CN102883602A - 降低细菌的毒力的方法 - Google Patents

降低细菌的毒力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102883602A
CN102883602A CN2011800191272A CN201180019127A CN102883602A CN 102883602 A CN102883602 A CN 102883602A CN 2011800191272 A CN2011800191272 A CN 2011800191272A CN 201180019127 A CN201180019127 A CN 201180019127A CN 102883602 A CN102883602 A CN 102883602A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ester
described method
aryl
bacterium
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800191272A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102883602B (zh
Inventor
C.杨
X.陈
E.J.图恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UWM Research Foundation Inc
Duke University
Original Assignee
UWM Research Foundation Inc
Duke University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UWM Research Foundation Inc, Duke University filed Critical UWM Research Foundation Inc
Publication of CN102883602A publication Critical patent/CN102883602A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102883602B publication Critical patent/CN102883602B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
    • C07C259/06—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/194—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more carboxyl groups, e.g. succinic, maleic or phthalic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/255—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of sulfoxy acids or sulfur analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4172—Imidazole-alkanecarboxylic acids, e.g. histidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4406—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 3, e.g. zimeldine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/01—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C211/26—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring
    • C07C211/29—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring the carbon skeleton being further substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/46—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C215/48—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by hydroxy groups
    • C07C215/54—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and amino groups bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by carbon chains not further substituted by hydroxy groups linked by carbon chains having at least three carbon atoms between the amino groups and the six-membered aromatic ring or the condensed ring system containing that ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/65—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/32—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C235/34—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C243/00—Compounds containing chains of nitrogen atoms singly-bound to each other, e.g. hydrazines, triazanes
    • C07C243/24—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids
    • C07C243/26—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C243/30—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton
    • C07C243/32—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton the carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
    • C07C259/08—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/24—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/63—Esters of sulfonic acids
    • C07C309/64—Esters of sulfonic acids having sulfur atoms of esterified sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/68—Esters of sulfonic acids having sulfur atoms of esterified sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80—[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/82—Carbazoles; Hydrogenated carbazoles
    • C07D209/86—Carbazoles; Hydrogenated carbazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/56—Amides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/52—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/50—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D333/52—Benzo[b]thiophenes; Hydrogenated benzo[b]thiophenes
    • C07D333/54—Benzo[b]thiophenes; Hydrogenated benzo[b]thiophenes with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D333/60—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
    • C07F9/3826—Acyclic unsaturated acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的本文所述化合物。

Description

降低细菌的毒力的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年2月16日提交的美国临时申请号61/305,027和2010年5月7日提交的美国临时申请号61/332,385的优先权，它们每篇通过引用整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明在国家科学基金授予的EF-0332163的政府支持下完成。美国政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于控制细菌的毒力的方法和化合物、鉴别用于控制细菌的毒力的其它化合物的方法和用于治疗具有细菌感染的受试者以降低所述受试者中的细菌的毒力的方法、化合物和组合物。
背景技术
GacS/GacA是一种双组分信号转导***(“TCSTS”)，其广泛地分布于许多细菌中，以对环境刺激做出反应并适应不同的环境条件。GacS是一种假定的组氨酸激酶传感器，GacA是应答调节剂。已经在多种革兰氏阴性细菌中报道了GacS/GacA的TCSTS的同系物，所述革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌(BarA/UvrY)、果胶杆菌属某些种(Pectobacterium spp.)、鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)(BarA/SirA)、假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp.)(GacS/GacA)、嗜肺军团病杆菌(Legionellapneumophila)(LetS/LetA)和弧菌属某些种(Vibrio species)。
GacS/GacA和同源***调节许多致病因子，包括、但不限于：调节性的RNA、数量感知(“QS”)信号、III型分泌***(“T3SS”)基因、果胶酸裂合酶、蛋白酶、生物膜形成和毒素。例如，在菊欧文氏菌(菊欧文氏菌i)中，GacS/GacA***位于调节级联的顶部，且通过控制各种转录因子和转录后因子而起中枢调节剂的作用。GacS/GacA***对果胶酶生产和T3SS基因表达的影响，主要如下实现：通过调节性的RNA***(即Rsm***)，通过活化rsmB，所述rsmB结合RsmA并抑制RsmA的T3SS mRNA衰退效应。
除了所述的GacS/GacA-RsmA-rsmB-hrpL调节途径以外，菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)的T3SS(其属于植物病原细菌的第I组T3SS)由HrpX/Y-HrpS-HrpL途径调节。所述双组分***HrpX/HrpY会活化编码HrpS的基因，所述HrpS是hrpL的表达所必需的。HrpL(一种替代性的∑因子)进一步活化编码T3SS器官的基因和它的分泌产物的表达。因而，GacS/GacA和HrpX/HrpY TCSTS***都在菊欧文氏菌中发挥调节作用，具体地通过T3SS***。
发明内容
在一个实施方案中，本发明可以提供降低细菌的毒力的方法，所述细菌包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的本文所述化合物，诸如本文所述的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)和式(VII)的化合物。
在另一个实施方案中，本发明可以提供选自下述的化合物：
Figure BDA00002255629900021
Figure BDA00002255629900031
附图说明
图1显示了菊欧文氏菌3937(Ech3937)的III型分泌***(T3SS)调节途径的调节网络。
图2A和2B显示了在12h(图2A)和24h(图2B)时使用FACS分析测得的菊欧文氏菌3937(Ech3937)中的hrpN的启动子活性。
图3显示了使用FACS分析测得的菊欧文氏菌3937(Ech3937)和hrpL突变体WPP96中的hrpA、hrpN、hrpL和hrpS的启动子活性。
图4显示了使用定量RT-PCR(qRT-PCR)测得的菊欧文氏菌3937(Ech3937)中的hrpY、hrpS、hrpL、dspE、hrpA、rsmB和gacA的相对mRNA水平。
图5显示了使用FACS分析测得的菊欧文氏菌3937(Ech3937)、hrpS突变体WPP90、hrpX突变体WPP67、hrpY突变体WPP92和Ech3937(pAT)中的hrpN的启动子活性。
图6A显示了SOBG培养液中的生物膜和菌膜形成。
图6B显示了用扫描电子显微术在不同放大率观察到的菌膜的横截面。
图7显示了通过板试验检查的野生型Ech-Rif、gacA突变体Ech137和gacA突变体补足菌株Ech137(pCLgacA)的果胶酸裂合酶(Pel)、蛋白酶(Prt)和纤维素酶(Cel)生产。
图8显示了Ech-Rif、gacA突变体Ech137和补足菌株Ech137(pCLgacA)的果胶酸裂合酶(Pel)活性的分光光度测量定量。
图9显示了在Ech-Rif(具有黑色填充的黑线)和gacA突变体Ech137(灰线)中的pelD和pelL的启动子活性。
图10A显示了在基本培养基中培养6或12h时，gacA突变体Ech137与野生型Ech-Rif相比的rsmA、rsmB、rsmC和hrpL mRNA的相对水平。
图10B显示了在基本培养基中培养12h时，gacA突变体Ech137和gacA突变体补足菌株Ech137(pCLgacA)与野生型Ech-Rif相比的gacA和rsmB mRNA的相对水平。
图11显示了由下述菌株造成的局部浸渍病变：a，Ech-Rif；b，gacA突变体Ech137；和c，补足菌株Ech137(pCLgacA)。
图12显示了分别通过板试验和分光光度测量定量测得的Ech-Rif(实心菱形)和Ech137(实心三角形)的细菌群体和果胶酶活性。
图13显示了Ech-Rif和Ech137菌株在African violet cv.Gauguin(非洲紫罗兰)植物中造成的***性征状的发展。
图14显示了在补充了0.1mM对香豆酸(PCA)的基本培养基(MM)中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)与在不含PCA的MM中的那些相比，hrpS、hrpL、dspE、hrpA、hrpN和rsmB的相对mRNA水平。
图15显示了在基本培养基(MM)和补充了对香豆酸(PCA)的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的HrpN蛋白表达。
图16A和16B显示了在12h(图16A)和24h(图16B)时，在基本培养基(MM)和补充了不同量的对香豆酸(PCA)的MM中培养的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的hrpA的启动子活性。
图17显示了在12h时在基本培养基(MM)和补充了0.1mM对香豆酸(PCA)的MM中培养的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的果胶酸裂合酶(Pel)生产。
图18显示了不同化合物的一个合成方案。
图19显示了不同化合物的一个合成方案。
图20显示了不同化合物的一个合成方案。
图21显示了不同化合物的一个合成方案。
图22是不同浓度的化合物103对hrpA表达的影响的图。
图23显示了在补充了化合物103的培养基中培养的细菌细胞的rsmBRNA的RNA印迹。
图24显示了不同化合物的一个合成方案。
图25显示了不同化合物的一个合成方案。
图26显示了不同化合物的一个合成方案。
图27显示了不同化合物的一个合成方案。
图28显示了不同化合物的一个合成方案。
图29显示了不同化合物的一个合成方案。
图30显示了不同化合物的一个合成方案。
图31显示了在该研究中使用的细菌株、质粒和引物的表。
图32显示了筛选用作丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，DC3000)hrpA诱导物和抑制剂的化合物。在HIM或补充了不同化合物的HIM中的DC3000hrpA的表达。
图33显示了在培养(A)6h和(B)9h时，在补充了不同浓度的TCA的HIM中培养的、携带GFP报告质粒phrpA的丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的hrpA启动子活性和生长。
图34显示了：(A)丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(DC3000)(OD600＝0.1)或补充了不同浓度的T3SS抑制剂TCA的DC3000(OD600＝0.1)浸润的烟叶(N.tabacum cv.Xanthi)。1.25μM.2.50μM.3.100μM.4.250μM.5.500μM.6.-10.：单独的DC3000。(B)用DC3000(OD600＝0.1)或补充了不同浓度的104的DC3000(OD600＝0.1)浸润的烟叶。1.25μM.2.50μM.3.100μM.4.250μM.5.500μM.6.-10.：单独的DC3000。
图35显示了使用抗-HrpW多克隆抗体进行的HrpW免疫印迹分析。在2个不同的时间点取样：在HIM培养基中传代培养细胞以后9h和12h。通过细胞质级分和上清液级分的分别6min和8min暴露，检测化学发光信号。泳道1，在HIM中的丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(DC3000)；泳道2，在补充了DMSO的HIM中的DC3000；泳道3，在补充了250μMTCA的HIM中的DC3000。
图36显示了：在dH2O和0.02％Silwet L-77中将丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(DC3000)的细菌悬浮液稀释至6×105CFU/ml，用于浸渍接种。(A)补充了250μM 001的DC3000。在用TCA处理的番茄植物中没有观察到细菌斑点病变。(B)单独的DC3000。
图37显示了化合物对exoS表达和细菌生长的影响。灰线代表用DMSO处理的细胞的exoS表达水平。
图38显示了化合物对exoS表达的剂量依赖性的影响的评价。(A)T3抑制剂或(B)T3诱导物对exoS表达的剂量依赖性的影响。X-轴代表相对exoS表达水平(化合物/DMSO)。黑线代表DMSO处理的样品的渐近线。
图39显示了化合物对铜绿假单胞菌生长的剂量依赖性的影响的评价。(A)T3抑制剂或(B)T3诱导物对铜绿假单胞菌生长的剂量依赖性的影响。X-轴代表相对细胞密度(化合物/DMSO)。黑线代表DMSO处理的样品的渐近线。
图40显示了化合物对exoS表达和细胞总数的剂量依赖性的影响的评价。X-轴，MFI(平均荧光强度)；Y-轴，细胞数目；Z-轴，化合物浓度。
在详细地解释本发明的任何实施方案之前，应当理解，本发明的应用不限于在下面的描述中阐述的或在附图中图解的部件的结构和排列的细节。本发明能够具有其它实施方案，且能够以不同的方式实践或实现。还应当理解，在本文中使用的短语和术语是用于描述目的，不应当视作限制。
具体实施方式
已经证实，双组分***GacS/GacA对菊欧文氏菌3937(Ech3937)的III型分泌***(“T3SS”)的调节作用是通过次级代谢(Rsm)***的调节剂来实现。Rsm是一种新颖类型的转录后调节***，其在基因表达中起关键作用。RsmA是一种小RNA结合蛋白，其通过缩短靶mRNA的半衰期而起作用。rsmB是一种未翻译的调节性的RNA，其结合RsmA，并通过形成无活性的核糖核蛋白复合体来抑制它的活性。在Ech3937中，GacS/GacA通过转录后调节通过增加rsmB RNA水平来增量调节hrpLmRNA，所述rsmB RNA结合RsmA并抑制RsmA的hrpL mRNA衰退效应(图1)。
图1显示了菊欧文氏菌3937(Ech3937)的III型分泌***(T3SS)的调节网络。具有(+)符号的线表示正调节，具有(-)符号的线表示负调节。Ech3937的T3SS由HrpX/HrpY-HrpS-HrpL和GacS/GacA-rsmB-HrpL调节途径来调节。双组分***HrpX/HrpY会活化编码σ54-增强子HrpS的基因，所述σ54-增强子HrpS是替代性的∑因子hrpL的表达所必需的。HrpL另外活化编码T3SS器官的基因和它的分泌产物的表达。
T3SS会促进宿主内的细菌毒力。发现菊欧文氏菌的gacA删除突变体(菊欧文氏菌3937)会表现出减少的果胶酸裂合酶、蛋白酶和纤维素、通常导致植物细胞壁的结构完整性丧失的酶的生产。攻击植物细胞壁的酶的减少的生产会导致减少的细菌毒力。
包括邻香豆酸(“OCA”)和叔肉桂酸(“TCA”)在内的几种化合物已经被鉴别为GacS/GacA调节***的诱导物。GacS/GacA***的诱导又会影响Rsm***，后者进一步影响T3SS基因(包括果胶酶基因)的表达。
在进一步的研究中，发明人已经筛选了化合物，包括叔肉桂酸、邻香豆酸、间香豆酸、对香豆酸、氢化肉桂酸、苯氧基醋酸、反式-2-苯基环丙烷-1-羧酸、反式-3-(3-吡啶基)丙烯酸、反式-3-吲哚丙烯酸、2-甲基肉桂酸、2-氯肉桂酸、反式-肉桂酸甲酯和肉桂醇。发现2种化合物对香豆酸(PCA)和肉桂醇会降低菊欧文氏菌的毒力的诱导。不受理论限制，PCA似乎会通过HrpX/HrpY***来降低毒力(参见图1、实施例10)。
基于OCA、TCA、PCA和肉桂醇可以调节(即促进或减少)细菌毒力的发现，进行了进一步筛选，以便鉴别出降低细菌毒力的化合物。合成了不同的化合物，并筛选它们的降低细菌毒力的能力。测试了所述合成的化合物的降低细菌的毒力的能力，所述细菌具有双组分信号转导***，诸如GacS/GacA***(或GacS/GacA***的同系物)、HrpX/HrpY***(或HrpX/HrpY***的同系物)、Rsm***(或同系物)和/或T3SS***(或同系物)。
为了测试而生产的化合物包括在本文中称作“苯丙素衍生物”的化合物。苯丙素衍生物的描述通常参见2009年10月8日提交的美国专利申请号12/595,148中，并通过引用整体并入本文。
定义
下面定义的每个基团可以被本文定义的一个或多个部分取代。
烷基：本文使用的术语“烷基”是指从具有1-20个碳原子(除非另外说明)的烃化合物的碳原子去除氢原子而得到的单价部分，其可以为脂肪族或者脂环族，并且可以为饱和的或不饱和的(例如，部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下面讨论的子类：链烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基等。
在烷基的背景下，前缀(例如，C1-4、C1-7、C1-20、C2-7、C3-7等)意指碳原子数，或者碳原子数的范围。例如，本文使用的术语“C1-4烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基。烷基的实例包括C1-4烷基(“低级烷基”)、C1-7烷基、C1-20烷基和C1-30烷基。应该注意到，第一个前缀可以根据其它限制而变化；例如，对于不饱和烷基，第一个前缀必须是至少2；对于环状和支链烷基，第一个前缀必须是至少3；等等。
饱和烷基的实例包括、但不限于：甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)、辛基(C8)、壬基(C9)、癸基(C10)、十一基(C11)、十二烷基(C12)、十三烷基(C13)、十四烷基(C14)、十五烷基(C15)和二十烷基(C20)。
饱和直链烷基的实例包括、但不限于：甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(C5)、正己基(C6)和正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括：异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)和新戊基(C5)。
链烯基：本文使用的术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的烷基。链烯基的实例包括C2-4烯基、C2-7烯基、C2-20烯基。
不饱和链烯基的实例包括、但不限于：乙烯基(乙烯基、-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基、-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基、-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)和己烯基(C6)。
炔基：本文使用的术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的烷基。炔基的实例包括C2-4炔基、C2-7炔基、C2-20炔基。
不饱和炔基的实例包括、但不限于：乙炔基(乙炔基、-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基、-CH2-C≡CH)。
环烷基：本文使用的术语“环烷基”是指同时还是环基的烷基；也就是说，从碳环化合物的碳环的脂肪环原子去除氢原子而得到的单价部分，所述碳环可以为饱和的或不饱和的(例如，部分不饱和的、完全不饱和的)，所述部分具有3-20个碳原子(除非另外说明)，包括3-20个环原子。因此，术语“环烷基”包括子类环烯基和环炔基。优选地，每个环具有3-7个环原子。环烷基的实例包括C3-30环烷基、C3-20环烷基、C3-10环烷基、C3-7环烷基。
环烷基的实例包括、但不限于衍生自下列化合物的基团：
饱和单环烃化合物(环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)、甲基环己烷(C7)、二甲基环己烷(C8)、薄荷烷(C10))；不饱和单环烃化合物(环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)、甲基环己烯(C7)、二甲基环己烯(C8))；饱和多环烃化合物(侧柏烷(C10)、蒈烷(C10)、蒎烷(C10)、莰烷(C10)、降蒈烯(C7)、降蒎烷(C7)、降莰烷(C7)、金刚烷(C10)、萘烷(十氢化萘)(C10))；不饱和多环烃化合物(莰烯(C10)、柠檬烯(C10)、蒎烯(C10))；具有芳族环的多环烃化合物(茚(C9)、茚满(例如，2，3-二氢-1H-茚)(C9)、四氢化萘(1，2，3，4-四氢萘)(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(phenalene)(C13)、乙酰基菲(acephenanthrene)(C15)、醋蒽(C16)、胆蒽(C20))。
羟基烷基：本文使用的术语“羟基烷基”是指，其中氢原子已经被羟基替代的烷基。
杂环基：本文使用的术语“杂环基”是指，从杂环化合物的环原子去除氢原子而得到的单价部分，所述部分具有3-20个环原子(除非另外说明)，其中的1-10个原子为环杂原子。优选地，每个环具有3-7个环原子，其中的1-4个为环杂原子。
在该背景下，前缀(例如，C3-20、C3-7、C5-6等)意指环原子数，或者包括碳原子和杂原子在内的环原子的数目范围。例如，本文使用的术语“C5-6杂环基”是指具有5或6个环原子的杂环基。杂环基的实例包括C3-30杂环基、C3-20杂环基、C5-20杂环基、C3-15杂环基、C5-15杂环基、C3-12杂环基、C5-12杂环基、C3-10杂环基、C5-10杂环基、C3-7杂环基、C5-7杂环基和C5-6杂环基。
单环杂环基的实例包括、但不限于：衍生自下列物质的基团：
N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢化吡咯)(C5)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2，5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、氮杂卓(C7)；
O1：环氧乙烷(C3)、环氧丙烷(C4)、二氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(二氢呋喃)(C5)、氧丙烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂卓(C7)；
S1：硫杂丙环(C3)、硫杂环丁烷(C4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(C5)、噻烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(C7)；
O2：二氧戊环(C5)、二烷(C6)和二氧杂环庚烷(C7)；
O3：三烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二唑烷)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢
Figure BDA00002255629900113
唑(C5)、二氢唑(C5)、四氢异
Figure BDA00002255629900115
唑(C5)、二氢异
Figure BDA00002255629900116
唑(C5)、吗啉(C6)、四氢
Figure BDA00002255629900117
嗪(C6)、二氢
Figure BDA00002255629900118
嗪(C6)、
Figure BDA00002255629900119
嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：氧杂二嗪(C6)；
O1S1：氧硫杂环戊烷(C5)和氧硫杂环己烷(噻
Figure BDA000022556299001110
烷)(C6)；和，
N1O1S1：邻氧硫杂环丁烷(oxathiazine)(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括衍生自下列环形式的糖类的基团：
例如呋喃糖(C5)，诸如呋喃型***糖、呋喃型来苏糖、呋喃型核糖和呋喃型木糖，和吡喃糖(C6)，诸如吡喃型阿洛糖、吡喃型阿卓糖、吡喃型葡萄糖、吡喃型甘露糖、吡喃型古洛糖、碘代吡喃糖、吡喃型半乳糖和吡喃型塔罗糖。
芳基：本文使用的术语“芳基”是指，从芳族化合物的芳族环原子去除氢原子而得到的单价部分，所述部分具有3-20个环原子(除非另外指出)。优选地，每个环具有5-7个环原子。
在该背景下，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6等)意指环原子数，或者包括碳原子和杂原子在内的环原子的数目范围。例如，本文使用的术语“C5-6芳基”是指具有5或6个环原子的芳基。芳基的实例包括C3-30芳基、C3-20芳基、C5-20芳基、C5-15芳基、C5-12芳基、C5-10芳基、C5-7芳基、C5-6芳基、C5芳基和C6芳基。
所述环原子可以都是碳原子，如在“碳芳基”中。碳芳基的实例包括C3-20碳芳基、C5-20碳芳基、C5-15碳芳基、C5-12碳芳基、C5-10碳芳基、C5-7碳芳基、C5-6碳芳基和C6碳芳基。
碳芳基的实例包括、但不限于：衍生自苯(即，苯基)(C6)、萘(C10)、环戊并环庚五烯(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、萘并萘(C18)和芘(C16)的那些。
包含稠合环(所述稠合环中的至少一个是芳族环)的芳基的实例包括、但不限于：衍生自茚满(例如，2，3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1，2，3，4-四氢萘(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(C13)、乙酰基菲(C15)和醋蒽(C16)的基团。
或者，所述环原子可以包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。杂芳基的实例包括C3-20杂芳基、C5-20杂芳基、C5-15杂芳基、C5-12杂芳基、C5-10杂芳基、C5-7杂芳基、C5-6杂芳基、C5杂芳基和C6杂芳基。
单环杂芳基的实例包括、但不限于衍生自下述物质的那些：N1：吡咯(吡咯)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；O1：呋喃(氧杂环戊二烯)(C5)；S1：噻吩(硫杂环戊二烯)(C5)；N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；N3O1：噁***(C5)；N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；N2：咪唑(1，3-二唑)(C5)、吡唑(1，2-二唑)(C5)、哒嗪(1，2-二嗪)(C6)、嘧啶(1，3-二嗪)(C6)(例如、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1，4-二嗪)(C6)；N3：***(C5)、三嗪(C6)；和N4：四唑(C5)。
含有稠合环的杂环基的实例包括，但不限于：
源自下述物质的C9杂环基(具有2个稠合环)：苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、吲嗪(N1)、二氢吲哚(N1)、异二氢吲哚(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并间二氧杂环戊烯(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并***(N3)、苯并噻吩(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
源自下述物质的C10杂环基(具有2个稠合环)：色烯(O1)、异色烯(O1)、色满(O1)、异色满(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、萘啶(N2)、喋啶(N4)；
源自苯二氮杂卓(N2)的C11杂芳基(具有2个稠合环)；
源自下述物质的C13杂芳基(具有3个稠合环)：咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、萘嵌间二氮杂苯(N2)、吡啶并吲哚(N2)；和
源自下述物质的C14杂环基(具有3个稠合环)：吖啶(N1)、呫吨(O1)、噻吨(S1)、氧杂蒽烯(oxanthrene)(O2)、吩氧硫杂环己二烯(phenoxathiin)(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
具有-NH-基形式的氮环原子的杂芳基可以为N-取代的，即作为-NR-。例如，吡咯可以为N-甲基取代的，以得到N-甲基吡咯。N-取代基的实例包括、但不限于：C1-7烷基、C3-20杂环基、C5-20芳基和酰基。
具有-N＝基形式的氮环原子的杂环基(包括杂芳基)可以被取代成N-氧化物形式，即作为-N(→O)＝(也表示为-N+(→O-)＝)。例如，喹啉可以被取代成喹啉N-氧化物；吡啶可以被取代成吡啶N-氧化物；苯并呋咱可以被取代成苯并呋咱N-氧化物(也称作苯并N-氧化苯并噁二唑(benzofuroxan))。
环状基团可以额外地在环碳原子上带有一个或多个氧代(＝O)基团。
上述基团(无论为单独基团，还是为另一个取代基的一部分)本身可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自本身和下面所列的其它取代基。
卤素：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R为醚取代基，例如C1-7烷基(也称作C1-7烷氧基，在下面讨论)、C3-20杂环基(也称作C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(也称作C5-20芳氧基)，优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R是烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括、但不限于：-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)和-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR)2，其中每个R独立地是缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或者，在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2与它们连接的2个氧原子和它们连接的碳原子一起，形成具有4-8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括、但不限于：-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR)，其中R是半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括、但不限于：-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR)2，其中每个R如关于缩醛所定义，且每个R独立地是非氢的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括、但不限于：-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2和-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR)，其中R如关于半缩醛所定义，且R是非氢的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括、但不限于：-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)和-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮，-酮)：＝O。
