CN102876764A - 牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，属于生物技术领域。一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其制备步骤为：（1）牦牛乳酪蛋白溶解；（2）加胰蛋白酶水解；（3）灭活胰蛋白酶；（4）沉淀酪蛋白；（5）离心除沉淀；(6)葡聚糖凝胶层析分离；（7）质谱测定分子量；（8）超滤。用截留量1000Da和2500Da的超滤膜，收集1000Da至2500Da分子量范围的肽片段。（9）喷雾干燥。该方法制备的抑菌肽，肽分子量分布集中，抑菌活性强，金黄色葡萄球杆菌最小抑制浓度270μg/mL，大肠埃希氏菌最小抑菌浓度980μg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
乳是新生哺乳动物的主要食物来源。新生婴儿尚未完成免疫***的发育，其抗病和免疫作用主要来源于母乳，这是由于其中存在着多种生物活性肽的缘故。乳中含有多种生物活性因子，包括像乳铁蛋白这样的抗菌、抗病毒生物活性肽等。研究表明，在体外条件下，用适当的蛋白酶对乳中的蛋白进行水解，可以将这些生物活性肽释放出来。
酪蛋白占牛乳蛋白质含量的78.8%，是一种全价蛋白质。近年来研究表明，酪蛋白除了营养功能外，还具有非常重要的生理功能，是生物活性肽的重要来源，包括抑菌肽、酪啡肽、降血压肽、抗血栓肽、免疫活性肽、促进矿物离子吸收肽等活性肽。抑菌肽在体外条件下能抑制多种细菌的生长，在体内具有类似抗生素的活性，可以预防感染、提高机体对病原菌的抵抗能力。抑菌肽还可以通过参与非特异性细胞的吞噬作用和激活免疫***使动物产生长效的免疫抵抗力。
抗菌肽因其稳定性好，对高等动物正常细胞无害等特点而备受关注，但以食物蛋白来源的抗菌肽的研究报道还较少。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法。用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抑菌肽，实现了牦牛乳酪蛋白的深加工，工艺简单，水解产物抑菌活性高，适合工业化推广生产。水解产物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌具有较强的抑制活性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：配置2%-10%的牦牛乳酪蛋白水溶液，调节温度30℃-65℃，pH6.5-9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）加胰蛋白酶水解：称取按步骤（1）2%-10%的牦牛乳酪蛋的量加入0.5%-2%的胰蛋白酶,维持反应温度30℃-65℃，pH6.5-9.0，反应1~4小时；
（3）灭活胰蛋白酶，升温至80℃-100℃，维持15-30分钟：
（4）沉淀酪蛋白：用盐酸调节pH到3.8-4.6，使酪蛋白在其等电点处析出：
（5）离心：4000g-12000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液：
（6）葡聚糖凝胶层析分离：采用SephadexG25凝胶柱对离心液进行分部收集，检测各收集液抑菌活性；
（7）质谱测定分子量：采用质谱仪对抑菌组分层析液进行分子量测定，确定肽分子量，确定超滤膜分子量范围；
（8）超滤：取离心后上清液，过截留量1000Da-2500Da的超滤膜，收集分子量在1000Da-2500Da之间的多肽；
（9）喷雾干燥：取超滤液，采用喷雾干燥机，进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽。
所述的牦牛乳酪蛋白为食品级；所述的盐酸为食品级。
所选用的酶制剂为胰蛋白酶。
本发明的有益效果：
1.本发明采用牦牛乳酪蛋白为原料，原料蛋白含量高，价格低，间接降低了生产成本；同时酶水解牦牛乳酪蛋白，产物溶解性好，不但提高了牦牛乳酪蛋白的营养价值，而且赋予产品功能特性。
2.食源牦牛乳酪蛋白抑菌肽，与抗生素产品相比，安全性高，不存在抗性和过敏反应，肽段结构简单，分子量小，稳定性高。
3.操作工艺简单，绿色环保，生产成本低，适合工业化生产和推广。
附图说明：
图1：本发明活性组分质谱图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。
（2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白25g，加水500mL，调节反应温度55℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（3）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，效价测定不少于2500单位，按牦牛乳酪蛋白25g计算，称取0.25g酶,维持反应反应温度55℃，pH8.0，反应2小时。
（4）灭活胰蛋白酶，升温至80℃，维持15分钟。
（5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
（6）离心：4000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
（7）超滤：取离心后上清液，过截留量1000Da和2500Da的超滤膜，收集分子量在1000Da-2500Da之间的肽段。
（8）喷雾干燥：取超滤透过液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉7.3g，得率29.2%。
（9）抑菌活性测定，金黄色葡萄球杆菌最小抑制浓度270μg/mL，大肠埃希氏菌最小抑菌浓度980μg/mL。
实施例2：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。
（2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度55℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（3）加胰蛋白酶：加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，效价测定不少于2500单位，按牦牛乳酪蛋白20g计算，称取0.5g酶,维持反应反应温度55℃，pH8.0，反应2小时。
（4）灭活胰蛋白酶，升温至80℃，维持15分钟。
（5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
（6）离心：12000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
（7）超滤：取离心后上清液，取离心后上清液，过截留量1000Da和2500Da的超滤膜，收集分子量在1000Da-2500Da之间的肽段。
（8）喷雾干燥：取超滤透过液，采用喷雾干燥机对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉5.12g，得率25.6%。
（9）抑菌肽活性测定，对金黄色葡萄球杆菌最小抑制浓度314μg/mL，大肠埃希氏菌最小抑菌浓度1.07mg/mL。
实施例3：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。
（2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，调节反应温度55℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（3）加胰蛋白酶：加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，效价测定不少于2500单位，按牦牛乳酪蛋白40g计算，称取0.5g酶,维持反应反应温度55℃，pH8.0，反应2小时。
（4）灭活胰蛋白酶，升温至80℃，维持15分钟。
（5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
（6）离心：12000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
（7）超滤：取离心后上清液，取离心后上清液，过截留量1000Da和2500Da的超滤膜，收集分子量在1000Da-2500Da之间的肽段。
（8）喷雾干燥：取超滤透过液，采用喷雾干燥机对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉12.2g，得率30.4%。
（9）抑菌肽活性测定，对金黄色葡萄球杆菌最小抑制浓度276μg/mL，大肠埃希氏菌最小抑菌浓度982μg/mL。
实施例4：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。
（2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白10g，加水500mL，调节反应温度30℃，pH6.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（3）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，效价测定不少于2500单位，按牦牛乳酪蛋白10g计算，称取1g酶,维持反应温度30℃，pH6.5，反应4小时。
（4）灭活胰蛋白酶，升温至100℃，维持15分钟。
其余步骤与实施例1相同。
实施例5：一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。
（2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白50g，加水500mL，调节反应温度65℃，pH9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（3）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，效价测定不少于2500单位，按牦牛乳酪蛋白50g计算，称取0.25g酶,维持反应反应温度65℃，pH9.0，反应1小时。
（4）灭活胰蛋白酶，升温至80℃，维持30分钟。
其余步骤与实施例1相同。
见图1是葡聚糖凝胶柱分离液，具有最大抑菌活性的收集液的质谱图，从图中可以看出，该收集液有3个主要组分，分子量范围在1500~2000Da。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：配置2%-10%的牦牛乳酪蛋白水溶液，调节温度30℃-65℃，pH6.5-9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）加胰蛋白酶水解：称取按步骤（1）2%-10%的牦牛乳酪蛋的量加入0.5%-2%的胰蛋白酶，维持反应温度30℃-65℃，pH6.5-9.0，反应1~4小时；
（3）灭活胰蛋白酶，升温至80℃-100℃，维持15-30分钟：
（4）沉淀酪蛋白：用盐酸调节pH到3.8-4.6，使酪蛋白在其等电点处析出：
（5）离心：4000g-12000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液：
（6）葡聚糖凝胶层析分离：采用SephadexG25凝胶柱对离心液进行分部收集，检测各收集液抑菌活性；
（7）质谱测定分子量：采用质谱仪对抑菌组分层析液进行分子量测定，确定肽分子量，确定超滤膜分子量范围；
（8）超滤：取离心后上清液，过截留量1000Da-2500Da的超滤膜，收集分子量在1000Da-2500Da之间的多肽；
（9）喷雾干燥：取超滤液，采用喷雾干燥机，进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽。
2.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征在于所述的牦牛乳酪蛋白为食品级；所述的盐酸为食品级。
3.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制备方法，其特征在于所选用的酶制剂为胰蛋白酶。
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