CN102876793B

CN102876793B - 单核苷酸多态性rs2058660在检测麻风病易感基因中的应用

Info

Publication number: CN102876793B
Application number: CN201210372029.3A
Authority: CN
Inventors: 刘健; 田洪青; 张福仁
Original assignee: Shandong Dermatopathy Cypridopathy Prevention And Cure Institute
Current assignee: Shandong Dermatopathy Cypridopathy Prevention And Cure Institute
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN102876793A

Abstract

本发明公开了单核苷酸多态性rs2058660在检测麻风病易感基因中的应用。本发明所保护的一个技术方案是检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs2058660的多态性的物质与其它物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。

Description

单核苷酸多态性rs2058660在检测麻风病易感基因中的应用

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性rs2058660在检测麻风病易感基因中的应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、***或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组(如疾病易感性)，药物基因组(药效、药物代谢差异和不良反应)和群体进化等研究中具有重大意义。

目前已有多种方法可用于SNP检测,如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片（张小燕等。用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理。中国生物工程杂志。2005,25(11):52～56）。

麻风病是一种由麻风分枝杆菌感染所致的慢性传染病，在发展中国家这仍然是一个严重的健康问题，每年全球新发病例数为250000。主要侵犯皮肤和外周神经，并导致不可逆性的神经功能损害和慢性致畸致残。这已被证明在麻风的流行中环境因素和宿主遗传因素起着至关重要的作用，估计遗传因素高达57%。

世界卫生组织的方案把麻风病的临床表现分为结核型和瘤型，分别对应了Th1（细胞介导）和Th2（体液介导）组织的人体的免疫应答。麻风病多样性的临床表现反映出人体对同种病原体的两种截然不同的免疫应答，这就说明遗传易感性在麻风发病中的重要性。遗传研究的结果表明遗传与麻风易感性和其临床亚型的病情进展都有关联。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供单核苷酸多态性rs2058660在麻风病方面的新用途。

本发明所提供的新用途是下述1）-9）中的至少一种：

1）检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

2）检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

3）检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型的物质在制备筛查麻风病患者产品中的应用；

4）检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型的物质在制备检测麻风病易感性产品中的应用；

5）人基因组中的单核苷酸多态性在制备检测麻风病易感基因的产品中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs2058660的DNA序列多态性；

6）人基因组中的单核苷酸多态性在制备鉴定或辅助鉴定麻风病易感基因的产品中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs2058660的DNA序列多态性；

7）人基因组中rs2058660的多态性在制备筛查麻风病患者产品中的应用；

8）人基因组中rs2058660的多态性在制备检测麻风病易感性产品中的应用；

9）包括检测人基因组中rs2058660多态性的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：

a）检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，

b）鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，

c）筛查麻风病患者产品，

d）检测麻风病易感性产品。

在本发明的实施例中，所述麻风病具体为中国汉族人群及少数民族麻风病。

rs2058660是人染色体2q12.1上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(C/T，在其互补链上则为G/A)。所述rs2058660基因型是CC、CT或TT。所述CC是rs2058660位点为C的纯合型，所述TT是rs2058660位点为T的纯合型，所述CT是rs2058660位点为T和C的杂合型。所述检测人基因组中rs2058660的多态性或基因型具体可为检测rs2735591的核苷酸种类。

实验证明，rs2058660在由5503个麻风病患者组成的病例群体和由4971个正常人组成的病例对照群体的P值是4.57×10^-19,相对危险度是1.30，说明rs2058660是与麻风病相关的单核苷酸多态性。

实验证明，rs2058660的三个基因型中，TT基因型的个体在正常人群体中的比例是21.0%，明显低于麻风病患者群体中的比例30.6%。在实际应用中，可将检测rs2058660的多态性的物质与其它物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。

其中，检测人基因组中rs2058660的多态性的物质可为通过下述至少一种方法确定rs2058660的多态性所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。

本发明的一个实施例中，采用PCR引物扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，对得到的延伸产物的序列进行检测，确定rs2058660的多态性和基因型。所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs2058660在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列3和序列4所示的单链DNA。所述延伸引物根据人基因组中rs2058660上游（不包括该SNP位点）设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中rs2058660的前1位核苷酸，如所述延伸引物具体可为序列表中的序列6所示的单链DNA，当然也可将序列6所示的单链DNA按照人基因组中rs2058660的下游序列延长一个以上核苷酸，或按照人基因组中rs2058660的下游序列缺失一个以上核苷酸，只要能使该单碱基延伸引物的3′末端延伸出rs2058660位点的核苷酸即可。

