CN102876633B - 一种联合细胞模型及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联合细胞模型,它包括Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型,所述Caco-2细胞模型与大鼠原代肝细胞模型以半透膜相隔。本发明还公开了该联合细胞模型的制备方法,以及使用该联合细胞模型筛药的方法。本发明联合细胞模型可同时、准确、高效地检测药物的吸收和代谢过程,提高检测效率,具有良好的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种联合细胞模型。
背景技术
据估计,在新药开发中,临床检测发现50%的候选药物药效不理想,40%的候选药物存在安全性问题,导致开发失败,前期开发工作浪费。若能提前对候选药物的活性和毒性进行体外评估,可以极大降低药物开发成本。ADME/Tox模式,药物代谢和毒性检测模式,是近年发展起来的、全新的,是在细胞水平上早期进行吸收、分布、代谢、清除和毒性实验的新型新药研究模式,其可以提前对候选药物的活性和毒性进行体外评估,近年来在国外各大制药企业中得到广泛应用。
对候选药物进行早期筛选时,可以根据研究的需要,选用相应的高通量ADME/Tox体外模型,对药物进行早期的活性/毒性筛选。
Caco-2细胞模型,人结肠腺癌细胞,用于研究药物吸收的细胞模型。孙敏捷等,“Caco-2细胞单层模型的建立与验证”,中国药学杂志2006年9月第41卷第18期公开了一种Caco-2细胞模型的制备方法:将Caco-2细胞模型在T-75培养瓶中培养,培养液为MEM/EBSS NEAA(pH7.4,含胎牛血清10%、L-谷氨酰胺2mmol/L、Hepeps10mmol/L、青霉素、链霉素),在37℃,含5%CO2培养箱中全湿度培养,按1:3比例传代后,将细胞接种在24孔Millicell***式培养皿中,接种密度为1mL含8×104个,每孔400μL,基底侧加入培养液600μL培养液培养21天,期间换液。
大鼠原代肝细胞模型,用于研究药物代谢的细胞模型。周星辉等,“大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定”,中国临床药理学与治疗学,2005年2月;10(7):743-746,公开了一种大鼠原代肝细胞模型的制备方法:用两步灌流法制备原代肝细胞,后用RPMI1640、高糖DMEM(4.5g/LD-葡萄糖)和低糖DMEM(1.0g/L,D-葡萄糖)培养原代肝细胞,实验结果表明,在原代肝细胞出现增殖前,低糖DMEM与高糖DMEM对细胞的生长和功能状态的影响无明显差别,RPMI1640的培养效果则明显低于前两种培养液。且使用低糖DMEM培养肝细胞更贴近肝细胞在体内的生理状态,更适合于原代肝细胞模型的培养。
当前利用细胞模型研究药物的吸收和代谢过程仅限于单个细胞模型的顺序使用,只能分别考察药物的吸收和代谢,浪费时间,同时相较于体内药物代谢研究,缺少肝肠循环这一重要环节,存在较多干扰因素导致检测不准确。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种联合细胞模型。
本发明联合细胞模型包括Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型,所述Caco-2细胞模型与大鼠原代肝细胞模型以半透膜相隔。所述半透膜为聚碳酸酯膜、聚酯膜或混合纤维素膜,膜孔径为0.4~8.0μm。
所述聚酯膜为Millicell悬挂式培养皿。
所述的Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值≥550Ω·cm 2的细胞系。所述的Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值为550~800Ω·cm 2的细胞系。
所述联合细胞模型是按照如下方法制备而成:
a、取Caco-2细胞,复苏,加入DMEM-20%培养液中培养,按1:3传代,培养2代后,换成DMEM-10%培养液继续传代培养;
b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3~15代中任意一代细胞,调整细胞密度为1.5×105个/mL,从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上,在培养皿BL侧加入DMEM-10%培养液,置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,连续培养17~25天,期间更换培养液,得载有Caco-2细胞模型的培养皿;
