方法制备，且可为液体或干组合物的形式。举例而言，所述组合物可为颗粒或微粒的形式。所述变体可依照本领域已知方法稳定化。
用途
本发明的变体可用于数种降解或转化含木聚糖材料的应用，包括用所述变体处理所述材料(参见，例如WO 2002/18561)。本发明的变体可用于增强纸浆的亮度，改善纸的品质，减少用于纸浆漂白阶段的化学漂白剂如氯的量，和为其它目的处理纸浆，而不诱导纸浆中任何纤维素损伤。
所述变体可用于处理纸浆的方法，例如根据美国专利号5,658,765处理Kraft纸浆。纸浆是通过将纤维从木材、纤维作物或废纸以化学方法或机械方法分离而制备的干纤维材料。木纸浆是最常见的用于造纸的材料。用于制备木纸浆的木料来源称作造纸材。木纸浆来源于软木树如云杉、松、冷杉、落叶松和铁杉，以及硬木如桉树、白杨和桦树。所述变体可用于纸浆漂白以减少毒性含氯化学品的使用。此外，期望用于生物漂白的木聚糖酶在碱性条件下在高温是稳定并具有活性的。在一个优选实施方案中，本发明涉及用于制备纸浆的方法，包括将纸浆与所述变体相接触。
在根据本发明的纸浆处理中，用于制备纸浆的酶的条件，如温度、pH、压力、时间期间等，可合适地选取使得所需的酶作用呈现为实现所需效果，如亮度的增强。举例而言，所述温度的范围可为10至90℃，例如25至85℃，30至85℃，40至85℃，50至85℃，60至80℃，70至80℃，或任何其它合适温度。pH的范围可为3至11，例如4至10，5至10，6至10，7至10，7至9.5，8至9.5，或其它任何合适的pH。所述纸浆用变体处理，所述变体的量为0.1至25mg/kg干纸浆，例如0.25至20，0.5至10，0.75至10，1至8，1至6，1至5mg/kg干纸浆，或其它任何合适量。
压力可在常规用于纸浆漂白或其它一般纸浆处理步骤的压力下施加；对此并无特别限制，但从经济角度出发优选常压。处理的时间期间的范围可为10分钟至50小时，例如0.5小时至24小时，1小时至24小时，1小时至12小时，1小时至5小时，例如2小时，或任何其它合适的时间期间。
在需要增强亮度的情况下，在酶处理之后使用的化学漂白剂的量可极大地减少。本发明的纸浆处理对于替代至少一部分使用氯漂白剂的目前的漂白工艺是充分的。
本发明处理纸浆的方法可适用于广泛范围的纸浆，所述纸浆来源于阔叶树，针叶树，或非树材料，如kraft纸浆，亚硫酸盐纸浆，半化学纸浆，磨木浆，提纯器磨木浆(refiner groundwood pulp)，热机械纸浆(thermo-mechanicalpulp)，等等。通过将本发明的纸浆处理方法施用于这些纸浆，可减少在纸浆中剩余的木质素的量以获得下述作用如纸浆亮度的增强，品质的改善，和化学漂白剂的量的减少。本发明的纸浆处理方法亦可在漂白之前或之后施用于通过氧等对这些纸浆进行的漂白步骤。
在使用本发明的变体进行的纸浆处理之后，亦可进行提取以有效地从纸浆去除溶解的或易溶解的木质素。所述提取可使用例如氢氧化钠进行。在此情况下，提取的通常条件设定为0.3至20%的纸浆浓度，基于干纸浆重量0.5至5%的氢氧化钠浓度，40至80℃的温度范围，和30分钟至3小时的时间期间，例如1至2小时。然而，可使用本领域中已知的任何合适的提取。
在根据本发明的方法处理纸浆之后，亦可使用化学漂白剂以进一步增强纸浆的亮度。在此情况下，即使化学漂白剂的量相对于仅使用化学漂白剂漂白纸浆的情况极大地减少，但仍可获得更佳的亮度。当使用二氧化氯作为化学漂白剂时，二氧化氯的量可减少23%至43%或甚至更多。
当从根据本发明的方法处理的纸浆造纸时，该纸具有优秀的特性，如与从常规漂白的纸浆制备的纸相比较低的氯代酚类化合物含量。
所述变体亦可用于根据美国专利号5,658,765产生木糖或木寡糖的工艺。在另一个优选实施方案中，本发明涉及产生木糖的方法，其包括将含木聚糖材料与所述变体相接触。在一个方面，所述方法进一步包括回收所述木糖。
所述变体亦可根据美国专利号6,245,546用作饲料增强酶，其改善饲料可消化性以增加其利用效率。
所述变体亦可用于根据美国专利号5,693,518的烘烤。
所述变体可进一步用于根据WO 2002/24926的酿造。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述变体。变体可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有所述变体的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、43myl43chyma、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达变体而确定。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1或稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.of Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPysiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、***(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码变体的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opin.Biotech.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括那些描述于美国专利6,395,966和7,151,204的那些(两者均通过全文提述并入本文)。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了用根据本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有所述构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将编码变体的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而导致转基因引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。
植物可通过回交转化方法生成。例如，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所需性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
本发明还涉及产生本发明变体的方法，包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
菌株
枯草芽孢杆菌168Δ4来源于枯草芽孢杆菌模式菌株168(BGSC 1A1,Bacillus Genetic Stock Center,Columbus,OH,USA)，并在spoIIAC，aprE，nprE，和amyE基因中具有缺失。所述四个基因的缺失基本上如对于枯草芽孢杆菌A164Δ5(美国专利号5,891,701)所述进行。
使用枯草芽孢杆菌菌株McLp2(168Δ4,xynAΔpel：:三重启动子，其包含在对应于位置5具有突变的地衣芽孢杆菌46myl 4199启动子，对于“-35”区具有序列TTGACA和对于“-10”区具有TATAAT的短的共同解淀粉芽孢杆菌amyQ启动子，和苏云金芽孢杆菌Tenebrionis亚种crylIIA启动子[WO 2003/095658],neos,specR)表达Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体。
使用枯草芽孢杆菌菌株McLp7(164Δ5[spoIIAC，aprE,nprE,amyE,srfAC;美国专利号5,891,701],xynAΔpel：:三重启动子，其包含在对应于位置5具有突变的地衣芽孢杆菌46myl 4199启动子，对于“-35”区具有序列TTGACA和对于“-10”区具有TATAAT的短的共同解淀粉芽孢杆菌amyQ启动子，和苏云金芽孢杆菌Tenebrionis亚种cryIIIA启动子[WO 2003/095658]specR)表达Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体。
培养基
Spizizen I培养基的组成为6g的KH2PO4，14g的K2HPO4，2g的(NH4)2SO4，1g的Na3C6H5O7，0.2g的MgSO4·7H2O，5g的葡萄糖，0.2g的酪蛋白水解物，1g的酵母提取物，50mg的色氨酸，和去离子水至1升。
Spizizen II培养基的组成为Spizizen I培养基和每升0.055g的CaCl2和0.24g的MgCl2。
LB培养基的组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl，和去离子水至1升。
LB+Amp培养基的组成为补充每ml 100μg的氨苄青霉素的LB培养基。
LB琼脂培养基的组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl，15g的bacto琼脂，和去离子水至1升。
LB+Amp琼脂培养基的组成为补充每ml 100μg的氨苄青霉素的LB琼脂培养基。
LB+Cm琼脂培养基的组成为补充每ml 5μg的氯霉素的LB琼脂培养基。
含0.1%AZCl-木聚糖的LB+Cm琼脂培养基的组成为补充每升0.1g的AZCl-***木聚糖(Megazyme，Ireland)的LB+Cm琼脂培养基。
含0.1%AZCl-木聚糖的LB平板的组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl，15g的Bacto琼脂，1g的AZCl-木聚糖桦木(Megazyme，Ireland)，和去离子水至1升。
TBAB+Cm平板的组成为33g的TBAB(Tryptose Blood Agar Base)，5mg的氯霉素，和去离子水至1升。
MY25培养基的组成为25g的麦芽糊精，2g的MgSO4·7H2O，10g的KH2PO4，2g的柠檬酸无水粉末，2g的K2SO4，2g的尿素，10g的酵母提取物，0.5ml的AMG微量金属溶液，和去离子水至1升。
AMG微量金属溶液的组成为14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸，和去离子水至1升。
DIFCOTM Lactobacilli MRS培养液的组成为10g的Proteose Peptone No.3，10g的牛肉提取物，5g的酵母提取物，20g的右旋糖，1g的聚山梨酯80，2g的柠檬酸铵，5g的乙酸钠，0.1g的硫酸镁，0.05g的硫酸锰，2g的磷酸二钾，和去离子水至1升。
实施例1：枯草芽孢杆菌质粒pTH025和pTH153的构建
质粒pTH025和pTH153如下所述构建。构建质粒pTH025(图1)以供整合和表达突变基因文库，并亦用于构建质粒pTH153，一种含有Thermobifidafusca家族11木聚糖酶合成基因(去除纤维素结合模块(CBM)区)的枯草芽孢杆菌整合表达载体。构建了质粒pTH153(图2)用作文库中的阳性对照和变体筛选，并用作模板以供生成易错随机文库。
下述步骤描述了pTH025的构建。将质粒pMB1508(美国专利号7,485,447)用Pac I和Kpn I消化以去除含有两个存在于质粒上的Sac I位点之一的913bp片段。将6.5kb质粒片段用T4DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.,Ipswich,MA,USA)平端化，通过40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，使用
GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)提取，使用Rapid Ligation Kit(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)自连接使质粒重新环化，并转化入大肠杆菌XL-1Blue Sub-cloning Grade Competent细胞(Stratagene,La Jolla,CA)。在LB+Amp培养基上选择转化体。使用
9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)制备来自几个所得大肠杆菌转化体的质粒DNA。所得的质粒pTH022通过用Sac I和Pst I进行的限制性酶消化来验证，其表明正确的质粒构建体仅含有一个Sac I位点，且pTH022的完全消化产生了5kb和871bp的两个片段(根据TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳)。