本发明在一个来自中国人群的样本（5503个麻风病患者和4971个健康者）中发现rs2058660是与麻风病相关的单核苷酸多态性。可将检测rs2058660的多态性的物质与其它物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。

附图说明

图1为rs2058660的关联区域。

左侧纵轴显示为SNP的P值，右侧纵轴显示为重组率，横轴显示其物理位置。各区域中SNP与本实验阳性SNP位点rs2058660的相关系数（r2）用不同颜色标记，箭头指示的为本实验的阳性SNP rs2058660、区域中P值最小SNP位点以及以往报道过的SNP，P值最小的SNP位点rs1916307、以往报道与哮喘相关的位点rs3771166均与本实验阳性SNP位点rs2058660无关联，与乳糜泻相关的位点rs917997、rs13015714与阳性位点强关联（r²＞0.8）。重组率的估算基于千人基因组中中国及日本人群样本。图中注释的基因源于(http://genome.ucsc.edu/)。

图2为rs6871626的关联区域。

左侧纵轴显示为SNP的P值，右侧纵轴显示为重组率，横轴显示其物理位置。各区域中SNP与本实验阳性SNP位点rs6871626的相关系数（r²）用不同颜色标记，箭头指示的为本实验的阳性SNP rs6871626、区域中P值最小SNP位点以及以往报道过的SNP，P值最小的位点rs1422877以及与克罗恩氏病相关的rs10045431，多发性硬化症相关的rs2546890，银屑病相关的rs2546890、rs3213094、rs2082412，关节病型银屑病相关的rs12188300，强直性脊柱炎相关的rs6556416均与阳性SNP位点rs6871626无关联（r²＜0.01）。重组率的估算基于千人基因组中中国及日本人群样本。图中注释的基因源于(http://genome.ucsc.edu/)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、rs2058660是与麻风病相关的单核苷酸多态性

2009年发明人所在研究小组采用全基因组关联研究（GWAS）在中国汉族人群中发现了麻风病的7个易感基因(CCDC122，C13orf31,NOD2,TNFSF15,HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5个基因以NOD2为中心建立起一个信号通路(Zhang,F.R.,Huang,W.,Chen,S,M.,Sun,L.D.,Liu,H.,Li,Y.,Cui,Y.,Yan,X.X.,Yang,H.T.,Yang,R.D.et al.(2009)Genomewide association study of leprosy.N.Engl.J.Med.,361,2609-2618.)，2011年继GWAS后又发现了2个麻风易感基因(IL23R和RAB32)(Zhang,F.,Liu,H.,Chen,S.,Low,H.,Sun,L.,Cui,Y.,Chu,T.,Li,Y.,Fu,X.,Yu,Y.etal.(2011)Identification of two new loci at IL23R and RAB32that influence)。麻风病作为一类多个微效基因共同起作用的复杂性疾病,目前发现的9个易感基因位点仅是其易感基因谱的冰山一角,更多的麻风易感基因尚待进一步发现。

候选基因及SNP的选择

发明人通过PUBMED的GWAS官网(http://www.genome.gov/26525384)，查阅了12个CD（克罗恩病）的GWAS研究和2个UC（溃疡性结肠炎）的GWAS研究。从中选出位于118个基因上的155个与CD或UC或两者相关的SNPs（p<5.0×10^-8）。排除位于MHC区域的7个SNP和15个位于5个已知的麻风易感基因（NOD2，TNFSF15，IL23R，C13ORF31和LRRK2）上的SNPs。剩余的133个SNPs，包括75个CD的相关SNPs，54个UC相关的SNPs，41个IBD（MIM266600）（CD和UC）相关的SNPs。这些点将在来自中国人群的4个独立样本中被验证。

伦理声明

本研究通过了山东省医学科学院皮肤病与性病学研究机构伦理委员会批准，所有麻风病患者及健康对照者均签署了知情同意书。

研究对象

来自中国人群的四个独立样本，这四个独立样本中共有4971名麻风病患者，5503名健康对照者。他们均为无血缘关系的独立个体。临床分型、家族史情况及发病年龄等信息通过病历采集。样本均通过标本的质控。麻风病患者的诊断至少由两名皮肤科专家同时确诊（临床依据包括爪形手、畸形足及病理依据等）。健康对照者均无麻风家族史及其他面议疾病病史。