硫酮(硫代酮)：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基团的实例包括、但不限于：＝NH、＝NMe、＝NEt和＝NPh。
甲酰基(甲醛)：-C(＝O)H。
酰基(酮)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基(也称作C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(也称作C3-20杂环基酰基)、C5-20芳基(也称作C5-20芳基酰基)，优选C1-7烷基或卤代。酰基的实例包括、但不限于：-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)、-C(＝O)Ph(苯甲酰基、苯甲酮)、-C(＝O)Cl。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫羟羧基(硫羟羧酸)：-C(＝O)SH。
硫羰羧基(硫羰羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯、羧酸酯、氧基羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括、但不限于：-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)OPh。
酰氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括、但不限于：-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph和-OC(＝O)CH2Ph。
氧甲酰氧基(oxycarboyloxy)：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基团的实例包括、但不限于：-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR2，其中每个R独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基(也称作C1-7烷基氨基或二-C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或者，在“环状”氨基的情况下，两个R’与它们连接的氮原子一起形成具有4-8个环原子的杂环。氨基可以是伯氨(-NH2)、仲氨(-NHR)或叔氨(-NHR2)，且在阳离子形式，可以是季氨(-+NR3)。氨基的实例包括、但不限于：-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基的实例包括、但不限于：氮杂环丙烷-1-基(aziridino)、氮杂环丁烷-1-基(azetidino)、吡咯烷子基、哌啶子基、哌嗪子基、吗啉代和硫代吗啉代。
酰氨基(氨甲酰基、氨基甲酰基、氨基羰基、羧酰胺)：-C(＝O)NR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基。酰氨基的实例包括、但不限于：-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及其中两个R’与它们连接的氮原子一起形成杂环结构的酰氨基，如在例如哌啶子基羰基、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基和哌嗪子基羰基中。
硫代酰氨基(硫代氨基甲酰基)：-C(＝S)NR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基。酰氨基的实例包括、但不限于：-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰氨基(酰基氨基)：-NR10C(＝O)R11，其中R10是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，且R11是酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰基酰氨基的实例包括、但不限于：-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R10和R11可以一起形成环结构，如在例如琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和邻苯二酰亚胺基中。
Figure BDA00002255629900161
氨基碳酰氧基：-OC(＝O)NR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基。氨基碳酰氧基的实例包括、但不限于：-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R12)CONR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基，且R12是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括、但不限于：-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
亚氨基：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括、但不限于：＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R独立地是脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基的实例包括、但不限于：-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈，甲腈)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
硫氰基(硫氰酰基)：-SCN。
异硫氰基(异硫氰酰基)：-NCS。
硫氢基(硫醇，巯基)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基(也称作C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括、但不限于：-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基(在本文中也称作C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基团的实例包括、但不限于：-SSCH3和-SSCH2CH3。
锍化物(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R是锍化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。锍化物基团的实例包括、但不限于：-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括、例如，氟化的或全氟化的C1-7烷基。砜基的实例包括、但不限于：-S(＝O)2CH3(甲烷磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯磺酰基(对甲苯磺酰基)、4-氯苯磺酰基(对氯苯磺酰基)、4-溴苯磺酰基(对溴苯磺酰基)、4-硝基苯基(对硝基苯磺酰基)、2-萘磺酰基(萘磺酰基)和5-二甲氨基-萘-1-基磺酰基(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(亚磺酸的酯)：-S(＝O)OR；其中R是亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基的实例包括、但不限于：-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；亚磺酸甲酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；亚磺酸乙酯)。
磺酸酯(磺酸的酯)：-S(＝O)2OR，其中R是磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酸酯基的实例包括、但不限于：-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R是亚磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氧基的实例包括、但不限于：-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R是磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括、但不限于：-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R是硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基的实例包括、但不限于：-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨亚磺酰基(氨基亚磺酰基；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基。氨亚磺酰基的实例包括、但不限于：-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
氨磺酰基(氨基磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR2，其中每个R独立地是关于氨基所定义的氨基取代基。氨磺酰基的实例包括、但不限于：-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NRS(＝O)2OH，其中R是关于氨基所定义的氨基取代基。磺氨基的实例包括、但不限于：-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基：-NR13S(＝O)2R，其中R13是关于氨基所定义的氨基取代基，且R是磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括、但不限于：-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基：-NR13S(＝O)R，其中R13是关于氨基所定义的氨基取代基，且R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括、但不限于：-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
甲硅烷基：-SiR3，其中每个R独立地是甲硅烷基取代基，例如，H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。
膦基(膦)：-PR2，其中每个R独立地是膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括、但不限于：-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
二氧磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中每个R独立地是氧膦基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基的实例包括、但不限于：-P(＝O)(CH3)2，-P(＝O)(CH2CH3)2，-P(＝O)(t-Bu)2，和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中每个R独立地是膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯的实例包括、但不限于：-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中每个R独立地是磷酸盐取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯的实例包括、但不限于：-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中每个R独立地是亚磷酸盐取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯的实例包括、但不限于：-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
氨基亚磷酸酯：-OP(OR)-NR2，其中每个R独立地是氨基亚磷酸酯取代基，例如，-H、(任选地取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。氨基亚磷酸酯基的实例包括、但不限于：-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
氨基磷酸酯：-OP(＝O)(OR)-NR2，其中每个R独立地是氨基磷酸酯取代基，例如，-H、(任选地取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。氨基磷酸酯基的实例包括、但不限于：-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
本文所用的术语“亚烷基”是指，通过从具有1-12个碳原子(除非另外说明)的烃化合物去除两个氢原子而获得的二齿部分，所述两个氢原子来自同一个碳原子或者各自来自两个不同碳原子中的一个，所述烃化合物可以是脂肪族或者脂环族，并且其可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。所以，术语“亚烷基”包括下面讨论的子类：亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。
线性的饱和亚烷基的实例包括、但不限于：-(CH2)n-，其中n为3-12的整数，例如，-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)和-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和亚烷基的实例包括、但不限于：-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
线性的部分不饱和的亚烷基(亚烯基和亚炔基)的实例包括、但不限于：-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-和-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和的亚烷基(亚烯基和亚炔基)的实例包括、但不限于：-C(CH3)＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和亚烷基(亚环烷基)的实例包括、但不限于：亚环丙基(例如环丙-1，2-亚基)、亚环丁基(例如环丁-1，2-亚基)、亚环戊基(例如环戊-1，3-亚基)和亚环己基(例如环己-1，4-亚基)。
脂环族部分不饱和的亚烷基(亚环烷基)的实例包括、但不限于：亚环戊烯基(例如4-环戊烯-1，3-亚基)、亚环己烯基(例如2-环己烯-1，4-亚基、3-环己烯-1，2-亚基、2，5-环己二烯-1，4-亚基)。
本文使用的术语“C1-3亚烷基”是具有1-3个碳原子的如上定义的亚烷基。亚烷基包括亚环丙基。
本文使用的术语“杂亚烷基”是指，其中至少一个碳原子已经被诸如O、S或NR等杂原子替代的亚烷基，其中R是氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。杂亚烷基的实例包括、但不限于：-O-CH2-、-NH-CH2-、-S-CH2-、-O-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-和-CH2-NH-CH2-。杂亚烷基也包括环状杂亚烷基(杂环亚烷基)，其实例包括、但不限于：去除了2个氢原子的环氧乙烷环、环氧丙烷环、氮丙啶环和氮杂环丁烷环。
术语“GacS/GacA-型***”表示，在菊欧文氏菌中的信号转导***以及在其它细菌(例如大肠杆菌(BarA/UvrY)、果胶杆菌属某些种、鼠伤寒沙门菌(BarA/SirA)、假单胞菌属某些种(GacS/GacA)和嗜肺军团病杆菌(LetS/LetA)、弧菌属某些种)中的同源***，所述同源***具有与菊欧文氏菌的GacS/GacA***类似的结构和功能，即使所述同源调节***可能通过不同名称在其它细菌中已知。类似地，“GacA-型多肽”和“GacS-型多肽”表示，在菊欧文氏菌中的各种多肽以及在其它细菌中的具有类似结构和功能的同源多肽。
术语“HrpX/HrpY-型***”表示，在菊欧文氏菌中的信号转导***以及在其它细菌中的同源***，所述同源***具有与菊欧文氏菌的HrpX/HrpY***类似的结构和功能，即使所述同源调节***可能通过不同名称在其它细菌中已知。类似地，“HrpY-型多肽”和“HrpX-型多肽”表示，在菊欧文氏菌中的各种多肽以及在其它细菌中的具有类似结构和功能的同源多肽。
术语“Rsm-型***”表示，菊欧文氏菌的次级代谢(Rsm)***以及在其它细菌中的同源***的调节剂，所述同源***具有与菊欧文氏菌的Rsm***类似的结构和功能，即使所述同源调节***可能通过不同名称在其它细菌中已知。
术语“T3SS-型***”表示，菊欧文氏菌的III型分泌***(T3SS)以及在其它细菌中的同源***，所述同源***具有与菊欧文氏菌的T3SS类似的结构和功能，即使所述同源调节***可能通过不同名称在其它细菌中已知。
本文使用的术语“减少”或“减少的”是相对于未处理的样品或其它合适对照而使用。例如，响应于细菌与实验化合物的接触而“减少所述细菌中的多核苷酸的表达”是指，与在对照条件下的相同细菌中的多核苷酸的表达水平相比，减少所述多核苷酸的表达量(例如减少所述多核苷酸编码的mRNA或形成的蛋白的量)。所述对照条件可包括：将所述细菌暴露于相同条件，但是不使所述细菌接触所述实验化合物。
“减少细菌的毒力”表示，改变与毒力有关的基因(包括毒力的调节剂)的表达。减少毒力也表示，毒力的物理和生化表现，包括当细菌与宿主结合时与细菌生命周期的任何步骤有关的那些表现，所述步骤包括、但不限于附着、侵入、复制、逃避宿主防御和传送给新宿主。减少的细菌毒力可以以在宿主中减少的征状的形式显示，因而可以通过监测宿主对与此有关的细菌的反应减少而检测到。减少的毒力可以作为抑制或刺激双组分调节***(诸如GacS/GacA-型***或HrpX/HrpY-型***)的结果而产生，所述抑制或刺激可能导致多核苷酸和多肽生产的增加或减少。例如，减少的毒力可以与阻遏物的生产增加、转录因子的生产减少或酶或毒素的生产增加有关。细菌毒力的调节可能导致革兰氏阴性细菌中的下述物质的生产的改变：果胶酶、外切蛋白酶、丁香霉素、syringolin、海藻酸盐、tolaasin、铁载体、绿脓菌素、氰化物、脂肪酶、III型分泌***(T3SS)基因、霍乱毒素、聚羟基丁酸酯或由GacS/GacA-型***或HrpX/HrpY-型***控制的多核苷酸。毒力的减少可以是，当相对于合适的对照测量时，通过本文所述的或本领域技术人员已知的任意试验测得，毒力的至少约1％减少、至少约10％减少、至少约20％减少、至少约30％减少、至少约40％减少、至少约50％减少、至少约60％减少、至少约70％减少、至少约80％减少、至少约90％减少或至少约100％减少。
GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***的“组分”包括、但不限于：作为各个***的一部分的多核苷酸和多肽(包括命名的操纵子的基因和基因产物)，以及调节所述***的多核苷酸、多肽和其它分子，包括在所述***的上游或下游的基因和基因产物。“组分”也包括：作为所述***的基因或基因产物的产物的分子，以及造成所述***的多核苷酸或多肽的翻译后修饰的基因或基因产物。“调节剂”是改变(增加或减少)组分的表达或活性水平的组分。“阻遏物”是降低组分的表达或活性水平的组分，这源自阻遏物的量或活性水平的增加或减少。“效应物”是实现所述***的活性的组分，例如T3SS-型***的胞外酶是效应物的非限制性实例。如果组分的量或活性的变化直接地或间接地导致细菌毒力在某些方面的增加或减少，则所述组分“与毒力有关”。
本文使用的“苯丙素-型抑制性化合物”包括，减少细菌毒力的苯丙素化合物，诸如对香豆酸或肉桂醇。另外，“苯丙素-型抑制性化合物”也包括，已经发现是“活性化合物”的苯丙素衍生物，即通过筛选已经证实具有细菌毒力减少活性的化合物。
当细菌是在宿主或受试者诸如植物或动物(包括人)中或表面上时，所述细菌“与所述宿主或受试者有关”(或“与其有关”)。对于植物宿主或受试者，有关的细菌可以是在植物部分(诸如植物的根、茎、叶、花或果实)上，或在根或茎基部附近的土壤中。对于动物宿主或受试者，有关的细菌可以是在动物的外表面上或在内表面(诸如肠表面)上，或有关的细菌可以是在动物体内，例如在动物的组织或流体或动物的任何其它内部部分中。
本文在治疗病症的背景下使用的“治疗”，通常指处理和治疗人、动物(例如在兽医应用中)或植物，其中实现某种希望的治疗效果，例如，减慢病症的发展，包括降低发展速度、停止发展、缓解病症和治愈病症。还包括作为预防措施(即，预防)的治疗。“治疗”也表示减少与进行治疗的病症有关的征状。
在使与植物有关的细菌接触本文所述化合物的背景下，本文使用的“有效量”表示这样的化合物的量：其可以在治疗上有效地抑制、预防或治疗特定疾病、障碍或副作用的征状，特别是与细菌毒力有关的那些征状。有效量的活性化合物可以单独使用，或作为本文所述组合物的一部分使用。在不同的实施方案中，在组合物中的活性化合物的有效量可以是：约0.1μg/g至约0.9g/g、约1μg/g至约100mg/g、约10μg/g至约10mg/g、和约100μg/g至约1mg/g。施用于表面(例如土壤、茎或叶)上的活性化合物的量可以是：约0.1μg/平方英尺、约1μg/平方英尺、约10μg/平方英尺、约100μg/平方英尺、约1mg/平方英尺、约10mg/平方英尺、约100mg/平方英尺、约1g/平方英尺、约10g/平方英尺或约100g/平方英尺。
在使与动物(例如，人)有关的细菌接触本文所述化合物的背景下，本文使用的“有效量”表示这样的化合物的量：其可以在治疗上有效地抑制、预防或治疗特定疾病、障碍或副作用的征状，特别是与细菌毒力有关的那些征状。因而，有效量的活性化合物可以单独使用，或作为本文所述组合物的一部分使用，以治疗具有与其有关的细菌的动物受试者，从而减少细菌的毒力。所述组合物可以制备成适合口服的、局部的、肺的、肠胃外的或其它给药途径。在组合物中的活性化合物的浓度可以是：约0.1μg/g至约0.9g/g、约1μg/g至约100mg/g、约10μg/g至约10mg/g、和约100μg/g至约1mg/g。当在内部(例如肠胃外地或口服地)给药时，施用给受试者的剂量可以是：约0.1μg/kg体重至约1.0g/kg体重、约1μg/kg体重至约100mg/kg体重、约10μg/kg体重至约10mg/kg体重、和约100μg/kg体重至约1mg/kg体重。
在使与表面有关的细菌接触本文所述化合物的背景下，本文使用的“有效量”表示这样的化合物的量：当将所述化合物或包含所述化合物的组合物施用于包括所述细菌的表面时，其可以有效地减少与表面有关的细菌的毒力。有效量的活性化合物可以单独使用，或作为本文所述组合物的一部分使用。在不同的实施方案中，在组合物中的活性化合物的有效量可以是：约0.1μg/g至约0.9g/g、约1μg/g至约100mg/g、约10μg/g至约10mg/g、和约100μg/g至约1mg/g。施用于表面的活性化合物的量可以是：约0.1μg/平方英尺、约1μg/平方英尺、约10μg/平方英尺、约100μg/平方英尺、约1mg/平方英尺、约10mg/平方英尺、约100mg/平方英尺、约1g/平方英尺、约10g/平方英尺、或约100g/平方英尺。
本文使用的术语“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：其在合理的医学判断范围内，适用于接触目标受试者(例如，人或其它动物)的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。每种载体、赋形剂等还必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容。
在用它们的从左向右书写的常规化学式指定取代基的情况下，它们任选地包括从右向左书写所述结构而产生的取代基，例如，-CH2O-任选地也表示-OCH2-。
化合物
可用于本文所述方法中的化合物包括式(I)化合物或其盐：
Figure BDA00002255629900251
其中R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自：氢、烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、烷基氨基、甲酰基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸酯、取代的或未取代的二环杂芳族和羧酰胺基团。
在有些实施方案中，在式(I)化合物中：
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
R2、R5和R6各自独立地选自：氢、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、卤代、羧基和氨基；
R3选自：氢、羟基、羟基烷基和烷氧基；
R4选自：氢、烷基、烯基、炔基、卤代、羟基、羟基烷基和烷氧基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸酯、取代的或未取代的二环杂芳族和羧酰胺基团。
在有些实施方案中，R1是C2-C3亚烷基(例如，C2-C3亚烯基或C2-C3亚炔基。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烯基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，R4是烷氧基(例如，甲氧基)或羟基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸、烯丙醇、羟基、羧基、烷氧基(例如，甲氧基)或酯(例如，CO2Et)。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
在有些实施方案中，所述化合物是化合物103：
Figure BDA00002255629900261
可用于本文所述方法中的化合物包括式(II)化合物：
Figure BDA00002255629900262
其中A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、烷基氨基、甲酰基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸酯、取代的或未取代的二环杂芳族和羧酰胺基团。
在有些实施方案中，A是芳基(例如，苯基或萘基)。在有些实施方案中，A是杂芳基(例如，噻吩、呋喃、吲哚、吡啶基、咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉或咔唑)。在有些实施方案中，R1是C2-C3亚烷基(例如，C2-C3亚烯基或C2-C3亚炔基)。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烯基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是至少1。在有些实施方案中，至少一个R2是烷氧基(例如，甲氧基)或羟基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸、烯丙醇、羟基、羧基、烷氧基(例如，甲氧基)或酯(例如，CO2Et)。
在有些实施方案中，所述化合物是化合物127：
Figure BDA00002255629900271
可用于本文所述方法中的化合物包括式(III)化合物或其盐：
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
在有些实施方案中，A是芳基(例如，苯基)。在有些实施方案中，A是杂芳基(例如，吲哚、吡啶基、咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩或咔唑)。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是0。在有些实施方案中，n是1或2。在有些实施方案中，每个R2独立地选自：烷基(例如，甲基)、羟基、羟基烷基(例如，-CH2OH)、烷氧基(例如，甲氧基)、巯基、卤代(例如，氟代、氯代或溴代)、羧基、硝基、氨基(例如，-NH2或-NMe2)、甲酰基、芳基(例如，苯基)、卤代烷基(例如，三氟甲基)、酯和酰氨基。在有些实施方案中，R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯(例如，-C(O)OMe或-C(O)OEt)、氨基(例如，-NH2)、酰氨基(例如，-C(O)NH2或-C(O)NHMe)、磺酸、磺酸酯(例如，-S(O)2OEt)、膦酸、膦酸酯(例如，-P(O)(OEt)2)和取代的或未取代的二环杂芳族基团(例如，邻苯二甲酰亚胺基)。在有些实施方案中，R7是羧基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
可用于本文所述方法中的化合物包括式(IV)化合物或其盐：
Figure BDA00002255629900281
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
在有些实施方案中，A是芳基(例如，苯基)。在有些实施方案中，A是杂芳基(例如，吲哚、吡啶基、咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩或咔唑)。在有些实施方案中，R1是亚烷基，诸如C2-C3亚烷基(例如，-CH＝CH-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-或-C≡C-)。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烷基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是0。在有些实施方案中，n是1或2。在有些实施方案中，每个R2独立地选自：烷基(例如，甲基)、羟基、羟基烷基(例如，-CH2OH)、烷氧基(例如，甲氧基)、巯基、卤代(例如，氟代、氯代或溴代)、羧基、硝基、氨基(例如，-NH2或-NMe2)、甲酰基、芳基(例如，苯基)、卤代烷基(例如，三氟甲基)、酯和酰氨基。在有些实施方案中，R7选自：异羟肟酸、肼基羰基、氨基(例如，-NH2)、酰氨基(例如，-C(O)NH2或-C(O)NHMe)、磺酸、磺酸酯(例如，-S(O)2OEt)、膦酸、膦酸酯(例如，-P(O)(OEt)2)和取代的或未取代的二环杂芳族基团(例如，邻苯二甲酰亚胺基)。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
可用于本文所述方法中的化合物包括式(V)化合物或其盐：
Figure BDA00002255629900291
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、氟代、溴代、碘代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
在有些实施方案中，A是芳基(例如，苯基)。在有些实施方案中，A是杂芳基(例如，吲哚、吡啶基、咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩或咔唑)。在有些实施方案中，R1是亚烷基，诸如C2-C3亚烷基(例如，-CH＝CH-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-或-C≡C-)。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烷基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是0。在有些实施方案中，n是1或2。在有些实施方案中，每个R2独立地选自：烷基(例如，甲基)、羟基烷基(例如，-CH2OH)、烷氧基(例如，甲氧基)、巯基、氟代、溴代、羧基、硝基、氨基(例如，-NH2或-NMe2)、甲酰基、芳基(例如，苯基)、卤代烷基(例如，三氟甲基)、酯和酰氨基。在有些实施方案中，R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯(例如，-C(O)OMe或-C(O)OEt)、氨基(例如，-NH2)、酰氨基(例如，-C(O)NH2或-C(O)NHMe)、磺酸、磺酸酯(例如，-S(O)2OEt)、膦酸、膦酸酯(例如，-P(O)(OEt)2)和取代的或未取代的二环杂芳族基团(例如，邻苯二甲酰亚胺基)。在有些实施方案中，R7是羧基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
可用于本文所述方法中的化合物包括式(VI)化合物或其盐：
其中：
A选自：咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩和咔唑；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
在有些实施方案中，A是咪唑、噻吩或呋喃。在有些实施方案中，R1是亚烷基，诸如C2-C3亚烷基(例如，-CH＝CH-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-或-C≡C-)。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烷基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是0。在有些实施方案中，n是1或2。在有些实施方案中，每个R2独立地选自：烷基(例如，甲基)、羟基、羟基烷基(例如，-CH2OH)、烷氧基(例如，甲氧基)、巯基、卤代(例如，氟代、氯代或溴代)、羧基、硝基、氨基(例如，-NH2或-NMe2)、甲酰基、芳基(例如，苯基)、卤代烷基(例如，三氟甲基)、酯和酰氨基。在有些实施方案中，R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯(例如，-C(O)OMe或-C(O)OEt)、氨基(例如，-NH2)、酰氨基(例如，-C(O)NH2或-C(O)NHMe)、磺酸、磺酸酯(例如，-S(O)2OEt)、膦酸、膦酸酯(例如，-P(O)(OEt)2)和取代的或未取代的二环杂芳族基团(例如，邻苯二甲酰亚胺基)。在有些实施方案中，R7是羧基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
可用于本文所述方法中的化合物包括式(VII)化合物或其盐：
Figure BDA00002255629900311
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
在有些实施方案中，A是芳基(例如，苯基)。在有些实施方案中，A是杂芳基(例如，吲哚、吡啶基、咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩或咔唑)。在有些实施方案中，R1是C2-C3亚烷基(例如，C2-C3亚烯基或C2-C3亚炔基。在有些实施方案中，R1是杂亚烷基，诸如-O-CH2-或-S-CH2-。在有些实施方案中，R1是亚环烷基，诸如亚环丙基。在有些实施方案中，R1是杂环亚烷基，诸如环氧丙烷或氮丙啶。在有些实施方案中，R1是键。在有些实施方案中，n是2。在有些实施方案中，每个R2独立地选自：烷基(例如，甲基)、羟基、羟基烷基(例如，-CH2OH)、烷氧基(例如，甲氧基)、巯基、卤代(例如，氟代、氯代或溴代)、羧基、硝基、氨基(例如，-NH2或-NMe2)、甲酰基、芳基(例如，苯基)、卤代烷基(例如，三氟甲基)、酯和酰氨基。在有些实施方案中，R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯(例如，-C(O)OMe或-C(O)OEt)、氨基(例如，-NH2)、酰氨基(例如，-C(O)NH2或-C(O)NHMe)、磺酸、磺酸酯(例如，-S(O)2OEt)、膦酸、膦酸酯(例如，-P(O)(OEt)2)和取代的或未取代的二环杂芳族基团(例如，邻苯二甲酰亚胺基)。在有些实施方案中，R7是羧基。在有些实施方案中，R7是异羟肟酸。
可用于本文所述方法中的化合物也包括下述的：
Figure BDA00002255629900321
Figure BDA00002255629900351
或它们的盐。
也预见到上面关于式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)所述的取代基的组合，作为本公开内容的一部分。
本文所述的化合物包括，差别仅在于一个或多个同位素富集的原子的存在的化合物。例如，化合物可以具有本发明的结构，但是用氘或氚替代氢，或用13C-或14C-富集的碳替代碳。