质粒pTH022中Sac I位点的缺失如下所述实现：在Sac I消化之后，将质粒用T4DNA聚合酶平端化，使用Rapid Ligation Kit依照生产商的指示自连接，并转化入大肠杆菌XL-1 Blue Sub-cloning Grade Competent Cell。在LB+Amp培养基上选择转化体。使用9600制备来自几个所得大肠杆菌转化体的质粒DNA。所得的质粒pTH023通过用Sac I和Pst I进行的限制性酶消化来验证，其通过一个6.5kb的片段(根据TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳)的存在表明Sac I位点的缺失。
似马链球菌hasA基因从质粒pRB156(WO 2003/054163)获得，即用Pac I消化，用T4DNA聚合酶平端化，并用Not I消化以释放携带hasA基因的1.9kb片段，其通过TAE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳显影。将质粒pTH023用Eco RI消化，使用Klenow片段平端化，然后用Not I消化。将1.9kb hasA基因片段和6.4kb pTH023载体片段通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，使用
Gel Extraction Kit提取，使用RapidLigation Kit连接在一起，并转化入大肠杆菌XL1-Blue Sub-cloning GradeCompetent Cells(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。在LB+Amp培养基上选择转化体。使用
9600制备来自几个所得大肠杆菌转化体的质粒DNA。所得的质粒pTH025通过用Sac I和BglII进行的限制性酶消化来验证，其得到6.9kb和1.4kp的两个片段(根据TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳)。使用质粒pTH025作为骨架构建质粒pTH153。
下述步骤描述了pTH153的构建。设计了合成的多核苷酸片段以在整合入枯草芽孢杆菌时提供最佳的蛋白表达，所述片段包含克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶核糖体结合位点(RBS)，和与582bp编码T.fusca GH11木聚糖酶(去除纤维素结合域)的密码子优化的基因融合的克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶信号序列(图3)。所述密码子优化的合成的多核苷酸由Codon Devices,Inc.,(Cambridge,MA,USA)合成，并作为命名为ptfxyCBM的大肠杆菌来源的质粒递送。该合成的多核苷酸亦设计为含有两翼的Sac I和Mlu I限制性内切核酸酶位点以供T.fusca GH11木聚糖酶突变体多核苷酸片段的后续亚克隆。
将质粒ptfxyCBM的691 bp Sac I和Mlu I片段亚克隆入质粒pMDT100(WO 2008/140615)以生成质粒中间体pSMO248。亚克隆是通过用Sac I和MluI消化pMDT100去除这两个限制性位点之间的克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶RBS片段，通过TAE缓冲液中的0.7%琼脂糖凝胶电泳纯化剩余的质粒骨架片段，从凝胶切出，并使用
Gel Extraction Kit提取来实现的。类似地消化质粒ptfxyCBM，释放克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶信号序列-Thermobifida fusca木聚糖酶合成多核苷酸片段，将其如上所述纯化，使用Rapid Ligation Kit连接入pMDT100骨架，并转化入大肠杆菌感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。在LB+Amp琼脂培养基选择转化体。使用
9600分离来自单个大肠杆菌菌落的质粒DNA，并且691bp合成Thermobifida fusca木聚糖酶片段正确***pMDT100骨架以构建pSMO248是通过Sac I和Mlu I消化以及通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳显影来验证的。
将来自pSMO248的合成Thermobifida fusca木聚糖酶多核苷酸片段亚克隆入pTH025以生成pTH153。为实现该亚克隆，设计了下示引物以从pSMO248通过PCR扩增编码合成的Thermobifida fusca家族11木聚糖酶的多核苷酸。
正向引物(Tf.xylF)：
5’-ATCAGTTTGAAAATTATGTATTATGGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGG-3’(SEQ ID NO:5)
反向引物(Tf.xylR)：
5’-CTTTAACCGCACAGCGTTTTTTTATTGATTAACGCGTTTA-3’(SEQID NO:6)
引物Tf.xylF设计为除了质粒pTH025上Sac I位点下游17bp区之外还含有苏云金芽孢杆菌Tenebrionis亚种cryIIIA mRNA稳定化序列(WO 94/25612)。引物Tf.xylR设计为含有质粒pTH025上MluI位点下游31bp区以供融合PCR产物和pTH025。
将总共50皮摩尔的上述各引物用于扩增反应，所述反应含有50ng的pSMO248，1X AMPLITAQ
Buffer II(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的混合物，各10mM，5个单位的AMPLITAQ
DNA聚合酶(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，和3μl的25mM MgSO4，终体积为50μl。扩增反应在
5333(Eppendorf EG，Hamburg,Germany)中进行，其程序为：1个循环，在95℃进行9分钟，和30个循环，每个在95℃进行30秒，55℃进行30秒和72℃进行30秒。在30个循环之后，将反应物在72℃加热5分钟。然后加热块进入10℃浸泡循环。
反应产物通过TAE缓冲液中的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中将717bpPCR产物从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit提取。
质粒pTH025通过用Sac I和MluI消化来间隔化。消化通过在TAE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶上将消化物的等分试样分级来进行验证，其中获得了7038bp(间隔化的)和1307bp(来自似马链球菌hasA基因)的预期片段。将7038bp(间隔化的)片段从凝胶切出，并使用
Minelute柱(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。
将经Sac I和MluI消化的质粒pTH025和717bp PCR产物的同源末端使用IN-FUSIONTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA,USA)连接。将总共50ng的717bp PCR产物和100ng的质粒pTH025(用Sac I和MluI消化)用于反应，所述反应含有2μl的5XIN-FUSIONTM反应缓冲液(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View，CA,USA)和1μl的IN-FUSIONTM酶(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View，CA,USA)，终体积为10μl。将反应物在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟，然后置于冰上。将反应体积用10mM Tris-0.1mM EDTA pH 8(TE)缓冲液增加至50μl，并将3μl的反应物用于根据生产商的指示转化大肠杆菌
Ultracompetent Cells(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。在LB+Amp琼脂培养基上选择转化体。使用
9600制备来自几个所得大肠杆菌转化体的质粒DNA。
鉴定了含有与Thermobifida fusca家族11木聚糖酶合成基因融合的编码克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶信号序列的多核苷酸的质粒pTH153，且全长基因序列使用3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)确定。
实施例2：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶基因突变体的构建
Thermobifida fusca家族11木聚糖酶合成基因的突变体是通过使用
XL Site-Directed Mutagenesis Kit或QUIKCHANGE
Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA,USA)对ptfxyCBM(参见实施例1)进行定点诱变以生成突变体51，49，340，341，370，386，473，472，470，474，和471来构建的。用于定点诱变的寡聚物和获得的突变体的总结示于表1。
使用
9600制备所得的突变体质粒DNA，并使用3130xlGenetic Analyzer对其进行测序。将经测序确证的突变体用Sac I和MluI消化，并通过TAE缓冲液中的1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化。将700bp的片段从凝胶切出，并使用
Gel Extraction Kit提取。然后将一百ng的各片段使用Rapid Ligation Kit在10μl反应体积中在15℃过夜连接至50ng经Sac I和MluI消化并经纯化的pTH025(如上所述)。使用五μl的连接混合物转化大肠杆菌
感受态细胞。在LB+Amp琼脂培养基上选择转化体。使用
9600制备来自含有pSMO398(L186V)，pSMO396(T74A)，pSMO513(T74S+L186V)，pSMO520(T74S+L186I)，pSMO514(T74A+L186I)，pSMO512(T74A+L186V)，pSMO567(A21S+T74S+L186V)，pSMO566(S38Y+T74S+L186V)，pSMO564(G55D+T74SL+186V)，pSMO568(T74S+N81D+L186V)，或pSMO565(S62T+T74S+L186V)的大肠杆菌转化体的质粒DNA。质粒使用3130xl Genetic Analyzer测序。
表1
实施例3：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体在枯草芽孢杆菌中的表达
将一μg的pSMO398，pSMO396，pSMO513，pSMO520，pSMO514，pSMO512，pSMO567，pSMO566，pSMO564，pSMO568，或pSMO565(参见表1)用Sal I线性化。将线性化的质粒使用
Minelute柱纯化。将每个线性化的DNA转化入枯草芽孢杆菌McLp2或McLp7。
枯草芽孢杆菌McLp2或McLp7的感受态细胞是根据Anagnostopoulos和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81:741-746制备的。然后将细胞在3836x g离心10分钟。将十八ml的细胞上清添加至2ml甘油。将细胞沉淀重悬于上清/甘油混合物，分配为0.5ml等分试样，并在-70℃冻结。
将含2mM EGTA的半ml的Spizizen II培养基添加至0.5ml的冻结的感受态枯草芽孢杆菌McLp2或McLp7细胞。将细胞在水浴中在37℃解冻，并分至18个试管(大约每个50μl)。将一μg的每个经线性化的突变体质粒DNA添加至不同的感受态细胞等分试样，并用0.5ml的氯霉素以0.2μg每ml的最终浓度进行诱导。将线性化的pSMO398，pSMO396，pSMO512，pSMO567，pSMO566，pSMO564，pSMO568，或pSMO565转化至McLp2，而将线性化的pSMO513，pSMO520和pSMO514转化至McLp7。转化反应物在37℃以250rpm振荡温育1小时。然后将细胞铺板于TBAB CM培养基上。用每个表达载体转化枯草芽孢杆菌McLp2或McLp7产生50-100个菌落。将来自每个转化的一个菌落划线于TBAB CM培养基上以供分离，并在LB 0.1%AZCL-木聚糖平板上测试木聚糖酶的产生。对于木聚糖酶的产生为阳性的菌落在LB0.1%AZCL-木聚糖平板上产生蓝色晕环。