c、取大鼠原代肝细胞,加入RP-MI 1640培养液后混匀,得大鼠原代肝细胞混悬液;
d、取步骤c制备的大鼠原代肝细胞混悬液,调整细胞密度为1.5×105个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养板上,每孔加入2ml并每天换液,培养1~5天,得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板;
e、将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿,置于步骤d所得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板之上,即可。
步骤b中,AP侧指顶端,BL指底端。
其中,步骤b中:
铺有鼠尾胶原的培养皿是按照如下方法制备:取Millicell悬挂式培养皿,加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原,加样量为100μl/cm2,紫外照射1小时,放入37℃,5%CO2培养箱内过夜,PBS清洗3次,即可;
取第4代细胞;连续培养21天;更换培养液的方式为接种24h后更换培养液,前一周隔天换液,一周后每天换液。
其中,步骤d中,培养3天。
本发明还提供了一种制备前述联合细胞模型的方法,它包括如下步骤:
a、取Caco-2细胞,复苏,加入DMEM-20%培养液中培养,按1:3传代,培养2代后,换成DMEM-10%培养液继续传代培养;
b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3~15代中任意一代细胞,调整细胞密度为1.5×105个/mL,从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上,在培养皿BL侧加入DMEM-10%培养液,置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,连续培养17~25天,期间更换培养液,得载有Caco-2细胞模型的培养皿;
c、取大鼠原代肝细胞,加入RPMI 1640培养液后混匀,得大鼠原代肝细胞混悬液;
d、取步骤c制备的大鼠原代肝细胞混悬液,调整细胞密度为1.5×105个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养板上,每孔加入2ml并每天换液,培养1~5天,得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板;
e、将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿,置于步骤d所得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板之上,即可。
其中,步骤b中:
铺有鼠尾胶原的培养皿是按照如下方法制备:取Millicell悬挂式培养皿,加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原,加样量为100μl/cm2,紫外照射1小时,放入37℃,5%CO2培养箱内过夜,用PBS清洗3次,即可;
取第4代细胞;连续培养21天;更换培养液的方式为接种24h后更换培养液,前一周隔天换液,一周后每天换液。
其中,步骤d中,培养3天。
本发明还提供了前述联合细胞模型的筛药方法,它包括如下步骤:
①采用前述联合细胞模型,取待检药物,从Caco-2细胞模型一侧施药;
②收集大鼠原代肝细胞模型一侧样品,检测,根据检测结果评价待检药物。
将Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型作为一个联合细胞模型整体来使用,除了可以克服现有技术的缺陷外,还可以使联合细胞模型更加准确地模拟人体药物吸收和代谢过程,因而研究结果更加准确,对高通量的药物筛选有着重要意义。
然而,研究发现,直接将现有方法制备的Caco-2细胞模型与大鼠原代肝细胞放置在一起,因培养体系不同、细胞分泌物的抑制作用等原因,两种细胞之间会相互影响,导致两种细胞模型难以成为一个有机整体,不能达到同时检测药物吸收和代谢的目的。