本文所述化合物可以是盐的形式，例如，药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”包括由相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于在本文所述化合物上发现的特定取代基。当本发明化合物包含相对酸性的官能团时，通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)，可以获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似盐。当本发明化合物包含相对碱性的官能团时，通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)，可以获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的那些和衍生自相对无毒性的有机酸的盐，所述的无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸，所述的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括诸如精氨酸等氨基酸的盐和诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等有机酸的盐(参见，例如，Berge等人，J.Pharma.Science 1977，66：1-19)。本发明的某些具体化合物包含碱性和酸性官能团，其允许将化合物转化成碱或酸加成盐。
通过使盐接触碱或酸，并且按照常规方式分离母体化合物，可以再生所述的化合物的中性形式。化合物的母体形式与各种盐形式的差别在于某些物理特性，诸如在极性溶剂中的溶解度，但是在其它方面，所述盐与用于本发明目的的化合物的母体形式相当。
除盐形式外，本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下容易发生化学改变以提供本文所述化合物的那些化合物。例如，本发明的羧酸化合物的前药包括多种酯。另外，通过在离体环境中的化学或生化方法，可以将前药转化成本发明化合物。例如，当放在含有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂蓄池中时，前药可以被缓慢地转化成本发明的化合物。
化合物的合成
使用多种方法，可以合成可用于本文所述方法中的化合物。可用于本文所述方法中的化合物包括苯丙素，所述苯丙素是从苯丙氨酸合成的植物衍生的有机化合物。通过使用本领域技术人员已知的方法添加或去除取代基，可以制备苯丙素衍生物。如在实施例中所示，可以从头或通过修饰天然存在的化合物来合成苯丙素衍生物，诸如本文公开的那些。
在图18-22和24-30所示的路线图中，描述了所述化合物的合成路线。在图18中，在Heck反应条件下，使芳基溴A1与丙烯酸乙酯反应，得到反式-肉桂酸乙酯A2(Patel，B.A.，等人J.Org.Chem.1977，42：3903-3907)。在用三氟醋酸(TFA)去除保护基以后，用羟胺替换酯，得到在苯基中分别具有羟基、羟硫基、氨基和其它基团的氧肟酸酯A3。对酯A2进行碱性水解，随后TFA去保护，得到肉桂酸衍生物A4。在A4中的羧基可以被二硼烷还原，产生肉桂醇A5。通过遵循报道的规程(Zhang，X.，等人J.Org.Chem.2002，67：9471-9474)，通过用HOBt和肼处理，可以从酸A4得到酰肼A6。在Corey-Chaykovsky环丙烷化反应条件(TMSOI，NaH，DMSO)下(Corey，E.J.，Chaykovsky，M.J.Am.Chem.Soc. 1965，87：1353-1364)，肉桂酸乙酯A2被转化成环丙烷基酯A7。后者可以通过TFA去保护和与羟胺反应而进一步转化成氧肟酸环丙烷酯A8，或者通过LAH还原和TFA去保护而进一步转化成对应的醇A9。以类似的方式，可以合成具有其它杂环(诸如吲哚基、硫代萘基、萘基和其它基团)的类似物。
如图19所示，在乙醇钠存在下，苯甲醛B1与氯乙酸乙酯反应，得到环氧乙烷羧酸乙酯B2(Li，S.W.，等人Bioorg.Chem.1998，26：45-50)。通过TFA去保护和随后的碱性水解，实现B2向3-芳基环氧乙烷羧酸B4的转化(图19)。
如图20所示，苯甲醛B1与二乙基膦酰乙酸的Knoevenagel反应，会导致反式-2-芳基乙烯基膦酸二乙酯C1的形成(Krawczyk，H.，Albrecht，L.Synthesis 2005，17：2887-2896)。在用三甲基甲硅烷基溴(TMSBr)和TFA处理以后，膦酸酯C1可以转化成反式-2-芳基乙烯基磷酸C3(图20)。以类似的方式，可以从对应的吲哚-3-醛得到反式-2-(吲哚-3-基)乙烯基磷酸C4。
如图21所示，在正丁基锂存在下，使苯甲醛B1与二乙基磷酰基-甲磺酸乙酯反应，以产生反式-2-芳基乙烯基磺酸乙酯D1(Niimi，T.，等人J.Med.Chem.2001，44：4737-4740)(图21)。所述磺酸乙酯D1可以用四正丁基碘化铵(n-Bu4NI)裂解，并用TFA进一步去保护，得到反式-2-芳基乙烯基磺酸D2。D1的Corey-Chaykovsky环丙烷化反应会产生环丙烷基磺酸酯D3，在用n-Bu4NI和TFA处理以后，可从D3得到对应的磺酸D4。
在图24中，将肉桂酸转化成对应的甲基酯。通过在碱性条件下用羟胺处理，可以将后者进一步转化成异羟肟酸。当在苯基中的取代基是卤代、甲基、甲氧基或不会形成酰胺/酯的其它基团时，可以从对应的羧酸直接得到异羟肟酸。通过与氨一起在甲醇中回流，可以从甲基酯得到对应的酰胺。所述酯可以被LiAlH4/AlCl3***容易地还原，产生肉桂醇。通过采用报道的规程(Zhang等人2002)，通过用HOBt和EDC、然后用肼处理，可以从肉桂酸得到酰肼。
在Corey-Chaykovsky环丙烷化反应条件下(Corey和Chaykovsky，1965)，将4-甲氧基肉桂酸乙酯转化成环丙烷基酯(100)。在水解后，得到酸105。用三溴硼烷将100脱甲基化，得到106。后者用氢氧化锂进一步水解，得到对应的羧酸107(图25)。
4-羟基苯甲醛与二乙基膦酰乙酸的Knoevenagel反应(Krawczyk和Albrecht 2005)会导致反式-2-芳基乙烯基膦酸二乙酯114的形成。在用三甲基甲硅烷基溴(TMSBr)处理以后，所述膦酸酯被转化成乙烯基磷酸115(图26)。以类似的方式，可以从对应的芳基醛得到其它反式-2-芳基乙烯基磷酸。
在正丁基锂存在下，可以使苯甲醛与二乙基磷酰基-甲磺酸乙酯反应，以产生反式-2-芳基乙烯基磺酸乙酯(Niimi等人2001)(图27)。得到的磺酸乙酯可以用四正丁基碘化铵(n-Bu4NI)裂解，生成反式-2-芳基乙烯基磺酸。
可以在DMF中用烯丙基氯烷基化邻苯二甲酰亚胺钾盐，以生成N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺。在Heck反应条件下(Patel等人1977)，使N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺与芳基溴反应，得到N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺。在用肼处理以后，从N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺得到肉桂基胺(图28)。
技术人员可以理解，合成本文通式的化合物的替代方法是本领域普通技术人员显而易见的。另外，各个合成步骤可以以替代序列或次序执行，以得到希望的化合物。可用于合成本文所述化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和去保护)是本领域已知的，且包括，例如，在诸如下述文献中描述的那些：R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第2版，John Wiley和Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley andSons(1994)；和L.Paquette，编，Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1995)，和它们的后续版本。
化合物的活性
活性试验可以在完整的细菌上或在分离的细菌组分上进行。例如，可以在体外(例如在膜微粒体中)重构GacS/GacA-型***或HrpX/HrpY-型***的受体部分，或重构成分离的可溶性的蛋白组分。在一个实施方案中，所述试验包括测量实验化合物与GacS-type或HrpX-型多肽的结合亲和力。
所述试验也可以在遗传工程改造的细菌上进行，在所述细菌中，GacS/GacA-型***或HrpX/HrpY-型***与报告物相偶联。因而，可以如下筛选实验化合物：使所述化合物接触适当地工程改造的细菌，使得所述化合物对GacS/GacA途径的结合和/或活化被直接报道，而不需要测定下游靶物或效应物，诸如Rsm途径或T3SS***的组分。所述遗传工程改造的细菌中的报告物可以与任意数目的已知荧光或比色测量试验(例如绿荧光蛋白(GFP))相关联，使得大量化合物的快速筛选成为可能。
可以使用不同的试验来测试所述化合物的效力，诸如本文所述的任意试验，包括、但不限于启动子-探针生物报告物试验、细胞分选(FACS)、果胶酶活性试验、qRT-PCR分析、GacA或HrpY的磷酸化分析、叶浸渍试验、生长动力学试验、板试验、菌膜形成分析、胞外酶生产分析和分光光度测量定量试验。使用菊欧文氏菌或具有GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、Rsm-型***和/或T3SS-型***的任意其它合适的细菌种或株，可以进行试验。使用来自多种植物中的任一种的叶子，包括非洲紫堇叶、大白菜叶或witloof chicory叶，可以进行叶浸渍试验。
除了本文所述的方法以外，可以根据需要使用本领域技术人员已知的其它方法，筛选和测定合成的化合物。例如，为了检测和测量多肽的量，可以使用诸如SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白印迹法和酶联免疫测定(ELISA)等方法和其它技术。为了检测和测量多核苷酸，可以使用聚合酶链式反应(PCR)以及基于电泳迁移率的方法(诸如DNA和RNA印迹法)和其它技术。
所述细菌可以是许多有毒的细菌种或株中的任一种，包括具有GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、Rsm-型***和/或T3SS-型***中的至少一种***的那些细菌种或株。合适的细菌种或株包括、但不限于：假单胞菌属某些种、欧文氏菌属相关的菌株、维涅兰德固氮菌、霍乱弧菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌菌株。所述细菌可以是假单胞菌属某些种，包括致金色假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、边缘假单胞菌(P.marginalis)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、托拉假单胞菌(P.tolaasii)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。
所述细菌可以是欧文氏菌属相关的菌株，包括菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌(也称作胡萝卜软腐果胶杆菌)、Erwinia atroseptica(也称作Pectobacterium atrosepticum)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。菊欧文氏菌是肠杆菌科的一个成员，该科包括植物病原体胡萝卜软腐果胶杆菌和解淀粉欧文氏菌以及动物和人病原体诸如大肠杆菌、沙门菌属某些种和耶尔森菌属某些种(诸如假结核病耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌)。细菌可以另外包括食酸菌属某些种(诸如燕麦噬酸菌)、气单胞菌属某些种(诸如嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌)、博德特菌属某些种(诸如百日咳博德特菌)、短根瘤菌属某些种(诸如大豆短根瘤菌和辽宁慢生根瘤菌)、伯霍尔德杆菌属某些种(诸如类鼻疽伯霍尔德杆菌)、Candidatus某些种、纤维弧菌属某些种、衣原体属某些种(诸如沙眼衣原体和肺炎衣原体)、Chlamydophilia某些种(诸如Chlamydophilia psittaci和Chlamydophilia pneumoniae)、色杆菌属某些种(诸如青紫色素杆菌)、柠檬酸杆菌属某些种(诸如Citrobacter rodentium)、Cupriavidus某些种、脱硫弧菌属某些种、Dickeya某些种、爱德华菌属某些种(诸如迟钝爱德华菌和鲶鱼爱德华菌)、欧文氏菌属某些种(诸如菊欧文氏菌)、埃希氏菌属某些种、Hahella某些种(诸如Hahella chejuensis)、Hamiltonella某些种(诸如Hamiltonella defensa)、泡沫花属某些种(诸如细胞内散沫花)、中间根瘤菌属某些种(诸如Mesorhizobium loti)、成团泛菌属某些种(诸如凝聚成团泛菌)、果胶杆菌属某些种(诸如Pectobacterium wasabiae)、发光细菌属某些种、发光杆菌属某些种(诸如Photorhabdus asymbiotic、Photorhabdus temperata和发冷光杆菌)、变形杆菌属某些种(诸如奇异变形杆菌)、普罗威登斯菌属某些种、假单胞菌属某些种(诸如铜绿假单孢菌、丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种和丁香假单胞菌丁香致病变种)、劳尔氏菌属某些种(诸如茄科劳尔氏菌)、根瘤菌属某些种、(诸如根瘤菌属菌株NGR234)、沙门菌属某些种(诸如鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌)、斯瓦尼菌属某些种、志贺菌属某些种(诸如弗氏志贺菌)、大豆根瘤菌属某些种(诸如快生大豆根瘤菌)、Sodalis某些种、弧菌属某些种(诸如霍乱弧菌和副溶血弧菌)和黄单胞菌属某些种(诸如野油菜黄单胞菌、Xanthomonas axonopodis、水稻黄单胞杆菌、褐色黄单胞菌褐色亚种、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、野油菜黄单胞菌柑橘致病变种、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种和野油菜黄单胞菌辣椒致病变种)。
根据本文所述的方法，并根据本领域技术人员的知识，可以评价所述试验的结果，以确定受测化合物是否会减少细菌毒力。在所述试验中表现出减少细菌毒力的活性的那些化合物，然后可以用作抗微生物化合物，例如如本文所述。
因此，本发明可以提供筛选化合物的减少细菌毒力的能力的方法，所述细菌包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种。所述方法包括：使所述细菌接触本文所述化合物，并检测下述的至少一项：(i)细菌的GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种的组分的变化，和(ii)宿主病理学的变化。
使用方法
在已经筛选所述化合物的减少毒力诱导的效力以后，可以测试表现出有效减少的那些类似物(也称作“活性化合物”)，用于降低与受试者(诸如植物或动物，包括人)有关的细菌的毒力。所述细菌可以是在受试者的表面上或在受试者内部或以其它方式与受试者相关。活性化合物可以用于治疗具有细菌感染的受试者的方法中。所述方法包括：给所述受试者施用有效量的包含所述化合物的组合物(参见实施例)。活性化合物也可以施用于表面上，以降低与表面有关的细菌的毒力。
因此，在一个实施方案中，本发明可以提供治疗受试者的方法，所述受试者具有与其有关的细菌，所述细菌包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种。所述方法包括：给所述受试者施用包含有效量的本文所述化合物的组合物。
在另一个实施方案中，本发明可以提供减少在表面上的细菌的毒力的方法，所述细菌包括具有GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和rsm-型***中的至少一种的细菌。所述方法包括：使所述表面接触包含有效量的本文所述化合物的组合物。
在另一个实施方案中，本发明可以提供一种药物组合物，其包含有效量的本文所述化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
应用于植物
所述活性化合物、含有所述活性化合物的组合物和使用它们的方法，可以与任意植物一起使用，所述植物包括具有与其有关的、适当的含有TCSTS的细菌的那些植物，所述细菌包括具有GacS/GacA-型***或HrpX/HrpY-型***的细菌。这些植物可以包括栽培的、驯化的或野生的植物，包括一年生作物和长期作物诸如树。农业上有关的一年生作物包括、但不限于：玉米、大豆、小麦、大麦、燕麦、水稻、高粱、黑麦、苜蓿、烟草和向日葵。所述化合物、组合物和方法可以用于陆生植物或水生植物上，包括淡水和海洋栖生植物。
就应用于植物而言，所述化合物可以配制在组合物中，诸如适合通过喷洒或或其它施用模式来施用的液体、粉尘、颗粒、油或固体(例如作为刺突)。所述组合物可以以浓缩形式生产，包括浓缩液、粉末、固体或其它形式，它们可以在使用前重构。
下述物质适合用作可行的制剂：可润湿的粉末(WP)，水溶性的粉末(SP)，可乳化的浓缩物(EC)，水性溶液或浓缩物，乳剂(EW)，可喷洒的溶液，胶囊悬浮液(CS)，基于油或水的分散系，悬乳剂，悬浮液浓缩物(SC)，扑粉(DP)，可以与油混合的溶液(OL)，拌种剂，采取微型颗粒、喷洒颗粒、包衣颗粒和吸附颗粒形式的颗粒(GR)，用于撒播和土壤施用的颗粒，水溶性的颗粒(SG)，水可分散的颗粒(WG)，ULV制剂，微胶囊和蜡类。
这些各个类型的制剂基本上是已知的，并参见例如：Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie[化学技术]”，第7卷，C.Hauser Verlag Munich，1986年第4版；van Valkenburg，“PesticidesFormulations”，Marcel Dekker N.Y.，1972-73年第2版；K.Martens，“SprayDrying Handbook”，1979年第3版，G.Goodwin Ltd.London
必要的配制助剂，如惰性材料、表面活性剂、溶剂及其它添加剂同样是已知的，并参见例如：Watkins，“Handbook of Insecticide Dust Diluentsand Carriers”，第2版，Darland Books，Caldwell N.J.；H.V.Olphen，“Introduction to Clay Colloid Chemistry”；第2版，J.Wiley & Sons，N.Y.，Marsden，“Solvents Guide”，第2版，Interscience，N.Y.1950；McCutcheon′s，“Detergents and Emulsifiers Annual”，MC Publ.Corp.，Ridgewood N.J.；Sisley和Wood，“Encyclopedia of Surface Active Agents”，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfeldt，“GrenzflachenaktiveAthylenoxidaddukte[Surface-active Ethylene Oxide Adducts]”，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；以及Winnacker-Kuchler，“ChemischeTechnologie[Chemical Technology]”，第7卷，C.Hauser Verlag Munich，1986年第4版。
基于这些制剂，也可以制备与其它活性物质(诸如除草剂、杀真菌剂或杀昆虫剂、以及肥料和/或生长调节剂)的组合，例如以预拌物的形式或作为罐混合物。
根据本发明的活性化合物组合可以是2种组分的混合制剂，然后用水稀释所述制剂并以常规方式施用，或者它们可以制备成所谓的罐混合物，这通过用水共同稀释分别配制的组分来实现。
可润湿的粉末是可均匀地分散在水中的制品，其除了含有活性化合物以外，还含有：润湿剂，例如聚乙氧基化的烷基酚类、聚乙氧基化的脂肪醇类、聚乙氧基化的脂肪胺类、烷磺酸酯类、烷基苯磺酸酯类，和分散剂，例如木质磺酸钠、2，2′-二萘基甲烷-6，6′-二磺酸钠、二丁基萘磺酸钠或油烯基甲基牛磺酸酯，以及稀释剂或惰性物质。
可以如下制备可乳化的浓缩物：将活性化合物溶解在有机溶剂中，所述有机溶剂诸如丁醇、环己酮、二甲基甲酰胺、二甲苯以及更高沸点的芳族化合物或烃，并添加一种或多种乳化剂。可以使用的乳化剂的实例是：烷芳基磺酸的钙盐(如十二烷基苯磺酸钙)，或非离子型乳化剂，如脂肪酸聚乙二醇酯、烷芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、环氧丙烷/环氧乙烷缩合产物、烷基聚醚、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨醇酯。
通过将活性化合物与精细粉碎的的固体物质一起研磨，得到撒布剂，所述固体物质例如滑石或天然粘土，诸如高岭土、皂粘土、叶蜡石或硅藻土。
可以如下生产颗粒：将活性物质喷洒在吸附性的粒状惰性物质上，或借助于粘合剂(如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠或矿物油)将活性物质浓缩物施用于载体(如砂、高岭石或粒状惰性物质)的表面上。也可以使用制造肥粒颗料的常规方法，将适宜的活性物质造粒，并视需要制成与肥料的混合物。
在一个实施方案中，在可润湿的粉末中的活性化合物的浓度可以是，例如，约10至约95重量％，达到100重量％的余量由常规制剂组分组成。在可乳化的浓缩物的情况下，活性化合物的浓度可以是约1至约85重量％、优选约5至约80重量％。粉剂形式的制剂通常含有约1至约25重量％、主要约5至约20重量％的活性化合物，可喷洒的溶液含有约0.2至约25重量％、优选约2至约20重量％的活性化合物。在颗粒(诸如水可分散的颗粒)的情况下，活性化合物含量部分地取决于所述活性化合物是液体还是固体，并取决于使用哪种造粒助剂和填充剂。在水可分散的颗粒中的含量通常是约10至约90重量％。
另外，所述活性化合物制剂含有适当的粘着剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、穿透剂、溶剂、填充剂或载体，它们每种都是常规的。
为了使用，在适当时可以以常规方式稀释以商购可得形式存在的制剂，例如，在可润湿的粉末、可乳化的浓缩物、分散系和水可分散的颗粒的情况下，用水稀释。粉剂、土壤用颗粒和/或撒布用颗粒和可喷洒的溶液形式的制剂通常在使用前不用其它惰性物质进一步稀释。
组合物所需的施用频率随外部条件而变化，例如，除了别的以外，温度、湿度和使用的化合物和组合物的性质。
关于农业用组合物的配制和使用的的其它信息，参见美国专利5,447,903，它通过引用并入本文。
所述组合物可以施用于植物的不同部分上，包括叶、茎、根、芽、果实、褶皱、残株、树皮和根，以及施用于植物附近的土壤(例如，根际)。施用方法可以包括：喷洒、灌溉、撒粉和撒布或撒播颗粒、粉末或其它固体或液体形式。
所述组合物可以施用于植物(包括农作物)的叶表面、茎上，并灌溉进土壤中，以保护根***免于人和其它病原体(包括，例如，在莴苣、菠菜上的大肠杆菌O157：H7)，所述病原体可能作为由暴露于动物废物而产生的污染物存在。
所述组合物可以施用于贮藏作物(包括但不限于洋葱、马铃薯、谷物、南瓜、甜瓜)的表面上，以减少植物、动物和人病原体的收获后感染和污染。
所述组合物可以施用于植物的叶表面、茎、果实和其它部分上，所述植物意图用于动物(包括人类)消费，不论用于新鲜消费，还是在烹饪或其它制备以后消费。所述组合物可以在不同阶段施用，包括：当植物还在土壤中时；收获后；和在运输之前、过程中或之后。所述组合物的施用可以减少植物、动物和人病原体的收获后感染和污染。
所述组合物可以施用一次或重复施用。可以每天、每周、每月或每年重复施用任意次数。根据需要，可以每天、每周、每月或每年重复施用约1至约100次。
施用包含活性化合物的组合物，可以降低与植物有关的细菌的毒力。
应用于包括人类在内的动物
通过任何方便的给药途径，可以将活性化合物或包括活性化合物的药物组合物施用给动物受试者，无论全身地/外周地，还是在希望的作用位置，包括、但不限于：口服的(例如，通过摄入)；局部的(包括例如，透皮、鼻内、眼睛、经颊和舌下)；肺的(例如，通过吸入或吹入疗法，其中使用例如气雾剂，例如经由嘴或鼻)；直肠；鞘；肠道外的，例如通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌肉内的、静脉内的、动脉内的、心内的、鞘内的、椎管内的、囊内的、囊下的、眶内的、腹膜内的、气管内的、表皮下的、关节内的、蛛网膜下的和胸骨内的；通过植入蓄池，例如，皮下地或肌肉内地。其它给药模式可以包括：将活性化合物和/或包含活性化合物的组合物加入食物或饮料(包括给动物工艺的水)中，以提供活性化合物作为动物饮食的一部分。
所述受试者可以包括、但不限于：真核生物、动物、脊椎动物、鸟、爬行动物、昆虫、哺乳动物、啮齿类动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、羊科动物(例如，绵羊)、牛科动物(例如，牛)、灵长类动物诸如猴(例如，绒猴、狒狒)、猿(大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或者人。
虽然活性化合物可以单独给药，在有些实施方案中，所述活性化合物可以作为药物组合物(例如，制剂)存在，所述组合物包括至少一种上述活性化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员已知的其它物质以及任选的其它治疗剂或预防剂。
因此，本发明另外提供了如上所述的药物组合物和制备药物组合物的方法，该方法包括：使至少一种上述的活性化合物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、佐剂、稳定剂或本文中描述的其它物质一起混合。
适当的载体、赋形剂等可以在标准的药学文献中找到。例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1990。
可以方便地以单位剂量形式提供制剂，而且可以以药学领域公知的任意方法制备制剂。这样的方法包括使活性化合物与作为一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，可以如下制备制剂：使活性化合物与液体载体或精细粉碎的固体载体或二者均匀地且密切地结合，之后如果必要的话，对产物进行成型。
制剂可以为液体、溶液、悬浮液、乳剂、酏剂、糖浆剂、片剂、锭剂、颗粒、粉末、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿、栓剂、***栓剂、软膏剂、凝胶、糊剂、乳膏剂、喷雾剂、合剂、泡沫、洗剂、油、大丸药、药糖剂或气雾剂的形式。
适于口服给药(例如，通过摄入)的制剂可以为不连续的单元，诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个单元含有预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；作为大丸剂；作为药糖剂；或作为糊剂。
通过常规方式，例如压制或模塑，可以制备片剂，其任选地使用一种或多种助剂。可以如下制备压制的片剂：在适当的机器中压制自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性化合物，其任选地与一种或多种下述物质混合：粘合剂(例如，聚维酮、明胶、***胶、山梨醇、黄蓍胶、羟丙甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如，乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠、交联的聚维酮、交联的羧甲基纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸)。通过在适当的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物，可以制得模塑的片剂。片剂可以任选地具有包衣或带有刻痕，而且可以配制成缓慢地或受控地释放其中的活性化合物，例如，使用不同比例的羟丙甲基纤维素，以提供希望的释放特性。片剂可以任选地带有肠溶衣，以提供在非胃的肠道部分中释放。
适于局部给药的制剂(例如，透皮的、鼻内的、眼睛的、经颊的和舌下)可以制成软膏剂、乳膏剂、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。或者，制剂可以包括贴剂或敷料，例如浸渍了活性化合物和任选的一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或或粘着硬膏剂。另外，可以将制剂加入常规绷带中，例如加入接触伤口的纱布部分中，作为抗微生物剂。
适于由嘴局部给药的制剂包括：锭剂，其包含混在调味基质中的活性化合物，所述基质通常为蔗糖和***胶或黄蓍胶；软锭剂，其包含混在惰性基质中的活性化合物，所述基质诸如明胶和甘油或蔗糖和***胶；和漱口液，其包含在合适的液体载体中的活性化合物。
适于眼睛局部给药的制剂也包括滴眼液，其中将活性化合物溶解或悬浮在适当的载体中，尤其是活性化合物的水性溶剂。
适于鼻部给药(其中载体为固体)的制剂包括粒度在例如约20至约500微米范围内的粗粉末，其采用吸入方式给药，即将装有粉末的容器接近鼻部，将粉末从所述容器迅速吸过鼻腔。当其中的载体为液体时，适合作为例如鼻喷雾剂、滴鼻液或借助喷雾器以气雾剂形式给药的制剂包括活性化合物的水性或油性溶液。
适于吸入给药的制剂包括，使用适当的推进剂而从压力盒中喷出的那些气雾剂制剂，所述推进剂例如为二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。
适于通过皮肤局部给药的制剂包括软膏剂、乳膏剂和乳剂。当制成软膏剂时，活性化合物可以任选地与石蜡族的或水可混溶的软膏剂基质一起使用。或者，活性化合物可以与水包油乳膏剂基质一起制成乳膏剂。如果需要的话，乳膏剂基质的水相中可以包括，例如，至少约30％w/w的多元醇，即，具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。所述局部制剂可以根据希望包括特定化合物，所述化合物会增强所述活性化合物的穿过皮肤或其它患病区域的吸收或渗透。这种皮肤穿透促进剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。
当配制成局部用乳液时，油相可以任选地仅包括乳化剂(还已知为利泄药)，或者它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或者与脂肪和油二者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与用作稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。还优选地包括油和脂肪二者。总的来说，带有或者不带有稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化蜡，该蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏剂基质，其形成乳膏剂制剂的油状分散相。
适当的利泄药和乳剂稳定剂包括吐温60、Span 80、十六醇十八醇混合物、十四烷醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。用于制剂的适当的油或脂肪的选择是基于实现希望的美容性质，因为活性化合物在大部分可能用于药用乳剂制剂的油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏剂应该优选为非脂性的、非着色的和可洗的产品，并具有适当的稠度以避免从管或其它容器中泄漏。可以使用直链或支链、一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯、硬脂酸异鲸蜡酯、可可脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸-2-乙基己酯，或者可以使用称作Crodamol CAP的支链酯的混合物，最后三种物质为优选的酯。取决于要求的性质，这些物质可以单独地或者联合地使用。或者，可以使用高熔点的脂类，例如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。
适于直肠给药的制剂可以为具有适当基质的栓剂，所述基质包括例如，可可脂或水杨酸酯。
适于***给药的制剂可以为***栓剂、止血垫、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其除了含有活性化合物之外，还含有本领域已知适当的载体。
适于肠道外给药(例如通过注射，包括经皮肤、皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)的制剂包括：水性的和非水性的、等渗的、无热原的、无菌注射液，其除了含有活性化合物以外，还可以含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和溶质，所述溶质使所述制剂与目标受体的血液等渗；水性的和非水性的无菌悬浮液，其可以包括助悬剂和增稠剂，和设计成使化合物靶向血液组分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒体系。用于这种制剂中的适当的等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸盐化的林格氏注射液。通常，溶液中的活性化合物的浓度为约1ng/ml至约1μg/ml，尽管其它浓度是可能的，且被包括在本发明内。制剂可以存在于单位剂量或多次剂量的密封容器(例如，安瓿和管形瓶)中，并且可以保存在冻干(低压冻干)条件下，只需在即将使用之前加入无菌的液体载体，例如注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以由无菌的粉末、颗粒和片剂制得。制剂可以为脂质体或其它微粒体系的形式，它们被设计成使活性化合物靶向血液组分或一个或多个器官。
应该理解，活性化合物和含有活性化合物的组合物的适当剂量可以随病人不同而不同。最佳剂量的确定通常包括：使治疗益处的水平相对于本发明治疗的任何风险或有害副作用平衡。所选的剂量水平取决于多种因素，包括、但不限于：特定化合物的活性、给药途径、给药时间、化合物的***速率、治疗持续时间、联合使用的其它药物、化合物和/或物质，以及患者的年龄、性别、体重、病症、健康状况和之前的医疗史。化合物的量和给药途径最终由医师决定，虽然通常剂量是达到作用位置处的局部浓度，该浓度可以获得希望的效果，但不会造成实质的有害的或有毒的副作用。
体内给药可以在一剂中、在整个疗程中连续地或间歇地实现(例如，以适当的间隔，在分份剂量中)。确定最有效的给药方式和剂量的方法，是本领域技术人员众所周知的，而且可以根据治疗所用的制剂、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受体而变化。可以进行单次或多次给药，剂量水平和模式由治疗医师选择。
一般而言，活性化合物的适当剂量是在约100μg至约250mg/kg受试者体重/天的范围内。在活性化合物为盐、酯、前药等的情况下，基于母体化合物来计算给药量，因此要用的实际重量按比例地增加。
关于药物组合物的配制和使用药物组合物的治疗的其它信息，参见美国专利7,196,085，它通过引用并入本文。
所述组合物可以施用一次、连续施用(例如通过静脉内滴注)或周期地/间歇地施用，包括约每1小时1次、约每2小时1次、约每4小时1次、约每8小时1次、约每12小时1次、约每1天时1次、约每2天1次、约每3天1次、约每周2次、约每周1次和约每月1次。可以施用所述组合物，直到实现希望的征状减轻，这可以视作细菌毒力已经降低的指征。
使用活性化合物或包含活性化合物的组合物治疗动物受试者，可以降低与动物受试者有关的细菌的毒力。
应用于表面上
在一个实施方案中，所述活性化合物可以施用于表面上，以降低在表面上的细菌的毒力。所述活性化合物可以配制在组合物中，所述组合物适合施用于表面上，包括作为凝胶、粉末、液体、浓缩物、喷雾剂或本领域技术人员已知的其它合适的组合物。
所述组合物可以施用于在住宅场所、商业场所、医疗场所、工业场所、农业场所和其它场所中的表面上，以降低与表面有关的细菌的毒力。所述组合物可以施用于包括但不限于下述场所的表面上：浴室；厨房和其它食物储存区或制备区；医疗设施，包括手术室和病房；洗衣房设施，包括洗烫过的物品；饭店设施，包括厨房和食物储存区；冰箱和冷柜；洗碗盘设施；工厂；屠宰场所；和食品商店。所述活性化合物可以掺入包装(例如用于医疗物品或食品)中或施用于包装上，以降低与其有关的细菌的毒力。
在一个实施方案中，所述活性化合物和/或包含所述活性化合物的组合物可以用于减少或抑制在医疗设备、工业设备和其它设备中的生物膜形成，其中生物膜被定义为微生物在固体基质上的聚集。所述活性化合物可以施用于设备(包括导管和管道)的外表面和内表面，以减少或抑制细菌毒力和生物膜形成。
所述组合物可以喷、撒、铺、擦、涂、拭、浸或以其它方式施用于表面上。所述组合物可以施用一次，或可以周期地重复。周期施用可以是每天、每周、每月或每年约1至约100次，视需要而定。
将包含活性化合物的组合物施用于表面，可以降低在表面上或与表面有关的细菌的毒力。
下述非限制性实例意图是纯粹示例性的，并证实根据本发明的实施方案实现的具体实验。
实施例
下述方法适用于实施例1-3：
细菌株、质粒、培养基和化学试剂
在表1中，列出了在该研究中使用的细菌株和质粒。在LB培养基中在37℃培养大肠杆菌，并在hrp-诱导基本培养基(MM)中在28℃培养菊欧文氏菌。使用的抗生素(μg/ml)是：氨苄西林，100；氯霉素，50；卡那霉素，50；壮观霉素，50。在表1中，也列出了在该报告中的聚合酶链式反应(PCR)所用的引物。在该研究中，使用大白菜(在杂货店购买)和非洲紫堇，它们没有病原体感染的可见征状。
表1.在该研究中使用的菌株、质粒和DNA引物
Figure BDA00002255629900521
aApR，氨苄西林抗性；CmR，氯霉素抗性；KmR，卡那霉素抗性；SpR，壮观霉素抗性。
Hugouvieux-Cotte-Pattat，N.，Condemine，G.，Nasser，W.，和Reverchon，S.(1996)Regulation of pectinolysisin Erwinia chrysanthemi.Annu Rev Microbiol50：213-257.