根据实施例7和8就改善的热稳定性和热活性筛选木聚糖酶变体。
实施例4：在枯草芽孢杆菌McLp2中Thermobifida fusca家族11木聚糖酶突变体的初级随机文库的生成
为了鉴定Thermobifida fusca家族11木聚糖酶对于蛋白质热稳定性至关重要的区，将整个来自质粒pTH153的合成的Thermobifida fusca家族11木聚糖酶基因(实施例1)用设计为在芽孢杆菌克隆载体pTH153(实施例1)的所需***位点侧翼含有至少30bp的同源序列的寡聚引物使用易错PCR进行诱变。对末端进行如此的工程改造，使得可使用IN-FUSIONTM Advantage PCRCloning Kit暴露克隆载体上的互补区和DNA***，以供通过碱基配对自发退火，从而从线性化的载体和PCR产物的组合生成环状的复制质粒。
随机诱变通过PCR使用
Random Mutagenesis II Kit(Stratagene,La Jolla,CA,USA)进行。使用质粒pTH153作为模板DNA以供PCR扩增Thermobifida fusca家族11木聚糖酶易错文库。PCR产物使用引物Tf.xylF和Tf.xylR(实施例1)生成。易错PCR扩增的组成为75-100ng的模板DNA，1X
II反应缓冲液(Stratagene,La Jolla,CA,USA)，1μl的40mM dNTP混合物，各250ng的引物(Tf.xylF和Tf.xylR)，和2.5单位的
II DNA聚合物(Stratagene,La Jolla,CA,USA)，终体积为50μl。扩增反应在
5333中进行，其程序为1个循环，在95℃进行2分钟；和30个循环，每个在95℃进行1分钟，55℃进行1分钟，和72℃进行1分钟。在30个循环之后，将反应物在72℃加热10分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
将质粒pTH153通过用Sac I和MluI消化间隔化。通过TAE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离出7038bp(间隔化)和1307bp(来自似马链球菌hasA基因)的片段，将其从凝胶切出，并使用
Minelute柱纯化。
使用IN-FUSIONTM Advantage PCR Cloning Kit连接经Sac I和MluI消化的质粒pTH025和717bp易错PCR产物的同源末端。PCR产物在末端含有至少30bp的同源5’和3’DNA以协助这些末端与克隆载体的连接。将总共50ng的717bp PCR产物和100ng的质粒pTH025(用Sac I和MluI消化)用于反应，所述反应含有2μl的5X IN-FUSIONTM反应缓冲液和1μl的IN-FUSIONTM酶，终体积为10μl。将反应物在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟，然后置于冰上。将反应体积用TE缓冲液增加至50μl，并使用3μl的反应根据生产商的指示转化大肠杆菌
Ultracompetent Cell。在LB+Amp琼脂培养基上选择转化体。
在LB+Amp培养液中收集所得的转化的菌落，并使用Plasmid Maxi Kit(
Inc.,Valencia,CA,USA)从菌落分离质粒DNA。将分离的质粒DNA用Sal I消化以线性化DNA，并使用PCR Purification Kit(
Inc.,Valencia,CA,USA)纯化，然后转化入枯草芽孢杆菌McLp2菌株。将DNA制备物转化入枯草杆菌宿主根据实施例3进行。
产生了两个随机文库，一个产生平均每编码序列5.8个突变(文库1)，而另一个产生平均每编码序列大约7.5个突变(文库2)。确定在
Random Mutagenesis II Kit中分别需要100ng和75ng的模板DNA以生成文库1和2。
根据实施例7和8筛选从文库1和2生成的木聚糖酶变体，并将对于变体136，96，101，197，210，235，291，308，378，417，425，430，和435的枯草芽孢杆菌转化体单菌落分离至TBAB+Cm平板之上。对于这些变体的多核苷酸序列根据实施例9确定。
实施例5：在枯草芽孢杆菌McLp2中改组的突变体Thermobifida fuscaGH11木聚糖酶文库的生成
使用在初级筛选(参见实施例7和8)中具有改善的性能的Thermobifidafusca GH11木聚糖酶变体的突变的DNA生成改组的文库。构建了三个文库，并且每个文库分别来源于改组14、6或10个改善的突变体。突变体在体外根据Stemmer,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751所述的方法进行改组。将每个突变体DNA从制备的基因组DNA使用REDExtract-N-AmpTMPCR ReadyMix Kit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行PCR扩增。在该提取中，将枯草芽孢杆菌McLp2突变体菌落添加至100μl的ExtractionSolution(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，并进行短暂地涡旋。将提取反应在95℃温育10分钟，接着添加100μl的Dilution Solution(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)。对含有基因组DNA的提取混合物进行PCR以扩增每个突变体T.fusca木聚糖酶序列。在50μl反应中，每个变体PCR含有1-5单位THERMPOL IITM DNA聚合酶(New England Bio Labs,Ipswich,MA,USA)，各0.2mM的dNTP，各50pMol的引物aTH153.1S和引物aTH153.1A(如下所示)，和4μl的如上所述制备的基因组DNA。将反应在
5333中温育，其程序为：1个循环，在94℃进行3分钟，接着30个循环，每循环在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行90秒(5分钟最终延伸)。
引物aTH153.1S：
5’-GCCTTACTATACCTAACATG-3’(SEQ ID NO:34)
引物aTH153.1A：
5’-GAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGC-3’(SEQ ID NO:35)
将突变体PCR产物(1.2kb产物条带)在TAE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳以定量用于DNase I消化的DNA。将每种突变体PCR产物以相同DNA浓度合并，并使用PCR Purification Kit纯化，并在TE缓冲液中洗涤以得到最终DNA浓度为100ng/μl的混合突变体PCR产物。
然后用DNase I处理突变体PCR混合物以将产物消化为小DNA片段。在30μl反应中，将2μg的突变体PCR DNA用10mM MgCl2-0.5M Tris pH 7.4中的100-500单位的DNase I(New England Bio Labs,Ipswich,MA USA)在20℃消化30-60秒。反应通过在95℃温育10分钟来终止。将大约100bp至600bp的消化的片段在TAE缓冲液中的2%NUSIEVETM 3:1低熔点琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts,Rockland,ME,USA)上进行电泳，从凝胶切出，并使用
Gel Extraction Kit提取。
将纯化的DNase I消化的突变体DNA用于第二PCR扩增以合并并组装1.2kb全长产物。第二PCR(50μl)的组成为大约0.5-1.0μg的纯化的DNase I消化的片段，1X THERMPOL IITM缓冲液(New England Bio Labs,Ipswich,MA,USA)，1-5单位的THERMPOL IITM DNA聚合酶，和各0.2mM的dNTP。反应不含有引物寡聚物。将反应在
5333中温育，其程序为：1个循环，在94℃进行1.5分钟，接着进行35个循环，每个循环在94℃进行30秒，65℃进行1.5分钟，62℃进行1.5分钟，59℃进行1.5分钟，56℃进行1.5分钟，53℃进行1.5分钟，50℃进行1.5分钟，47℃进行1.5分钟，44℃进行1.5分钟，41℃进行1.5分钟，和72℃进行1.5分钟。通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳就重组的、组装的1.2kb全长产物对反应进行显影，并将其切出，使用
PCR Purification Kit纯化，并在第三PCR中进行扩增。
第三PCR(50μl)的组成为1X THERMPOL IITM缓冲液，1-5单位的THERMPOL IITM DNA聚合酶，各0.2mM的dNTP，各50皮摩尔的引物Tf.xylF和Tf.xylR(实施例1)，和大约50-100ng的纯化的、重组的、组装的1.2kb全长产物。反应在
5333中温育，其程序为：1个循环，在94℃进行3分钟，接着进行30个循环，每循环在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行90秒(5分钟最终延伸)。将产物就重组的、扩增的、组装的757bp片段通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳进行显影。将片段切出并使用
PCR Purification Kit纯化。
将每个最终757bp PCR产物使用IN-FUSIONTM Advantage PCR CloningKit亚克隆入质粒pTH153以连接用Sac I和MluI消化的质粒pTH153和757bpPCR产物的同源末端。每个反应的组成为大约150ng至200ng的757bp PCR产物和160ng的质粒pTH025(用Sac I和MluI消化)，2μl的5X IN-FUSIONTM反应缓冲液，和1μl的IN-FUSIONTM酶，终体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟，然后置于冰上。每个反应体积用TE缓冲液增加至50μl，并将2-3μl的各反应物用于根据生产商的指示转化大肠杆菌Ultracompetent Cells。将所得的菌落在LB培养基中收集。使用Plasmid Maxi Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)以从菌落分离质粒DNA。将分离的质粒用Sal I限制性消化以线性化DNA，并或者使用
PCR Purification Kit纯化，或用乙醇沉淀，然后转化入枯草芽孢杆菌McLp2。每个最终DNA制备物转化入感受态枯草芽孢杆菌McLp2根据实施例3进行。
在枯草芽孢杆菌McLp2菌株中制备T.fusca GH11木聚糖酶改组文库。为了生成单个改组文库，将感受态枯草芽孢杆菌McLp2细胞的0.5ml等分试样在37℃在水浴中解冻，并分至18个试管(大约每个50μl)。将一μg的线性化的、改组的质粒DNA添加至每个感受态细胞混合物的等分试样，并用0.5ml的氯霉素以0.2μg每ml的终浓度诱导。将改组的文库转化反应在37℃以250rpm振荡温育1小时。在温育之后，将甘油添加至每个反应至10%(v/v)，然后在-70℃冻结。为了确定文库效价(菌落/μl)，将转化反应物等分试样的系列稀释涂布于TBAB+Cm平板上，并允许其在37℃温育16-20小时。一旦确定了效价，便将改组的文库转化反应物解冻，并铺板于筛选平板上，并根据实施例7和8进行筛选。
将通过筛选鉴定的改善的变体的菌落单菌落分离至TBAB+Cm平板上。改善的变体的序列根据实施例9确定。
实施例6：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体341，370，525-528，569-583，和529的构建
对于变体370和341，其Thermobifida fusca家族11木聚糖酶骨架为变体136，其含有取代L186I。选择变体136作为根据Thermobifida fusca家族11木聚糖酶筛选(实施例7和8)的性能改善者，其来源于随机文库(实施例4)。为了从变体136生成变体370(T74S+L186I)，与下述正向和反向引物一同使用了