本发明用半透膜将Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型合并,并对两种细胞模型的培养条件—包括培养液、培养时间等参数进行改进,特别是大鼠原代肝细胞的培养液,使用了现有技术认为用于大鼠原代肝细胞培养不理想的RPMI 1640培养液,制备得到的联合细胞模型中,两种细胞之间无相互 抑制作用,两种细胞模型组成了一个稳定的有机整体,用于检测药物的吸收和代谢,重现性好,准确度高,检测效率高,显著优于顺序使用单个Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型,制备联合细胞模型的培养液和培养皿等材料价格低廉,生产成本低,具有良好的临床应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1聚酯膜内Caco-2细胞培养10天后的形态
图2聚酯膜内Caco-2细胞培养21天后的形态
图3 透射电镜观察聚酯膜内Caco-2细胞培养21天后的形态
图4刚分离的原代肝细胞形态
图5培养24小时的原代肝细胞形态
图6培养48小时的原代肝细胞形态
图7培养3天的原代肝细胞形态
图8原代肝细胞第1-7天的ALB,BUN分泌情况
图9 ADME/Tox并联测试体系示意图
图10模型组给药前2h细胞形态
图11模型组给药后2h细胞形态
图12标准品270nm色谱图
图13空白溶剂270nm色谱图
图14联合模型样品270nm色谱图
图15分步模型样品270nm色谱图
图16黄芩苷标准曲线图
图17汉黄芩苷标准曲线图
图18汉黄芩素标准曲线图
图19黄芩苷的吸收代谢方式
具体实施方式
实施例1本发明联合细胞模型的建立
1实验材料
1.1细胞株Caco-2细胞株购自美国ATCC(American Type Culture Collection)。
1.2实验动物SD大鼠,SPF级,雄性,170g-200g,由四川省中医药科 学院动物中心提供,合格证号:SCXK(川)2008-19。
1.3主要试剂和药品DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶购自Gibco公司,HBSS、I型鼠尾胶原、EDTA·2Na、HEPES、非必需氨基酸购自Sigma公司,胎牛血清购自PAA公司、肝细胞生长因子、表皮生长因子购自Peprotech inc公司,青霉素和链霉素购自华北制药有限公司,其余试剂均为国产分析纯,第一灌流液为PBS、HBSS或D-Hank’s液,其中含EDTA·2Na 0.01%~0.03%,HEPES 1.43~5.72g/L,pH 7.2~7.5,灌流时间5~30min,灌流温度25℃~38℃。第二灌流液为PBS、HBSS或D-Hank’s液,其中含钙离子2.5~10mmol/L,Ⅳ型胶原酶0.02%~0.15%,HEPES1.43~5.72g/L,pH 7.2~7.5,灌流时间5~30min,灌流温度25℃~38℃。所用缓冲液为HBSS、PBS或D-Hank’s溶液,pH 7.2~7.5。
1.4主要器材和仪器:6孔板(Costar),Millicell悬挂式培养皿(聚酯膜,孔径1.0μm)、90mm平板过滤器、Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水***(Millipore,美国),3111水套式CO2培养箱(Forma,美国),DMLL倒置相差显微镜(Leica,德国),XSZ-H7双目生物显微镜(重庆),SW-CJ-2F双人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司),ALLEGRAX-15R台式冷冻离心机(Beckman,美国),MLS-3070高压灭菌锅(三洋,日本),YDS-50B-80液氮容器(乐山市东亚机电工贸有限公司),CP-225D型精密电子天平(Sartorius),PB-10酸度计(Sartorius),FD-ID-50冷冻干燥机(北京博医康),7020全自动生化测试仪(日立,日本),XW-80A漩涡混旋仪(海青浦泸西)。
2实验方法
2.1建立Caco-2细胞模型
2.1.1Caco-2细胞的复苏及传代