Miller，W.G.，Leveau，J.H.J.，和Lindow，S.E.(2000)Improved gfp and inaZ b road-host-rangep romoter-probe vectors.Mol Plant-Microbe Interact 13：1243-1250.
Miller，W.G.，和Lindow，S.E.(1997)An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotictranscriptional fusions.Gene191：149-153.
Peng，Q.，Yang，S.，Charkowski，A.O.，Yap，M.N.，Steeber，D.A.，Keen，N.T.，和Yang，C.H.(2006)Populationbehavior analysis of dspE and pelD regulation in Erwinia chrysanthemi 3937.Mol Plant-Microbe Interact 19：451-457.
Yang，S.，Q.Peng，Q.Zhang，X.Yi，C.J.Choi，R.M.Reedy，A.O.Charkowski，和C.-H.Yang.2008.Dynamic regulation of GacA in type III secretion system，pectinase gene expression，pellicle formation，and
Figure BDA00002255629900531
pathogenicity of Dickeya dadantii.Mol. Plant-MicrobeInteract.21：133-142.
Yang，S.，Zhang，Q.，Guo，J.，Charkowski，A.O.，Glick，B.R.，Ibekwe，A.M.等人(2007)Global effect ofIndole-3-acetic acid(IAA)biosynthesis on multiple virulence factors of Erwinia chrysanthemi 3937.Appl EnvironMicrobiol 73：1079-1088.
Yang，S.，Perna，N.T.，Cooksey，D.A.，Okinaka，Y.，Lindow，S.E.，Ibekwe，A.M.等人(2004)Genome-wideidentification of plant-upregulated genes of Erwinia chrysanthemi 3937 using a GFP-based IVET leaf array.MolPlant-MicrobeInteract 17：999-1008.
Yap，M.N.，Yang，C.H.，Barak，J.D.，Jahn，C.E.，和Charkowski，A.O.(2005)The Erwinia chrysanthemi typeIII secretion system is required for multicellular behavior.J Bacteriol 187：639-648.
FACS分析
如(Peng等人，2006)所述，进行dspE、hrpA、hrpL、hrpN和hrpS的启动子活性的FACS分析。简而言之，在LB培养基上在28℃培养野生型Ech3937和携带启动子报告质粒的突变株过夜，并转移至适当的培养基。为了FACS分析，通过离心，收集样品，用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)在13,000rpm洗涤1min，并重新悬浮于1X PBS-ca 106CFU/ml中，然后上FACSCalibur流式细胞计(BD Biosciences，CA)。对于每种处理，执行3个副本。
qRT-PCR分析
在MM中培养细菌株。如(Peng等人，2006)所述，使用TRI试剂方法(Sigma，MO)，从细菌细胞中分离出总RNA，并用Turbo无DNA的DNA酶试剂盒(Ambion，TX)进行处理。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，CA)，从0.5μg处理过的总RNA合成cDNA。使用Real Master Mix(Eppendorf，Westbury，NY)进行qRT-PCR反应，以定量不同样品中的靶基因的cDNA水平。使用rplU作为内源对照进行数据分析。使用文献描述的相对表达软件工具(Relative Expression Software Tool)(Pfaffl，M.W.，Horgan，G.W.，和Dempfle，L.(2002)Relative expression software tool(REST)for group-wise comparison and statistical analysis of relativeexpression results in real-time PCR.Nucleic Acids Res30：e36.)，分析qRT-PCR数据。
实施例1：植物酚类化合物诱导的T3SS基因表达
在Ech3937中的植物增量调节的基因的筛选已经证实，dspE和hrpA在植物中表达。在该研究中，进一步对比了培养于营养物富集的LB培养基、营养物限制的培养基(MM)和补充了大白菜汁(10％V/V)的MM中的细菌细胞中的Ech3937的dspE的表达。为此目的，使用GFP报告质粒pdspE(pPROBE-AT衍生物，其具有含有dspE启动子区的PCR片段)，并通过流式细胞术对比了在不同条件下培养的细胞。与培养于LB中的细菌细胞相比，在培养于MM中的Ech3937(pdspE)(携带质粒pdspE的Ech3937细胞)中观察到更高的总GFP强度(表2)。与培养于单独的LB中的细菌细胞相比，在补充了大白菜汁的MM中进一步诱导了dspE的表达。另外，在培养于MM和补充了大白菜的MM中的、携带pdspE的hrpL突变体Ech131中，观察到dspE的低启动子活性(表2)，这提示，HrpL是在诱导条件下表达dspE所必需的。
表2.在LB、MM和含有大白菜汁(10％V/V)的MM(MMJ)中培养的菊欧文氏菌3937(Ech3937)和hrpL突变体Ech131的dspE的表达
Figure BDA00002255629900551
a在LB、MM和补充了植物汁的MM中培养12h以后，对比野生型Ech3937和hrpL突变体Ech131中的dspE启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。
b值(平均荧光强度)是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值是具有标准差的平均值。
植物汁诱导Ech3937的T3SS基因的表达，这提示，在植物组织中存在活化T3SS调节子的化合物。酚类化合物构成由植物生产的有机物的重要类别。酚类化合物SA是在宿主防御中起作用的信号传递分子。OCA和TCA是SA的生物合成前体，且据报道还会诱导植物中的防御相关基因的表达。检查了OCA、TCA和SA，以阐明它们对T3SS基因表达的影响。分别在MM和补充了浓度为0.05、0.1和0.2mM的OCA、TCA和SA的MM中，检查了T3SS基因hrpN的表达。图2A和2B显示了在接种后12h(图2A)和24h(图2B)，在MM和补充了0.05、0.1和0.2mM的OCA、TCA和SA的MM中培养的菊欧文氏菌3937(Ech3937)中的hrpN的启动子活性。通过流式细胞术在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度，并使用Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。记录在补充了不同浓度的OCA、TCA和SA的MM中的Ech3937生长。与单独的MM相比，当将0.05mM的OCA和TCA加入培养基中时，Ech3937(phrpN)的细菌细胞的平均GFP荧光强度增加了大约4倍(图2A、2B)。SA的添加没有导致Ech3937的GFP荧光强度增加(图2A、2B)。当将OCA、TCA和SA加入MM中时，没有观察到细菌生长的减少(图2A、2B)。
酚类化合物叔肉桂酸(TCA)在健康马铃薯叶中的浓度是大约0.5μM，并且在暴露于胡萝卜软腐欧文氏菌(E.c.carotovora)的无细胞培养物滤液(CF)以后，在叶中的水平可以升高至大约10uM。为了研究植物中的酚类化合物的水平是否能够诱导T3SS基因的表达，使用与在植物中发现的水平相当的TCA浓度，检查了hrpN的表达。分别在补充了0.2、0.5、5和10μM的TCA的MM中，培养Ech3937(phrpN)。与在单独的MM中的Ech3937(phrpN)相比，在培养于补充了0.2和0.5μM TCA的MM中的细菌细胞中，观察到GFP强度的1.5-1.8倍增加(表3)。与在MM中的Ech3937(phrpN)相比，在培养于补充了5和10μM的TCA的MM中的细菌细胞中，观察到GFP强度的3-3.5倍增加(表2)。
表3.分别在MM和补充了不同量的TCA和sA的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的hrpN的表达.
a单独的基本培养基(MM)和补充了不同浓度的叔肉桂酸(TCA)或水杨酸(SA)的MM。
b在培养基中培养12和24h时，测量hrpN的启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。在该实验中使用3个副本。所述值(平均荧光强度)表示为3个副本的平均值和标准差。
由于OCA和TCA会诱导hrpN的表达，进一步研究了这2种酚类化合物对hrpA、hrpL和hrpS的表达的影响。图3显示了在培养12h以后，在培养于MM和补充了0.1mM OCA的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)和hrpL突变体WPP96中的hrpA、hrpN、hrpL和hrpS的启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度，并用Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。标注“1”的线代表含有pPROBE-AT载体的Ech3937的GFP表达对照基础水平；标注“2”的线代表在MM中的Ech3937中的hrpS、hrpL、hrpA和hrpN的启动子活性；标注“3”的线代表在补充了0.1mM OCA的MM中的Ech3937的启动子活性；标注“4”的线代表在MM中的hrpL突变体WPP96的启动子活性；标注“5”的线代表在补充了0.1mM OCA的MM中的hrpL突变体WPP96的启动子活性。值是至少2个实验的代表。在该实验中使用3个生物学副本，它们具有类似的结果，并将一个副本用于叠加显示。与单独的MM相比，当将0.1mM的OCA和TCA加入培养基中时，Ech3937(phrpA)的细菌细胞的平均GFP荧光强度倍增(表4；图3)。与单独的MM相比，在分别补充了OCA和TCA的MM中培养的Ech3937(hrpL)中，观察到hrpL的稍微更高的启动子活性。与单独的MM相比，当在补充了OCA和TCA的MM中培养细菌细胞时，观察到Ech3937(phrpS)的稍微更低的GFP强度(表4；图3)。在该研究中，使用mrp(其蛋白产物具有ATP酶保守结构域(2e-06))作为参照基因。当分别在MM和补充了0.1mM OCA和TCA的MM中培养细菌细胞时，在Ech3937(pmrp)中观察到稍微更高的mrp表达(表4)。
表4.在MM、补充了0.1mMoCA的MM(MMOCA)和补充了0.1mMTCA的MM(MMTCA)中，菊欧文氏菌3937(Ech3937)和hrpL突变体WPP96的hrpA、hrpN、hrpL、hrpS和mrp的表达
a在培养基中培养12h时，对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。
b值(平均荧光强度)是3个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差。
为了证实表明植物酚类化合物的T3SS诱导的FACS结果，通过qRT-PCR，检查了在MM和补充了OCA的MM中培养的Ech3937的hrpY、hrpS、hrpL、dspE和hrpA的相对mRNA水平。与单独的MM相比，在补充了OCA的Ech3937中观察到显著更高量的dspE和hrpA mRNA(图4)。尽管在补充了OCA的MM中培养的Ech3937(phrpL)中仅观察到hrpL启动子活性的轻微增加(表4)，在培养12h时，与在单独的MM中培养的那些相比(P＜0.01)，补充了0.1mM OCA的Ech3937培养物生产多约3倍的hrpL mRNA(图4)。在该实验中使用3个副本。使用文献描述的相对表达软件工具Pfaffl.等人(2002)，计算p-值。在MM和补充了OCA的MM中培养的Ech3937细胞之间，没有发现基因hrpY、hrpS和gacA的显著差异(p＞0.5)但是在MM和补充了0.1mM OCA的MM之间，hrpL、dspE、hrpA和rsmB的基因表达是显著不同的(p＜0.003)(图4)。
实施例2：负责OCA和TCA诱导的调节剂
在iaaM突变体Ech138中，T3SS基因dspE、hrpA和hrpN的表达减少；iaaM编码在吲哚-3-乙酸(IAA)生物合成途径中的酶。为了研究IAA生物合成是否参与T3SS的OCA诱导，在加入OCA的情况下，对比了野生型Ech3937和Ech138中的hrpN的表达。如预期的，在iaaM突变体背景下，hrpN的表达减少。但是，在细菌生长的每个时间点，在野生型Ech3937和Ech138中观察到OCA对hrpN的类似诱导比(表5)。这些结果提示，OCA不会通过IAA生物合成来活化T3SS表达。
表5.在MM和补充了0.1mM OCA的MM(MMOCA)中菊欧文氏菌3937(Ech3937)和iaaM突变体Ech138的hrpN的表达，以及在MM和补充了0.1mM OCA的MM(MMOCA)中Ech-Rif和gacA突变体Ech137的hrpA的表达
Figure BDA00002255629900581
a在细菌生长6、12和24h时，对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。
b值(平均荧光强度)是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差(SD)。
Ech3937gacA在调节T3SS基因的表达(通过hrpL的转录后调节，通过Gac-Rsm调节途径)中起作用(Yang，S.，Q.Peng，Q.Zhang，X.Yi，C.J.Choi，R.M.Reedy，A.O.Charkowski，和C.-H.Yang.2008.Dynamicregulation of GacA in type III secretion system，pectinase gene expression，pellicle formation，and pathogenicity of Dickeya dadantii.Mol.Plant-Microbe Interact.21：133-142)。为了研究OCA是否通过Gac-Rsm调节途径影响T3SS基因表达，在分别培养于MM和补充了OCA的MM中的野生型Ech-Rif(phrpA)和gacA突变体Ech137(phrpA)中，对比了hrpA的表达。与在单独的MM中培养的Ech-Rif(phrpA)相比，在补充了OCA的MM中培养的细菌细胞中，观察到更高的GFP强度。但是，在培养于MM和补充了OCA的MM中的Ech137(phrpA)细胞中，观察到类似的GFP强度，这提示，OCA可以通过Gac-Rsm途径诱导T3SS基因表达(表5)。为了进一步证实OCA对T3SS的影响是通过Gac-Rsm***，通过qRT-PCR，检查了gacA和rsmB的表达。结果证实，与在单独的MM中的Ech3937(标准化的-1)相比，在培养于补充了OCA的MM中的细菌中，观察到显著更高的rsmBmRNA(相对表达比1.4，P＝0.003)(图4)。还检查了TCA对Ech3937的rsmB的mRNA水平的影响。与在单独的MM中生长的Ech3937(标准化的-1)相比，在培养于TCA中的Ech3937中，观察到显著更高量的rsmB mRNA(1.58，P＝0.05)。但是，在培养于MM和补充了OCA的MM中的Ech3937中，没有观察到gacA mRNA的水平的显著差异(图4)。
HrpL似乎参与酚酸OCA和TCA对T3SS基因表达的诱导，因为在hrpL突变体背景下，OCA或TCA的添加没有诱导T3SS基因表达(hrpA和hrpN)(表4)。鉴于通过HrpX/Y-HrpS-HrpL来调节T3SS基因，在分别缺少hrpX、hrpY和hrpS的情况下进行实验来研究OCA和TCA是否能够诱导T3SS基因的表达。测量了分别在MM和补充了OCA和TCA的MM中培养的野生型Ech3937和携带phrpN的hrpX、hrpY和hrpS突变体的GFP强度(图5)。图5显示了在MM、补充了0.1mM OCA的MM(MMOCA)和补充了0.1mM TCA的MM  (MMTCA)中，菊欧文氏菌3937(Ech3937)、hrpS突变体WPP90、hrpX突变体WPP67、hrp Y突变体WPP92中的hrpN的表达水平。Ech3937(pAT)是含有pPROBE-AT载体的野生型。在培养基中培养12h时，对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。值(平均荧光强度；MFI)是3个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差(SD)。结果表明，OCA和TCA在Ech3937中会诱导hrpN的表达，但是在hrpX、hrpY和hrpS突变体中却不会(图5)。
实施例3：T3SS调节子的自调节
与Ech3937相比，在携带phrpS和phrpL的hrpL突变体WPP96细胞中观察到更高的GFP强度，这提示，HrpL会负调节hrpL和它的上游hrpS的表达(表4；图3)。为了进一步证实基于GFP的FACS试验的结果(其证实了HrpL的自调节)，通过qRT-PCR，检查了在培养于MM中的Ech3937和hrpL突变体Ech131中的hrpS的相对mRNA水平。与Ech3937相比，在MM中培养6h时，在Ech131中观察到4倍更高水平的hrpS mRNA(相对表达比5.1，P＝0.002)。这些结果提示，在细菌中发生HrpL对hrpL自身和hrpS的反馈抑制。分别在Ech3937和携带phrpS、phrpX和phrpY的hrpS突变体中，观察到类似的GFP强度，这提示，HrpS不会调节hrpS、hrpX和hrpY的表达。最后，分别在Ech3937和携带phrpX和phrpY的hrpY突变体中，观察到类似的GFP强度，这提示，HrpY不能调节hrpX和hrpY的表达。
实施例4-9
下述方法适用于实施例4-9：
细菌株、质粒和培养基
在表6中，列出了在该组试验中使用的细菌株和质粒。在-80℃在15％甘油中保藏野生型Ech-Rif和它的突变株，并在Luria-Bertani(LB)培养基(Sambrook，J.，和Russell，D.W.2001.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，U.S.A.)和MM培养基(Yang等人2007)中培养。以下述浓度，将抗生素加入培养基中：卡那霉素，50μg/ml；利福平，100μg/ml；氨苄西林，100μg/ml；和壮观霉素，50μg/ml。通过文献所述的交换PCR诱变方案(Yang，C.H.，Gavilanes-Ruiz，M.，Okinaka，Y.，Vedel，R.，Berthuy，I.，Boccara，M.，Chen，J.W.，Perna，N.T.，和Keen，N.T.2002.hrp genes of Erwinia chrysanthemi3937 are important virulence factors.Mol.Plant-Microbe Interact.15：472-480)，构建gacA删除突变体；使用的引物是：gacA_A，5′GCA CCCGAT TGC CTG TAC TTA3′(SEQ ID NO：19)；gacA_B，5′GCA CCA GTTCAT GGT CAT CAA C3′(SEQ ID NO：20)；gacA_C，5′CGG AGA CATTGA TTA GTA GTG A3′(SEQ ID NO：21)；和gacA_D，ATT GGG AAACGG GCC GAA GT(SEQ ID NO：22)。
GFP报告质粒构建
如以前所述(Peng等人2006)，构建克隆进报告质粒pPROBE-AT中的dspE和pelD的GFP启动子区(Leveau，J.H.，和Lindow，S.E.2001.Predictive and interpretive simulation of green fluorescent proteinexpression in reporter bacteria.J.Bacteriol.183：6752-6762)。从Ech3937染色体DNA，PCR扩增hrpA、hrpN、hrpL和pelL的启动子区的DNA片段，并连接进pCR2.1-TOPO TA克隆载体***(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中。在该研究中为pelL启动子使用的引物对是：PpelL_F，5′ATGCGG TAA TGC GGG GAT3′(SEQ ID NO：23)和PpelL_R，5′GGC CAGAAC TGA TGT ACT GT3′(SEQ ID NO：24)，其产生Ech-Rif的609碱基对pelL启动子区序列。将***的DNA进一步亚克隆进启动子-探针载体pPROBE-AT的XbaI/SacI位点中(表6)。使用引物集合gacAco_F，5′GCCAAT GTT TCG GGT GTA G3′(SEQ ID NO：25)和gacAco_R，5′CAT CGATCT GCC GGA TAC TTT3′(SEQ ID NO：26)，还构建了质粒pCLgacA，其含有质粒pCL1920中的全长gacA。
与基于FACS的方案相组合的GFP报告物已经被用于在单细胞水平评价几种细菌中的基因活性。因为在pPROBE-AT中的gfp基因含有它自己的核糖体结合位点，当将Ech3937的含有启动子的DNA区域克隆进报道载体中时，gfp mRNA的稳定性不会受到RsmA的干扰。
启动子活性的FACS研究
用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(每升含有8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，pH7.2-7.4)，洗涤携带GFP报告质粒构建体的Ech-Rif和Ech137的细菌细胞3次，并稀释至大约106CFU/ml，然后分析。基于前向和侧向光散射性质，鉴别细菌细胞，并电子门控地进行分析。通过FACS(Becton Dickinson，San Jose，CA，U.S.A.)，测定启动子活性，并使用Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.A.)，分析流式细胞术结果。
实时pCR分析
在使用葡萄糖作为碳源的MM中(Yang等人2007)，培养野生型Ech-Rif和gacA突变体Ech137。使用TRI试剂方法(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，从细菌分离出总RNA，并用Turbo无DNA的DNA酶试剂盒(Ambion，Austin，TX，U.S.A.)进行处理。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，U.S.A.)，从0.5μg处理过的总RNA合成cDNA。使用Real Master Mix(Eppendorf，Westbury，NY，U.S.A.)进行实时PCR反应，以定量不同样品中的hrpL、rsmA、rsmB、rsmC和rplU的cDNA水平。使用rplU作为内源对照进行数据分析。在该研究中使用的引物对是：就rplU而言，RplUsF，5′GCG GCA AAA TCA AGG CTG AAGTCG 3′(SEQ ID NO：27)，和RplUsR，5′CGG TGG CCA GCC TGC TTACGG TAG 3′(SEQ ID NO：28)；就hrpL而言，HrpLsF，5′GAT GAT GCTGCT GGA TGC CGA TGT 3′(SEQ ID NO：29)，和HrpLsR，5′TGC ATCAAC AGC CTG GCG GAG ATA 3′(SEQ ID NO：30)；就rsmA而言，rsmAf，5′TTT TGA CTC GTC GAG TTG GCG AAA 3′(SEQ ID NO：31)，和rsmAr，5′GCG CGT TAA CAC CGA TAC GAA CCT 3′(SEQ IDNO：32)；就rsmB而言，rsmBf， 5′AGA GGG ATC GCC AGC AAG GATTGT 3′(SEQ ID NO：33)，和rsmBr，5′CGT TTG CAG CAG TCC CGCTAC C 3′(SEQ ID NO：34)；就rsmC而言，rsmCf，5′ACG AAG TGC TCCCGG TTA ATG TCC 3′(SEQ ID NO：35)，和rsmC r，5′ACG AGA GCGTAC TGA GCG GCT TTT 3′(SEQ ID NO：36)。进行反应，通过Opticon2***(Bio-Rad)收集数据。使用文献描述的相对表达软件工具(Pfaffl等人，2002)，分析实时PCR数据。
菌膜形成和胞外酶生产
就菌膜形成试验而言，如文献所述(Yap等人2005)，在SOBG培养液中在28℃培养细菌株。由于菌膜在Ech137中的缓慢形成，使用来自Ech-Rif和Ech137的10天龄菌膜进行SEM观察。在含有2％戊二醛的PBS缓冲液(pH7.0)中固定菌膜样品2h，并在含有1％四氧化锇的相同缓冲液中后固定1h。在分级系列乙醇中脱水以后，用聚乙二醇(PEG)浸润样本。使用超薄切片机，切割菌膜的横断面。然后，通过在温热的乙醇中浸泡几次，从所述块萃取PEG。在临界点干燥以后，将样本固定在用Duco粘固剂包被的残段(stub)上、用金包被的sputter，并用Hitachi S-570扫描电子显微镜检查。
如文献所述(Matsumoto，H.，Muroi，H.，Umehara，M.，Yoshitake，Y.，和Tsuyumu，S.2003.Peh production，flagellum synthesis，and virulencereduced in Erwinia carotovora subsp.carotovora by mutation in ahomologue of cytR.Mol.Plant-Microbe Interact.16：389-397)，进行Pel、Cel和Prt的活性的平板试验以及Ech-Rif、Ech137和补足菌株Ech137(pCLgacA)的Pel活性的分光光度计测量试验。对于每种处理，执行3个生物学副本。
毒力试验、生长动力学和在植物内(in planta)Pel生产
如文献所述(Yang等人2004；Yang，C.H.，Gavilanes-Ruiz，M.，Okinaka，Y.，Vedel，R.，Berthuy，I.，Boccara，M.，Chen，J.W.，Perna，N.T.，和Keen，N.T.2002.hrp genes of Erwinia chrysanthemi3937 are importantvirulence factors.Mol.Plant-Microbe Interact.15：472-480)，进行局部叶浸渍试验。简而言之，在相同叶的每个对称侧的中央，使用大约50μl细菌悬浮液(106CFU/ml)，用注射器浸润野生型细菌细胞和gacA突变体Ech137细胞。使用磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.4)来悬浮细菌细胞。接种3个副本植物，共至少12片叶子。在***性侵入试验中，如文献所述(Franza，T.，Sauvage，C.，和Expert，D.1999.Iron regulation and pathogenicity inErwinia chrysanthemi 3937：Role of the fur repressor protein.Mol.Plant-MicrobeInteract.12：119-128)，稍作修改，评价细菌的致病性。将50μl体积的细菌悬浮液(在600nm的光密度为0.01)接种进非洲紫堇叶的前缘。对于每个细菌株，接种12株植物。将接种的植物保持在28℃、95％相对湿度、16h光照期的生长室中。当至少一片叶和它的叶柄被浸渍时，认为由非洲紫堇植物中的细菌株诱导的征状的发展是***性的。每天对征状的进展评分，持续12天。
如文献所述(Yang等人2002)，在African violet cv.Gauguin中进行在植物内的生长动力学。简而言之，使用大约50μl细菌悬浮液(106CFU/ml)，用1-ml注射器浸润叶子。在浸润后在不同的时间间隔收获在浸渍区周围的叶盘(4mm直径)，并置于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。通过将叶提取物的系列稀释物铺板在LB琼脂平板上，测定细菌浓度(CFU/cm2)。使用分光光度计测量试验，监测在植物内生长期间的Ech-Rif和Ech137的Pel生产。将10-μl来自非洲紫堇叶(其接种了所述细菌)的植物汁的上清液加入990μl Pel反应缓冲液中，并使用分光光度计测量试验(Matsumoto等人2003)，定量Pel生产。Pel生产是在230nm单位的光密度与细菌浓度单位对数之比(U/log[CFU/cm2])。在植物内Pel生产和细菌生长动力学试验的每个取样时间，使用3个副本植物，共6片叶子/植物。
实施例4：GacA影响生物膜-菌膜形成
Ech3937能够在SOBG培养液中形成生物膜和菌膜。在该研究中，使用Ech3937的自发的利福平抗性的衍生物Ech-Rif作为野生型(表6)。构建了Ech-Rif的gacA删除突变体Ech137，并通过DNA测序分析进行确认。Ech137的gacA基因被删除，仅保留20碱基对的gacA开放读码框。在M9基本培养基(MM)中，没有观察到Ech-Rif和gacA突变体Ech137之间的显著生长差异。在SOBG培养液中在28℃培养2天时，Ech-Rif形成生物膜-菌膜。但是，在SOBG培养液中培养3天之前，没有在Ech137中观察到可见的生物膜-菌膜。当用低拷贝数质粒pCLgacA补足Ech137时，所述突变体的这种延迟的生物膜-菌膜形成表型可以几乎恢复至野生型水平(图6A)。使用超薄切片机，切开Ech-Rif和Ech137的菌膜，并使用扫描电子显微镜，对比细菌的菌膜的内部结构。与Ech137相比，在Ech-Rif中观察到10天龄菌膜中的更致密的结构(图6B)。用纤维素处理过的Ech-Rif和Ech137的菌膜分解，这提示，在Ech137中的主要组分纤维素没有改变。
图6A显示了在SOBG培养液中的生物膜和菌膜形成(Yap等人2005)。图6A(a)显示了在28℃培养3天时，在SOBG培养物中的野生型Ech-Rif中形成的生物膜和菌膜。图6A(b)显示了在28℃培养3天时，在SOBG培养物中的Ech137(gacA突变体)中延迟的生物膜和菌膜形成。图6A(c)显示了在质粒pCLgacA上表达的gacA基因会恢复生物膜和菌膜形成——在28℃培养3天时在SOBG培养物中的gacA突变体Ech137。图6B显示了使用扫描电子显微术在不同放大率观察到的菌膜的横截面。图6B(a1)显示了Ech-Rif；图6B(b1)显示了Ech137；图6B(a2)显示了Ech-Rif；图6B(b2)显示了Ech137。在图6B(a1)和图6B(b1)的显微照片中的尺寸条是1mm，而在图6B(a2)和图6B(b2)中，尺寸条是100μm。
表6.细菌株和质粒
Figure BDA00002255629900661
Apr、Kmr、Rifr和Spr分别是氨苄西林、卡那霉素、利福平和壮观霉素抗性；PCR，聚合酶链反应；GFP，绿荧光蛋白。
Metcalf，W.W.，Jiang，W.，Daniels，L.L.，Kim，S.K.，Haldimann，A.，和Wanner，B.L.1996.Conditionallyreplicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning，mutagenesis，and allele replacement inbacteria.Plasmid 35：1-13.