XL Site-Directed Mutagenesis Kit：
正向引物：
5’-GGTAACGCTTATCTTTCACTTTACGGATGGAC-3’(SEQ ID NO:36)反向引物：
5’-GTCCATCCGTAAAGTGAAAGATAAGCGTTACC-3’(SEQ ID NO:37)为了从变体136生成变体341(T74A+L186I)，与下述正向和反向引物一同使用了
XL Site-Directed Mutagenesis Kit：
正向引物：
5’-GGTAACGCTTATCTTGCACTTTACGGATGGAC-3’(SEQ ID NO:38)
反向引物：
5’-GTCCATCCGTAAAGTGCAAGATAAGCGTTACC-3’(SEQ ID NO:39)
将所得的突变体质粒DNA连接入pTH025，并根据实施例2中所述的步骤转化入大肠杆菌
感受态细胞。使用9600制备了来自含有pSMO514(T74A+L186I)和pSMO520(T74S+L186I)的大肠杆菌转化体的质粒DNA，并使用3130xl Genetic Analyzer测序。
对于变体525，526，527，和528，其Thermobifida fusca家族11木聚糖酶骨架为变体340，其含有取代T74S和L186V。对变体340使用
XL Site-Directed Mutagenesis Kit或QUIKCHANGE
Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA,USA)用表2中所示的寡聚物进行了定位诱变。
表2
将所得的突变体质粒DNA连接入pTH025并根据实施例2中所述的步骤转化入大肠杆菌
感受态细胞。使用9600制备来自含有pSMO583(F17L+N81D+T188A+T74S+L186V)；pSMO584(V2I+R57H+T74S+L186V)；pSMO585(R57H+T74S+L186V)；和pSMO586(N41D+T74S+L186V)的大肠杆菌转化体的质粒DNA，并使用3130xl GeneticAnalyzer进行测序。
对于变体473，其Thermobifida fusca家族11木聚糖酶骨架为变体473，其含有取代A21S，T74S，和L186V。使用QUIKCHANGESite-Directed Mutagenesis Kit用下述寡聚物对变体473进行定点诱变：
N81D：
5’-TACGGATGGACTCGCGACCCTCTTGTTGAGTAC-3’(SEQ ID NO:49)
S38Y：
5’-GCAACTACTCAACGTACTGGCGCAACACAGG-3’(SEQ ID NO:50)
S62T：
5’-CGCACAGTTACTTACACTGCTTCTTTCAACCCTTC-3’(SEQ ID NO:51)
使用
9600制备所得的质粒DNA，并使用3130xl GeneticAnalyzer进行测序。使用
9600制备来自含有pSMO611(A21S+T74S+N81D+L186V；ID569)；pSMO611(A21S+S38Y+T74S+L186V；ID570)；pSMO612(A21S+S38Y+T74S+N81D+L186V；ID572)；pSMO614(A21S+S62Y+T74S+N81D+L186V；ID573)；pSMO615(A21S+S38Y+S62T+T74S+L186V；ID574)；pSMO616(A21S+S38Y+S62T+T74S+N81D+L186V；ID575)；和pSMO617(A21S+S62T+T74S+L186V；ID577)的大肠杆菌转化体的质粒DNA，并使用3130xl Genetic Analyzer进行测序。
在一个单独反应中，对变体473使用QUIKCHANGE
Site-Directed Mutagenesis Kit用寡聚物N81D和S38Y以及下述寡聚物进行定点诱变：
G55D：
5’-GGCTGGGCGACAGGAGACCGTCGCACAGTTAC-3’(SEQ ID NO:52)
将所得的突变体质粒DNA连接入pTH025，并根据实施例2中所述的步骤转化入大肠杆菌感受态细胞。使用
9600制备来自含有pSMO613(A21S+G55D+T74S+L186V；ID571)和pSMO618(A21S+S38Y+G55D+T74S+N81D+L186V；ID576)的大肠杆菌转化体的质粒DNA，并使用3130xl Genetic Analyzer进行测序。
为了生成变体578-583，使用
XL Site-DirectedMutagenesis Kit对多种如上所述起初从突变体473生成的突变体模板进行定点诱变。寡聚物和模板ID突变体描述于表3。
表3
将所得的突变体质粒DNA连接入pTH025并根据实施例2中所述的步骤转化入大肠杆菌
感受态细胞。使用
9600制备来自含有pSMO611(A21S+T74S+N81D+L186V；ID 569)；pSMO612(A21S+S38Y+T74S+L186V；ID 570)；pSMO613(A21S+G55D+T74S+L186V；ID 571)；pSMO614(A21S+S38Y+T74S+N81D+L186V；ID 572)；pSMO615(A21S+S62Y+T74S+N81D+L186V；ID 573)；pSMO616(A21S+S38Y+S62T+T74S+L186V；ID 574)；pSMO617(A21S+S38Y+S62T+T74S+N81D+L186V；ID 575)；pSMO618(A21S+S38Y+G55D+T74S+N81D+L186V；ID 576)；pSMO619(A21S+S62T+T74S+L186V；ID 577)；pSMO620(A21S+G55D+T74S+N81D+L186V；ID 578)；pSMO621(A21S+S38Y+G55D+T74S+L186V；ID 579)；pSMO622(A21S+G55D+S62T+T74S+L186V；ID 580)；pSMO623(A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+L186V；ID 581)；pSMO624(A21S+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V；ID 582)；和pSMO625(A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V；ID 583)的大肠杆菌转化体的质粒DNA，并使用3130xl Genetic Analyzer进行测序。
将枯草芽孢杆菌McLp2用上述各质粒转化，并根据实施例3培养至生成木聚糖酶变体。此外，将实施例3中所述的pSMO513(T74S,L186V；之前McLp7变体ID 340)转化入McLp2，得到变体529，以确保与其它McLp2来源的变体类似的表达水平。将上述Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体根据实施例7和8进行筛选。
实施例7：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶文库的筛选
将枯草芽孢杆菌McLp2中的初级Thermobifida fusca家族11木聚糖酶突变体文库涂布于Genetix QTrays(22x 22cm培养皿,Genetics Ltd.,Hampshire,United Kingdom)中的含0.1%AZCL-***木聚糖小麦(Megazyme Wicklow，Ireland)的LB+Cm琼脂培养基上，并在37℃温育1日。产生木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌落在菌落周围生成蓝色晕环。使用QPix System(Genetix Ltd.,Hampshire,United Kingdom)，将活性菌落挑入含有1/3稀释的MY25培养基的96孔平板中。将平板在37℃以250rpm搅拌温育4日。在温育之后，将平板用去离子水中的0.01%
20使用FX LaboratoryAutomation Workstation(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)进行稀释。使用ORCA机器人(Beckman Coulter，Fullerton,CA,USA)，将稀释的平板转运至
FX，并从平板移取10μl的稀释样品，并等分入两个96孔聚碳酸酯v底平板。将40μl的0.01%20-125mM硼酸钠pH 8.8添加至测定平板。将测定平板转移至温度控制的培养箱，在此将一个平板在室温温育15分钟，并将另一个平板在80℃至90℃之间的预决温度温育15分钟。在该温育之后，将测定平板转移至
FX，并添加30μl的0.01%
20-0.5%w/v AZCL-木聚糖燕麦(Megazyme Wicklow，Ireland)底物和80μl的0.01%
20-125mM硼酸钠pH 8.8。将测定平板重新转移回温度控制的培养下，在此将两个平板均在50℃温育15分钟。在温育之后，将测定平板转移回
FX以供混合和静置30分钟。在30分钟之后，从平板移取60μl的上清，并转移至384孔聚丙烯平底平板。将384孔平板转移至DTX微滴定板读数器(microplate reader)(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)并在595nm测量吸光度。
将在高温处理的平板的吸光度比值(“热处理活性”)与来自相同的在室温温育的样品的吸光度(“非热处理活性”)进行比较，使用
(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)以确定对于每个变体的相对热稳定性比值。基于热稳定性比值，对之前实施例中构建的文库的筛选生成了表4中列出的变体。为了测量相对于亲本木聚糖酶热稳定性的改善，将每个变体的热稳定性比值针对亲本木聚糖酶的热稳定性比值进行标准化，这在表4中标记为“改善的倍数”。对于Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体热稳定性改善的倍数的范围为1.1至2.28(表4)。表4阐明了对于Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体，热稳定性改善的程度。对于在初级筛选中获得的变体，热稳定性的改善相对于亲本木聚糖酶为1.1倍至1.6倍的范围。对于从定位诱变(SDM)获得的变体，观察到的热稳定性的改善相对于亲本木聚糖酶在80℃为1.1倍至2.28倍。表5列出了在85℃测试时改善的变体。对于这些Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体热稳定性改善的倍数在85℃为1.2至3.9的范围(表5)。
表4：在80℃具有改善的热稳定性的变体
| ID | 变体 | 改善倍数 | 类型 |
| 亲本 | - | 1 | - |
| 51 | L186V | 1.43 | SDM |
| 136 | L186I | 1.28 | 随机文库 |
| 49 | T74A | 1.1 | SDM |
| 96 | T74S | 1.21 | 随机文库 |
| 340 | T74S+L186V | 1.77 | SDM |
| 370 | T74S+L186I | 1.58 | SDM |
| 341 | T74A+L186I | 1.5 | SDM |
| 386 | T74A+L186V | 1.55 | SDM |
| 473 | A21S+T74S+L186V | 2.28 | SDM |
| 472 | S38Y+T74S+L186V | 2.17 | SDM |
| 470 | G55D+T74S+L186V | 2.16 | SDM |
| 474 | T74S+N81D+L186V | 2.11 | SDM |
| 471 | S62T+T74S+L186V | 2.05 | SDM |
| 462 | S38Y+L186V | 1.59 | 改组文库 |
| 461 | T74A+N81D+L186V | 1.64 | 改组文库 |
| 425 | E28V+R56H+N183D | 1.38 | 随机文库 |
| 197 | F17L+N81D+T188A | 1.32 | 随机文库 |
| 435 | S38F+G192D | 1.30 | 随机文库 |
| 417 | R56P+T60S | 1.27 | 随机文库 |
| 210 | V2I+R57H | 1.27 | 随机文库 |
| 430 | A21S | 1.26 | 随机文库 |