其中，中国麻风病患者的诊断标准是符合下述4条中的2条或2条以上，或符合第3条者确立诊断：1、皮损伴有感觉障碍及闭汗，或有麻木区；2、周围神经受累，表现为神经干粗大伴相应功能障碍；3、皮损组织切片或组织液涂片查到麻风杆菌；4、病理可见特征性改变。

健康对照者的诊断标准：无麻风病史及其他传染病病史,无其他自身免疫性疾病病史及家族史。

表1显示了样本1-4的基本信息。

表1、4971名中国麻风病患者和5503名健康对照者的基本情况

^a样本来自中国华东的山东、安徽和武汉省

^b样本来自中国华东的山东、安徽和江苏省

^c样本来自中国华南的云南、贵州和福建省

^d样本来自中国华南的云南、贵州和福建省。

本发明应用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技术（San Diego，USA）分析4组独立麻风样本的基因型。第一阶段中，对来自中国北方的1504名麻风病患者和1502名健康对照者的133个SNPs进行了基因分型，其中119个被成功分型。19个SNPs的p值小于0.05，包括9个CD的SNPs，8个UC的SNPs和2个IBD的SNPs。第二阶段中，上述的19个SNPs在另一个独立的中国人群中被验证。该人群分为3组：1）来自中国北方汉族的1154名麻风病患者和2605名健康对照者；2）来自中国南方汉族的1165名麻风病患者和648名健康对照者；3）来自中国南方少数民族的1148名麻风病患者和748名健康对照者（壮族：358名麻风患者和323名健康对照者；苗族：277名麻风患者和190名对照者；彝族：366名麻风患者和182名健康对照者；其它民族：147名麻风患者和53名健康对照者）。

在4组独立样本中（其遗传异质性的p>0.05），发现了2个新的相关的SNPs，即位于2q12.1的rs2058660和位于5q33.3的rs6871626。综合分析所有样本（4971名麻风患者和5503名健康对照者）后，得出2个SNPs的p值分别为4.57×10^-19和3.95×10^-18，OR值分别为1.30和0.75。

表2.rs2058660在4个独立样本和全部样本的关联分析结果

^a用于评估OR值的等位基因。

^b在四个独立样本中检测等位基因的平均频率。

表3.rs6871626在4个独立样本和全部样本的关联分析结果

^a用于评估OR值的等位基因。

^b在四个独立样本中检测等位基因的平均频率。

接着发明人在先前已经发表的GWAS数据集中在这两个新基因座附近区域研究了两基因的相关证据（Zhang FR，Liu H,Chen S,Low H,Sun L,Cui Y,Chu T,Li Y,Fu X,Yu Y,et al.(2011).Identification of two new loci at IL23R and RAB32that influencesusceptibility to leprosy.Nat Genet.43,1247-1251）。为了最大限度的覆盖该基因变异，发明人们应用来自千人基因组计划的遗传变异数据集导入GWAS数据集，千人基因组计划包括来自于非洲（246样本），美洲（181样本）、亚洲（286个样本）以及欧洲（379样本）总计1092个样本的不同祖先的个体。保证个体基因型概率＜90%，SNP的导入＜80%，MAF<5%，缺失率＞1%的个体在下一步的分析中被排除在外。总之，有6593个样本（706个麻风患者和5587个对照个体）和1,987,713SNP通过质量控制仍然保留在相关分析中。

Rs2058660位于2q12.1一个480kb的连锁不平衡区域内,其包含5个基因IL1RL1,IL18RAP，IL18R1,SLC9A4和SLC9A2(图1)。IL1RL1,IL18RAP和IL18R1是位于2q12区域的细胞因子受体簇的一部分，IL1RL1编码IL33受体，IL18RAP和IL18R1编码IL18受体。IL33作为配体选择性表达于Th2细胞和肥大细胞，并且刺激Th2相关细胞因子的生成。

Rs6871626位于5q33.3一个只有40kb很小的LD区域内(图2),该区域内仅有一个基因(LOC285627)的功能尚无明确。然而，IL12B位于该LD区域附近，且为强烈的生物学候选基因。IL12B编码异二聚体白介素IL-12和IL-23的p40亚基。Rs2058660和Rs6871626这两个位点提示IL18RAP/IL18R1和IL12B作为麻风的新的易感基因，参与了麻风中IFN-r转录表达的调节过程。

其中，基因分型的方法如下：

133个SNPs采用Sequenom MassArray(San Diego,USA)平台验证，每个样本约用到15ngDNA。首先提取外周血的基因组DNA，标准化后，样本DNA经多重PCR反应扩增包括SNP位点在内的基因组DNA片段，扩增产物进行SNP位点特异性单一链的延伸，延伸产物脱盐并转移到384孔的芯片上。质谱仪（MALDI-TOF MS）进行等位基因的检测，采用Sequenom Mass ARRAY分型软件对检测结果进行分析。

1、全血标本采集

在知情同意，并签署书面同意书的情况下采集研究对象外周静脉血5ml，放置于EDTANa₂抗凝管中，置-80℃冰柜储存备用。

2、DNA浓度标准化包括如下步骤：

1）利用NanoDrop-1000浓度测试仪准确测定每一份需要标准化的样本DNA浓度和OD比值（A260/A280、A260/A230）。

2）建立电子表格，排定每个样本孔需要加入的DNA编号。

进行Sequenom MassArray分型的样本，在每96孔板上留有空白对照和重复样本对照。

3）按照电子表格的顺序，加入已测定浓度的DNA。

对于进行Sequenom MassArray分型的样本要求实验浓度为12-30ng/μl，一般以18ng/μl为佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之间、A260/230介于1.5-2.3，如DNA浓度高于18ng/ul则加入适量FG3，将浓度标化至18ng/ul；如DNA浓度低于12ng/ul，则重新从血液提取合格的DNA。浓度在12—18ng/μl间直接加入。

离心后贴上粘性锡箔纸，并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。

4）在平板离心机上，3000g离心3分钟，存放于-20℃备用。

3、多重PCR

其中，多重PCR中扩增包括rs6871626在内的基因组DNA片段的引物如下：

ACGTTGGATGGCAGAGAAAGTTACCTGTCC（序列表中的序列1）和

ACGTTGGATGCTGCCATTATGGGCTAAGTG（序列表中的序列2）。

多重PCR中扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段的引物如下：

ACGTTGGATGCAGCCCCATTAGCAGTAAAT（序列表中的序列3）和

ACGTTGGATGAGCTCCACTTAACACCAGTC（序列表中的序列4）。

4、SNP位点特异性单一链的延伸反应

其中，延伸引物根据人基因组中SNP位点上游（不包括该SNP位点）设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中该SNP位点的前1位核苷酸。rs6871626的延伸引物的序列是TGTCCTTCATCACTTGG（序列表中的序列5）。rs2058660的延伸引物的序列是TGGCCCCATTAGCAGTAAATGCCCTTT（序列表中的序列6）。

5、数据质量控制

1)对分型的SNP进行call rate计算，去除call rate<95%的SNP或等位基因频率<0.01的SNPs;

2)对SNP进行遗传平衡检验，去除偏离遗传平衡定律的SNP（对照样本中Hardy-Weinberg平衡检验的P≦0.001）。

3)在Sequenom MassArray***中查看SNP的分型聚类图，去除聚类图分堆不清的SNP。

4)样本质控：直接去除分型失败的样本。

将通过质控的样本和SNP进行统计分析。

6、数据统计分析

利用Plink1.07软件对分型成功并通过质控的SNP在病例组和对照组做基因表型相关性分析，用Cochran-Armitage trend检验每个样本的基因型和表型的关联性，然后用Cochran-Mantel-Haenszel综合分析所有样本的基因型和表型的相关性。用Q检验来评价个体间的异质性，本次实验中，以p<0.05作为检验水准。多重logistic回归分析用于检测区域内的信号的独立性。检验水准α以0.05除以通过质量控制的SNP数目为检验水准。Q检验用于评估遗传异质性的显著性，对SNP校正检测后P值小于0.05者视为有显著遗传异质性。

rs6871626的基因型和表型关联研究结果如表4所示，表明rs6871626是与麻风病相关的单核苷酸多态性。

表4.rs6871626的基因型和表型关联研究结果

rs2058660的基因型和表型关联研究结果如表5所示，表明rs2058660是与麻风病相关的单核苷酸多态性。

表5.rs2058660的基因型和表型关联研究结果

Claims

1.扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

2.扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物在制备鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

3.扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物在制备筛查麻风病患者产品中的应用。

4.扩增包括rs2058660在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物在制备检测麻风病易感性产品中的应用。