Lerner C.G.，和Inouye M.1990.Low copy number plasmids for regulated low-level expression of clonedgenes in Escherichia coli with blue/white insert screening capability.NucleicAcids Res.18：4631.
实施例5：GacA调节胞外酶生产
使用半定量板试验，检查了在基本培养基(MM)和补充了1％聚半乳糖醛酸盐的MM(MMP)中培养36h时的野生型Ech-Rif、gacA突变体Ech137和gacA突变体补足菌株Ech137(pCLgacA)中的胞外酶的生产，所述胞外酶包括果胶酸裂合酶(Pel)、蛋白酶(Prt)和纤维素酶(Cel)。值是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。与Ech-Rif相比，在36h时在培养于MM和补充了1％聚半乳糖醛酸盐(PGA)的MM(MMP)中的Ech137中观察到减少的Pel、Cel和Prt生产(图7)。
使用分光光度计测量试验，定量所述细菌株中的Pel活性。图8显示了在36h时在补充了1％聚半乳糖醛酸盐的基本培养基中培养的Ech-Rif、gacA突变体Ech137和补足菌株Ech137(pCLgacA)的果胶酸裂合酶(Pel)活性(U/在600nm的光密度[OD600])的分光光度测量定量。值是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本；所述值表示为3个副本的平均值和标准差。与板试验的结果相一致，当细菌细胞生长在36h时(静止期晚期)，通过分光光度计测量试验观察到Ech137的更低的Pel生产(图8)。与Ech-Rif相比，当细菌细胞生长在指数期(12h)和静止期初期(24h)时，通过分光光度计测量试验也观察到Ech137的更低的Pel生产。通过将含有野生型gacA基因的质粒pCLgacA导入突变体中，可以使Ech137的Pel、Cel和Prt生产几乎恢复至野生型细菌水平(图7和8)。
实施例6：GacA调节pel和T3SS基因的表达
菊欧文氏菌的pelD和PelL编码endo-Pels。PelD对非甲基化的果胶具有更高的活性，PelL偏好部分地甲基化果胶。分别将pelD和pelL的启动子区克隆进pPROBE-AT中，以生成ppelD和pPelL(表6)。在补充了1％PGA的MM中，培养携带这些GFP启动子质粒的Ech-Rif和Ech137细胞，并通过FACS测量所述细菌细胞的荧光强度。通过FACS收集荧光强度，并使用来自Becton Dickinson的CellQuest Pro软件在4-十进位对数标度(four-decade log scale)中进行分析，将基因表达谱分析为：i)总值，即全体细菌细胞的平均GFP荧光强度；ii)GFP+均值，即表达GFP的细菌细胞的平均GFP荧光强度；和iii)GFP+％，即表达GFP的细菌细胞占全体细菌细胞的百分比。
为了研究GacA对Ech3937中的pel基因的转录的影响，检查了Ech-Rif和Ech137的pelD和pelL的启动子活性。图9显示了在补充了1％聚半乳糖醛酸盐的基本培养基(MMP)中培养的Ech-Rif(具有黑色填充的黑线)和gacA突变体Ech137(灰线)中的pelD和pelL的表达。在培养基MMP中培养12和24h以后，对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定绿荧光蛋白(GFP)强度，并使用Cell Quest软件(BDBiosciences，San Jose，CA，U.S.A.)进行分析。具有灰色填充的灰线代表含有pPROBE-AT载体(没有***物)的Ech-Rif的GFP表达对照基础水平。值是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本，并将一个副本用于叠加显示。与Ech-Rif相比，在培养基中培养12和24h时，在gacA突变体Ech137中观察到pelD和pelL的明显更低的表达，这指示，GacA增量调节pelD和pelL的表达(图9)。在培养后12h，在野生型Ech-Rif中的pelD表达是gacA突变体Ech137的表达的2倍多(图9)。携带pPelD的Ech-Rif细胞在12和24h时表达190±17和459±73的平均荧光强度(MFI)，而携带pPelD的Ech137细胞在12和24h时表达52±3和324±11的MFI。类似地，在Ech-Rif细胞中的pelL启动子活性比在gacA突变体Ech137细胞中高大约50％。在培养后12和24h，Ech-Rif(pPelL)的MFI值分别是31±0.1和28±0(图9)。在12和24h，Ech137(pPelL)的MFI值分别是19±1和22±1(图9)。
已经报道了胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病亚种(E.carotovorasubsp.carotovora)中GacA对T3SS基因的调节。为了研究GacA对Ech3937中的T3SS基因转录的影响，将所述细菌的dspE、hrpA和hrpN的启动子区克隆进pPROBE-AT中，以生成质粒pDspE、pHrpA和pHrpN(表6)。在hrp-诱导MM中培养8h时，Ech-Rif(pDspE)的总GFP强度是15±0.8，在12h时是17±1.2(表7)。在相同的时间段，观察到Ech137(pDspE)的更低的总GFP强度3.4±0.01和3.4±0.05。类似地，与Ech-Rif相比，在8和12h时，在培养于MM中的携带pHrpA和pHrpN的Ech137细胞中观察到更低的GFP强度(表7)。上述数据证实，GacA增量调节dspE、hrpA和hrpN。
表7.在基本培养基中培养的Ech-Rif和Ech137的dspE、hrpA和hrpN的表达
Figure BDA00002255629900681
a在基本培养基中培养8和12h以后，对比启动子活性。值代表总绿荧光蛋白强度，且是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。
所述值表示为3个副本的平均值和标准差。
实施例7：Gac-Rsm调节网络控制Pel和T3SS基因表达
Rsm是在基因表达中起关键作用的新类型的转录后调节***。为了研究GacA对果胶酶基因表达的影响是否是通过Rsm调节途径，通过qRT-PCR，检查了rsmC、rsmB和rsmA的相对mRNA水平。使用Pfaffl和同事描述的相对表达软件工具(Pfaffl等人2002)，分析qRT-PCR数据。图10A显示了在基本培养基中培养6或12h时，gacA突变体Ech137中的rsmA、rsmB、rsmC和hrpL mRNA与野生型Ech-Rif相比的相对水平。在每个实验中使用3个副本，并将值表示为3个副本的平均值和标准差。与野生型相比，在Ech137中观察到更低量的rsmB mRNA。在6h时，野生型Ech-Rif生产比gacA突变体Ech137多大约10倍的rsmB mRNA，在12h时多24倍，P值小于0.05。在Ech-Rif和Ech137之间没有观察到rsmC和rsmA mRNA的量的显著差异(P值范围为0.74-1)(图10A)。
图10B显示了在基本培养基中培养12h时，gacA突变体Ech137和gacA突变体补足菌株Ech137(pCLgacA)中的gacA和rsmB mRNA与野生型Ech-Rif相比的相对水平。通过实时聚合酶链式反应试验，检查了mRNA的量，并通过相对表达软件工具进行分析。野生型的mRNA的标准化值是1.0。在每个实验中使用3个副本，并将值表示为3个副本的平均值和标准差。通过qRT-PCR，没有观察到Ech137中的gacA的可检测的mRNA(图10B)。通过将质粒pCLgacA导入突变体中，恢复了Ech137的gacA和rsmB表达。Ech137(pCLgacA)的gacA和rsmB的相对mRNA量是Ech-Rif的大约180％和150％(图10B)。在Ech137(pCLgacA)中的gacA和rsmBmRNA比Ech-Rif更高的量可能是由于所述质粒的拷贝数效应。
为了进一步研究GacA对T3SS基因表达的影响是否是通过GacA-RsmA-rsmB-hrpL调节途径，通过qRT-PCR，检查了所述细菌的hrpL mRNA的量。与Ech-Rif(标准化的-1)相比，在MM中培养12h时，在gacA突变体Ech137中观察到显著更低的hrpL mRNA(0.362±0.065)，P值为0.001(图10A)。在该培养基中培养6h时，在Ech-Rif和Ech137之间观察到类似的hrpL mRNA量(P＝1)。在Ech-Rif和Ech137之间，观察到hrpL的类似的启动子活性，这提示，hrpL在转录后水平受到调节。
实施例8：GacA会影响Pel和T3SS基因在植物内的表达
为了将体外结果与体内条件相关联，进一步检查了宿主植物非洲紫堇(非洲紫罗兰)叶中的Ech-Rif和Ech137之间的pelL和dspE的表达。与Ech137相比，在接种后24h，观察到非洲紫罗兰中的Ech-Rif的pelL和dspE的更高转录，这是pelL的大约3倍，是dspE的4倍(表8)。
表8.在非洲紫堇中Ech-Rif和gacA  变体Ech137的pelL和dspE的表达a。
Figure BDA00002255629900701
a在接种24h以后对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定绿荧光蛋白(GFP)强度。值是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差。
实施例9：gacA突变体减少了浸渍和***性侵入能力
因为GacA影响促成发病机制的多个表型，如以前所述(Yang等人2002)，使用Ech-Rif、Ech137和补足菌株Ech137(pCLgacA)在Africanviolet cv.Gauguin中进行局部浸渍试验。图11显示了由下述菌株造成的局部浸渍病变：a，Ech-Rif；b，gacA突变体Ech137；和c，补足菌株Ech137(pCLgacA)。将细菌细胞接种在相同叶的每半侧的中央。使用磷酸盐缓冲液(pH7.4，50mM)悬浮细菌细胞，并使用50μl体积的细菌悬浮液，细菌浓度为106CFU/ml。在接种后2天，检查浸渍征状。重复该实验2次。与Ech-Rif相比，在接种后2天，Ech137的植物内浸渍能力急剧下降(图11)。pCLgacA使Ech137的浸渍能力恢复至接近野生型Ech-Rif水平(图11)。
图12显示了在African violet cv.Gauguin(非洲紫罗兰)中的Ech-Rif和gacA突变体Ech137的浓度。用50-μl细菌悬浮液(浓度为106CFU/ml)接种非洲紫堇的叶。对于每个细菌株，在每次取样时使用来自6个副本植物的6片叶子，所述值表示为3个副本的平均值和标准差：Ech-Rif(实心菱形)和Ech137(实心三角形)的浓度。按照描述的进行所述分光光度测量定量，以测量来自相同样品的接种的叶中的果胶酶(Pel)活性，用于描绘群体动力学：Ech-Rif(空心菱形)和Ech137(空心三角形)的Pel生产。令人感兴趣地，尽管与用野生型Ech-Rif接种的叶相比，在用Ech137接种的植物叶中也观察到更低的Pel活性(图12)，通过成对样品t检验分析确定，在接种后第2天，在非洲紫堇叶中的野生型Ech-Rif和Ech137之间的细菌浓度没有差异(P＝0.23)(图12)。与Ech-Rif相比，在第3天(P＝5.9×10-11)和第4天(P＝1.7×10-4)，观察到在植物中的Ech137的更低细菌浓度。
进一步进行了***性侵入试验(Franza等人1999)，以研究细菌的GacA在非洲紫罗兰中的作用。对于每个细菌株(Ech-Rif和Ech137)，接种12株植物(1片叶子/植物)。当至少一片叶和它的叶柄被浸渍时，认为应答是***性的。值是2个实验的代表。在接种后8天，12株接种了Ech-Rif的植物中的11株出现***性侵入征状(图13)。相比而言，Ech137表现出减少的在植物宿主中造成***性侵入的能力；在接种后16天，仅一株植物出现gacA突变体的***性侵入。
实施例10：T3SS抑制剂的鉴别
为了鉴别抑制T3SS的活化的潜在化合物，通过流式细胞术，进一步筛选了TCA的类似物和异构体以及植物中水杨酸和苯丙素生物合成途径的中间体对Ech3937hrpA表达的影响(表9)。构建了绿荧光蛋白(GFP)报告质粒phrpA(pPROBE-AT衍生物，其具有含有hrpA启动子区的PCR片段)，产生hrpA启动子与GFP基因的转录融合体。在补充了0.1mM的每种化合物的MM中，培养含有phrpA质粒的细菌细胞。通过流式细胞术，测量GFP强度，它是hrpA启动子活性的量度。发现TCA类似物对香豆酸(PCA)和肉桂醇是hrpA表达的抑制剂(表9)。
表9.在MM和补充了叔肉桂酸的不同异构体和类似物的MM中，菊欧文氏菌3937(Ech3937)的hrpA的表达
Figure BDA00002255629900711
a基本培养基(MM)和补充了0.1mM的不同化合物的MM。
b在该研究中使用携带GFP报告物phrpA的Ech3937细胞。在细菌生长6、12和24h时，对比启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。GFP的值(平均荧光强度)是3个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差(SD)。
分别在MM和补充了PCA(浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.05和0.1mM)的MM中，进一步检查T3SS基因hrpA的表达。图16A和16B显示了在接种后12h(图16A)和24h(图16B)，培养于基本培养基(MM)和补充了不同量的对香豆酸(PCA)的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的hrpA的启动子活性。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度，并用Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。记录Ech3937在补充了不同浓度的PCA的MM中的生长。与单独的MM相比，当将0.05和0.1mM的PCA加入培养基中时，Ech3937(phrpA)的细菌细胞的平均GFP荧光强度降低了超过4倍(图16A、16B)。在0.001、0.005和0.01浓度的PCA的添加，没有导致Ech3937的GFP荧光强度的大幅下降。当将PCA加入MM中时，没有观察到细菌生长的抑制(图16A、16B)。
为了证实PCA对Ech3937的T3SS的抑制作用，还检查了Ech3937的hrpN的启动子活性。与生长在单独的MM中的细菌细胞相比，在补充了0.1mM PCA的MM中观察到减少的hrpN表达(表10)。使用mrp(其蛋白产物具有ATP酶保守结构域(2e-06))作为参照基因。当分别在MM和补充了0.1mM PCA的MM中培养细菌细胞时，在Ech3937(pmrp)中观察到类似的mrp表达(表10)。通过qRT-PCR试验，进一步证实了PCA对T3SS基因表达的抑制作用。图14显示了与不含PCA的MM中的那些菌株相比，在补充了0.1mM对香豆酸(PCA)的基本培养基(MM)中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的hrpS、hrpL、dspE、hrpA、hrpN和rsmB的相对mRNA水平。通过qRT-PCR，测定mRNA的量。在该实验中使用3个副本。使用Pfaffl等人(2002)描述的相对表达软件工具，计算p-值。在MM和补充了0.1mM PCA的MM之间，hrpS、hrpL、dspE、hrpA和hrpN的基因表达水平是显著不同的(p＜0.001)。与在单独的MM中的Ech3937(标准化的-1)相比，在培养于补充了PCA的MM中的细菌中，观察到dspE(P＝0.001)、hrpA(P＝0.001)和hrpN(P＝0.001)的显著更低量的mRNA(图14)。
表10.在基本培养基(MM)和补充了0.1mM PCA的MM(MMPCA)中，菊欧文氏菌3937(Ech3937)的III型分泌基因hrpA和hrpN的表达
Figure BDA00002255629900731
a在对香豆酸(PCA)中培养细菌12和24h时，对比启动子活性。
b通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。值(平均荧光强度)是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差(SD)。
GacS/GacA也诱导Ech3937的果胶酸裂合酶的生产。为了研究PCA是否通过Gac-Rsm调节途径影响T3SS基因表达，通过qRT-PCR进一步检查了rsmB的表达。图17显示了如文献所述(Matsumoto等人2003)通过板试验测得的在12h时，培养于基本培养基(MM)和补充了0.1mM的对香豆酸(PCA)的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的果胶酸裂合酶(Pel)生产。值是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。就基因rsmB而言，在培养于MM和补充了PCA的MM中的Ech3937之间没有观察到显著差异(p＝0.928)(图14)。该结果表明，PCA对T3SS表达的抑制表示通过Gac-Rsm途径。果胶酶试验进一步提示，Gac-Rsm途径不受PCA影响。在培养于MM和补充了0.1mM PCA的MM中的Ech3937之间，观察到类似的果胶酸裂合酶生产，这证实，GacS/GacA不受PCA影响(图17)。
与GacS/GacA-RsmA-rsmB-hrpL调节途径一起，Ech3937的T3SS(其属于植物病原细菌的第I组T3SS)主要通过HrpX/Y-HrpS-HrpL途径受到调节。双组分***HrpX/HrpY会活化编码HrpS的基因，所述HrpS是hrpL的表达所必需的。HrpL(一种替代性的∑因子)进一步活化编码T3SS器官的基因和它的分泌底物的表达。为了研究PCA是否通过HrpX/Y-HrpS-HrpL途径来抑制T3SS基因表达，进一步检查了hrpS和hrpL的启动子活性。与在MM中的Ech3937(phrpS)和Ech3937(phrpL)相比，在培养于补充了0.1mM PCA的MM中的、携带phrpS和phrpL的细菌细胞中观察到更低的GFP强度(表10)。通过qRT-PCR，也证实了hrpS和hrpL的表达。结果表明，与在单独的MM中的Ech3937(标准化的-1)相比，在培养于补充了PCA的MM中的细菌中，观察到hrpS(相对表达比0.223，P＝0.001)和hrpL(相对表达比0.039，P＝0.001)的显著更低量的mRNA(图14)。
为了进一步阐明T3SS基因表达是否主要通过HrpX/Y-HrpS-HrpL调节途径受到调节，检查了在MM中的野生型Ech3937和hrpX(WPP67)、hrpY(WPP92)、hrpS(WPP90)和hrpL(WPP96)突变体的hrpA和hrpN的表达。结果表明，与携带phrpA和phrpN的Ech3937相比，在培养于MM中的WPP67、WPP92、WPP90和WPP96中，观察到非常低的hrpA和hrpN表达。在培养于MM和补充了PCA的MM中的、携带phrpA和phrpN的WPP67、WPP92、WPP90和WPP96中，观察到hrpA和hrpN的类似表达。这些结果证实，hrpX、hrpY、hrpS和hrpL对于T3SS基因表达而言是重要的，且PCA通过HrpX/Y-HrpS-HrpL调节途径来抑制T3SS基因的表达(表11)。由于PCA会抑制几种T3SS基因(诸如hrpN)的表达，进一步检查了PCA对HrpN的蛋白生产的影响。图15显示了在基本培养基(MM)和补充了0.1mM对香豆酸(PCA)的MM中的菊欧文氏菌3937(Ech3937)的HrpN蛋白表达。图15的泳道1显示了HrpN过表达菌株。泳道2显示了在补充了0.1mM PCA的MM中培养的Ech3937。泳道3显示了在MM中培养的Ech3937。泳道4显示了在补充了0.01mM PCA的MM中培养的Ech3937。与单独的MM相比，在培养于补充了0.1mM PCA的MM中的Ech3937中观察到更低量的HrpN(图15)。
表11.在基本培养基(MM)和补充了0.1mM PCA的MM(MMPCA)中，野生型菊欧文氏菌3937(Ech3937)和hrpX(WPP67)、hrpY(WPP92)、hrpS(WPP90)和hrpL(WPP96)突变体的hrpA和hrpN的表达
Figure BDA00002255629900741
Figure BDA00002255629900751
a在对香豆酸(PCA)中培养细菌12和24h时，对比启动子活性。
b通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。值(平均荧光强度)是2个实验的代表。在该实验中使用3个副本。所述值表示为3个副本的平均值和标准差(SD)。
实施例11：化合物的合成
合成或商业购得在表12中的化合物。
表12
Figure BDA00002255629900752
Figure BDA00002255629900761
Figure BDA00002255629900771
Figure BDA00002255629900781
Figure BDA00002255629900791
Figure BDA00002255629900811
合成或商业购得下述化合物：
Figure BDA00002255629900821
Figure BDA00002255629900831
氧肟酸酯(103、125、127、128、129、130、131、132)的合成
方法A：将肉桂酸(25mmol)和浓H2SO4(0.1mL)在无水MeOH(25mL)中的混合物在80℃(浴温)回流16h。在通过旋转蒸发器去除过量的MeOH以后，用H2O(50mL)处理残余物，并用EtOAc(3×50mL)萃取得到的混合物。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，并通过快速硅胶色谱法(用在EtOAc中的10-60％己烷洗脱)纯化粗产物，得到肉桂酸甲酯。向冰冷的上述肉桂酸甲酯(8mmol)溶解在无水MeOH(10mL)和THF(10mL)中的溶液中，加入盐酸羟胺(1.67g，24mmol，3当量)，随后加入25％甲醇钠的甲醇溶液(8.4mL，36mmol，4.5当量)。在氩下和在0℃搅拌所述反应混合物2h，然后温热至环境温度，并继续搅拌过夜(16h)。使用旋转蒸发器，将得到的黄色悬浮液浓缩至干燥，并用1N HCl水溶液(30mL)处理残余物。用EtOAc(3×50mL)萃取所述混合物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂，得到粗产物(480mg)，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的5-15％MeOH洗脱)进行纯化，得到氧肟酸酯。
使用方法A，合成了化合物103、125、129、130和131。通过在碱性条件下使甲基酯101与羟胺反应，将PCA的羧酸转化成氧肟酸酯(hydroxamite)，以合成化合物103。化合物103是浅褐色固体，以25％产率得到(基于甲基酯)。用甲氧基替代化合物103的羟基，产生氧肟酸酯125。化合物125是浅褐色固体，以67％产率得到。化合物129是浅褐色固体，以21％产率得到。化合物130是灰白色固体，以63％产率得到。化合物131是灰色固体，以25％产率得到。通过1H NMR(75MHz，CD3OD)，验证化合物的身份。
方法B：在室温，向搅拌的肉桂酸(7mmol)和二异丙基乙胺(DIEA)(2.45mL，17mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物中，加入HBTU(2.92g，7.7mmol)，随后加入盐酸羟胺(0.98g，14mmol)和DBU(2.13g，14mmol)在无水DMF(8mL)中的溶液，然后将整个反应混合物在室温搅拌1h。在用旋转蒸发器去除大多数DMF以后，将残余物溶解于EtOAc(150mL)中，然后用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的5-15％MeOH洗脱)进行纯化，得到氧肟酸酯。
使用方法B，合成了化合物127、128和132。通过在碱性条件下使对应的甲基酯与羟胺反应，合成了吲哚氧肟酸酯127。化合物127是黄色固体，以35％产率得到。化合物128是白色固体，以50％产率得到。化合物132是白色固体，以60％产率得到。通过1H NMR(对于化合物127，400MHz，CD3OD；对于化合物128和132，300MHz，DMSO-d6)，证实化合物的身份。
肉桂醇(104、126)的合成
用氢化铝还原化合物101，以产生4-羟基肉桂醇104。将AlCl3(1.33g，10mmol)在无水二***(25mL)中的***液逐滴加入冰冷的搅拌的LiAlH4(1.33g，35mmol)在无水二***(25mL)中的悬浮液中。在加入结束以后，将所述混合物温热至环境温度，搅拌30min，产生灰色悬浮液。在10min内向该灰色悬浮液中逐滴加入肉桂酸甲酯(10mmol)溶解于无水二***(25mL)中的溶液，并将所述反应混合物在室温搅拌1h。用冰浴冷却反应混合物，并用EtOAc(50mL)和1N HCl溶液(100mL)小心地处理。用EtOAc(3×50mL)萃取得到的混合物。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，并通过快速硅胶色谱法(用在EtOAc中的20-50％己烷洗脱)纯化粗产物，得到肉桂醇。化合物104是黄色固体，以43％产率得到。化合物126是白色固体，以79％产率得到。通过1H NMR(对于化合物104，75MHz，CD3OD；对于化合物126，400MHz，CDCl3)证实化合物的身份。
制备肉桂酰胺(102)的合成
通过在有磺酸存在下在甲醇中回流，将PCA转化成它的甲基酯101。通过与氨反应，将化合物101转化成酰胺102。将肉桂酸甲酯(28mmol)和7M氨在MeOH(30mL)中的溶液密封在100mL厚壁圆底烧瓶中，并在搅拌下在90℃加热72h，得到褐色溶液。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的2-10％MeOH洗脱)纯化粗产物，得到肉桂酰胺。化合物102是黄色固体，以30％产率得到。通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实身份。
2-芳基环丙烷-1-羧酸(100、105、106、107)的合成
在Corey-Chaykovsky环丙烷化反应条件下(TMSOI，NaH，DMSO)，合成化合物100、105、107和106。将反式-4-甲氧基肉桂酸(18g，101mmol)和浓H2SO4(0.5mL)在无水EtOH(100mL)中的混合物在90℃(浴温)回流16h。在通过旋转蒸发器去除过量的EtOH以后，用H2O(100mL)处理残余物，并用***(3×120mL)萃取得到的混合物。用1N NaOH水溶液(2×50mL)、H2O(80mL)和盐水(80mL)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，得到反式-4-甲氧基肉桂酸乙酯(20g，96％产率)，为浅黄色油。
在室温，向三甲基碘化亚砜(TMSOI)(22g，100mmol，2.6当量)和60％NaH(4g，100mmol，2.6当量)的混合物中，一次性加入无水DMSO(120mL)，并将所述混合物在室温在氮下搅拌1.5h。在室温在10min内，将反式-4-甲氧基肉桂酸酯(7.91g，38.4mmol)在无水DMSO(50mL)中的溶液逐滴加入得到的悬浮液中，并将整个混合物在室温搅拌18h。用冰浴冷却反应混合物，并用盐水(250mL)猝灭。用***(5×100mL)萃取得到的混合物，用盐水(2×60mL)洗涤，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的2-10％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到100(1.6g，19％产率)，为白色固体。通过1H NMR(300MHz，CDCl3)证实身份。
将氢氧化锂一水合物(252mg，6mmol)加入100(440mg，2mmol)溶解于THF/H2O(1∶1，20mL)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌16h。在通过旋转蒸发器去除大部分THF以后，用1N HCl(20mL)将水性残余物酸化至pH＝1-2。用EtOAc(2×50mL)萃取得到的白色悬浮液。用H2O(30mL)和盐水(40mL)洗涤合并的有机层，并干燥(无水Na2SO4)。用旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并在-20℃冰箱中从己烷/EtOAc重结晶粗产物(400mg)，得到105(320mg，83％产率)，为白色固体。通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实身份。
用干冰/丙酮浴将100(880mg，4mmol)溶解于无水DCM(20mL)中的溶液冷却至-78℃，在6min内逐滴加入1M BBr3DCM(6mL，6mmol)。将所述反应混合物在-78℃搅拌30℃，在0℃搅拌另外1h，然后温热至环境温度，并搅拌另外30min。用冰浴将所述反应混合物重新冷却至0℃，并用饱和NaHCO3(40mL)处理。用DCM(3×50mL)萃取得到的混合物，用H2O(40mL)和盐水(40mL)洗涤，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的10-20％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到106(480mg，58％产率)，为白色固体。
用环丙烷基替代PCA的双键，产生环丙烷酸107。将氢氧化锂一水合物(326mg，7.8mmol)加入106(320mg，1.5mmol)溶解于THF/H2O(1∶1，16mL)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌20h。在通过旋转蒸发器去除大部分THF以后，用1N HCl(20mL)将水性残余物酸化至pH＝1-2。用EtOAc(2×50mL)萃取得到的白色悬浮液。用盐水(40mL)洗涤合并的有机层，并干燥(无水Na2SO4)。用旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并在-20℃冰箱中从己烷/EtOAc重结晶粗产物(320mg)，得到107(150mg，56％产率)，为白色固体。通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实身份。
乙烯基磷酸(114、115)的合成
将二乙基膦酰乙酸(1.96g，10mmol)、4-羟基苯甲醛(1.46g，12mmol，1.2当量)、哌啶(0.23g，2.7mmol，0.27当量)和AcOH(0.12g，2mmol，0.2当量)在甲苯(60mL)中的混合物回流加热19h。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，将残余物溶解于DCM(200mL)中，用饱和NaHCO3溶液(2×50mL)、H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的2-8％MeOH洗脱)进行纯化，得到纯的乙烯基膦酸酯114(2g，78％产率)，为黄色油。
用磷酸基团(phosphoric group)替代PCA的羧基，产生2-(4-羟苯基)乙烯基磷酸115。通过4-羟基苯甲醛与二乙基膦酰乙酸的Knoevenagel反应，随后用三甲基甲硅烷基溴处理，制备化合物115。将溴代三甲基硅烷(2mL)加入114(760mg，3mmol)在无水DCM(12mL)中的溶液中，并将所述混合物在45℃回流16h，产生褐色溶液。在减压下蒸发过量的溴代三甲基硅烷至干燥以后，将油状残余物溶解于DCM(5mL)和H2O(5mL)中，并在室温搅拌2h。滤出得到的白色悬浮液，用DCM(2×10mL)洗涤固体，并风干。收集115(370mg，61％产率)，为灰白色固体。通过1H NMR(400MHz，CD3OD)证实身份。
肉桂基胺(117、119)的合成
在室温，向搅拌的邻苯二甲酰亚胺钾盐(20g，108mmol)和四丁基溴化铵(1.04g，3.24mmol，0.03当量)在无水DMF(75mL)中的混合物中，加入烯丙基氯(8.84mL，108mmol)，并将所述混合物在室温搅拌22h，产生浅黄色悬浮液。通过加入冷的H2O(150mL)，猝灭反应，并将所述混合物搅拌10min(在该时间内施加冰浴，以辅助沉淀)。滤出得到的白色悬浮液，用H2O(3×50mL)洗涤，并风干，得到N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺(8.5g，42％产率)，为白色固体。