从液氮中取出Caco-2细胞,立即放入37℃水浴。快速融化后,将Caco-2细胞转移至盛有8ml DMEM-20%(37℃)培养液的离心管中,混匀,在900转的速度下离心5min,如此重复离心3次后,得到Caco-2细胞悬浮液。将Caco-2细胞悬浮液转移至细胞培养瓶中,放入恒温培养箱中培养,第二天换液,以后隔天换液。当培养瓶内细胞汇合达到约80%左右时,倾去旧的培养液,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化。在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,约2min后,细胞间隙变大,细胞变圆,立即停止消化,倒掉消化液,加入6ml DMEM-20%培养液,轻轻将细胞吹落至瓶底并混匀,转移至离心管中,在900转的速度下离心5min,倒去上清液,加入6ml DMEM-20%培养液,混匀,按1:3传代。用DMEM-20%培养液继续培养两代后,换成DMEM-10%培养液培养。
2.1.2Millicell膜涂铺Ⅰ型鼠尾胶原
将Millicell悬挂式培养皿放入6孔培养板,加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原100μl/cm2(452μl),将培养板在超净工作台内用紫外线照射,1小时后,放入37℃,5%CO2培养箱内过夜,拿出后,用PBS清洗Millicell膜3次,备用。
2.1.3Caco-2细胞的接种及培养
实验时,取复苏第4代以后的细胞,按2.1.1项下传代,调整密度为1.5×105个/mL,接种在Millicell膜上。在Millicell膜的AP侧,加入混匀的细胞悬液2ml,BL侧加入DMEM-10%培养液4ml。将细胞置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,接种24h后更换培养液。前一周隔天换液,之后每天换液,连续培养2l天。
2.1.4Caco-2细胞模型的验证
①倒置相差显微镜观察细胞形态:每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
细胞接种2h后开始贴壁,生长至第4天左右时汇合达80%,膜上可看到细胞形态。由图1可知,生长10天以后细胞边界清晰,为不规则多边形。由图2可知,生长21天时,各细胞间如铺路石镶嵌排列,互不重叠,为典型单层形态。
②透射电镜观察细胞形态:由图3可知,细胞生长至21天时,由微绒毛形成的刷状缘非常整齐致密,细胞之间的紧密连接和桥粒出现在腔侧。
③跨膜电阻值的测定:用Millicell-ERS跨膜电阻仪隔天测定Caco-2细胞的跨膜电阻值,每次测量电阻前,电极用PBS浸泡过夜,使用前用75%乙醇浸泡30min,然后用培养液浸泡15min备用。
Caco-2细胞的跨膜电阻值=(测定值-空白膜电阻值)×Millicell膜面积
Caco-2细胞的TEER值在前6天增长迅速,6天后TEER值维持在一个稳定的范围内,21天时,Caco-2细胞跨膜电阻值大于550Ω·cm2。
2.1.5小结
上述方法建立的Caco-2细胞模型重复性好,通过电阻值测定发现,21天时,TEER值大于550Ω·cm2。
2.2建立原代肝细胞模型。
2.2.1原代肝细胞模型的建立
(1)开腹,沿腹白线打开腹腔,充分暴露肝门静脉及下腔静脉,用眼科剪小心分离并各穿置一根缝合线。在距肝门约2厘米的门静脉处剪开一“V”型小口,***软硅胶管并固定,硅胶管连接恒流泵灌流装置。
(2)插管成功后,立即以40ml/min灌注第一灌流液并剪断下腔静脉腹段。肝脏颜色逐渐变浅至土黄色时(约200ml左右),改灌第二灌流液,至 肝包膜出现龟裂或压之凹陷不易恢复时停止(约130ml左右)。
(3)小心分离肝脏于培养皿,用4℃的HBSS液快速清洗2次,再加入RP-MI 1640培养液,小心撕裂肝包膜,轻柔摆动肝组织,让细胞游离出来,至剩下肝纤维组织为主。吸取肝细胞粗制悬液,依次经100目和200目细胞筛网过滤。
(4)细胞悬液以500r/min离心3min,倾去上清液,如此反复离心三次。然后吸去细胞上清液,加入RP-MI 1640培养液后混匀,即得原代肝细胞悬液。
(5)调整密度为1.5×105个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的6孔板上,每孔加入2ml细胞悬液,并每天更换培养液。
2.2.2原代肝细胞模型的验证
①用台盼蓝染色排斥法测定肝细胞活力:将肝细胞悬液与0.4%的台盼蓝溶液1∶1混匀,立即用全自动细胞分析仪计算活细胞百分率。
图像显示活肝细胞呈透亮,圆形,立体感较强,死肝细胞被蓝染,细胞膜模糊已破损,经计数后,肝细胞存活率在70%-93%,细胞得率在1.8×108-2.5×108之间。