| 308 | F17L+N81D | 1.22 | 随机文库 |
| 291 | N81D | 1.24 | 随机文库 |
| 378 | S38Y+T104S | 1.22 | 随机文库 |
| 235 | F17L+M161L | 1.20 | 随机文库 |
| 101 | G55D | 1.20 | 随机文库 |
表5：在85℃具有改善的热稳定性的变体
实施例8：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体的热活性
将来自实施例7中热稳定性筛选的改善的变体在含有1/3稀释的MY25培养基的24孔板中进行重新培养。将平板在37℃以250rpm温育4日。在温育之后，将平板用0.01%
20去离子水使用
FX工作站稀释。使用
FX工作站，将10μl的稀释样品从平板移取并等分入96孔聚碳酸酯v底平板。将五十μl的0.01%
20中的125mM硼酸钠pH 8.8和40μl 0.01%
20中的0.5%w/v AZCL-木聚糖燕麦底物添加至测定平板。将测定平板转移至温度控制的培养箱，其中将一个平板在27℃温育15分钟，并将另一个在80℃至90℃之间的预决温度温育15分钟。在温育之后，将测定平板转移回
FX以供混合和静置30分钟。在30分钟之后，从平板移取各60μl的上清并转移至384孔聚丙烯平底板。将384孔板转移至DTX读数器(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)，并读取595nm吸光度。重复进行上述测定步骤60分钟而非15分钟。
从在80℃处理15分钟的平板的吸光度减去在80℃处理60分钟的平板的吸光度，称为“80℃活性(60-15分钟)”。从在27℃处理15分钟的平板的吸光度活性减去在27℃处理60分钟的平板的吸光度活性，称为“27℃活性(60-15分钟)”。将80℃活性(60-15分钟)的比例与27℃活性(60-15分钟)对于相同样品进行比较，使用
确定对于每个变体的相对热活性。为了测量热活性相对于木聚糖酶的改善，将每个变体的热活性比值针对亲本木聚糖酶的热活性进行标准化，这在表6中称为“改善倍数”。表6阐明了Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体相对于起始亲本木聚糖酶(1.0)的热活性改善程度。这些变体在热活性方面相对于亲本木聚糖酶具有7.7倍至164.8倍的改善倍数。
表6：具有改善的热活性的变体
实施例9：通过DNA测序确定木聚糖酶突变序列
为了确定来源于前述实施例的文库的Thermobifida fusca GH11木聚糖酶突变体的序列，分离了含有所述Thermobifida fusca木聚糖酶突变体基因的基因组PCR片段。将每个含有木聚糖酶突变体基因的枯草芽孢杆菌转化体划线于TBAB+Cm平板上，并在37℃温育1日。从枯草芽孢杆菌菌落提取DNA使用REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)略微进行修饰来进行。将一个枯草芽孢杆菌菌落添加至100μl的ExtractionSolution，封闭试管并短暂地进行涡旋。将反应在95℃温育10分钟。然后添加100μl的Dilution Solution，并涡旋以混合。对稀释的提取物立即如下所述进行PCR扩增。将剩余稀释的提取物储藏在4℃。
使用引物Tf.xylF和Tf.xylR(实施例1)PCR扩增来自基因组DNA提取物的编码Thermobifida fusca GH11木聚糖酶突变体序列的多核苷酸。将总共0.4μM的各引物Tf.xylF和Tf.xylR用于PCR反应，所述反应含有4μl的各DNA提取物和10μl的REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，终体积为20μl。扩增反应在
ep梯度S热循环仪(Eppendorf，Hamburg,Germany)中进行，程序为1个循环在94℃进行3分钟；和35个循环，每个在94℃进行1分钟，57℃进行1分钟，和72℃进行1分钟。在35个循环之后，将反应在72℃加热10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过将5μl的PCR产物加载至89mM Tris碱-89mM硼酸-2mM EDTA二钠盐(TBE)缓冲液中的1.0%琼脂糖凝胶上进行显影，其中对于每个突变体观察到0.6kb产物条带。然后将剩余PCR产物(15μl)使用PCR Purification Kit根据生产商的指示进行纯化。
PCR产物的DNA测序使用3130xl Genetic Analyzer使用染料终止子化学(Giesecke等,1992,Journal of Virol.Methods 38:47-60)进行。每个Thermobifidafusca GH11木聚糖酶突变体的整个编码区使用10ng的质粒DNA和1.6pmol的引物Tf.xylF和Tf.xylR进行测序。
汇编了序列示踪文档(sequence trace file)，并使用程序确定序列突变，该程序进行变体的序列读取的自动汇编，接着与亲本序列相比较以确定氨基酸残基变化。
实施例10：从枯草芽孢杆菌McLp2产生Thermobifida fusca GH11木聚
糖酶变体
将每个从筛选鉴定出表达Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体的枯草芽孢杆菌McLp2菌株涂布于TBAB+Cm琼脂平板上以供单菌落分离，并在37℃温育1日。将每个变体的每芽孢杆菌菌株一个菌落用于接种含有100ml的DIFCOTM Lactobacilli MRS培养基的1L Erlenmeyer摇瓶。将摇瓶在37℃以250rpm搅拌温育3日。在温育之后，将培养液以5524x g离心20分钟，并收集上清以供纯化。
实施例11：从枯草芽孢杆菌McLp2纯化Thermobifida fusca GH11木聚糖酶变体
将实施例10中获得的收获的培养液各自使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore,Bedford,MA,USA)进行无菌过滤。将经过滤的培养液各自用20mM Tris-HClpH 8.5使用大约500ml SEPHADEXTM G25Fine柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)进行脱盐。然后将脱盐的材料各自施于30ml Q-SEPHAROSETM HighPerformance(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)柱，并在流过物质中收集每个木聚糖酶变体。使用10%乙酸调整流过物质的pH至5.0，然后施于20mlMONO STM柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。将结合的蛋白质用50mM乙酸钠pH 5.0中0M NaCl至100mM NaCl的盐梯度(4柱体积)进行洗脱。在8-16%CRITERIONTM Stain Free SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上检查级分。汇集含有纯Thermobifida fusca GH11木聚糖酶变体的级分，并通过测量280/260nm处的吸光度并使用计算出的消光系数2.9(mg/ml)-1*cm-1确定蛋白质浓度。
实施例12：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体熔融温度的确定
几种木聚糖酶变体的热稳定性通过Differential Scanning Calorimetry(DSC)使用VP-DSC Differential Scanning Calorimeter (MicroCal Inc.,Piscataway,NJ,USA)确定。将热变性温度Td(℃)视作在以恒定的程序设定的加热速率加热50mM甘氨酸pH 9.0中的变体酶溶液获得的热分析图(Cp对T)变性峰(主要吸热峰)的顶部。
将样品和参照溶液仔细地除气，随即将样品加载入量热器(参照：不含酶的缓冲液)。将样品和参照溶液(大约0.5ml)在10℃热预平衡20分钟，并以90K/hr的扫描速率从10℃至100℃进行DSC扫描。变性温度以大约+/-1℃的准确度确定。
木聚糖酶变体的热稳定性确定的结果示于表7。
表7
| 变体 | Td(℃) |
| 亲本 | 85 |
| 49 | 86 |
| 51 | 90 |
| 91 | 88 |
| 94 | 87 |
| 96 | 88 |
| 101 | 86 |
| 106 | 88 |
| 110 | 84 |
| 131 | 85 |
| 136 | 91 |
| 225 | 85 |
| 235 | 87 |
| 254 | 89 |
| 265 | 90 |
| 340 | 92 |
| 341 | 90 |
| 370 | 91 |
| 473 | 94 |
| 564 | 96 |
| 566 | 94 |
| 575 | 96 |
实施例13：Thermobifida fusca家族11木聚糖酶变体的漂白剂增强性能的确定
在Totally Chlorine Free(TCF)漂白序列中评价了T.fusca木聚糖酶变体136(L186I)，变体370(T74S+L186I)，变体564(V2I+E28V+S38Y+S62T+T74S+T111I+L186V)，或变体566(E28V+S38Y+T74S+N121Y+N151D+L186V)的漂白剂增强性能，并与野生型T.fusca木聚糖酶相比较。
在表8中提及的条件下使用XQP序列(X表示木聚糖酶阶段，Q为螯合阶段，而P为过氧化氢阶段)以分析不同木聚糖酶的预漂白作用。将Britton &Robinsson缓冲液中经洗涤的、未经漂白的、具有10%纸浆稠度的桉树kraft纸浆用T.fusca木聚糖酶变体136，变体370，变体564或变体566，或野生型T.fusca木聚糖酶以4mg/kg的干纸浆在
袋(BA 6040;SewardLtd,West Sussex,UK)中进行处理。纸浆的量为8g干纸浆每袋。木聚糖酶处理在pH 9.5和70℃或80℃进行2小时。参照纸浆(阴性对照)以相同方式处理，但不添加木聚糖酶。在滤过物中提取的高木质素含量(通过A280测量)和XQP漂白的纸浆中的低木质素含量(通过kappa数测量)反映了漂白增强作用。在木聚糖酶处理之后，收集滤过物的样品以供分析。纸浆中的水通过藉由Büchner漏斗过滤去除，并对滤过物就生色团在280nm的释放(释放的木质素在280nm产生吸光度)进行分光光度法分析。Q和P阶段亦在袋中进行，且对于Q和P阶段的条件总结于表8。在Q阶段之后过滤并洗涤纸浆。在漂白之后，通过使用Büchner漏斗过滤从纸浆样品去除过氧化氢。然后将样品充分洗涤。在洗涤之后，将纸浆样品重悬于水至0.4%的稠度。用H2SO4调整纸浆的pH(至pH 2)。在20分钟之后，使用Büchner漏斗排干纸浆，并用去离子水洗涤。将纸浆垫风干过夜。对大约0.5至1g纸浆样品使用TechnicalAssociation of the Pulp and Paper Industry(TAPPI)标准方法T236的比例缩小型式确定kappa数。kappa数定义为由1g不含水分的纸浆在指明的条件下消耗的20mM高锰酸钾溶液的毫升数(结果针对添加的高锰酸盐的50%消耗进行校正)。所有实验进行一式两次，且平均值表示于图4-7。
表8：对于评价漂白剂增强作用的TCF漂白条件
| 阶段 | X | Q | P |
| 处理的纸浆的量(g) | 8 | 8 | 8 |
| 稠度(%) | 10 | 10 | 10 |
| 保留时间(分钟) | 120 | 60 | 150 |
| 温度(℃) | 70或80 | 70 | 90 |
| pH | 9.5 | 6-7 | 11 |
| 酶剂量(mg/kg干纸浆) | 4 | - | - |
| EDTA(%干物质) | - | 0.2 | - |
| MgSO4(%干物质) | - | - | 0.1 |
| NaOH(%干物质) | - | - | 1.33 |
| H2O2(%干物质) | - | - | 1.5 |
来自漂白实验的结果示于图4-7。分光光度法以及kappa数测量显示T.fusca木聚糖酶变体136(L186I)和370(T74S+L186I)与野生型T.fusca木聚糖酶相比在70℃和pH 9.5产生更高的kappa数减少和280nm吸收材料的释放(图4-5)。在80℃和pH 9.5，T.fusca木聚糖酶变体564(V2I+E28V+S38Y+S62T+T74S+T111I+L186V)和566(E28V+S38Y+T74S+N121Y+N151D+L186V)与野生型T.fusca木聚糖酶相比释放更多的生色材料并更多地减少kappa数(图6-7)。结果表明T.fusca木聚糖酶变体136中的取代L186I，变体370中的取代T74S+L186I，变体564中的取代V2I+E28V+S38Y+S62T+T74S+T111I+L186V和变体566中的取代E28V+S38Y+T74S+N121Y+N151D+L186V在高温和pH 9.5改善了漂白剂增强性能。
本发明通过下述编号的段落描述：
[1]一种亲本木聚糖酶的分离的变体，其在对应于SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个位置处包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
[2]段1的变体，其中所述亲本木聚糖酶为(a)多肽，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；或(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，其具有木聚糖酶活性。
[3]段1或2的变体，其中所述亲本木聚糖酶与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。
[4]段1-3任一项的变体，其中所述亲本木聚糖酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下，与以下杂交：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链。
[5]段1-4任一项的变体，其中所述亲本木聚糖酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。
[6]段1-5任一项的变体，其中所述亲本木聚糖酶包含或组成为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽。
[7]段1-5任一项的变体，其中所述亲本木聚糖酶是SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的成熟多肽的片段，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
[8]段1-7任一项的变体，其与亲本木聚糖酶的氨基酸序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%同一性，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的序列同一性。
[9]段1-8任一项的变体，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但少于100%的序列同一性。
[10]段1-9任一项的变体，其中所述变体组成为151至160，161至170，171至180，181至190，191至200，201至210，211至220，221至230，231至240，241至250，251至260，261至270，或271至280个氨基酸。
[11]段1-10任一项的变体，其中取代数为1-23，例如1-15，1-10和1-5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，或23个取代。
[12]段1-11任一项的变体，其在对应于位置2的位置包含取代。
[13]段12的变体，其中所述取代是Ile。
[14]段1-13任一项的变体，其在对应于位置17的位置包含取代。
[15]段14的变体，其中所述取代是Leu。
[16]段1-15任一项的变体，其在对应于位置21的位置包含取代。
[17]段16的变体，其中所述取代是Ser。
[18]段1-17任一项的变体，其在对应于位置28的位置包含取代。
[19]段18的变体，其中所述取代是Val。
[20]段1-19任一项的变体，其在对应于位置38的位置包含取代。
[21]段20的变体，其中所述取代是Tyr或Phe。
[22]段1-21任一项的变体，其在对应于位置41的位置包含取代。
[23]段22的变体，其中所述取代是Asp。
[24]段1-23任一项的变体，其在对应于位置55的位置包含取代。
[25]段24的变体，其中所述取代是Asp。
[26]段1-25任一项的变体，其在对应于位置56的位置包含取代。
[27]段26的变体，其中所述取代是His或Pro。
[28]段1-27任一项的变体，其在对应于位置57的位置包含取代。
[29]段28的变体，其中所述取代是His。
[30]段1-29任一项的变体，其在对应于位置60的位置包含取代。
[31]段30的变体，其中所述取代是Ser。
[32]段1-31任一项的变体，其在对应于位置62的位置包含取代。
[33]段32的变体，其中所述取代是Thr。
[34]段1-33任一项的变体，其在对应于位置74的位置包含取代。
[35]段34的变体，其中所述取代是Ala或Ser。
[36]段1-35任一项的变体，其在对应于位置81的位置包含取代。
[37]段36的变体，其中所述取代是Asp。
[38]段1-37任一项的变体，其在对应于位置104的位置包含取代。
[39]段38的变体，其中所述取代是Ser。
[40]段1-39任一项的变体，其在对应于位置161的位置包含取代。
[41]段40的变体，其中所述取代是Leu。
[42]段1-41任一项的变体，其在对应于位置183的位置包含取代。
[43]段42的变体，其中所述取代是Asp。
[44]段1-43任一项的变体，其在对应于位置186的位置包含取代。
[45]段44的变体，其中所述取代是Ile或Val。
[46]段1-45任一项的变体，其在对应于位置188的位置包含取代。
[47]段46的变体，其中所述取代是Ala。
[48]段1-47任一项的变体，其在对应于位置192的位置包含取代。
[49]段的变体48，其中所述取代是Asp。
[50]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的两个位置包含取代。
[51]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的三个位置包含取代。
[52]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的四个位置包含取代。
[53]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的五个位置包含取代。
[54]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的六个位置包含取代。
[55]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的七个位置包含取代。
[56]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的八个位置包含取代。
[57]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的九个位置包含取代。
[58]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十个位置包含取代。
[59]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十一个位置包含取代。
[60]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十二个位置包含取代。
[61]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十三个位置包含取代。
[62]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十四个位置包含取代。
[63]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十五个位置包含取代。
[64]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十六个位置包含取代。
[65]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十七个位置包含取代。
[66]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十八个位置包含取代。
[67]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的十九个位置包含取代。
[68]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十个位置包含取代。
[69]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十一个位置包含取代。
[70]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的二十二个位置包含取代。
[71]段1-49任一项的变体，其在对应于任何位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的每个位置包含取代。
[72]段1-71任一项的变体，其包含一个或多个选自下组的取代：V2I，F17L，A21S，E28V，S38Y，F，N41D，G55D，R56H,P，R57H，T60S，S62T，T74A,S，N81D，T104S，T111I，N121Y，N151D，H159R，M161L，N183D，L186I,V，T188A，和G192D。
[73]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+R57H。
[74]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+T74A。
[75]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+T74S。
[76]段1-72任一项的变体，其包含取代F17L+N81D。
[77]段1-72任一项的变体，其包含取代F17L+M161L。
[78]段1-72任一项的变体，其包含取代S38Y+T104S。
[79]段1-72任一项的变体，其包含取代S38Y+L186V。
[80]段1-72任一项的变体，其包含取代S38F+G192D。
[81]段1-72任一项的变体，其包含取代R56P+T60S。
[82]段1-72任一项的变体，其包含取代T74S+L186V。
[83]段1-72任一项的变体，其包含取代T74S+L186I。
[84]段1-72任一项的变体，其包含取代T74A+L186V。
[85]段1-72任一项的变体，其包含取代T74A+L186I。
[86]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+T74S+L186V。
[87]段1-72任一项的变体，其包含取代F17L+N81D+T188A。
[88]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+T74S+L186V。
[89]段1-72任一项的变体，其包含取代E28V+R56H+N183D。
[90]段1-72任一项的变体，其包含取代S38Y+T74S+L186V。
[91]段1-72任一项的变体，其包含取代N41D+T74S+L186V。
[92]段1-72任一项的变体，其包含取代G55D+T74S+L186V。
[93]段1-72任一项的变体，其包含取代R57H+T74S+L186V。
[94]段1-72任一项的变体，其包含取代S62T+T74S+L186V。
[95]段1-72任一项的变体，其包含取代T74A+N81D+L186V。
[96]段1-72任一项的变体，其包含取代T74S+N81D+L186V。
[97]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+T74S+H159R+L186V。
[98]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+F17L+T74S+L186I。
[99]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+S62T+T74S+L186V。
[100]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+T74S+N81D+L186V。
[101]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+R57H+T74S+L186V。
[102]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+T74S+N81D+L186V。
[103]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+T74S+L186V。
[104]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+G55D+T74S+L186V。
[105]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S62T+T74S+L186V。
[106]段1-72任一项的变体，其包含取代F17L+T74S+N81D+L186V+T188A。
[107]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+T74S+N81D+L186V。
[108]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S62Y+T74S+N81D+L186V。
[109]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+S62T+T74S+L186V。
[110]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+G55D+T74S+N81D+L186V。
[111]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+G55D+T74S+L186V。
[112]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+G55D+S62T+T74S+L186V。
[113]段1-72任一项的变体，其包含取代E28V+S38Y+T74S+N121Y+N151D+L186V。
[114]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+S62T+T74S+N81D+L186V。
[115]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+G55D+T74S+N81D+L186V。
[116]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+L186V。
[117]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V。
[118]段1-72任一项的变体，其包含取代V2I+E28V+S38Y+S62T+T74S+T111I+L186V。
[119]段1-72任一项的变体，其包含取代A21S+S38Y+G55D+S62T+T74S+N81D+L186V。
[120]段任一项的变体1-119，其在一个或多个对应于位置19，23，84，和88的位置进一步包含取代。
[121]段120的变体，其中进一步取代的数量为1-4，如1，2，3或4个取代。
[122]段120或121的变体，其在对应于位置19的位置包含取代。
[123]段122的变体，其中所述取代是用Ala。
[124]段120-123任一项的变体，其在对应于位置23的位置包含取代。
[125]段124的变体，其中所述取代是用Pro。
[126]段120-125任一项的变体，其在对应于位置84的位置包含取代。
[127]段126的变体，其中所述取代是用Pro。
[128]段120-127任一项的变体，其在对应于位置88的位置包含取代。
[129]段128的变体，其中所述取代是用Thr。
[130]段120-129任一项的变体，其在对应于任何位置19，23，84，和88的两个位置包含取代。
[131]段120-129任一项的变体，其在对应于任何位置19，23，84，和88的三个位置包含取代。
[132]段120-129任一项的变体，其在对应于位置19，23，84，和88的每个位置包含取代。
[133]段120-132任一项的变体，其包含一个或多个选自下组的取代：T19A，G23P，V84P，和I88T。
[134]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+G23P。
[135]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+V84P。
[136]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+I88T。
[137]段120-133任一项的变体，其包含取代G23P+V84P。
[138]段120-133任一项的变体，其包含取代G23P+I88T。
[139]段120-133任一项的变体，其包含取代V84P+I88T。
[140]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+G23P+V84P。
[141]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+G23P+I88T。
[142]段120-133任一项的变体，其包含取代G23P+V84P+I88T。
[143]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+V84P+I88T。
[144]段120-133任一项的变体，其包含取代T19A+G23P+V84P+I88T。
[145]一种分离的多核苷酸，其编码段1-144任一项的变体。
[146]一种核酸构建体，其包含段145的多核苷酸。
[147]一种表达载体，其包含段145的多核苷酸。
[148]一种宿主细胞，其包含段145的多核苷酸。
[149]一种产生具有木聚糖酶活性变体的方法，包括：(a)在适于表达所述变体的条件下培养包含段145的多核苷酸的宿主细胞；和(b)回收所述变体。
[150]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用段145的多核苷酸转化。
[151]一种产生段1-144任一项的变体的方法，其包括：在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和回收所述变体。
[152]一种用于获得段1-144任一项的变体的方法，包括在对应于SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个位置将取代引入亲本木聚糖酶，其中所述变体具有木聚糖酶活性；和回收所述变体。
[153]一种降解含木聚糖材料的方法，其通过用段1-144任一项的变体处理所述材料。
[154]一种处理纸浆的方法，其包括将纸浆与段1-144任一项的变体相接触。
[155]段154的方法，其中用所述变体处理纸浆与用亲本处理相比，增加纸浆的亮度至至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍，至少1.4倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，或至少10倍。
[156]一种用于产生木糖的方法，其包括用段1-144任一项的变体与含木聚糖材料相接触。
[157]段156的方法，进一步包括回收所述木糖。
本文中描述和要求保护的方面的范围并不受本文中公开的具体方面的限制，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同的方面旨在落在本发明的范围内。事实上，根据前述描述，除了本文中显示和描述的那些之外，本发明多种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。这些修饰亦旨在落在所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
本文中引用了多种参考文献，其公开通过全文提述并入本文。
Claims (20)
1.一种亲本木聚糖酶的分离的变体，其在对应于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个位置处包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。
2.权利要求1的变体，其中所述亲本木聚糖酶为
(a)多肽，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或其全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；或
(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段，其具有木聚糖酶活性。
3.权利要求1或2的变体，其中所述亲本木聚糖酶包含或组成为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽，或它们具有木聚糖酶活性的片段。
4.权利要求1-3任一项的变体，其与亲本木聚糖酶的氨基酸序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%同一性，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的序列同一性。
5.权利要求1-4任一项的变体，其中取代数为1-23，例如1-15，1-10和1-5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，或23个取代。
6.权利要求1-5任一项的变体，其包含一个或多个选自下组的取代：V2I，F17L，A21S，E28V，S38Y，F，N41D，G55D，R56H,P，R57H，T60S，S62T，T74A,S，N81D，T104S，T111I，N121Y，N151D，H159R，M161L，N183D，L186I,V，T188A，和G192D。
7.权利要求1-6任一项的变体，其在对应于位置19，23，84，和88的一个或多个位置处进一步包含取代。
8.权利要求7的变体，其中进一步取代的数量为1-4，如1，2，3或4个取代。
9.权利要求7或8的变体，其包含一个或多个选自下组的取代：T19A，G23P，V84P，和I88T。
10.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-9任一项的变体。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求10的多核苷酸。
12.一种产生具有木聚糖酶活性变体的方法，其包括：(a)在适于表达所述变体的条件下培养包含权利要求10的多核苷酸的宿主细胞；和
(b)回收所述变体。
13.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其是用权利要求10的多核苷酸转化的。
14.一种产生权利要求1-9任一项的变体的方法，其包括：
(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和
(b)回收所述变体。
15.一种用于获得权利要求1-9任一项的变体的方法，包括在对应于SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的位置2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的一个或多个位置处将取代引入亲本木聚糖酶，其中所述变体具有木聚糖酶活性；和回收所述变体。
16.一种降解含木聚糖材料的方法，其通过用权利要求1-9任一项的变体处理所述材料。
17.一种处理纸浆的方法，其包括将纸浆与权利要求1-9任一项的变体相接触。
18.权利要求17的方法，其中用所述变体处理纸浆与用亲本的处理相比，增加纸浆的亮度至至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍，至少1.4倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，或至少10倍。
19.一种用于产生木糖的方法，其包括用权利要求1-9任一项的变体与含木聚糖材料相接触。
20.权利要求19的方法，进一步包括回收所述木糖。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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| GB201401680D0 (en) * | 2014-01-31 | 2014-03-19 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Compositions and methods comprising a xylanase enzyme variant |
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| US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
| CN108138153A (zh) | 2015-07-24 | 2018-06-08 | 诺维信股份有限公司 | 具有***呋喃糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 |
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| WO2017205535A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
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| EP3618615B1 (en) * | 2017-05-04 | 2023-06-21 | TLC Products | Methods of pest control |
| EP4019629A1 (en) * | 2020-12-28 | 2022-06-29 | AB Enzymes Oy | Xylanase variants |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1550548A (zh) * | 1996-09-09 | 2004-12-01 | ���ô�����о�Ժ | 提高木聚糖酶嗜热性、嗜碱性和热稳定性的修饰 |
| CN101501190A (zh) * | 2006-06-16 | 2009-08-05 | 先正达参股股份有限公司 | 无催化活性的蛋白以及用于恢复来自植物源材料的酶的方法 |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| IL97645A (en) | 1990-03-23 | 1997-03-18 | Gist Brocades Nv | Production of enzymes in seeds and their use |
| US6395966B1 (en) | 1990-08-09 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corp. | Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein |
| IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
| EP0695349B1 (en) | 1993-03-10 | 2004-01-21 | Novozymes A/S | Enzymes with xylanase activity from aspergillus aculeatus |
| JP2807612B2 (ja) | 1993-03-12 | 1998-10-08 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法 |
| FR2704860B1 (fr) | 1993-05-05 | 1995-07-13 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire. |
| DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| DE69523052T2 (de) | 1994-06-03 | 2002-06-20 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Gereinigte myceliophthora laccasen und nukleinsäuren dafür kodierend |
| CN1151762A (zh) | 1994-06-30 | 1997-06-11 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达***及所用启动子和终止子 |
| WO1996023062A1 (en) | 1995-01-26 | 1996-08-01 | Novo Nordisk A/S | Animal feed additives comprising xylanase |
| US5891701A (en) | 1997-06-12 | 1999-04-06 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Nucleic acids encoding a polypeptide having protease activity |
| US6013860A (en) * | 1998-07-24 | 2000-01-11 | Calgene Llc | Expression of enzymes involved in cellulose modification |
| AU6188599A (en) | 1998-10-26 | 2000-05-15 | Novozymes A/S | Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells |
| US7060482B1 (en) * | 1998-11-16 | 2006-06-13 | National Research Council Of Canada | Thermostable xylanases |
| EP2278016B1 (en) | 1999-03-22 | 2012-09-26 | Novozymes Inc. | Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof |
| EP1263941B1 (en) * | 2000-03-08 | 2010-12-08 | Danisco A/S | Xylanase variants having altered sensitivity to xylanase inhibitors |
| EP1184460A1 (en) | 2000-08-29 | 2002-03-06 | Dsm N.V. | Modified fungal xylanases |
| NZ524814A (en) | 2000-09-21 | 2004-08-27 | Basf Ag | Talaromyces xylanases |
| US7151204B2 (en) | 2001-01-09 | 2006-12-19 | Monsanto Technology Llc | Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof |
| WO2003012036A2 (en) | 2001-07-27 | 2003-02-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides |
| US7811806B2 (en) | 2001-12-21 | 2010-10-12 | Novozymes, Inc. | Methods for producing hyaluronan in a recombinant host cell |
| WO2003095658A1 (en) | 2002-05-07 | 2003-11-20 | Novozymes A/S | Homologous recombination into bacterium for the generation of polynucleotide libraries |
| DE602004026446D1 (de) | 2003-06-19 | 2010-05-20 | Novozymes As | Verbesserte proteasen und verfahren zu ihrer herstellung |
| EP1668125B1 (en) | 2003-09-15 | 2014-06-18 | Danisco US Inc. | Modified enzymes, methods to produce modified enzymes and uses thereof |
| US7348172B2 (en) * | 2004-04-16 | 2008-03-25 | Ab Enzymes Oy | Method and DNA constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi |
| WO2007115391A1 (en) | 2006-04-12 | 2007-10-18 | National Research Council Of Cananda | Modification of xylanases to increase thermophilicity, thermostability and alkalophilicity |
| US8268586B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-09-18 | Novozymes, Inc. | Modified messenger RNA stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells |
| DK2496694T3 (en) * | 2009-11-06 | 2017-06-06 | Novozymes Inc | COMPOSITIONS FOR SACCHARIFYING CELLULOS MATERIAL |
-
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-
2012
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1550548A (zh) * | 1996-09-09 | 2004-12-01 | ���ô�����о�Ժ | 提高木聚糖酶嗜热性、嗜碱性和热稳定性的修饰 |
| CN101501190A (zh) * | 2006-06-16 | 2009-08-05 | 先正达参股股份有限公司 | 无催化活性的蛋白以及用于恢复来自植物源材料的酶的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIAN-YI SUN等: "Improvement of the thermostability and catalytic activity of a mesophilic family 11 xylanase by N-terminus replacement", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》, vol. 42, 30 March 2005 (2005-03-30) * |
| QIN WANG等: "Enhancement of the activity and alkaline pH stability of Thermobifida fusca xylanase A by directed evolution", 《BIOTECHNOL LETT》, vol. 30, 22 February 2008 (2008-02-22), XP019569972 * |
| XIAO-YAN WENG等: "Construction, Expression, and Characterization of a Thermostable Xylanase", 《CURRENT MICROBIOLOGY》, vol. 51, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 188 - 192, XP019365619 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105452271A (zh) * | 2013-06-05 | 2016-03-30 | 诺维信公司 | 木聚糖酶变体以及编码该木聚糖酶变体的多核苷酸 |
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