将芳基溴(10mmol)、N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺(1.93g，10.3mol，1.03当量)和三乙胺(2.78mL，20mmol，2当量)放入50mL三颈圆底烧瓶中，在氩冲洗(flash)下将乙酸钯(23mg，0.1mmol，0.01当量)和三-O-甲苯基膦(61mg，0.2mmol，0.02当量)加入烧瓶中，并在氩下在100℃(浴温)加热整个混合物，并搅拌16h。在将反应混合物冷却至环境温度以后，加入DCM(50mL)和H2O(50mL)，并在室温搅拌10min。分离DCM层，并用DCM(2×50mL)萃取水层。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的DCM层，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的30-80％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺(116或118)。
将N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺(3mmol)与65％肼水合物(6mmol，2当量)和MeOH(10mL)混合，并将所述混合物在70℃加热2h。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，用1N NaOH(30mL)处理固体残余物，并用EtOAc(4×50mL)萃取得到的混合物，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的5-20％MeOH洗脱)进行纯化，得到肉桂基胺。以30％产率得到化合物117(白色固体)，并以80％产率得到化合物119(灰白色固体)。通过1H NMR(400MHz，CD3OD)证实身份。
乙烯基磺酸乙酯和四丁基铵乙烯基磺酸盐(120、121、122、123)的合 成
用磺基替代PCA的羧基，产生2-(4-羟苯基)乙烯基磺酸123。通过4步从对应的苯甲醛合成化合物123和它的衍生物114、120、121和122。向搅拌的甲磺酸乙酯(4.11mL，40mmol)在无水THF(100mL)中的溶液中，在10min内逐滴加入在-78℃的在己烷(17.8mL，44.4mmol)中的2.5Mn-BuLi。在将所述混合物搅拌15min以后，在相同温度缓慢地加入氯代磷酸乙酯(3.2mL，22.2mmol)。将所述溶液在-78℃搅拌30min，然后温热至-45℃，并搅拌另外1h。通过加入4.4M NH4Cl溶液(11mL)来猝灭反应，并将所述混合物温热至环境温度。在通过旋转蒸发器去除有机溶剂以后，用H2O(50mL)处理残余物，并用DCM(3×70mL)萃取，用盐水(40mL)洗涤，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在己烷中的30-100％EtOAc洗脱)进行纯化，得到二乙基磷酰基甲磺酸乙酯(4.6g，80％产率)，为浅黄色油。
将2.5M n-BuLi己烷溶液(3.36mL，8.4mmol)逐滴加入在-78℃搅拌的二乙基磷酰基甲磺酸乙酯(2.19g，8.4mmol)在无水THF(20mL)中的溶液中，并在相同温度搅拌30min。逐滴加入芳基醛(7mmol)溶解于无水THF(15mL)中的溶液，并将所述混合物在-78℃搅拌30min，然后在30min内温热至环境温度，并继续在室温搅拌另外1h(对于122，18h)。在通过加入AcOH(0.53mL，9.2mmol，1.1当量n-BuLi)来猝灭反应以后，通过旋转蒸发器去除溶剂。用H2O(50mL)处理油状残余物，用EtOAc(3×50mL)萃取，用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并干燥。通过快速硅胶柱色谱法(用在己烷中的10-50％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到乙烯基磺酸乙酯。以100％产率得到化合物120(浅黄色油)，并通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实它的身份。以71％产率得到化合物122(白色固体)，并通过1HNMR(300MHz，CD3OD)证实它的身份。
将乙烯基磺酸乙酯(2mmol)和四丁基溴化铵(2.2mmol，1.2当量)在丙酮(12mL)中的混合物回流21h。在通过旋转蒸发器去除丙酮以后，将残余物溶解于DCM(100mL)中，用H2O(30mL)和盐水(30mL)洗涤，并干燥。通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的5-10％MeOH洗脱)纯化粗产物，得到四丁基铵乙烯基磺酸盐。以85％产率得到化合物121(白色固体)，并通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实它的身份。以40％产率得到化合物123(白色固体)，并通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实它的身份。
4-羟甲基肉桂酸(124)的合成
用羟甲基替代PCA的羟基，产生化合物4-羟甲基肉桂酸124。通过用在水性tetrahedron中的硼氢化钠还原4-甲酰基肉桂酸，得到化合物124。
将NaBH4(0.53g，14mmol)在THF/H2O(4∶1)(12mL)中的溶液逐滴加入冰冷的搅拌的4-甲酰基肉桂酸(2.47g，14mmol)在THF(25mL)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌3h。通过加入4N HCl(20mL)来猝灭反应，并通过旋转蒸发器去除THF。用H2O(20mL)处理固体残余物，并用EtOAc(4×50mL)萃取。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤所述EtOAc萃取物，并干燥。从EtOAc重结晶所述粗产物，得到纯的4-羟甲基肉桂酸124(1.3g，52％产率)，为黄色固体，通过1H NMR(300MHz，CD3OD)证实它的身份。
反式-3-(4-羟苯基)-2-丙烯酰肼(133)的合成
在室温，向搅拌的对香豆酸(3.28g，20mmol)在无水乙腈(40mL)中的溶液中，加入HOBt(3.24g，24mmol)和EDC·HCl(4.6g，24mmol)，并将所述混合物在室温搅拌2h。用冰浴冷却得到的黄色悬浮液，并一次性地加入冰冷的肼(1.25mL，40mmol)和环己烯(0.61mL，6mmol)在乙腈(30mL)中的溶液。将所述混合物在0℃搅拌20min，随后在室温搅拌另外1h。滤出得到的黄色悬浮液，相继用MeOH(3×30mL)、H2O(2×30mL)、饱和NaHCO3(2×30mL)、H2O(2×20mL)和EtOAc(2×20mL)洗涤固体，最后风干，得到133(1.3g，36％产率)，通过1H NMR(300MHz，DMSO-d6)证实它的身份。
可商业得到的化合物
化合物111(用在苯基环中的溴替代PCA的羟基)是可商业得到的(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。化合物108、110、112和113具有分别被苯基、氟代、二甲氨基和三氟甲基取代的羟基，且是可商业得到的(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；Alfa Aesar，Ward Hill，MA)。化合物109也是可商业得到的(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)。
实施例12：化合物的活性
phrpA报告质粒
通过补充不同浓度的化合物，测量所述化合物对hrpA的最低抑制浓度，并将报告质粒phrpA用于测量这些化合物对hrpA表达的影响。化合物101、102、104、105、106、113、116、125、126和127在100μM的浓度表现出对hrpA表达的抑制作用。化合物103在10μM的浓度表现出对hrpA表达的抑制作用。
为了测试对T3SS hrpS表达的抑制作用，使用报告质粒phrpS来测量这些化合物对hrpA表达的影响。化合物103、104、106、111、125、126和127会抑制hrpS，这提示，这些化合物也通过HrpX/Y-HrpS-HrpL途径抑制T3SS。
hrpA会编码蛋白易位进植物细胞中所需的T3SS菌毛。为了测试对T3SS hrpA表达的抑制作用，使用报告质粒phrpA来测量这些化合物对hrpA表达的影响。所述报告质粒phrpA编码hrpA启动子的转录融合体，所述启动子控制绿荧光蛋白(gfp)的表达。使用50μl携带hrpA报告物的菊欧文氏菌3937的细菌悬浮液(在600nm的光密度OD600＝1.0)作为起始接种物，并加入5mL MM或补充了100μM化合物之一的MM中。如下测量这些细菌细胞的hrpA的表达水平：通过流式细胞术测量门控的细菌细胞群体的GFP强度，并用Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。在2个不同的时间(培养细菌12和24h)测定化合物，使用T3SS基本培养基(MM)作为每组实验的对照处理。结果显示在表13和表14中。在表14中显示的值是GFP的平均荧光强度，2个实验的代表，显示为3个副本的平均值和标准差(SD)。简而言之，化合物101、103、104、106、111、112、116、125、126和127表现出对hrpA表达的抑制作用。进一步在不同浓度检查了化合物103，结果显示在图22中。
化合物124没有表现出任何抑制活性(数据未显示)。
化合物111表现出中等效力(表13)。
就T3SS基因表达的抑制而言，化合物108、110、112和113都是无活性的。
化合物107没有表现出对T3SS基因表达的抑制活性(数据未显示)。但是，它的乙基酯106表现出强抑制效力(表13)。
化合物115和123、以及它们的衍生物114、120、121和122没有表现出对T3SS基因表达的任何活性(数据未显示)。
与PCA相比，化合物101表现出弱抑制活性(数据未显示)。但是，化合物102没有表现出对T3SS基因表达的任何抑制活性(数据未显示)。
当将10μM的PCA加入T3SS诱导基本培养基(MM)中时，没有观察到对hrpA的抑制作用。但是，当将10μM的103加入培养基中时，hrpA的表达减少了大约4倍，这提示，103是比PCA更有效的抑制剂。与PCA相比，使用103观察到对T3SS基因的更有效的抑制活性(数据未显示)。
化合物125仍然表现出对T3SS基因的有效抑制活性(表13)。
化合物127表现出中等效力。
化合物104表现出有效的抑制活性。类似地，烯丙醇126也是T3SS基因表达的有效抑制剂。
烯丙基胺117和119没有表现出任何抑制活性。
化合物116表现出中等抑制活性。
结果证实了PCA氧肟酸酯和烯丙醇作为T3SS基因表达的有效抑制剂的潜力。
表13.使用报告质粒phrpA，下面列出的8种化合物表现出对T3SS hrpA表达的抑制作用
Figure BDA00002255629900911
Figure BDA00002255629900921
aT3SS诱导基本培养基(MM)和补充了100μM的不同化合物的MM。
表14.在MM和补充了PCA、TCA和OCA的不同异构体和类似物的MM中，菊欧文氏菌3937的hrpA表达
Figure BDA00002255629900922
＊表示在MM和补充了不同化合物的MM中培养的细菌细胞之间，GFP强度是统计上显著不同的(P＜0.01，Student氏t-检验)
RNA印迹分析
使用RNA印迹分析来定量菊欧文氏菌3937的rsmB RNA。如图23所示，T3SS抑制剂103和125减少了rsmB mRNA，并抑制所述细菌细胞中的调节性的RNA rsmB表达。这些结果提示，103和125也通过HrpX/Y-HrpS-HrpL和GacS/A-rsmB-HrpL途径抑制T3SS。
在有化合物103存在下其它基因的表达
检查了化合物103对菊欧文氏菌3937的其它T3SS基因hrpA、hrpN、hrpS和hrpL(显示在表15中)的表达的影响。使用GFP报告质粒phrpA、phrpN、phrpS和phrpL来测量这些化合物对hrpA、hrpN、hrpS和hrpL的表达的影响。在有化合物103存在下，在细菌生长12和24h时，对比启动子活性在。通过流式细胞术，在门控的细菌细胞群体上测定GFP强度。结果显示在表16中。所述荧光强度是全体细菌细胞的平均GFP荧光强度。
在表16中显示的值是平均荧光强度值，2个实验的代表，并表现为3个副本的平均值和标准差(SD)。
表15.使用的菌株和质粒
Figure BDA00002255629900931
表16.在MM和补充了100μM 103的MM(MM103)中，菊欧文氏菌3937的T3SS基因hrpA、hrpN、hrpS和hrpL的表达
Figure BDA00002255629900932
＊是指在MM和MM103中培养的细菌细胞之间，GFP强度是统计上显著不同的(P＜0.01，student氏t-检验)。
实施例13.化合物的合成。
在杜克大学小分子合成设备(Duke University Small MoleculeSynthesis Facility)(Durham，NC)中，合成化合物。所述化合物的合成路线如下面和图24-30所述。
使用TMS作为内部标准品，在Varian Mercury 300或Inova 400波谱仪上测量NMR(1H、13C和32P)谱。在具有Daly转换倍增极检测器的Agilent1100Series LC/MSD Trap波谱仪上，进行电喷射电离质谱法(ESI-MS)。通过在毛细管的入口处施加+5或-5kV，以阳离子或阴离子模式进行电离。在预包被的硅胶60F254平板(Merck，0.25mm，购自Sigma-AldrichCompany)上，进行薄层色谱法(TLC)。
所有化学试剂购自商业来源，并如接收时使用。所有无水溶剂(二***、DMF、DMSO、DCM、THF、MeOH、EtOH)都具有无水质量，购自Sigma-Aldrich Company。商品级溶剂用于常规目的，不经进一步纯化。使用无水溶剂，并在超纯质量氩的轻压下，进行所有湿敏性的反应。在使用前在烘箱中在140℃干燥玻璃器皿至少12h，然后趁热迅速地装配，用橡胶隔片密封，并在氩流下冷却。使用特氟隆包被的磁性搅拌棒，磁性地搅拌反应物。使用可商业得到的一次用弃的注射器，转移试剂和溶剂。
在图24中，将肉桂酸转化成对应的甲基酯。通过在碱性条件下用羟胺处理，进一步将后者转化成异羟肟酸。当在苯基中的取代基是卤代、甲基、甲氧基或不会形成酰胺/酯的其它基团时，所述异羟肟酸可以从对应的羧酸直接得到。通过与在甲醇中的氨一起回流，从甲基酯得到对应的酰胺。用LiAlH4/AlCl3***容易地还原所述酯，产生肉桂醇。通过采用报道的规程(Zhang等人2002)，通过用HOBt和EDC、随后用肼处理，从肉桂酸得到酰肼。
在Corey-Chaykovsky环丙烷化反应条件下(Corey和Chaykovsky，1965)，将4-甲氧基肉桂酸乙酯转化成环丙烷基酯(100)。在水解后，得到酸105。用三溴硼烷将100脱甲基化，得到106。用氢氧化锂进一步水解后者，得到对应的羧酸107(图25)。
4-羟基苯甲醛与二乙基膦酰乙酸的Knoevenagel反应(Krawczyk和Albrecht 2005)，会导致形成反式-2-芳基乙烯基膦酸二乙酯114。在用三甲基甲硅烷基溴(TMSBr)处理以后，所述膦酸酯被转化成乙烯基磷酸115(图26)。以类似的方式，可以从对应的芳基醛得到其它反式-2-芳基乙烯基磷酸。
在有正丁基锂存在下，使苯甲醛与二乙基磷酰基-甲磺酸乙酯反应，以产生反式-2-芳基乙烯基磺酸乙酯(Niimi等人2001)(图27)。用四正丁基碘化铵(n-Bu4NI)裂解得到的磺酸乙酯，得到反式-2-芳基乙烯基磺酸。
用在DMF中的烯丙基氯烷基化邻苯二甲酰亚胺钾盐，以生成N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺。在Heck反应条件下(Patel等人1977)，使N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺与芳基溴反应，得到N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺。在用肼处理后，从N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺得到肉桂基胺(图28)。
用于制备氧肟酸肉桂酯的一般规程
方法A：将肉桂酸(25mmol)和浓H2SO4(0.1ml)在无水MeOH(25ml)中的混合物在80℃(浴温)回流16h。在通过旋转蒸发器去除过量的MeOH以后，用H2O(50ml)处理残余物，并用EtOAc(3×50ml)萃取得到的混合物。用H2O(50ml)和盐水(50ml)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，并通过快速硅胶色谱法(用在EtOAc中的10-60％己烷洗脱)纯化粗产物，得到肉桂酸甲酯。
向冰冷的肉桂酸甲酯(8mmol)溶解于无水MeOH(10ml)和THF(10ml)中的溶液中，加入盐酸羟胺(1.67g，24mmol，3当量)，随后加入在甲醇溶液中的25％甲醇钠(8.4ml，36mmol，4.5当量)。将所述反应混合物在氩下和在0℃搅拌2h，然后温热至环境温度，并继续搅拌过夜(16h)。使用旋转蒸发器将得到的黄色悬浮液浓缩至干燥，并用1N HCl水溶液(30ml)处理残余物。用EtOAc(3×50ml)萃取混合物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂，得到粗产物(480mg)，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的5-15％MeOH洗脱)进行纯化，得到异羟肟酸。
103(R1＝4-OH)：
25％产率(基于甲基酯)；浅褐色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.28(d，J＝15.6Hz，1H)，6.75(d，J＝8.1Hz，2H)，7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.49(d，J＝15.6Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ113.61，115.58，126.46，129.38，140.71，159.40，166.00；MS(ESI)：m/z 178(M-1)。
125(R1＝4-OMe)：
67％产率；浅褐色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ3.78(s，3H)，6.32(d，J＝15.6Hz，1H)，6.89(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.50(d，J＝15.6Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ54.66，114.16，114.53，127.57，129.23，140.32，161.44，165.75；MS(ESI)：m/z192(M-1)。
129(R1＝2-OH)：
21％产率；浅褐色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.64(d，J＝15.9Hz，1H)，6.77(d，J＝7.5Hz，1H)，6.81(m，1H)，7.13(m，1H)，7.40(d，J＝7.5Hz，1H)，7.86(d，J＝15.9Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ115.85，116.84，119.60，121.86，128.87，130.81，136.88，156.81，166.34；MS(ESI)：m/z178(M-1)。
130(R1＝3-OH)：
63％产率；灰白色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.42(d，J＝15.9Hz，1H)，6.81(d，J＝8.1Hz，1H)，6.96(brs，1H)，6.98(d，J＝8.1Hz，1H)，7.17(m，1H)，7.48(d，J＝15.9Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ113.95，116.91，117.00，119.23，129.82，136.27，140.80，157.77，165.34；MS(ESI)：m/z178(M-1)。
131(R1＝3，4-二OH)：
25％产率；灰色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.22(d，J＝15.6Hz，1H)，6.75(d，J＝8.1Hz，1H)，6.89(d，J＝8.1Hz，1H)，δ.99(brs，1H)，7.42(d，J＝15.6Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ113.56，113.80，115.28，120.92，127.03，141.06，145.54，147.65，166.00；MS(ESI)：m/z194(M-1)。
132(R1＝H)：
71％产率；白色固体；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ6.47(d，J＝15.6Hz，1H)，7.30-7.55(m，5H)，7.46(d，J＝15.6Hz，1H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ119.74，128.16，129.60，130.14，135.49，139.10，163.49；MS(ESI)：m/z162(M-1)。
方法B：在室温，向搅拌的肉桂酸(7mmol)和二异丙基乙胺(DIEA)(2.45ml，17mmol)在无水DMF(20ml)中的混合物中，加入HBTU(2.92g，7.7mmol)，随后加入盐酸羟胺(0.98g，14mmol)和DBU(2.13g，14mmol)在无水DMF(8ml)中的溶液，然后将整个反应混合物在室温搅拌1h。在用旋转蒸发器去除大部分DMF以后，将残余物溶解于EtOAc(150ml)中，然后用H2O(50ml)和盐水(50ml)洗涤，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的5-15％MeOH洗脱)进行纯化，得到异羟肟酸。
127(R1-Ar＝3-吲哚)
35％产率；黄色固体；1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ6.46(d，J＝15.6Hz，1H)，7.16-7.23(m，3H)，7.44(d，J＝7.5Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.82(d，J＝15.6Hz，1H)，7.87(d，J＝8Hz，1H)；MS(ESI)：m/z 201(M-1)。
128(R1＝4-Br)：
50％产率；白色固体；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ6.46(d，J＝15.9Hz，1H)，7.40(d，J＝15.9Hz，2H)，7.48(d，J＝8.4Hz，2H)，7.56(d，J＝8.4Hz，1H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ120.63，123.28，130.12，132.54，134.77，137.80，163.18；MS(ESI)：m/z 241(M-1)。
肉桂醇的一般规程
将AlCl3(1.33g，10mmol)在无水二***(25ml)中的***液逐滴加入冰冷的搅拌的LiAlH4(1.33g，35mmol)在无水二***(25ml)中的悬浮液中。在加入结束以后，将所述混合物温热至环境温度，搅拌30min，产生灰色悬浮液。在10min内向该灰色悬浮液中逐滴加入肉桂酸甲酯(10mmol)溶解于无水二***(25ml)中的溶液，将所述反应混合物在室温搅拌1h。用冰浴冷却所述反应混合物，用EtOAc(50ml)和1N HCl溶液(100ml)小心地处理。用EtOAc(3×50ml)萃取得到的混合物。用H2O(50ml)和盐水(50ml)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，并通过快速硅胶色谱法(用在EtOAc中的20-50％己烷洗脱)纯化粗产物，得到肉桂醇。
104(R1＝4-OH)：
43％产率；黄色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ4.17(dd，J＝6.0，1.5Hz，2H)，6.18(dt，J＝15.6，6.0Hz，1H)，6.48(d，J＝15.6Hz，1H)，6.72(d，J＝8.4Hz，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ62.80，115.16，125.49，127.53，128.83，130.73，157.06；MS(ESI)：m/z 149(M-1)。
126(R1＝4-OMe)：
79％产率；白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.78(brs，1H，OH)，3.79(s，3H)，4.27(d，J＝7.8Hz，2H)，6.22(dt，J＝16，6Hz，1H)，6.53(d，J＝16Hz，1H)，6.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.30(d，J＝8.4Hz，2H)；MS(ESI)：m/z 165(M+1)。
用于制备肉桂酰胺5的一般规程：
将肉桂酸甲酯(28mmol)和7M氨在MeOH(30ml)中的溶液密封在100ml厚壁圆底烧瓶中，在搅拌下在90℃加热72h，产生褐色溶液。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的2-10％MeOH洗脱)纯化粗产物，得到肉桂酰胺。
102(R1＝4-OH)：
30％产率；黄色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ6.43(d，J＝15.6Hz，1H)，6.79(d，J＝8.7Hz，2H)，7.40(d，J＝8.7Hz，2H)，7.45(d，J＝15.6Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ115.58，116.64，126.37，129.54，141.80，159.51，170.49；MS(ESI)：m/z 162(M-1)。
用于制备反式-3-(4-羟苯基)丙烯酰肼133的规程
向搅拌的4-羟基肉桂酸(3.28g，20mmol)在乙腈(40ml)中的溶液中，加入HOBt(3.24g，24mmol)和EDC·HCl(4.6g，24mmol)。将所述混合物在室温搅拌2h，并通过冰浴将得到的黄色悬浮液冷却至0℃。将冰冷的肼(1.25ml，40mmol)和环己烯(0.61ml，6mmol)在乙腈(30ml)中的溶液一次性地加入所述悬浮液中，并将所述混合物在0℃搅拌20min，然后温热至环境温度，继续搅拌另外1h。通过抽吸，滤出所述黄色悬浮液，相继用MeOH(3×30ml)、H2O(2×30ml)、饱和NaHCO3(2×30ml)、H2O(2×20ml)和EtOAc(2×20ml)洗涤固体，并风干，得到133(1.3g，36％产率)，为黄色固体。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ4.40(brs，3H)，6.32(d，J＝15.9Hz，1H)，6.76(d，J＝8.4Hz，2H)，7.33(d，J＝16.2Hz，1H)，7.36(d，J＝8.1Hz，2H)，9.21(br s，1H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ116.49，117.21，126.44，129.83，139.08，159.72，165.86；MS(ESI)：m/z 179(M+1)。
用于制备2-芳基环丙烷-1-羧酸的一般规程
将反式-4-甲氧基肉桂酸(18g，101mmol)和浓H2SO4(0.5ml)在无水EtOH(100ml)中的混合物在90℃(浴温)回流16h。在通过旋转蒸发器去除过量的EtOH以后，用H2O(100ml)处理残余物，并用***(3×120ml)萃取得到的混合物。用1N NaOH水溶液(2×50ml)、H2O(80ml)和盐水(80ml)洗涤合并的萃取物，并干燥(无水Na2SO4)。蒸发溶剂至干燥，得到反式-4-甲氧基肉桂酸乙酯(20g，96％产率)，为浅黄色油，其具有足以进行下一步的纯度。
向三甲基碘化亚砜(TMSOI)(22g，100mmol，2.6当量)和60％NaH(4g，100mmol，2.6当量)的混合物中，一次性加入在室温的无水DMSO(120ml)，并将所述混合物在室温在氮下搅拌1.5h。在10min内将反式-4-甲氧基肉桂酸酯(7.91g，38.4mmol)在无水DMSO(50ml)中的溶液逐滴加入得到的在室温的悬浮液中，并将整个混合物在室温搅拌18h。用冰浴冷却所述反应混合物，用盐水(250ml)猝灭。用***(5×100ml)萃取得到的混合物，用盐水(2×60ml)洗涤，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的2-10％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到100(1.6g，19％产率)，为白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.25(m，1H)，1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，1.56(m，1H)，1.82(m，1H)，2.48(m，1H)，3.78(s，3H)，4.16(q，J＝7.2Hz，2H)，6.82(d，J＝8.4Hz，2H)，7.03(d，J＝8.7Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ14.50，16.95，24.09，25.84，55.53，60.85，114.13，127.58，132.31，158.56，173.77。
将氢氧化锂一水合物(252mg，6mmol)加入100(440mg，2mmol)溶解于THF/H2O(1∶1，20ml)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌16h。在通过旋转蒸发器去除大部分THF以后，用1N HCl(20ml)酸化水性残余物至pH＝1-2。用EtOAc(2×50mL)萃取得到的白色悬浮液。用H2O(30ml)和盐水(40ml)洗涤合并的有机层，并干燥(无水Na2SO4)。用旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并在-20℃冰箱中从己烷/EtOAc重结晶粗产物(400mg)，得到105(320mg，83％产率)，为白色固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.28(m，1H)，1.47(m，1H)，1.73(m，1H)，2.40(m，1H)，3.74(s，3H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，7.03(d，J＝8.7Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ15.91，23.55，25.51，54.48，113.76，127.11，132.12，158.71，176.07；MS(ESI)：m/z191(M-1)。
用干冰/丙酮浴将100(880mg，4mmol)溶解于无水DCM(20ml)中的溶液冷却至-78℃，在6min内逐滴加入BBr3(1M DCM溶液，6ml，6mmol)。将所述反应混合物在-78℃搅拌30℃，在0℃搅拌另外1h，然后温热至环境温度，并搅拌另外30min。用冰浴将所述反应混合物重新冷却至0℃，并用饱和NaHCO3(40mL)处理。用DCM(3×50mL)萃取得到的混合物，用H2O(40mL)和盐水(40mL)洗涤，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的10-20％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到106(480mg，58％产率)，为白色固体。