②倒置相差显微镜观察细胞形态:每天在倒置相差显微镜下观察细胞情况。
刚分离的肝细胞呈单个,圆形,透亮,立体感较强(图4)。1小时后,肝细胞开始贴壁生长,变扁平。24小时后,肝细胞已经贴壁,体积增大并向周围发展,有的呈单核,有的呈双核(图5)。48小时后,大部分肝细胞伸出伪足,逐渐连接呈网状(图6)。培养3天的肝细胞镜下可见相互之间连接成片,可见细胞核呈单核或双核(图7)。
③肝细胞功能学检测:连续培养肝细胞7天,每天换液,取细胞培养上清液1ml,3000r/min离心5min后取上清,全自动生化仪测定ALB、BUN浓度。
如图8所示,原代肝细胞的分泌功能在第1、2天开始恢复,其ALB的分泌功能在第3天出现高峰,然后逐渐衰退,BUN的分泌在第3-4天是其活跃的高峰期,其后也开始衰退。
2.2.3小结
本发明建立了原代肝细胞模型。通过对原代肝细胞存活率的检测,形态变化的观察,以及对其分泌功能的检测,结果显示,本实验分离的原代肝细胞存活率在70%-93%,其形态结构变化符合文献报道,ALB的分泌在第3天达到高峰,BUN的分泌在第3、4天达到高峰。因此,以第3天为给药时间。
2.3联合模型的建立
在Caco-2细胞模型建立21天时,用HBSS清洗Caco-2细胞3次后,显微镜下观察细胞,选用细胞膜完整、排列紧密无脱落且电阻值大于550Ω·cm2的Caco-2细胞。用HBSS清洗已培养3天的肝细胞3次,尽量将死细胞洗去,镜下见细胞形态清晰,连接呈岛状,多数呈双核。将可用的Caco-2细胞(Millicell膜)提出,轻放入种有肝细胞的6孔板上,即得本发明联合细胞模型,如图9所示。
经观察,两种细胞之间无相互抑制作用,证明本发明成功建立了吸收和代谢的联合细胞模型。
实施例2用本发联合细胞模型考察小柴胡汤ADME/Tox特征
小柴胡汤,是传统的中药方剂,主治少阳病证和妇人伤寒。黄芩苷(BCN)、黄芩素(BCL)、汉黄芩苷(WGS)、汉黄芩素(WGN)均为小柴胡汤的有效成分。
本实施例通过小柴胡汤中黄芩苷(BCN)、汉黄芩苷(WGS)和汉黄芩素(WGN)的吸收代谢来考察本发明联合细胞模型的准确性,设置2组对照组,以Caco-2细胞模型作为空白对照组,以Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞顺序使用作为分步模型组。
根据现有技术,黄芩苷(BCN)、汉黄芩苷(WGS)和汉黄芩素(WGN)在Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型中的吸收代谢方式为:BCN的吸收代谢模式如图19所示,肝细胞中含有UGT酶,可以将药物中的BCL(黄芩素)转化为BCN,从而增加BCN的量;WGS被Caco-2细胞模型吸收并转化为WGN后转运至大鼠原代肝细胞模型,WGN被Caco-2细胞模型吸收并直接转运至大鼠原代肝细胞模型,WGN在大鼠原代肝细胞模型中,可被转化为WGS转运至另一侧,也可直接转运至另一侧。
具体地:1、空白模型组因缺少肝细胞模型,其最终得到的样品中BCN含量应当低于联合模型组和分步模型组,WGS含量应当低于联合模型组和分步模型组,WGN含量应当高于联合模型组和分步模型组;2、分步模型组和联合模型组相比较:分步模型中,Caco-2细胞模型完全吸收BCN和BCL后,再转运至大鼠原代肝细胞模型,而本发明联合模型组中,Caco-2细胞模型吸收的BCN和BCL会立即被转运至大鼠原代肝细胞模型,加大了Caco-2细胞模型两侧BCL的浓度差,促进BCL快速转运,进而提高BCN含量,本发明联合模型BL侧样品中BCN的浓度应当高于分步模型BL侧样品中BCN的浓度;分步模型中,Caco-2细胞模型完全吸收WGS和WGN后,全部转化为WGN,WGN被大鼠原代肝细胞模型代谢,以WGN或者WGS的形式转运至另一侧,联合模型组中,大鼠原代肝细胞模型代谢生成的WGS会经过 肝肠循环中再度转运至Caco-2,转化为WGN,导致WGN浓度提高,本发明联合模型BL侧样品中汉黄芩苷(WGS)的浓度应当低于分步模型BL侧样品的浓度,汉黄芩素(WGN)的浓度应当高于分布模型BL侧样品的浓度。
1实验材料和方法
1.1实验材料
1.1.1受试样品小柴胡汤(XCHT)由四川省中医药科学院中药化学研究所提供,批号20071220。
1.1.2细胞株Caco-2细胞株购自美国ATCC(American Type Culture Collection)。
1.1.3实验动物SD大鼠,SPF级,雄性,170-200g,由四川省中医药科学院动物中心提供,合格证号:SCXK(川)2008-19。
1.1.4主要试剂和药品:DMEM培养基、RP-MI 1640培养基、胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶购自Gibco公司,HBSS、I型鼠尾胶原、EDTA·2Na、HEPES、非必需氨基酸购自Sigma公司,胎牛血清购自PAA公司、肝细胞生长因子、表皮生长因子购自Peprotech inc公司,青霉素和链霉素购自华北制药有限公司,BCN标准品(含量≥98%)、WGN标准品(含量≥98%)购自中国药品生物制品检定所,WGS标准品(含量≥98%)购自四川维克奇生物科技有限公司,色谱纯乙腈购自沃凯公司,色谱纯甲醇购自美国fisher公司,其余试剂均为国产分析纯。
1.1.5主要器材和仪器:6孔板(Costar),悬挂式培养皿(聚酯膜,孔径1.0μm)、90mm平板过滤器、Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水***(Millipore,美国),3111水套式CO2培养箱(Forma,美国),DMLL倒置相差显微镜(Leica,德国),XSZ-H7双目生物显微镜(重庆),SW-CJ-2F双人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司),ALLEGRAX-15R台式冷冻离心机(Beckman,美国),MLS-3070高压灭菌锅(三洋,日本),YDS-50B-80液氮容器(乐山市东亚机电工贸有限公司,Waters高效液相色谱仪(Waters高效液相色谱***2695-2996),Empower Pro色谱数据工作,CP-225D型精密电子天平(Sartorius),PB-10酸度计(Sartorius),FD-ID-50冷冻干燥机(北京博医康),7020全自动生化测试仪(日立,日本),XW-80A漩涡混旋仪(海青浦泸西)。
1.2实验方法
1.2.1分组及给药
①联合模型组(本发明联合细胞模型):在Caco-2细胞AL侧加入2ml小柴胡汤液,肝细胞侧(BL侧)加入4mlHBSS液,于2小时后收集肝细胞侧样品,-20℃冻存。
②分步模型组:在Caco-2模型AL侧加入2ml小柴胡汤液,BL侧加入4mlHBSS液,2小时后收集BL侧经吸收样品,将吸收样品加入肝细胞模型中,作用2小时后,收集样品,-20℃冻存。
③空白对照组:在Caco-2模型AL侧加入2ml小柴胡汤液,BL侧加入4mlHBSS液,于2小时后收集BL侧样品,-20℃冻存。
1.2.2标准品溶液的配制
分别精密称取BCN,WGS和WGN标准品适量,以甲醇配制成浓度分别为10μg/ml,9.6μg/ml,10μg/ml的混合标准品溶液,作为标准储备液。
2 测定条件
色谱柱:SymmetryTM Shield R18(5.0μm,4.6mm×250mm)
流动相:乙腈-0.01%磷酸进行梯度洗脱,见表1
表1流动相梯度洗脱表
柱温:30℃;流速:0.45ml/min;检测波长:λ=270nm
3 方法学考察
3.1方法专属性
记录混合标准品、空白样品、样品色谱图以及它们的紫外吸收图谱,考察分析方法的专属性。
3.2线性关系考察
取混合标准储备液,用甲醇稀释成一系列不同的浓度,按测定条件进行测定,测定峰面积积分值,以峰面积Y对浓度X进行线性回归。
3.3精密度实验
取混合标准储备液,配成三个不同的浓度,每个浓度测定3次,做日内精密度考察。
3.4重复性实验
配制5份相同浓度的混合标准品,甲醇溶解后,超声30min,0.22μm滤膜过滤,滤液作为供试品溶液,各取20μl进样,记录峰面积。计算各成分含量,考察重复性。
3.5回收率实验
精密配制3个不同浓度的混合标准品,用HBSS液溶解,浓度分别为2.5μg/ml,1.25μg/ml,0.625μg/ml。超声30min,冷冻干燥机冻干后再加入甲醇。按含量测定方法测定,计算回收率。
3.6稳定性实验
取小柴胡汤代谢物供试品溶液,分别在2.5,5,7.5,10,24小时,进样20μl,测定峰面积积分值,考察样品的稳定性。
3.7样品的前处理:取1ml样品,冷冻干燥机冻干,加入0.3ml甲醇,涡旋仪混匀,超声30min,15000r/min离心10min后取上清液,用0.22μm滤膜过滤备用。
4实验结果
4.1模型组给药后肝细胞变化
如图10~11所示,分步模型组给药2小时后,镜下未见细胞形态变化;联合模型组给药2小时后,镜下细胞间隙增大,岛状连接变得不明显,肝细胞体积缩小,死细胞增多。
4.2方法专属性
如图12~15所示,在该实验条件下,BCN、WGS和WGN保留时间分别为13min、21min和51min。各峰分离度大于1.5,样品中BCN、WGS和WGN的紫外吸收图谱与对照品一致,BCN在276nm处有最大吸收峰,WGS在272nm处有最大吸收,WGN在275nm处有最大吸收。
4.2.1标准曲线
取标准储备液,用甲醇稀释成2.5μg/ml,1.25μg/ml,0.625μg/ml,0.31μg/ml。按测定条件进样测定,测定峰面积积分值,以面积对浓度进行线性回归,如图16~18以及表2所示,R值均大于0.99,线性关系良好。
表2标准曲线及灵敏度
4.2.2精密度实验
精密度考察结果显示,RSD%均小于5%,说明本方法精密度良好,结果见表3。
表3精密度实验结果
4.2.3重复性实验
重复性考察结果显示,RSD%均小于2%,说明本方法重复性良好,结果见表4。
表4重复性实验结果
4.2.4稳定性
稳定性考察结果显示,RSD%均小于3%,说明本方法稳定性良好,结果见表5。
表5稳定性实验结果
4.2.5加样回收率
各对照品的加样回收率在73~110%,RSD%小于3%,回收率良好。其结果见表6。
表6加样回收率实验结果
本实施例建立了高效液相色谱分离-二级管阵列检测器同时测定小柴胡汤代谢物中3种成分含量的方法。样品分离度较高,专属性强,回收率、精密度、重复性、稳定性和定量线性范围均符合生物样品检测的相关要求。
说明本发明黄芩苷(BCN)、汉黄芩苷(WGS)和汉黄芩素(WGN)的测定结果是准确可靠的。
4.3小柴胡汤代谢成分的含量测定
小柴胡汤BL侧代谢样品各成分测定结果见表7:
表7小柴胡汤代谢成分测定结果
与空白对照组比较:*P﹤0.05,**P﹤0.01;与联合模型组比较:#P﹤0.05,##P﹤0.01。
由表7可知,经联合模型吸收代谢后的小柴胡汤代谢物中BCN、WGS和WGN的含量分别为(2.60±0.11)μg、(2.03±0.11)μg、(0.65±0.05)μg;分步模型中的BCN、WGS、WGN分别为(2.37±0.37)μg、(2.72±0.53)μg、(0.44±0.09)μg。
联合模型组和分步模型组中BCN和WGS含量均高于空白对照组,WGN含量均低于空白对照组,与空白对照组比较差异均有显著意义(P<0.01);联合模型组的BCN和WGN含量高于分步模型组(P<0.01),联合模型组的WGS含量低于分布模型组(P<0.05)。
表7所示实验结果与现有技术中BCN、WGS和WGN吸收代谢方式是一致的,说明本发明联合模型可以准确地检测药物的吸收和代谢过程。
综上,本发明成功的建立了联合模型,联合模型中的两种细胞模型无相互抑制,可以同时检测药物的吸收和代谢过程,准确度高,与体内代谢高度相似,为药物前期筛选提供了良好的基础,缩短药物研究开发的周期,提高效率,降低成本,规避风险,具有较好的市场应用价值。
Claims (12)
1.一种联合细胞模型,其特征在于:它包括Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型,所述Caco-2细胞模型与大鼠原代肝细胞模型以半透膜相隔。
2.根据权利要求1所述的联合细胞模型,其特征在于:所述半透膜为聚碳酸酯膜、聚酯膜或混合纤维素膜,膜孔径为0.4~8.0μm。
3.根据权利要求2所述的联合细胞模型,其特征在于:所述聚酯膜为Millicell悬挂式培养皿。
4.根据权利要求1所述的联合细胞模型,其特征在于:所述Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值大于等于550Ω·cm2的细胞系。
5.根据权利要求4所述的联合细胞模型,其特征在于:所述Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值为550~800Ω·cm2的细胞系。
6.根据权利要求1所述的联合细胞模型,其特征在于:其是按照如下方法制备而成:
a、取Caco-2细胞,复苏,加入DMEM-20%培养液中培养,按1:3传代,培养2代后,换成DMEM-10%培养液继续传代培养;
b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3~15代中任意一代细胞,调整细胞密度为1.5×105个/mL,从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上,在培养皿BL侧加入DMEM-10%培养液,置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,连续培养17~25天,期间更换培养液,得载有Caco-2细胞模型的培养皿;
c、取大鼠原代肝细胞,加入RP-MI 1640培养液后混匀,得大鼠原代肝细胞混悬液;
d、取步骤c制备的大鼠原代肝细胞混悬液,调整细胞密度为1.5×105个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养板上,每孔加入2ml并每天换液,培养1~5天,得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板;
e、将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿,置于步骤d所得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板之上,即可。
7.根据权利要求6所述的联合细胞模型,其特征在于:所述步骤b中:
铺有鼠尾胶原的培养皿按照如下方法制备:取Millicell悬挂式培养皿,加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原,加样量为100μl/cm2,紫外照射1小时,放入37℃,5%CO2培养箱内过夜,PBS清洗3次,即可;
取第4代细胞;连续培养21天;更换培养液的方式为接种24h后更换培养液,前一周隔天换液,一周后每天换液。
8.根据权利要求6所述的联合细胞模型,其特征在于:步骤d中,培养3天。
9.一种制备权利要求1~8任意一项所述联合细胞模型的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
a、取Caco-2细胞,复苏,加入DMEM-20%培养液中培养,按1:3传代,培养2代后,换成DMEM-10%培养液继续传代培养;
b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3~15代中任意一代细胞,调整细胞密度为1.5×105个/mL,从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上,在培养皿BL侧加入DMEM-10%培养液,置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,连续培养17~25天,期间更换培养液,得载有Caco-2细胞模型的培养皿;
c、取大鼠原代肝细胞,加入RPMI 1640培养液后混匀,得大鼠原代肝细胞混悬液;
d、取步骤c制备的大鼠原代肝细胞混悬液,调整细胞密度为1.5×105个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养板上,每孔加入2ml并每天换液,培养1~5天,得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板;
e、将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿,置于步骤d所得载有大鼠原代肝细胞模型的细胞培养板之上,即可。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于:所述步骤b中:
铺有鼠尾胶原的培养皿按照如下方法制备:取Millicell悬挂式培养皿,加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原,加样量为100μl/cm2,紫外照射1小时,放入37℃,5%CO2培养箱内过夜,用PBS清洗3次,即可;
取第4代细胞;连续培养21天;更换培养液的方式为接种24h后更换培养液,前一周隔天换液,一周后每天换液。
11.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于:所述步骤d中,培养3天。
12.使用权利要求1~8任意一项所述联合细胞模型筛选药物的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
①采用权利要求1~8任意一项所述的联合细胞模型,取待检药物,从Caco-2细胞模型一侧施药;
②收集大鼠原代肝细胞模型一侧样品,检测,根据检测结果评价待检药物。
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