将氢氧化锂一水合物(326mg，7.8mmol)加入106(320mg，1.5mmol)溶解于THF/H2O(1∶1，16ml)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌20h。在通过旋转蒸发器去除大部分THF以后，用1N HCl(20ml)酸化水性残余物至pH＝1-2。用EtOAc(2×50mL)萃取得到的白色悬浮液。用盐水(40ml)洗涤合并的有机层，并干燥(无水Na2SO4)。用旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并在-20℃冰箱中从己烷/EtOAc重结晶粗产物(320mg)，得到107(150mg，56％产率)，为白色固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.27(m，1H)，1.45(m，1H)，1.70(m，1H)，2.38(m，1H)，6.69(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(d，J＝8.4Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ15.82，23.47，25.65，115.09，127.15，130.88，158.00，176.21；MS(ESI)：m/z 177(M-1)。
用于制备乙烯基磷酸115的规程
将二乙基膦酰乙酸(1.96g，10mmol)、4-羟基苯甲醛(1.46g，12mmol，1.2当量)、哌啶(0.23g，2.7mmol，0.27当量)和AcOH(0.12g，2mmol，0.2当量)在甲苯(60ml)中的混合物回流加热19h。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，将残余物溶解于DCM(200ml)中，用饱和NaHCO3溶液(2×50ml)、H2O(50ml)和盐水(50ml)洗涤，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的2-8％MeOH洗脱)进行纯化，得到纯的乙烯基膦酸酯114(2g，78％产率)，为黄色油。
将溴代三甲基硅烷(2ml)加入114(760mg，3mmol)在无水DCM(12ml)中的溶液中，并将所述混合物在45℃回流16h，产生褐色溶液。在减压下蒸发过量的溴代三甲基硅烷至干燥以后，将油状残余物溶解于DCM(5ml)和H2O(5ml)中，并在室温搅拌2h。滤出得到的白色悬浮液，用DCM(2×10mL)洗涤固体，并风干。收集115(370mg，61％产率)，为灰白色固体。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ6.20(t，J＝17.6Hz，1H)，6.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.27(dd，J＝22.8，17.6Hz，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)：δ112.7(d，J＝188.9Hz)，115.26，126.75(d，J＝22.7Hz)，128.88，145.46(d，J＝5.9Hz)，159.17；32P NMR(CD3OD)：δ18.07；MS(ESI)：m/z 399(2M-1)。
用于制备乙烯基磺酸乙酯和四丁基铵乙烯基磺酸盐的一般规程
向搅拌的甲磺酸乙酯(4.11ml，40mmol)在无水THF(100ml)中的溶液中，在10min内逐滴加入在-78℃的在己烷(17.8ml.44.4mmol)中的2.5Mn-BuLi。在将所述混合物搅拌15min以后，在相同温度缓慢地加入氯代磷酸乙酯(3.2ml，22.2mmol)。将所述溶液在-78℃搅拌30min，然后温热至-45℃，并搅拌另外1h。通过加入4.4M NH4Cl溶液(11ml)来猝灭反应，并将所述混合物温热至环境温度。在通过旋转蒸发器去除有机溶剂以后，用H2O(50mL)处理残余物，并用DCM(3×70mL)萃取，用盐水(40mL)洗涤，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在己烷中的30-100％EtOAc洗脱)进行纯化，得到二乙基磷酰基甲磺酸乙酯(4.6g，80％产率)，为浅黄色油。
将2.5M n-BuLi己烷溶液(3.36mL，8.4mmol)逐滴加入在-78℃搅拌的二乙基磷酰基甲磺酸乙酯(2.19g，8.4mmol)在无水THF(20ml)中的溶液中，并在相同温度搅拌30min。逐滴加入芳基醛(7mmol)溶解于无水THF(15mL)中的溶液，并将所述混合物在-78℃搅拌30min，然后在30min内温热至环境温度，并继续在室温搅拌另外1h(对于122，18h)。在通过加入AcOH(0.53ml，9.2mmol，1.1当量n-BuLi)来猝灭反应以后，通过旋转蒸发器去除溶剂。用H2O(50mL)处理油状残余物，用EtOAc(3×50mL)萃取，用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并干燥。通过快速硅胶柱色谱法(用在己烷中的10-50％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到乙烯基磺酸乙酯。
120(R＝4-OMe)：
100％产率；浅黄色油；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.34(t，J＝7.2Hz，3H)，3.82(s，3H)，4.17(q，J＝7.2Hz，2H)，6.88(d，J＝15.3Hz，1H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，7.52(d，J＝15.3Hz，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ14.05，54.78，66.79，114.42，118.60，125.02，130.48，144.54，162.63；MS(ESI)：m/z243(M+1)。
122(R＝4-OH)：
71％产率；白色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.33(t，J＝7.2Hz，3H)，4.16(q，J＝7.2Hz，2H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，6.82(d，J＝15.6Hz，1H)，7.48(d，J＝15.6Hz，1H)，7.49(d，J＝8.7Hz，2H)；MS(ESI)：m/z227(M-1)。
将乙烯基磺酸乙酯(2mmol)和四丁基溴化铵(2.2mmol，1.2当量)在丙酮(12ml)中的混合物回流21h。在通过旋转蒸发器去除丙酮以后，将残余物溶解于DCM(100ml)中，用H2O(30ml)和盐水(30ml)洗涤，并干燥。通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的5-10％MeOH洗脱)纯化粗产物，得到四丁基铵乙烯基磺酸盐。
121(R＝4-OMe)：
85％产率；白色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.01(t，J＝7.2Hz，12H)，1.39-1.72(m，16H)，3.25(m，8H)，3.80(s，3H)，6.80(d，J＝15.6Hz，1H)，6.92(d，J＝8.7Hz，2H)，7.20(d，J＝15.6Hz，1H)，7.43(d，J＝8.7Hz，2H)；MS(ESI)：m/z213(M-1)。
123(R＝4-OH)：
40％产率；白色固体；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.00(t，J＝7.2Hz，12H)，1.38-1.68(m，16H)，3.25(m，8H)，6.74(d，J＝15.6Hz，1H)，6.77(d，J＝8.7Hz，2H)，7.16(d，J＝15.6Hz，1H)，7.33(d，J＝8.7Hz，2H)；MS(ESI)：m/z199(M-1)。
用于制备肉桂基胺的一般规程
在室温，向搅拌的邻苯二甲酰亚胺钾盐(20g，108mmol)和四丁基溴化铵(1.04g，3.24mmol，0.03当量)在无水DMF(75ml)中的混合物中，加入烯丙基氯(8.84mL，108mmol)，并将所述混合物在室温搅拌22h，产生浅黄色悬浮液。通过加入冷的H2O(150mL)，猝灭反应，并将所述混合物搅拌10min(在该时间内施加冰浴，以辅助沉淀)。滤出得到的白色悬浮液，用H2O(3×50mL)洗涤，并风干，得到N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺(8.5g，42％产率)，为白色固体。
将芳基溴(10mmol)、N-烯丙基邻苯二甲酰亚胺(1.93g，10.3mol，1.03当量)和三乙胺(2.78ml，20mmol，2当量)放入50mL三颈圆底烧瓶中，在氩冲洗(flash)下将乙酸钯(23mg，0.1mmol，0.01当量)和三-O-甲苯基膦(61mg，0.2mmol，0.02当量)加入烧瓶中，并在氩下在100℃(浴温)加热整个混合物，并搅拌16h。在将反应混合物冷却至环境温度以后，加入DCM(50mL)和H2O(50mL)，并在室温搅拌10min。分离DCM层，并用DCM(2×50mL)萃取水层。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的DCM层，并干燥。通过旋转蒸发器蒸发溶剂至干燥，并通过快速柱色谱法(用在己烷中的30-80％EtOAc洗脱)纯化粗产物，得到N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺。
将N-肉桂基邻苯二甲酰亚胺(3mmol)与65％肼水合物(6mmol，2当量)和MeOH(10mL)混合，并将所述混合物在70℃加热2h。在用旋转蒸发器去除溶剂以后，用1N NaOH(30mL)处理固体残余物，并用EtOAc(4×50mL)萃取得到的混合物，并干燥。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，通过快速硅胶柱色谱法(用在DCM中的5-20％MeOH洗脱)进行纯化，得到肉桂基胺。
117(R＝4-OH)：
30％产率；白色固体；1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ3.34(d，J＝6.0Hz，2H)，6.20(dt，J＝15.6，6.0Hz，1H)，6.43(d，J＝15.6Hz，1H)，6.69(d，J＝8.8Hz，2H)，7.19(d，J＝8.4Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)：δ43.12，115.10，125.43，127.17，129.74，130.45，157.29；MS(ESI)：m/z 133(M-NH3)。
119(R＝4-OMe)：
80％产率；灰白色固体；1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ3.32(d，J＝6.0Hz，2H)，3.74(s，3H)，6.15(dt，J＝15.6，6.0Hz，1H)，6.42(d，J＝15.6Hz，1H)，6.82(d，J＝8.8Hz，2H)，7.28(d，J＝9.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)：δ43.23，54.25，113.52，127.04，127.28，129.52，129.87，159.18；MS(ESI)：m/z 147(M-NH3)。
用于制备4-羟甲基肉桂酸124的规程：
将NaBH4(0.53g，14mmol)在THF/H2O(4∶1)(12ml)中的溶液逐滴加入冰冷的搅拌的4-甲酰基肉桂酸(2.47g，14mmol)在THF(25ml)中的溶液中，并将所述混合物在室温搅拌3h。通过加入4N HCl(20mL)来猝灭反应，并通过旋转蒸发器去除THF。用H2O(20mL)处理固体残余物，并用EtOAc(4×50mL)萃取。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤所述EtOAc萃取物，并干燥。从EtOAc重结晶所述粗产物，得到纯的4-羟甲基肉桂酸124(1.3g，52％产率)，为黄色固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ4.62(s，2H)，6.45(d，J＝16.2Hz，1H)，7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.56(d，J＝8.1Hz，2H)，7.65(d，J＝16.2Hz，1H)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ63.53，117.81，127.17，128.08，133.58，144.25，144.92，169.22；MS(ESI)：m/z 177(M-1)。
类似地合成和表征剩余的化合物，或如果可商业得到的话，进行购买。
实施例14-17.在丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000中的研究
下述方法适用于实施例14-17：
细菌株、质粒和生长条件。
在图31的表中，列出了在该研究中使用的细菌株和质粒。在King氏B(KB)培养基中在28℃常规地培养野生型假单胞菌菌株(King 1954)，并在Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃常规地培养大肠杆菌菌株。为了诱导T3SS基因，如以前所述(Huynh等人1989)，在补充了10mM果糖的HIM中培养DC3000。在必要时，将下述浓度的抗生素加入生长培养基中：卡那霉素，50μg/ml；利福平，34μg/ml(用于假单胞菌细胞系的灭菌)。在图31的表中，列出了在该报告中的PCR所用的引物。如下构建启动子-探针质粒。分别使用掺入了BamHI和EcoRI限制位点的phrpAF和phrpAR引物，PCR扩增hrpA启动子区。用BamHI和EcoRI消化编码hrpA启动子的496碱基对DNA片段，并克隆进用相同酶消化的pPROBE-NT中。使用大肠杆菌S17-1λ-pir作为供体菌株，通过接合作用，将该构建体导入DC3000中。
启动子活性试验。
如以前所述(BD Biosciences，CA)(Peng等人2006)，使用FACSCalibur流式细胞计分析hrpA的表达。如文献所述(Li等人2009)，在KB培养基中培养携带启动子-探针phrpA或pPROBE-NT(载体对照)的野生型DC3000过夜，并转移至HIM或补充了不同化合物的HIM中。通过使用流式细胞术测量GFP强度，监测在DC3000中的hrpA的启动子活性。
过敏反应和毒力试验
将细菌细胞(来自培养于KB培养基中的过夜培养物)重新悬浮于无菌的dH2O中。将细胞悬浮液与化学试剂一起混合，并静置30分钟，然后接种植物。将Nicotiana tabacum cv.Xanthi植物用于HR试验。使用1×108细胞/ml和25μM、50μM、100μM、250μM或500μM TCA，使用无针注射器(Fu等人2006)，对烟叶进行压力浸润。在接种后18h，给植物拍摄照片，并评估指示HR的宏观组织收缩。
在4-5周龄番茄植物中进行毒力试验。使用0.02％Silwet L-77(LehleSeeds，Round Rock，TX)，在dH2O中将细菌细胞悬浮液调节至6×105细胞/ml。用阴性对照溶液(含有0.02％Silwet L-77和DMSO的dH2O)、阳性对照溶液(DC3000在含有0.02％Silwet L-77和DMSO的dH2O中)或化学处理溶液(DC3000在含有0.02％Silwet L-77和250μM TCA的dH2O中)，对Lycopersicon esculentum cV.Moneymaker植物进行浸渍接种。将叶风干，并用塑料穹顶覆盖植物，返回生长室。在接种后5天，使用改进的评分***(Kozik和Nowakowska 2010)，对植物的疾病征状评分。计数在番茄上的细菌斑点的病变，并使用下述DSI等级对植物评分：0＝每株植物无病变，1＝1-10个病变，2＝11-20个病变，3＝21-40个病变，4＝＞40个病变。
RNA提取和实时PCR分析。
在KB培养基中在28℃培养DC3000过夜，并在补充了DMSO或250μM TCA的HIM培养基中传代培养9h。使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)，分离总细菌RNA，并用Turbo无DNA的DNA酶试剂盒(Ambion，Austin，TX)处理。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)，从0.8μg总RNA合成cDNA。将Real Master MixSYBR ROX(5PRIME，Gaithersburg，MD)用于实时PCR反应，以定量不同样品中的靶基因的cDNA水平。通过Opticon 2***(Bio-Rad)，收集数据，并使用Pfaffl和同事描述的相对表达软件工具(Pfaffl等人2002)进行分析。2个持家基因gyrA(PSPTO1745)和gap1(PSPTO1287)用作数据分析的内源对照。在表1中，列出了在该研究中使用的引物对。所述引物的PCR效率是：gyrA，1.93；gap1，2.08；和hrpW，1.93。
免疫印迹分析
使用由Alan Collmer博士(Cornell University，Ithaca，NY)提供的抗-HrpW抗体，通过免疫印迹来测定HrpW蛋白水平。如以前所述，经过修改(Yuan和He 1996)，进行样品制备。在King氏B培养基中在28℃培养野生型DC3000过夜。用hrp-诱导培养基(HIM)洗涤培养物，并重新悬浮于40ml相同的培养基中，达到0.1的在600nm的光密度(OD)。为了测定TCA对HrpW蛋白水平的影响，以250μM的终浓度，将溶解于DMSO中的TCA加入培养物中，并在适度摇动下在28℃培养所述培养物。将DMSO加入单独的培养物中，作为阴性对照。在9h以后，通过在4,000×g离心10min，收集细胞，并重新悬浮于1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS；137mM NaCl，2.7mMKCl，4.3mM Na2HPO4，和1.47mM KH2PO4[pH 7.4])之间。将沉淀的细胞重新悬浮于1×样品缓冲液(2％w/v十二烷基硫酸钠，2％v/v甘油，2mMβ-巯基乙醇，50mM Tris-HCl[pH6.8]，和0.01％w/v溴酚蓝)中，并使用DryBath培养箱(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)在98℃热处理10min。用Amicon Ultra-4离心过滤单元(30kDa截止)(Millipore，Billerica，MA)，将上清液蛋白浓缩100倍，并与相同体积的2×样品缓冲液混合，并热处理。类似地热处理细胞沉淀物。如以前所述(Li等人2009)，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹分析。按照生产商的说明书，使用BrightStar BioDetect Kit(Ambion，Austin，TX)进行化学发光检测。
实施例14.TCA会抑制T3SS hrpA的基因表达，但是不抑制细菌生长
为了测定抑制hrpA启动子活性而不影响细菌生长的TCA的最大浓度，在HIM和补充了25μM、50μM、100μM、250μM或500μM TCA的HIM中，培养携带phrpA的DC3000。如上所述，使用流式细胞术，在6h和9h时测量启动子活性。如下测定细菌生长：取出每种培养物的样品，并将系列稀释物斑点涂布在King氏B琼脂(King等人1954)上，然后进行启动子活性试验。在28℃温育48h以后，计数菌落。将100μM TCA加入生长培养基中(用于筛选化学文库的浓度)，导致hrpA启动子活性的3倍降低，而更低浓度的TCA(25μM或50μM)具有更低的实质作用(图32)。补充了250μM和500μM浓度的TCA的HIM，造成hrpA启动子活性的几乎完全抑制，这与在空载体对照(含有pPROBE-NT的DC3000；图32和图33)中测得的表达水平类似。在对照培养物(0μM TCA)和加入了250μM或更低浓度的TCA的培养物中，在6h和9h时的DC3000的集落计数是类似的，而在含有500μM TCA的培养物中，集落计数稍微更低(图33)。这些结果提示，对DC3000hrpA的抑制程度与加入生长培养基中的TCA的浓度成比例。另外，当将250μM或更低浓度的TCA加入HIM中时，TCA既不会显著抑制也不会增强DC3000的生长。
实施例15.TCA会抑制DC3000在烟草中引起HR的能力
在DC3000中，编码T3SS的组分的基因中的突变会导致不能在非宿主中引起HR(Collmer等人2000)。由于TCA会在体外抑制hrpA(T3SS的一种重要组分)的表达，检查了TCA在植物内抑制HR的能力。将DC3000(OD600＝0.1)和在DMSO中的25μM、50μM、100μM、250μM或500μM TCA注射进烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的叶中。也将与类似量的TCA相对应的DMSO浓度注射进烟草植物中作为阴性对照。在浸润后18小时，评估烟叶的HR征状。当将DMSO或TCA分别浸润进烟叶中时，没有观察到组织损伤或HR的可见征象(数据未显示)。与250μM TCA相比，当将细菌细胞浸润进植物中时，DC3000对HR的引起被完全抑制(图34A)。100μM TCA不能完全阻断HR，但是与用50μM或25μM和细菌细胞浸润烟叶时观察到的那些征状相比，征状的严重性稍微更低。这些结果揭示，TCA不仅抑制编码T3SS菌毛的重要结构组分的hrpA基因的表达，而且也在植物内起抑制DC3000在非宿主中引起HR的能力的功能。该效应最可能是由于功能性的T3SS的缺少。
在初步筛选化学文库以后，发现几种化合物对hrpA启动子活性几乎不具有或不具有影响。选择这些TCA类似物之一(104)作为阴性对照，以评价TCA在植物内抑制T3SS的特异性。将DC3000(OD600＝0.1)与DMSO或与25μM、50μM、100μM、250μM或500μM Y104(与用于评价TCA的那些相同的浓度)浸润进烟叶中，并在18h以后评分HR征状。在测试的所有浓度，104在抑制HR方面是无效的(图34B)。这些结果指示，TCA对DC3000的造成HR的能力的抑制活性是特异性的。另外，TCA的结构对于它对HR的抑制作用而言是重要的。
实施例16.TCA对DC3000的HrpW的影响。
T3SS负责毒力和辅助蛋白的易位，所述辅助蛋白在植物中促成疾病(Lindeberg等人2006)。HrpW是T3SS分泌的Harpin结构，其能够在烟草上引起HR(Charkowski等人1998)。在TCA中培养的DC3000细胞中的hrpWmRNA和HrpW蛋白水平的量，可以充当所述细菌在烟草植物中引起的HR应答的指示器(Wei等人2000)。进行实时PCR以检查TCA对hrpW表达的影响。与T3SS在单独的HIM中的诱导相比，在补充了250μMTCA的HIM中观察到显著更低量的hrpW mRNA(相对表达比0.07，P＝0.04)。在培养于HIM或补充了250μM TCA的HIM中的DC3000上，进行免疫印迹分析。当在补充了250μM TCA的HIM中培养DC3000细胞时，HrpW在培养物上清液中不存在，且在全细胞裂解物中也是不可检测的(图35)。这些结果指示，TCA会抑制所述细胞生产和分泌HrpW蛋白。我们的结果证实，当在HIM或含有DMSO(TCA溶剂)的HIM中培养DC3000时，在类似的强度水平检测到HrpW蛋白，这提示，在该研究中使用的DMSO浓度不会造成所述细菌中的HrpW生产的改变。
实施例17.TCA prevents DC3000from causing disease in番茄。
总之，上述结果指示，TCA会通过抑制它的表达而特异性地阻断T3SS的作用。检查了TCA对在番茄植物中的毒力的影响。如在方法中所述，用阴性对照处理(含有0.02％Silwet L-77和DMSO的dH2O)、阳性对照处理(DC3000在含有0.02％Silwet L-77和DMSO的dH2O中)或化学处理(DC3000在含有0.02％Silwet L-77和250μM TCA的dH2O中)浸渍接种Lycopersicon esculentum cv.Moneymaker植物。如在方法中所述，计数每株植物的叶上的细菌斑点的病变，并用疾病严重性指数(DSI)对植物分类。在接种后5天时，在用DC3000和250μM TCA、或用阴性对照处理处理过的番茄植物中没有观察到细菌斑点病变(图36A)，对它们都给出0的DSI评分。对用DC3000处理过的植物都给出4的DSI评分(图36B)。
实施例18.筛选铜绿假单胞菌的T3SS的抑制剂/诱导物
为了鉴别PA01的T3SS抑制剂，使用含有无启动子绿荧光蛋白(gfp)基因的启动子-探针载体pPROBE-AT来构建exoS启动子-gfp质粒报告物pATexoS。在含有二甲基亚砜(DMSO；化学化合物的溶剂)或补充了250μM每种化合物的T3SS-诱导培养基中，培养含有pATexoS的PA01，并在6h时通过使用流式细胞术测量GFP强度来评估启动子活性。筛选了101种化合物(合成了58种，商业得到43种)。化合物027、032、101和149在250μM的终浓度抑制exoS表达，比样品平均值低至少1个标准差(Z评分≤-1)(图37A-E)。Z评分(或标准评分)指示观察结果或数据比平均值高或低多少个标准差[z＝(x-μ)/σ，其中x是要标准化的粗评分，μ是群体的均值，σ是群体的标准差]。发现化合物027、032、101和149起铜绿假单胞菌的T3抑制剂的作用，在250μM时微小地改变细菌生长(图37A、C和D)。另外，发现2种化合物103和134在相同的浓度会诱导exoS表达，比样品均值高至少4个标准差(Z评分≥4)(图37A和B)。但是，化合物103和134表现出对细菌生长的某种抑制。
实施例19.评价化合物对exoS表达和细菌生长的剂量依赖性的影响
为了测定化合物的有效浓度，测试了潜在抑制剂对exoS表达和细菌生长的剂量依赖性的影响。在补充了200mM NaCl的LB中预培养携带pATexoS的铜绿假单胞菌细胞，并转移至含有200mM NaCl、10mM NTA和不同浓度的化合物(20、50、100和250μM)或DMSO的新鲜LB中6h。如图37A和表17所示，027在20μM时抑制exoS表达，但是101没有。在50μM剂量，027和101二者在类似的水平抑制exoS表达，且该抑制作用随着化合物浓度增加而增加(图38A和表17)。这2种化合物在不同化合物浓度(对于101，最高250μM；对于027，最高500μM)对细菌生长仅具有微小影响(图39A)。另一方面，2种T3诱导物103和134在20μM表现出exoS表达的显著诱导(图38B和表17)。该诱导作用随着化合物浓度增加而增加(图38B和表17)，并观察到化合物浓度和细菌生长之间的反相关性(图39B)。exoS表达的这些抑制/诱导，由低态表达细胞和高态表达细胞之间的移位细菌群体造成(图40)。
表17.在不同浓度的化合物下的流式细胞术的实际读数(exoS表达)
Figure BDA00002255629901101
实施例20.构效关系(SAR)
在筛选T3SS抑制剂的同时，发现几种化合物对exoS启动子活性几乎没有或没有影响，诸如004、132和137。有效的T3SS抑制剂与无效的化学试剂的对比揭示，除了苯酚环的羟基已经被酰胺基替代以外，027的结构与004的结构相同(表18)。并且，101与004类似(羧基被羧甲基替代)(表18)。鉴于004对exoS表达几乎没有影响(图38A和表17)，表明这2个官能团对它们的exoS-抑制作用而言可能是重要的。同时，铜绿假单胞菌T3诱导物103与更低功能的132(在苯酚环上没有羟基)和无功能的137(在羰基-氮基团上的羟基被甲基替代)共享它的结构，这指示，在这2个官能团中，一个会增强化合物的作用，另一个对于它的诱导活性而言是关键性的(表18)。
表18.构效关系
Figure BDA00002255629901111
实施例21.在解淀粉欧文氏菌273中的研究
在该研究中使用野生型解淀粉欧文氏菌273。如下构建启动子-探针质粒phrpA。扩增解淀粉欧文氏菌273的hrpA启动子区，并克隆进pPROBE-NT中，以生成PhrpA。将质粒PhrpA电穿孔进解淀粉欧文氏菌273中。使用FACS Calibur流式细胞计(BD Biosciences，CA)，分析hrpA的表达。在含有二甲基亚砜(DMSO；化学化合物的溶剂)的hrp-诱导培养基(HIM)中或在补充了100μM每种化合物的HIM中，培养含有phrpA的野生型解淀粉欧文氏菌273，并在6h和9h时通过使用流式细胞术测量GFP强度来评估启动子活性(表19)。处理：
Ea273(pPROBE-NT)：携带pPROBE-NT的解淀粉欧文氏菌273(载体对照)
Ea273(phrpA)：携带phrpA的解淀粉欧文氏菌273
HIM：hrp诱导培养基
###：补充了指示的化合物的HIM
表19.在HIM或补充了指示的化合物的HIM中的解淀粉欧文氏菌273hrpA的表达
Figure BDA00002255629901121
Figure BDA00002255629901131
Figure BDA00002255629901141
贯穿本公开内容，本发明的不同方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和间接，不应当解释为对本发明的范围的固定限制。因此，本领域技术人员会理解，为了任意的和所有的目的，特别是以提供书面描述的方式，在本文中公开的所有范围也包括它们的任意的和所有的可能的子范围和子范围的组合，以及在所述范围内的整数和分数数字值。上面的发明详细描述是本发明的某些实施方案的示例，无意限制本发明的范围。
在本文中引用的所有专利、出版物和参考文献特此通过引用完整地并入。在本公开内容和并入的专利、出版物和参考文献之间冲突的情况下，以本公开内容为准。

Claims (57)

1.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的式(III)化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800011
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中A是芳基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中A是杂芳基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中n是0。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中n是1或2。
6.根据权利要求1-3或5中任一项所述的方法，其中每个R2独立地选自：烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯和酰氨基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯、氨基、酰氨基、磺酸、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
8.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的式(IV)化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800021
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
9.根据权利要求8所述的方法，其中A是芳基。
10.根据权利要求8所述的方法，其中A是杂芳基。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中R1是亚烷基、杂亚烷基或键。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中n是0。
13.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中n是1或2。
14.根据权利要求8-11或13中任一项所述的方法，其中每个R2独立地选自：烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯和酰氨基。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的方法，其中R7选自：异羟肟酸、肼基羰基、氨基、酰氨基、磺酸、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
16.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：
使所述细菌接触有效量的式(V)化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800031
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、氟代、溴代、碘代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
17.根据权利要求16所述的方法，其中A是芳基。
18.根据权利要求16所述的方法，其中A是杂芳基。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中R1是亚烷基、杂亚烷基或键。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中每个R2独立地选自：烷基、羟基烷基、烷氧基、巯基、氟代、溴代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯和酰氨基。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯、氨基、酰氨基、磺酸、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
22.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的式(VI)化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800032
其中：
A选自：咪唑、噻吩、呋喃、噁唑、噻唑、喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩和咔唑；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是0、1、2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
23.根据权利要求22所述的方法，其中R1是亚烷基、杂亚烷基或键。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中n是0。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯、氨基、酰氨基、磺酸、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
26.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的式(VII)化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800041
其中：
A是芳基或杂芳基；
R1选自：亚烷基、杂亚烷基、氧、硫和键；
n是2、3、4或5；
每个R2独立地选自：烷基、烯基、炔基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、硫醚、磺基、甲硅烷基、膦酰基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯、酰氨基和杂环基；且
R7选自：羟基、羟基烷基、烷氧基、羧基、异羟肟酸、酰肼、肼基羰基、芳基、酯、氨基、酰氨基、硫代酰氨基、磺酰基、亚磺酸、磺酸、亚磺酸酯、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
27.根据权利要求26所述的方法，其中A是芳基。
28.根据权利要求26所述的方法，其中A是杂芳基。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中R1是亚烷基、杂亚烷基或键。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中每个R2独立地选自：烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、卤代、羧基、硝基、氨基、甲酰基、芳基、卤代烷基、酯和酰氨基。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中R7选自：羟基、羧基、异羟肟酸、肼基羰基、酯、氨基、酰氨基、磺酸、磺酸酯、膦酸、膦酸酯和取代的或未取代的二环杂芳族基团。
32.一种降低包含GacS/GacA-型***、HrpX/HrpY-型***、T3SS-型***和Rsm-型***中的至少一种的细菌的毒力的方法，所述方法包括：使所述细菌接触有效量的选自下述的化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800051
Figure FDA00002255629800061
Figure FDA00002255629800071
Figure FDA00002255629800081
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性的。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是肠杆菌科的成员。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌属于选自下述的细菌属：假单胞菌属、Dickeya、欧文氏菌属、固氮菌属、弧菌属、耶尔森菌属、果胶杆菌属、沙门菌属、衣原体属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、斯瓦尼菌属、志贺菌属和埃希氏菌属。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是选自下述的假单胞菌属种：致金色假单胞菌、绿针假单胞菌、荧光假单胞菌、边缘假单胞菌、丁香假单胞菌、托拉假单胞菌、绿黄假单胞菌和铜绿假单胞菌。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细菌是铜绿假单胞菌。
38.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是选自下述的欧文氏菌属相关的菌株：菊欧文氏菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、马铃薯黑胫果胶杆菌和解淀粉欧文氏菌。
39.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是选自下述的沙门菌属种：鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌。
40.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是茄科劳尔氏菌。
41.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细菌是选自下述的黄单胞菌属种：野油菜黄单胞菌、地毯草黄单胞菌和水稻白叶枯黄单胞杆菌。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述细菌与受试者有关，且其中通过将所述化合物施用给所述受试者，使所述细菌接触所述化合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者是植物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述组合物配制成：可润湿的粉末、水溶性的粉末、可乳化的浓缩物、水性溶液或浓缩物、乳剂、可喷洒的溶液、胶囊悬浮液、基于油或水的分散系、悬乳剂、悬浮液浓缩物、扑粉、可以与油混合的溶液、拌种剂、颗粒、超低体积制剂、微胶囊或蜡。
45.根据权利要求43-44中任一项所述的方法，其中经由水或溶剂中的至少一种，施用所述组合物。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中局部地施用所述组合物。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用给叶、茎、根、芽、果实、褶皱、残株、树皮、根、土壤或根际中的至少一种。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的方法，其中每天、每周、每月或每年施用所述组合物。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中将所述组合物喷洒在所述植物上。
50.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者是动物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述动物是人。
52.根据权利要求50-51中任一项所述的方法，其中所述组合物另外包含药学上可接受的载体或稀释剂。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中局部地、口服地或肠胃外地施用所述组合物。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中静脉内地、皮下地、肌肉内地或腹膜内地施用所述组合物。
55.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述细菌是在表面上，且其中通过使所述表面接触所述化合物，使所述细菌接触所述化合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述表面是在医学场所、工业场所、商业场所或住宅场所中。
57.选自下述的化合物或其盐：
Figure FDA00002255629800111
CN201180019127.2A 2010-02-16 2011-02-16 降低细菌的毒力的方法 Active CN102883602B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30502710P 2010-02-16 2010-02-16
US61/305027 2010-02-16
US33238510P 2010-05-07 2010-05-07
US61/332385 2010-05-07
PCT/US2011/025082 WO2011103189A1 (en) 2010-02-16 2011-02-16 Methods of reducing virulence in bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102883602A true CN102883602A (zh) 2013-01-16
CN102883602B CN102883602B (zh) 2017-07-18

Family

ID=44483288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180019127.2A Active CN102883602B (zh) 2010-02-16 2011-02-16 降低细菌的毒力的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9260382B2 (zh)
EP (1) EP2536275A1 (zh)
CN (1) CN102883602B (zh)
WO (1) WO2011103189A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105669519A (zh) * 2016-01-04 2016-06-15 北方民族大学 吲哚类化合物、制备方法及其作为抗耐药菌药物的应用
CN113233993A (zh) * 2021-05-18 2021-08-10 贵州大学 一种阿魏酸酰胺衍生物及其合成方法
CN113318000A (zh) * 2021-05-28 2021-08-31 福建莲珂科技有限公司 化妆品防腐剂及其作为化妆品配方成分的用途
CN114145300A (zh) * 2021-12-17 2022-03-08 华南农业大学 水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用
CN114480226A (zh) * 2022-04-02 2022-05-13 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用
CN114773237A (zh) * 2022-04-24 2022-07-22 南京大学 一类含磺酸酯结构的新型苯丙烯基羟肟酸衍生物及其制备方法和应用

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8193182B2 (en) 2008-01-04 2012-06-05 Intellikine, Inc. Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof
KR101897881B1 (ko) 2008-01-04 2018-09-12 인텔리카인, 엘엘씨 특정 화학 물질, 조성물 및 방법
KR101875720B1 (ko) 2011-01-10 2018-07-09 인피니티 파마슈티칼스, 인코포레이티드 이소퀴놀린온 및 이의 고체 형태의 제조 방법
EP2487159A1 (en) 2011-02-11 2012-08-15 MSD Oss B.V. RorgammaT inhibitors
WO2013059582A2 (en) * 2011-10-20 2013-04-25 Nupotential, Inc. Small molecule inhibitors of histone deacteylases
CA2862259A1 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Pharmacyclics, Inc. Cinnamic acid hydroxyamides as inhibitors of histone deacetylase 8
US8633182B2 (en) 2012-05-30 2014-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Indanyloxyphenylcyclopropanecarboxylic acids
US8828998B2 (en) 2012-06-25 2014-09-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors
CN103553968A (zh) * 2012-06-29 2014-02-05 常州大学 肉桂羟肟酸类化合物及其制备方法
BR112015002466B1 (pt) * 2012-08-10 2020-03-24 Toray Industries, Inc. Método para fabricar p-cumaramida
WO2014026330A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 3-AMINOCYCLOALKYL COMPOUNDS AS RORgammaT INHIBITORS AND USES THEREOF
WO2014026327A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-heteroaryl substituted benzoic acid compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof
WO2014026329A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. N-alkylated indole and indazole compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof
WO2015026796A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 The Trustees Of Princeton University Heterocycle analogs of cai-1 as agonists of quorum sensing in vibrio
WO2015026935A2 (en) * 2013-08-20 2015-02-26 City Of Hope Hdac8 inhibitors for treating cancer
US20150320755A1 (en) 2014-04-16 2015-11-12 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
CN104365598B (zh) * 2014-10-30 2016-03-30 江苏科技大学 咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用
WO2016130818A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Merck Sharp & Dohme Corp. SUBSTITUTED PYRAZOLE COMPOUNDS AS RORgammaT INHIBITORS AND USES THEREOF
EP3268358A1 (en) 2015-03-13 2018-01-17 Forma Therapeutics, Inc. Alpha-cinnamide compounds and compositions as hdac8 inhibitors
CN104823974A (zh) * 2015-04-13 2015-08-12 江苏科技大学 咖啡酸烷基酯的应用
US10344000B2 (en) 2015-10-27 2019-07-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted bicyclic pyrazole compounds as RORgammaT inhibitors and uses thereof
WO2017075182A1 (en) 2015-10-27 2017-05-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted indazole compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof
JP2018531958A (ja) 2015-10-27 2018-11-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． ＲＯＲγＴ阻害薬としてのヘテロアリール置換安息香酸及びその使用
CA3022188A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Research Triangle Institute Vinylogous phenethylamines as neurotransmitter releasers
CN109640999A (zh) 2016-06-24 2019-04-16 无限药品股份有限公司 组合疗法
KR102171321B1 (ko) 2018-01-31 2020-10-28 서울대학교산학협력단 Rtx 독소 생성 저해제 및 이를 이용한 비브리오균 감염증 치료용 조성물
WO2019151664A1 (ko) * 2018-01-31 2019-08-08 서울대학교산학협력단 Rtx 독소 생성 저해제 및 이를 이용한 비브리오균 감염증 치료용 조성물
CN109251090A (zh) * 2018-10-22 2019-01-22 河南工业大学 一种促进小麦萌发和提高小麦抗病性的微生物拌种剂
US11311506B2 (en) 2018-11-01 2022-04-26 The University Of Memphis Research Foundation Controlling biofilms with cyclopropanated fatty acids
KR20230124927A (ko) 2020-11-25 2023-08-28 아카제라 메디신즈, 인크. 핵산 전달을 위한 지질 나노입자, 및 관련 사용 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020086332A1 (en) * 1999-02-02 2002-07-04 Mahan Michael J. Method of reducing bacterial proliferation
WO2002068610A2 (en) * 2001-01-12 2002-09-06 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for affecting virulence determinants in bacteria
WO2008115118A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Innate Pharmaceuticals Ab Method and means for preventing and inhibiting type iii secretion in infections caused by gram-negative bacteria
WO2008124836A2 (en) * 2007-04-10 2008-10-16 Uwm Research Foundation, Inc. Methods of reducing virulence in bacteria

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5447903A (en) 1989-10-18 1995-09-05 Hoechst Aktiengesellschaft Herbicidal active substance combinations
US5994077A (en) 1997-01-31 1999-11-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Flourescence-based isolation of differentially induced genes
US6136542A (en) * 1998-05-13 2000-10-24 Institut Pasteur Method for screening for inhibitors and activators of type III secretion machinery in gram-negative bacteria
US20020102246A1 (en) 2000-05-08 2002-08-01 Novozymes A/S Antimicrobial compositions
WO2003069993A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Pharmessen Scientific, Inc. Antimicrobial therapeutic compositions and methods of use
US7196085B2 (en) 2002-04-30 2007-03-27 Kudos Pharmaceuticals Limited Phthalazinone derivatives
US20070128328A1 (en) 2004-12-10 2007-06-07 Shozo Tanada Bacterial growth inhibitor or bacteriostatic agent utilizing substances derived from acerola fruit
KR20080103090A (ko) 2006-03-10 2008-11-26 유조 츠치다 항미생물제 및 항미생물성 조성물
AU2008247252B2 (en) * 2007-05-02 2012-08-30 Ouro Fino Participacoes E Empreendimentos S.A. Process to produce biodiesel and/or fuel oil

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020086332A1 (en) * 1999-02-02 2002-07-04 Mahan Michael J. Method of reducing bacterial proliferation
WO2002068610A2 (en) * 2001-01-12 2002-09-06 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for affecting virulence determinants in bacteria
WO2008115118A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Innate Pharmaceuticals Ab Method and means for preventing and inhibiting type iii secretion in infections caused by gram-negative bacteria
WO2008124836A2 (en) * 2007-04-10 2008-10-16 Uwm Research Foundation, Inc. Methods of reducing virulence in bacteria

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105669519A (zh) * 2016-01-04 2016-06-15 北方民族大学 吲哚类化合物、制备方法及其作为抗耐药菌药物的应用
CN105669519B (zh) * 2016-01-04 2018-01-05 北方民族大学 吲哚类化合物、制备方法及其作为抗耐药菌药物的应用
CN113233993A (zh) * 2021-05-18 2021-08-10 贵州大学 一种阿魏酸酰胺衍生物及其合成方法
CN113233993B (zh) * 2021-05-18 2022-07-01 贵州大学 一种阿魏酸酰胺衍生物及其合成方法
CN113318000A (zh) * 2021-05-28 2021-08-31 福建莲珂科技有限公司 化妆品防腐剂及其作为化妆品配方成分的用途
CN114145300A (zh) * 2021-12-17 2022-03-08 华南农业大学 水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用
CN114480226A (zh) * 2022-04-02 2022-05-13 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用
CN114480226B (zh) * 2022-04-02 2023-06-02 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用
CN114773237A (zh) * 2022-04-24 2022-07-22 南京大学 一类含磺酸酯结构的新型苯丙烯基羟肟酸衍生物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US9260382B2 (en) 2016-02-16
WO2011103189A1 (en) 2011-08-25
EP2536275A1 (en) 2012-12-26
US20120322769A1 (en) 2012-12-20
CN102883602B (zh) 2017-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102883602A (zh) 降低细菌的毒力的方法
Fong et al. Disulfide bond-containing ajoene analogues as novel quorum sensing inhibitors of Pseudomonas aeruginosa
Fong et al. Itaconimides as novel quorum sensing inhibitors of Pseudomonas aeruginosa
US6555356B2 (en) Methods for microbial regulation
Dembitsky et al. Natural and synthetic small boron-containing molecules as potential inhibitors of bacterial and fungal quorum sensing
US20100249234A1 (en) Methods of reducing virulence in bacteria
CN101928271B (zh) 3-邻甲基苯基-2-氧代-1-氧杂螺[4,4]-壬-3-烯-4-醇及其衍生物
EA028392B1 (ru) Композиции и способы контроля нематод
KR20100096101A (ko) 박테리아 독성을 억제하는 방법 및 이에 대한 화합물
ES2850774T3 (es) Método para la producción de p-hidroxibenzaldehído por un microorganismo
CN106661080A (zh) 用于治疗和预防眼科疾病的缓释药物组合物
US20210179646A1 (en) Method for treatment of senescence-related disorders
Fang et al. speG is required for intracellular replication of Salmonella in various human cells and affects its polyamine metabolism and global transcriptomes
US10322112B2 (en) Compound combinations for attenuation of bacterial virulence
Huang et al. Cajaninstilbene acid analogues as novel quorum sensing and biofilm inhibitors of Pseudomonas aeruginosa
Zore et al. Synthesis and biological evaluation of fingolimod derivatives as antibacterial agents
CN107232210B (zh) 噻二唑类化合物在制备水稻细菌性秧苗立枯病防治药剂上的应用
CN108117528B (zh) 2,5-取代基-1,3,4-噁二唑砜类衍生物、其制备方法及应用
AU708962B2 (en) Methods for microbial regulation
CN114711230B (zh) 蚊虫性信息素及其在蚊虫防治上的应用
Ligon et al. Genetic modifications of Pseudomonas that enhance biological disease control
KR100826663B1 (ko) 오돈탈리아 코림비퍼러로부터 분리된 브로모페놀 화합물을함유하는 살진균용 조성물
He et al. Discovery of novel amide derivatives as potent quorum sensing inhibitors of Pseudomonas aeruginosa
CN109641005A (zh) 治疗法布瑞氏症
Wang et al. Novel aurone-derived piperazine sulfonamides: Development and mechanisms of action as immunostimulants against plant bacterial diseases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant