CN102869639A - 制备鲨肌醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备鲨肌醇的方法。具体地，本发明涉及利用生物转化过程将肌醇转化为鲨肌醇的方法。

Description

制备鲨肌醇的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2010年2月15日提交的美国临时申请系列号no. 61/304,581的优先权，其内容全盘并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及制备鲨肌醇（scyllo-inositol）的方法。具体地，本发明涉及利用生物转化过程将肌醇（myo-inositol）转化为鲨肌醇的方法。
背景技术
鲨肌醇（1）[CAS登录号No. 488-59-5]是六氢环己烷的九个立体异构体之一，发现其存在于多种天然来源中。然而，当与广泛使用的营养补充剂肌醇（2）[CAS登录号No. 87-89-8]相比时，其仅以少量存在（Martinez-Castro等，Food Chem. 2004, 87, 325）。鲨肌醇（1）还存在于多种哺乳动物组织中（Sherman等，Biochemistry 1968, 7, 819），其浓度在患有阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease）的个体的脑中增加（Michaelis等，NMR Biomed. 1993, 6, 105; Griffith等，Ibid 2007, 20, 709）。另外，已经表明鲨肌醇（1）能够与患有阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease）的个体中沉积的老年斑的大多数神经毒性组分（例如Aβ42肽）相互作用，诱导其二级结构发生变化，稳定小Aβ寡聚体，并完全阻断纤维形成（McLaurin等，J. Mol. Biol. 1998, 278, 183; McLaurin等，Ibid 2000, 275, 18495; Fenili等，Ibid 2007, 85, 603和WO 2004/075882）。基于这些研究发现，目前正在对鲨肌醇（1）进行进一步的临床研究以评估其效力，并确定其用于治疗阿尔茨海默氏病的用途（Wolfson, Chem. Biol. 2008, 89）。
Figure 598713DEST_PATH_IMAGE001
已经报道了多种制备鲨肌醇（1）的方法。一种制备方法是基于对2,4,6/3,5五羟基环己酮（内消旋-2-肌醇单酮）的酶促方法，其利用弱氧化醋酸杆菌（Acetobacter suboxydans）由肌醇（2）制备（Kluyver等，Rec. Trav. Chim. Pays-Bas. 1939, 58, 956），而另一种制备方法是通过在酸性介质中用钠汞齐试剂使内消旋-2-肌醇单酮还原随后进行分离（Posternak, Helv. Chim. Acta 1941, 24, 1045），或者利用氢硼化钠还原试剂（Reymond, Helv. Chim. Acta 1957, 40 492），其产率很低。另一种制备方法是基于起始于六羟基苯，其产率很低（Angyal等，J. Chem. Soc. 1957, 3682），或者利用环己烯四醇（conduritol）作为原材料（Nakajima等，Chem. Ber. 1959, 92, 173）。另外的制备方法是通过在离子交换树脂上进行分离（Sasaki等，Carbohydrate Res. 1987, 167, 171）或者通过复合作用进行色谱分离（Sasaki等，Carbohydrate Res. 1988, 183, 1）或通过二氧化硅HPLC柱上的化学拆分（chemical resolution）（Ghias-ud-din等，J. Chromatogr. 1981, 211, 295）。另外一种方法起始于肌醇（2），经由氧化，随后使所得myo-inososepetaacetate还原并水解（Kohne等，Liebigs Ann. Chem. 1985, 4, 866; DE 1985/3405663），而另一种方法起始于肌醇（2），经由在碱性条件下利用雷尼镍（Raney nickel）使其平衡（Husson等，Carbohydrate Res. 1998, 307, 163），而其他方法掺入钯催化剂以进行顺序环加成反应，其起始于6-O-乙酰基-5-烯桥吡喃糖苷（Takahashi等，J. Org. Chem. 2001, 66, 2705）。已经阐述了通过利用肌醇（2）的另外的制备方法，其中用磺酸基团进行选择性保护，随后氧化和还原（Sarmah等，Carbohydrate Res. 2003, 338, 998）。或者，一种制备方法涉及起始于肌醇（2），其经由鲨肌醇单酮（scyllo-inosose）（3），其中利用假单胞菌（Pseudomos）和醋酸杆菌（Kenji等，JP 2003/102492）。其它制备方法包括起始于由苯醌依次制备的环己烯四醇（conduritol）（Bolck等，Eur. J. Org. Chem. 2003, 10, 1958）；经由由肌醇（2）制备的鲨肌醇单酮（3），基于利用有机硅（organosilyl）基团进行保护，随后进行化学或酶促还原（Kenji等，JP 2003/107287），或者通过鲨肌醇单酮（3）的酶促还原（Kenji等，WO 2005/035774），或者由肌醇（2）制备（Cruz等，WO 2007/119108）。
在这些方法中，仅有限几种方法适用于较大规模地，特别是以适于药学应用的高质量制备鲨肌醇（1）。然而，已经显示由Kenji等（WO 2005/035774）描述的方法能够进行千克级操作，该方法基于利用属于醋酸杆菌属的微生物将肌醇（2）转化为鲨肌醇单酮（3），随后将鲨肌醇单酮（3）酶促还原为鲨肌醇（1）。
在上面段落中描述的方法中，肌醇（2）首先转化为鲨肌醇单酮（3），接着后者大部分转化为鲨肌醇（1），但是留下显著部分的未反应的鲨肌醇单酮（3），得到混合物。另外，在此转化中还形成显著量的副产物鲨栎醇（syllo-quercitol）（6）。为了从未反应的鲨肌醇单酮（3）和副产物鲨栎醇（6）的混合物中将期望的鲨肌醇（1）分离出来，Kenji等（WO 2005/035774）首先进行细胞分离，随后将鲨肌醇（1）化学转化为鲨肌醇-二硼酸-二钠复合物（SBC盐，5），随后用甲烷和水的混合物中的盐酸进行水解。该转化需要使用硼酸来形成SBC盐（5）（Weissbach, J. Am. Chem. Soc. 1957, 23, 329和Grainger, Acta Cryst. 1981, B37 563）并使用浓盐酸，其不仅腐蚀仪器，还需要特殊的操作步骤以确保安全且远离有害气体。此外，任何残余量的D和L-手性肌醇（7和8）（鲨肌醇（1）药物物质中的相关杂质物质）的形成或存在未经确定。
Figure 395768DEST_PATH_IMAGE002
另外，由于该方法在回收鲨肌醇（1）的过程中需要使用硼酸以使其化学选择性衍生化为SBC盐（5），因此在随后步骤中依照ICH和管理准则将最终药物物质中的硼酸清除至适宜水平是很关键的。此外，事实上，生物转化步骤结束时以显著量存在的未反应的鲨肌醇单酮（3）通过碱和热学降解被破坏，该操作中潜在的产率损耗是不可避免的。因此，就试剂，总体产率以及确保产物质量而言，需要改进的制备鲨肌醇（1）的方法。
发明内容
本发明提供了一种有效且安全的制备鲨肌醇（1）的方法。在本发明的一个实施方案中，鲨肌醇依照以下过程产生：
Figure 66920DEST_PATH_IMAGE003
在另一个实施方案中，本发明包括制备鲨肌醇（1）的方法，包括以下步骤：（a）使肌醇（2）发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮（3）和鲨肌醇（1）；（b）在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解和使细胞质（cell mass）裂解；（c）利用硼酸和氢氧化钠将步骤（b）的鲨肌醇转化为鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物；（d）使鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物水解，以产生粗鲨肌醇；和（e）使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。步骤（a）的生物转化可以包括发酵，其中通过能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物而促进发酵。能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括Acetobacter cerevisiae，Acetobacter malorum，奥尔兰醋酸杆菌（Acetobacter orleanensis），Acetobacter indonesiensis，Acetobacter orientalis，醋化醋酸杆菌（Acetobacter aceti），液化醋酸杆菌（Acetobacter liquefaciens），巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus），汉氏醋酸杆菌（Acetobacter hansenii），须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis），石竹伯克氏菌（Burkholderia caryophylli）和Burkholderia graminis。一般来讲，能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物以冻干或冷冻培养物的形式提供。此方法的步骤（a）在大约20℃至大约40℃下进行。在另一个实施方案中，步骤（a）在大约26℃至大约30℃下进行。
步骤（b）的碱性化合物可以包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸钙及其组合。步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量一般是足以使发酵混合物的pH增加至大约10至大约13的水平的量。在另一个实施方案中，步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量一般是足以使发酵混合物的pH增加至大约12至大约13的水平的量。步骤（b）的加热过程通常包括直接注入蒸汽以使发酵混合物的温度增高，使得温度增高至大约100℃至大约150℃的水平。在另一个实施方案中，发酵混合物的温度增高至大约115℃至大约130℃的水平。在另外的实施方案中，随后可以使由步骤（b）产生的反应混合物冷却至低于大约80℃。
步骤（c）的反应通常在大约60℃至大约80℃下进行。掺入到步骤（c）的反应混合物中的氢氧化钠的量一般足以建立大约8.5至大约11的pH。在另一个实施方案中，掺入到步骤（c）的反应混合物中的氢氧化钠的量足以建立大约9.5至大约10.5的pH。步骤（c）可以进一步包括随后使反应混合物冷却至低于30℃。随后在步骤（d）之前，可以使由步骤（c）产生的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物穿过卧式螺旋倾析器（horizontal scroll decanter）。
在步骤（d）中，加入硫酸之前，将鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物加热至大约30℃至大约50℃。在另一个实施方案中，加入硫酸之前，将步骤（d）中的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物加热至大约36℃至大约43℃。步骤（d）中加入到鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物中的硫酸的量足以使pH降低至大约2至大约3.5的水平。随后可以使步骤（d）的反应产物冷却至大约15℃至大约26℃。在另一个实施方案中，随后可以使步骤（d）的反应产物冷却至大约18℃至大约24℃。
步骤（e）通常包括将水加入到由步骤（d）产生的粗鲨肌醇中，随后对反应混合物进行加热，并随后冷却以产生鲨肌醇结晶。具体地，将水加入到由步骤（d）产生的粗鲨肌醇中后，将水和粗鲨肌醇的反应混合物加热至大约70℃至大约100℃。在另一个实施方案中，可以将水和鲨肌醇的反应混合物加热至大约85℃至大约95℃。随后使步骤（e）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。一般来讲，冷却后，通过固体过滤或离心对步骤（e）中产生的粗鲨肌醇和水的溶液进行固体分离过程，并干燥以产生鲨肌醇结晶。在一个实施方案中，固体分离过程可以包括篮式离心和螺旋倾析离心。此外，在另一个实施方案中，干燥过程可以包括在流化床干燥器，箱式干燥器（tray dryer），滚筒式干燥器（tumble dryer）和unidryer中利用热空气。
在又一个实施方案中，本发明包括产生肌醇的方法，其中不会产生鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物中间体，其依照以下步骤进行：
Figure 551997DEST_PATH_IMAGE004
具体地，本发明包括制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：（a）使肌醇（2）发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮（3）和鲨肌醇（1）；（b）在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解和使细胞质裂解；和（c）使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。步骤（a）的生物转化可以包括发酵，其中通过能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物而促进发酵。能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括Acetobacter cerevisiae，Acetobacter malorum，奥尔兰醋酸杆菌（Acetobacter orleanensis），Acetobacter indonesiensis，Acetobacter orientalis，醋化醋酸杆菌（Acetobacter aceti），液化醋酸杆菌（Acetobacter liquefaciens），巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus），汉氏醋酸杆菌（Acetobacter hansenii），须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis），石竹伯克氏菌（Burkholderia caryophylli）和Burkholderia graminis。一般来讲，能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物以冻干的，冷冻培养物的形式提供。此过程的步骤（a）在大约20℃至大约40℃下进行。在另一个实施方案中，步骤（a）在大约26℃至大约30℃下进行。
步骤（b）的碱性化合物可以包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸钙及其组合。步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量一般是足以使发酵混合物的pH增加至大约10至大约13的水平的量。在另一个实施方案中，步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量一般是足以使发酵混合物的pH增加至大约12至大约13的水平的量。步骤（b）的加热过程通常包括直接注入蒸汽以使发酵混合物的温度增高，使得温度增高至大约100℃至大约150℃的水平。在另一个实施方案中，发酵混合物的温度增高至大约115℃至大约130℃的水平。在另外的实施方案中，随后可以使由步骤（b）产生的反应混合物冷却至低于大约80℃。
步骤（c）通常包括将水加入到由步骤（b）产生的粗鲨肌醇中，随后对反应混合物进行加热，并随后冷却以产生鲨肌醇结晶。随后使步骤（c）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。一般来讲，冷却后，通过固体过滤或离心对步骤（c）中产生的粗鲨肌醇和水的溶液进行固体分离过程，并干燥以产生鲨肌醇结晶。在一个实施方案中，固体分离过程可以包括篮式离心和螺旋倾析离心。而且，在另一个实施方案中，干燥过程可以包括在流化床干燥器，箱式干燥器，滚筒式干燥器和unidryer中利用热空气。
附图说明
本发明的其它优势将容易领会，因为通过参考以下详细描述以及结合所附附图考虑，其将变得更易理解。其中：
图1说明本发明商业规模的方法。具体地，图1说明将肌醇转化为鲨肌醇的方法，其中依次进行以下步骤：生物转化；通过对发酵混合物施用碱和热应力使其降解；与硼酸和氢氧化钠反应以产生鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物；通过与硫酸和水反应使鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物水解以产生粗鲨肌醇；以及使粗鲨肌醇结晶以产生鲨肌醇结晶。
图2说明实施本发明生物转化步骤的一种潜在方法。具体地，图2说明一种方法，其中使工作储存小瓶融化，接种于含有培养基的培养瓶中，并振荡温育以使培养物增殖。培养瓶或其一部分用于接种含有生长培养基的种子发酵罐（Seed Fermentor）并温育，以使细胞质进一步增殖。一个种子发酵罐或其一部分用于接种含有包含肌醇的生产培养基的生产发酵罐（Production Fermentor）。将可以设定为备用品的额外的种子发酵罐丢弃。在无菌条件下进行发酵循环，以完成肌醇（2）经由鲨肌醇单酮（3）中间体向鲨肌醇（1）的生物转化。发酵时间结束时，肌醇（2）耗尽，中间体鲨肌醇单酮（3）以g/l的量存在，产物鲨肌醇（1）是发酵液（fermentation beer）中的主要产物。
图3说明接种到生产发酵罐中之前随着培养物生长，在图2中描述的种子发酵罐中所监测的标准反应参数。具体地，图3说明以下参数，例如气流，回压，CER（Carbon-dioxide Evolution Rate，二氧化碳排放率），DO（Dissolved Oxygen，溶解氧），OUR（Oxygen Uptake Rate，摄氧率），pH，振荡，RQ（Respiratory Quotient，呼吸商，CER/OUR）和温度。
图4说明随着培养物使肌醇发生生物转化并使其反应指定的时间期，在图2中描述的生产发酵罐中所监测的标准反应参数。具体地，图4说明以下参数，例如气流，回压，CER（二氧化碳排放率），DO（溶解氧），OUR（摄氧率），pH，振荡，温度和重量。
图5说明肌醇（MI）起始产物转化为鲨肌醇（SI）终产物的高效液相色谱分析。具体地，图5说明鲨肌醇如何随时间产生以及如何产生最少量的肌醇和所有其它不期望的副产物（例如鲨肌醇单酮（SIS）和鲨栎醇（SQ））。
图6说明由肌醇生产鲨肌醇的中试规模的方法，其中不会生成鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物中间体。
图7说明由肌醇生产鲨肌醇的实验室规模的方法，其中不会生成鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物中间体。
发明详述
本发明涉及由肌醇生产鲨肌醇的更加有效且安全的方法。本发明还使得由本领域目前已知的鲨肌醇生产方法通常产生的不期望副产物的产生最小化。在一个实施方案中，本发明包括以下过程：
Figure 562679DEST_PATH_IMAGE005
如所显示，本发明涉及制备鲨肌醇（1）的方法，包括以下步骤：（a）使肌醇发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮和鲨肌醇；（b）在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解和使细胞质裂解；（c）利用硼酸和氢氧化钠使步骤（b）的鲨肌醇转化，以产生鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物；（d）使鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物水解，以产生粗鲨肌醇；和（e）使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。该过程可以以分批或连续性过程进行。
步骤（a）的生物转化过程一般可以描述为利用活的有机体（通常是微生物）实施化学反应。在本发明中，利用微生物产生能够将肌醇转化为鲨肌醇的发酵混合物。可以认识到的是，转化过程可以产生多种产物的混合物，包括鲨肌醇和鲨肌醇单酮。鲨肌醇单酮是鲨肌醇的结构衍生物，当使其反应延长的一段时间时，其可以转化为鲨肌醇终产物。由于本发明的目标是使由本方法产生的鲨肌醇的量最大化，可以认识到的是，肌醇耗尽后，仍然会保留一些残留的鲨肌醇单酮。术语“残留的”鲨肌醇单酮一般定义为包括肌醇初始量重量的大约5%至大约15%的量的鲨肌醇单酮。
可以认识到的是，可以利用多种微生物将肌醇转化为鲨肌醇单酮和鲨肌醇，这取决于所期望的物种。可以掺入到生物转化步骤中的微生物的适宜示例包括但不限于Acetobacter cerevisiae，Acetobacter malorum，奥尔兰醋酸杆菌（Acetobacter orleanensis），Acetobacter indonesiensis，Acetobacter orientalis，醋化醋酸杆菌（Acetobacter aceti），液化醋酸杆菌（Acetobacter liquefaciens），巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus），汉氏醋酸杆菌（Acetobacter hansenii），须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis），石竹伯克氏菌（Burkholderia caryophylli）和Burkholderia graminis及其组合。在一个实施方案中，掺入到生物转化过程中的微生物包括醋酸杆菌属。无论选择哪种微生物，该微生物可以包括先前已经冷冻-干燥的冻干物种，其通常储存于冷藏温度下。此外，使用冷冻小瓶，其通常储存于低于或等于-70℃下。如果步骤（a）的生物转化过程使用了冻干小瓶，则应当使微生物在引入培养瓶的培养基中之前融化。步骤（a）的生物转化过程通常在大约20℃至大约40℃下进行。在另一个实施方案中，步骤（a）在大约26℃至大约30℃下进行。在又一个实施方案中，步骤（a）在大约28℃下进行。
除了步骤（a）的温度范围之外，通常在大约5至大约9的pH范围下起始生物转化过程。在一个实施方案中，发酵过程开始时的起始pH是大约7。可以认识到的是，在发酵过程中，随着酸性副产物的产生，pH水平可以增高或降低。发酵过程结束时pH水平降低至低于pH 4的水平是常见的。发酵过程的时间长度可以根据所转化的肌醇的量以及选择用于生物转化过程的有机体类型而变化。
本领域技术人员将领会的是，所述生物转化过程可以利用本领域已知的任何潜在的发酵过程。在一个实施方案中，微生物可以直接接种于生产发酵过程中，由此肌醇直接发生转化。在另一个实施方案中，步骤（a）可以包括数个培养扩增时期，包括培养瓶和种子发酵增殖期以及生产发酵期。在该过程下，将微生物掺入到一个或多个种子发酵槽中，并使其在培养基中生长设定的时间段。在种子发酵罐中的生长产生足够量的微生物，随后用其接种生产发酵罐，在所述生产发酵罐中使肌醇发生生物转化，并开始产生期望的终产物。一个示例性实施方案显示于图2中，其说明一种***，其中使用培养瓶或种子发酵罐生成足够的培养质（culture mass）。将可以设定为备用品的额外的培养瓶和种子发酵罐丢弃。接着用种子发酵罐接种生产发酵罐。尽管种子发酵罐中使用的具体条件可以根据期望的产物而变化，图3提供了种子发酵罐中使用的参数的一个示例性种子曲线，包括气流，回压，CER（二氧化碳排放率），DO（溶解氧），OUR（摄氧率），pH，振荡，RQ（呼吸商，CER/OUR）和温度。此外，图4说明一个示例性实施方案，其中其图形阐明了生产发酵槽中的多种参数，包括气流，回压，CER（二氧化碳排放率），DO（溶解氧），OUR（摄氧率），pH，振荡，温度和重量。此外，图5说明类似于步骤（a）的标准发酵过程的高效液相色谱（HPLC）分析。具体地，如图5中所见，肌醇转化为鲨肌醇，其中发酵过程中仅形成最小量的其它副产物，包括鲨肌醇单酮和鲨栎醇。本领域技术人员将领会的是，术语最小量的副产物可以被视为包括低于肌醇初始量约10-15%的量的副产物。
该过程的步骤（b）包括在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使残留的鲨肌醇单酮降解。一般来讲，步骤（b）中使用的碱性化合物可以包括能够使发酵混合物的pH升高至期望水平的任何化合物。步骤（b）的碱性化合物可以包括但不限于氢氧化钠，碳酸钠，氢氧化钾，硼氢化钠，碳酸钙及其组合。该过程的步骤（b）一般在大约10至大约14的pH水平下进行。在另一个实施方案中，步骤（b）在大约12至大约13的pH水平下进行。相应地，掺入到步骤（b）的反应中的碱性化合物通常以足以使pH升高至期望水平的量加入。因此，本领域技术人员能够容易地确定掺入到反应步骤（b）中的碱性化合物的量。
步骤（b）的加热过程通常包括能够使反应温度增加以有助于鲨肌醇单酮和反应细胞质降解的任何过程。对反应混合物进行加热的方法可以根据设备的生产限制而变化。在一个实施方案中，可以利用直接注射蒸汽使发酵混合物的温度增高。在另一个实施方案中，步骤（b）可以使用热交换器以使反应温度增高。无论使用哪种加热机制，发酵混合物的温度一般增高至大约100℃至大约150℃的水平。在另一个实施方案中，步骤（b）的发酵混合物的温度一般增高至大约115℃至大约130℃的水平。在又一个实施方案中，发酵混合物的温度增高至大约120℃至大约125℃的水平。
使步骤（b）的发酵混合物反应足够的时间后，可以使发酵混合物在加入步骤（c）的反应物之前冷却。一般来讲，步骤（b）进行大约5分钟至大约60分钟。此外，在一个实施方案中，步骤（b）的发酵混合物冷却至低于大约90℃。在另一个实施方案中，步骤（b）的混合物冷却至低于大约80℃。
进行步骤（c）的反应，以产生鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物。具体地，使由步骤（b）产生的鲨肌醇与硼酸和氢氧化钠反应，以产生前述的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物。一般来讲，步骤（c）中使用的硼酸的量足以提供大约1.5至大约4的硼酸对鲨肌醇的摩尔比。在另一个实施方案中，硼酸对鲨肌醇的摩尔比为大约2至大约3.5。在又一个实施方案中，硼酸对鲨肌醇的摩尔比为大约2.5至大约3。重要的是，本发明的步骤（c）在由鲨肌醇向鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的转化中不会掺入氯化钠。已知氯化钠对不锈钢和其他仪器表面具有腐蚀性。就此而言，去除该腐蚀性试剂提高过程的效率。步骤（c）通常在大约60℃至大约80℃下进行。掺入到步骤（c）的反应混合物中的氢氧化钠的量一般足以建立大约8.5至大约11的pH。在另一个实施方案中，掺入到步骤（c）的混合物中的氢氧化钠的量足以建立大约9.5至大约10.5的pH。因此，本领域技术人员能够容易地确定掺入到反应步骤（c）中的氢氧化钠的量。步骤（c）可以进一步包括随后使混合物冷却至低于30℃。
需要注意的是，在步骤（d）之前，通常将由步骤（c）产生的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物从反应混合物中剩余的液体中分离出来。该过程提供仅包含鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的反应产物，而非鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐）和溶剂的混合物。鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的分离是重要的，因为溶剂通常含有很多杂质，其可以对产物产率产生不利影响。因此，通过清除溶剂部分并仅产生固体的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物，该过程能够产生更纯的产物并且产物产率更高。可以通过本领域目前已知的任何方法进行鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的分离。在一个实施方案中，使鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物穿过卧式螺旋倾析器，以便无需对反应混合物进行清洗或干燥即可将鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物分离出来，这进一步提供了成本效率。
鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物一经分离，使步骤（c）的产物水解，以产生粗鲨肌醇。在步骤（d）中，将鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物与水混合，并加热至大约30℃至大约50℃。一般来讲，步骤（d）中加入的水的量为每千克SBC盐大约1升水至每千克SBC盐大约7升水。在另一个实施方案中，在步骤（d）中以每千克SBC盐约3至约5升的量加入水。在又一个实施方案中，以每千克SBC盐大约4L的量加入水。相应地，鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物加热至大约36℃至大约43℃。重要的是需要注意，此过程在水解过程中不会掺入有机溶剂，而是相反依靠水作为主要溶剂。有机溶剂产生由于在过程中使用后丢弃溶剂而引起的潜在的环境污染方面的问题。用水作为溶剂消除了与有机溶剂丢弃相关的污染顾虑。
一旦达到指定的温度范围，将无机酸加入到鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物中，以诱导鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物发生水解。尽管上面的反应方案阐述了利用硫酸，然而本领域技术人员将理解的是，可以使用能够诱导水解的任何无机酸。无机酸可以包括但不限于盐酸，氢溴酸，氢碘酸，次氯酸，氯酸，高氯酸，高碘酸，硫酸，氟磺酸（fluorosulfuric acid），硝酸，磷酸，氟锑酸，氟硼酸，六氟硼酸和铬酸。在一个实施方案中，无机酸包括盐酸，硫酸和磷酸。在又一个实施方案中，无机酸包括硫酸。步骤（d）中加入到鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物中的无机酸的量一般是足以使pH降低至低于4的水平的量。在一个实施方案中，加入到混合物中的无机酸的量是足以使pH降低至大约2至大约3.5的水平的量。因此，本领域技术人员能够容易地确定掺入到反应步骤（d）中的无机酸的量。
随后可以使步骤（d）的反应产物冷却至大约15℃至大约26℃。在另一个实施方案中，随后可以使步骤（d）的反应产物冷却至大约18℃至大约24℃。冷却过程一经完成，可以对步骤（d）的反应产物进行过滤过程，以将多余的水从反应混合物中去除。过滤过程可以包括本领域已知的任何过程，具体地其可以包括离心。需要注意的是，反应结束后，步骤（d）的反应产物一般不经干燥。相反，在步骤（e）中对粗鲨肌醇进行处理，因为步骤（d）的反应中形成了湿滤饼（wet cake）。干燥过程不仅增加了处理时间，还可能造成一些产物损耗。
步骤（e）通常包括将水加入到由步骤（d）产生的粗鲨肌醇中，随后对反应混合物进行加热，并随后使其冷却，以产生鲨肌醇结晶。一般来讲，以每千克粗鲨肌醇大约6至大约20升之间的量将水加入到粗鲨肌醇中。在另一个实施方案中，以每千克粗鲨肌醇大约12至大约18升之间的量将水加入到粗鲨肌醇中。在又一个实施方案中，以每千克粗鲨肌醇大约15至大约17 升之间的量将水加入到粗鲨肌醇中。将水加入到由步骤（d）产生的粗鲨肌醇中后，将水和粗鲨肌醇的反应混合物加热至大约70℃至大约100℃。在另一个实施方案中，可以将水和鲨肌醇的反应混合物加热至大约85℃至大约95℃。随后使步骤（e）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约0℃至大约25℃。在另一个实施方案中，随后使步骤（e）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。一般来讲，冷却后，通过固体过滤或离心对步骤（e）中产生的粗鲨肌醇和水的溶液进行固体分离过程，并干燥以产生鲨肌醇结晶。一般来讲，固体分离过程可以包括本领域已知的任何过程。在一个实施方案中，固体分离过程包括篮式离心和螺旋倾析离心。离心可以包括使用多个预过滤器和初级过滤器以分离期望的化合物。除此之外，干燥过程可以包括本领域目前已知的任何干燥过程。在一个实施方案中，干燥方法包括在流化床干燥器，箱式干燥器，滚筒式干燥器和unidryer中利用热空气。
如该实施方案中所描述的产生鲨肌醇的方法与本领域已知的方法相比提供了多种益处。该实施方案中的方法不需要使用难以丢弃并且可能对环镜产生有害影响的有机溶剂。而且，该实施方案的过程也不需要使用某些腐蚀性反应物，例如氯化钠。除了这些益处之外，该方法获得出乎意料地高产率的鲨肌醇。一般来讲，基于该方法中使用的肌醇初始量，该方法获得大约20%至大约50%的鲨肌醇产率。在另一个实施方案中，基于该过程中使用的肌醇初始量，鲨肌醇产率在大约25%至大约35%。
在一个替代性实施方案中，本发明包括其中不形成鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的过程，以使由生物转化步骤产生粗鲨肌醇，随后通过暴露于碱性化合物和热能而使鲨肌醇降解，接着使化合物结晶。该实施方案由以下步骤阐述：
Figure 592951DEST_PATH_IMAGE004
如所阐述，该实施方案包括制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：（a）使肌醇发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮和鲨肌醇；（b）在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解；和（c）使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。本发明的该实施方案说明于图6和图7中。需要注意的是，该实施方案的步骤（a）和（c）分别类似于前面描述的实施方案的步骤（a）和（e）。就此而言，对于本实施方案的步骤（a）和（c），分别引用和并入关于步骤（a）和（e）的参数和考虑因素。
本实施方案的步骤（b）涉及使鲨肌醇单酮降解的方法。与前面的实施方案类似，用于使鲨肌醇单酮降解的碱性化合物一般是能够使反应混合物的pH增加的化合物。可以掺入的碱性化合物的适宜示例包括但不限于氢氧化钠，碳酸钠，氢氧化钾，硼氢化钠，碳酸钙及其组合。在一个实施方案中，碱性化合物包括氢氧化钠。在又一个实施方案中，碱性化合物包括硼氢化钠。
步骤（b）的反应温度和pH范围一般取决于所使用的使鲨肌醇单酮降解的碱性化合物。在产生鲨肌醇而不会形成鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的方法的一个实施方案中，氢氧化钠用作步骤（b）的碱性化合物，反应混合物的pH增加至大约12至大约13的水平。在该实施方案中，反应混合物的温度增加至大约100℃至大约150℃的水平，具体地至大约115℃至大约130℃。
在产生鲨肌醇而不会形成鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物的方法的另一个实施方案中，可以选择硼氢化钠作为步骤（b）中使用的碱性化合物。在该实施方案中，通常将反应混合物调节至大约6至大约8的pH水平。可以在大约50℃至大约70℃下将硼氢化钠加入到反应混合物中。在另一个实施方案中，可以在大约60℃下将硼氢化钠加入到反应混合物中。随后，利用硫酸使所得到的鲨肌醇，鲨肌醇单酮和硼氢化钠的混合物酸化至大约3.5或更低的pH水平。接着可以将经酸化的反应混合物加热至大约80℃至大约100℃。在一个实施方案中，可以将经酸化的反应混合物加热至大约90℃。该具体实施方案说明于图7中。
无论步骤（b）中使用哪种碱性化合物，对步骤（b）的反应混合物进行加热后，随后使其冷却，准备进行步骤（c）的结晶过程。可以使步骤（b）的反应混合物冷却至大约0℃至大约25℃。在另一个实施方案中，随后使步骤（b）的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。
该实施方案比前面的实施方案引入较少的过程步骤，其提供了不利用有机酸或某些腐蚀性反应物而产生鲨肌醇的方法。对现有领域中已知方法的这些改变提供了制备鲨肌醇的更有效且具有环保意识的方法。
通过参考以下实施例将更好地理解本发明的化合物和方法，所述实施例意在说明而非限制本发明的范围。每个实施例说明制备多种中间体化合物的至少一种方法，并进一步说明整个过程中利用的每种中间体。这些是某些优选的实施方案，其并非意在限制本发明的范围。相反，本发明涵盖了能够包含于权利要求的范围内的所有替代，修改和等同物，常规实验，包括反应条件的恰当操作，所使用的试剂，以及生物转化和合成途径的顺序，能够与反应条件相容的任何化学功能性保护，及在方法的反应顺序中的适宜点去保护，包含于本发明的范围内。
实施例
实施例1：肌醇（2）转化为鲨肌醇（1）以及鲨肌醇单酮（3）和细胞质的降解
Figure 502133DEST_PATH_IMAGE006
在含有培养基和冻干保护剂的小瓶中从醋酸杆菌属中制备细胞库（cell bank）和工作储存液（Working Stocks），将其储存于-70℃或更低温度下。使工作储存液融化，并接种于4L培养瓶中的1.5升培养瓶培养基中。接着于28 ± 2℃以240 ± 10 rpm温育大约24h，并对光密度（OD）和残留的葡萄糖进行测定。用培养瓶或其一部分以0.01至0.1%接种种子发酵罐，以使细胞质增殖。将种子发酵罐控制在28℃下，以大约150rpm振荡和以大约1VVM通气，进行24-30h的循环。用种子发酵罐或其一部分以2500Kg肌醇（2）的规模以1-5%接种生产发酵罐。发酵条件如下。温度：28℃，振荡：50rpm，通气：0.5VVM 0-5h并升高至1VVM，以及回压：5psig。pH不受控制，但监测其从开始时大约7的起始pH降至发酵结束时低于4。发酵循环在无菌条件下进行5天，以完成肌醇（2）经由鲨肌醇单酮（3）中间体向鲨肌醇（1）的转化。5天的发酵时间结束时，肌醇（2）被耗尽，鲨肌醇单酮（3）以大约10-15g/L存在，产物鲨肌醇（1）经测定为大约55-60g/L。利用25%的氢氧化钠水溶液将所得含有细胞质，鲨肌醇（1）和少量鲨肌醇单酮（3）的发酵液的pH调节至大约12-13，并利用蒸汽将发酵液加热至120-125℃ NLT 10分钟。使所得深棕色的经受应力的发酵液（stressed broth）冷却至80℃以下，并对经受应力的发酵液的一份样品进行测试，以确定鲨肌醇（1）的量（以g/L表示）。基于该测定，经受应力的发酵液中存在的鲨肌醇的总量估测为1377Kg。
实施例2：经受应力的发酵液中的鲨肌醇（1）选择性转化为鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）和利用卧式螺旋倾析器进行分离
Figure 276054DEST_PATH_IMAGE007
在一个单独的SS反应器中，将1323Kg的硼酸（2.8当量）悬浮于2065L的水 [1.5L/1Kg的鲨肌醇（1）]中，并加热至NLT 60℃的温度。将所得浆液转移至含有碱－经受热应力的发酵液和鲨肌醇（1）的发酵容器中。将额外量的水[1377L，1.0L/1Kg的鲨肌醇（1）]注入硼酸反应器，加热至NLT 60℃，并将该溶液转移至含有经受应力的发酵液的发酵容器中。含有经受应力的发酵液，鲨肌醇（1）和硼酸的发酵容器中的内含物总体积经测定为32500L，通过加入1914L水将其进一步调节至34414L，以保持经受应力的发酵液中4L/Kg 的鲨肌醇（1）的3期（Stage-3）起始体积。将混合物的温度调节至60-80℃，并在NLT 1h内振荡着注入25%的氢氧化钠水溶液，以将混合物的pH调节至9.5-10.5。将所得含有鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBＣ盐，5）的浆液混合NLT 3h，同时使反应混合物的温度保持在60-80℃，接着冷却至30℃以下。
在一个单独的SS反应器中，取2753L水[2.0L/1Kg的鲨肌醇（1）]，并于15-25℃温和地混合。使发酵反应器中的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）浆液以大约2200 RPM和20-100L/h的流速穿过卧式螺旋倾析器（CA-225），以将鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）从液体中分离出来，同时使固体直接落入单独的SS反应器中的混合水（2753L）中。周期性地对卧式螺旋倾析器（CA-225）中的深棕色液体废物进行检查，以确保无鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）固体存在。根据需要，对卧式螺旋倾析器的RPM和浆液流速进行调节，以保证发酵发应器中的所有浆液穿过之前无固体存在，并将所有鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）分离，使其落入SS反应器中的水中。
实施例3：鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）水解为鲨肌醇（1）和分离粗鲨肌醇（1）
Figure 141241DEST_PATH_IMAGE008
将额外量的水[2753L，[2.0L/1Kg的鲨肌醇（1）]注入含有水中的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物（SBC盐，5）的SS反应器中，并将混合物加热至36-43℃。在NLT 1h内缓慢地将浓硫酸注入该悬浮液中，并将SBC盐悬浮液的pH调节至2.0-3.5，同时在剧烈振荡下保持温度在36-43℃。完成加入硫酸并达到了2.0-3.5的稳定pH后，使所得鲨肌醇（1）浆液混合NLT 4h，同时保持温度在36-43℃。使混合物冷却至18-24℃，通过篮式离心进行过滤，将粗鲨肌醇（1）以湿滤饼（1746kg）的形式分离出来，并收集于圆桶中的粗产物中。进行下一个阶段前，对粗鲨肌醇（1）产物的多个混合样品（每个来自于约3-4个圆桶）测试干燥失重（Loss on Drying，LOD），计算得到鲨肌醇（1）（基于干重）为1370Kg。
实施例4：粗鲨肌醇（1）湿滤饼结晶化和分离鲨肌醇（1）
Figure 588754DEST_PATH_IMAGE009
使粗鲨肌醇（1）湿滤饼结晶化，干燥，按份研磨，并将鲨肌醇（1）产物逐步加入搅拌器中，直至所有亚批次的粗鲨肌醇（1）的加工均已完成。因此，将最多220Kg（基于干重）粗鲨肌醇（1）湿滤饼注入含有3600L纯水[16.5L/1kg的粗鲨肌醇（1）]的SS反应器中，并将悬浮液加热至85-95℃ NLT 15分钟，以使所有固体溶解。使所得清澈的，热的鲨肌醇（1）-水溶液通过预过滤器和初级过滤器组[棉质（1μm级）深层预过滤器，随后是具有两个孔径膜（绝对精度1.0μm和绝对精度0.22μm）的聚醚砜（PES）过滤器]过滤，进入单独的SS结晶器中。过滤完成后，将SS结晶器中的清澈的棕色溶液加热至85-95℃ NLT 10分钟，并在NLT 3小时内逐渐冷却至8-16℃。通过离心对所得浆液进行过滤，并以NMT 100L/离心负荷的冰纯水对无色鲨肌醇（1）进行清洗。在流化床干燥器（FBD）中用热空气以进气温度90℃对湿鲨肌醇（1）干燥NLT 1h，直至鲨肌醇（1）的混合样品符合限值为NLT 1.0 w/w%的干燥失重（LOD）测试。利用含有~840μm筛的Comil对经干燥的鲨肌醇（1）产物进行研磨，并在Beardsley & Piper搅拌器中合并所有的亚批次。使经合并的鲨肌醇（1）产物以30 RPM混合NLT 15分钟，并对一份鲨肌醇（1）产物样品进行限值为NLT 1.5 w/w%的干燥失重（LOD）测试，接着将其包裹入折线（poly-lined）圆桶中，以产生722.6Kg的鲨肌醇（1），总体产率为28.9%。通过篮式离心对鲨肌醇进行过滤。
实施例5：肌醇（2）转化为鲨肌醇（1），SIS和细胞质的降解以及直接分离粗鲨肌醇（1）
Figure 172182DEST_PATH_IMAGE010
使工作储存液融化，并接种于4L培养瓶中的1.5升培养瓶培养基中。接着于28 ± 2℃的温度以240 ± 10 rpm温育大约24h，并对光密度（OD）和残留的葡萄糖进行测定。用培养瓶或其一部分以0.01至0.1%接种种子发酵罐，以使细胞质增殖。将种子发酵罐控制在28℃下，以大约150rpm振荡和以大约1VVM通气，进行24-30h的循环。用种子发酵罐或其一部分以40Kg肌醇（2）的规模以1-5%接种生产发酵罐。发酵条件如下。温度：28℃，振荡：100rpm，通气：0.5VVM 0-5h并升高至1VVM，以及回压：5psig。pH不受控制，但监测其从开始时大约7的起始pH降至发酵结束时低于4。发酵循环在无菌条件下进行5天，以完成肌醇（2）经由鲨肌醇单酮（3）中间体向鲨肌醇（1）的转化。5天的发酵时间结束时，肌醇（2）被耗尽，鲨肌醇单酮（3）以大约10-15g/L存在，产物鲨肌醇（1）经测定为大约55-60g/L。利用氢氧化钠溶液将发酵液的pH调节至大约12-13，并将混合物加热至120-125℃ NLT 10分钟。使所得加压发酵液在NLT 4小时内冷却至15℃以下。通过篮式离心对所得浆液进行过滤，并用冰水（8Kg）清洗湿滤饼，以提供17.6kg暗棕色结晶湿固体形式的鲨肌醇（1）。
实施例6：粗鲨肌醇（1）湿滤饼结晶化和分离鲨肌醇（1）
Figure 484214DEST_PATH_IMAGE011
将粗鲨肌醇（1）湿滤饼（12.9kg和11.0kg（基于干重））注入含有水（179kg）的反应器中，并将悬浮液加热至NLT 90℃ NLT 15分钟。在压力下使所得清澈的溶液过滤通过0.2μm膜过滤器。使经过滤的溶液在NLT 3小时内冷却至15℃以下，通过离心对所得浆液进行过滤，并用冰水（1.5kg）对湿滤饼进行清洗，以提供17.6kg无色（白色）结晶湿固体形式的鲨肌醇（1）。在真空炉中于100-104℃对湿鲨肌醇（1）干燥NLT 12小时，以产生4.75kg干鲨肌醇（1）。
实施例7：肌醇（2）转化为鲨肌醇（1）和分离粗鲨肌醇（1）
将如实施例1中所述制备的发酵液的一部分（2.2L）加热至60℃，并利用氢氧化钠溶液将pH调节至大约7。将硼氢化钠（14.98g）逐步加入，并使混合物于60℃保持NLT 3小时。利用硫酸使所得混合物酸化至pH NMT 3.5，并加热至90℃ NLT 15分钟，以形成清澈的溶液，接着在NLT 4 小时内冷却至15℃以下。对所得浆液进行过滤，并用冰水（0.1kg）对湿滤饼进行清洗，以提供0.082kg暗棕色结晶湿固体的鲨肌醇（1）。
实施例8：粗鲨肌醇（1）湿滤饼结晶化和分离鲨肌醇（1）
Figure 592296DEST_PATH_IMAGE011
将粗鲨肌醇（1）湿滤饼（0.082kg和0.081kg（基于干重））注入含有水（1.35kg）的玻璃反应器中，并将悬浮液加热至NLT 90℃ NLT 15分钟。利用泵使所得清澈的溶液过滤通过0.2μm膜过滤器。使经过滤的溶液在NLT 3小时内冷却至15℃以下，对所得浆液进行过滤，并用冰水（0.05kg）对湿滤饼进行清洗，以提供湿鲨肌醇（1），将其在真空炉中于100-104℃干燥NLT 12小时，以提供0.047kg白色结晶固体形式的鲨肌醇（1）。
可以理解的是，上面的详述和所附实施例仅仅是说明性的，其不能被看作是对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求和其等同物限定。所公开实施方案的多种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不偏离其精神和范围的情况下，可以作出包括但不限于与本发明的化学结构，替代物，衍生物，中间物，合成，制剂和/或使用方法相关的变化和修改。

Claims (60)

1.制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：
Figure 147837DEST_PATH_IMAGE001
。
2.制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：
a. 使肌醇发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮和鲨肌醇；
b. 在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解和使细胞质裂解；
c. 利用硼酸和氢氧化钠将步骤（b）的鲨肌醇转化产生鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物；
d. 利用硫酸和水使鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物水解，以产生粗鲨肌醇；及
e. 使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。
3.权利要求2的方法，其中所述生物转化步骤包括产生发酵液，其中通过能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物而促进发酵。
4.权利要求2的方法，其中所述能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括Acetobacter cerevisiae，Acetobacter malorum，奥尔兰醋酸杆菌（Acetobacter orleanensis），Acetobacter indonesiensis，Acetobacter orientalis，醋化醋酸杆菌（Acetobacter aceti），液化醋酸杆菌（Acetobacter liquefaciens），巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus），汉氏醋酸杆菌（Acetobacter hansenii），须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis），石竹伯克氏菌（Burkholderia caryophylli）和Burkholderia graminis。
5.权利要求3的方法，其中所述能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括冻干和/或冷冻培养物。
6.权利要求3的方法，其中步骤（a）在大约20℃至大约40℃下进行。
7.权利要求3的方法，其中步骤（a）在大约26℃至大约30℃下进行。
8.权利要求2的方法，其中所述步骤（b）的碱性化合物包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸钙及其组合。
9.权利要求8的方法，其中步骤（b）中加入到发酵液中的碱性化合物的量是足以使发酵液的pH增加至大约10至大约13的水平的量。
10.权利要求8的方法，其中步骤（b）中加入到发酵液中的碱性化合物的量是足以使发酵液的pH增加至大约12至大约13的水平的量。
11.权利要求2的方法，其中步骤（b）包括直接注入蒸汽以使发酵液的温度增高。
12.权利要求11的方法，其中所述发酵液的温度增高至大约100℃至大约150℃的水平。
13.权利要求11的方法，其中所述发酵液的温度增高至大约115℃至大约130℃的水平。
14.权利要求12的方法，其中将发酵液加热至大约100℃至大约150℃后，使发酵液冷却至低于大约80℃。
15.权利要求2的方法，其中所述步骤（c）的反应在大约60℃至大约80℃下进行。
16.权利要求2的方法，其中掺入到步骤（c）的发酵液中的氢氧化钠的量足以建立大约8.5至大约11的pH。
17.权利要求2的方法，其中掺入到步骤（c）的发酵液中的氢氧化钠的量足以建立大约9.5至大约10.5的pH。
18.权利要求15的方法，其中步骤（c）进一步包括随后使发酵液冷却至低于30℃。
19.权利要求2的方法，其中在步骤（d）之前，使由步骤（c）产生的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物穿过卧式螺旋倾析器。
20.权利要求2的方法，其中在加入硫酸之前，将步骤（d）中的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物加热至大约30℃至大约50℃。
21.权利要求2的方法，其中在加入硫酸之前，将步骤（d）中的鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物加热至大约36℃至大约43℃。
22.权利要求20的方法，其中步骤（d）中加入到鲨肌醇-二硼酸-二钠盐复合物和水的组合物中的硫酸的量足以使pH降低至大约2至大约3.5的水平。
23.权利要求22的方法，其中随后使步骤（d）的反应产物冷却至大约15℃至大约26℃。
24.权利要求22的方法，其中随后使步骤（d）的反应产物冷却至大约18℃至大约24℃。
25.权利要求2的方法，其中步骤（e）包括将水加入到粗鲨肌醇中，随后对反应混合物进行加热，并随后冷却以产生鲨肌醇结晶。
26.权利要求2的方法，其中将水加入到步骤（d）中产生的粗鲨肌醇中后，将水和粗鲨肌醇的反应混合物加热至大约70℃至大约100℃。
27.权利要求2的方法，其中将水加入到步骤（d）中产生的粗鲨肌醇中后，将水和鲨肌醇的反应混合物加热至大约85℃至大约95℃。
28.权利要求25的方法，其中随后使步骤（e）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。
29.权利要求27的方法，其中对步骤（e）中产生的粗鲨肌醇和水的经冷却溶液进行固体分离过程，并干燥以产生鲨肌醇结晶。
30.权利要求28的方法，其中所述固体分离过程包括篮式离心和螺旋倾析离心。
31.权利要求29的方法，其中所述干燥过程包括在流化床干燥器，箱式干燥器，滚筒式干燥器和unidryer中利用热空气。
32.制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：
。
33.制备鲨肌醇（1）的方法，其包括以下步骤：
a. 使肌醇发生生物转化过程，以产生鲨肌醇单酮和鲨肌醇；
b. 在碱性化合物和热的条件下使步骤（a）中产生的鲨肌醇单酮和鲨肌醇反应，以使鲨肌醇单酮降解，和使细胞质裂解；
c. 使粗鲨肌醇结晶化，以产生鲨肌醇结晶。
34.权利要求33的方法，其中所述生物转化步骤包括产生发酵混合物，其中通过能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物而促进发酵。
35.权利要求33的方法，其中所述能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括Acetobacter cerevisiae，Acetobacter malorum，奥尔兰醋酸杆菌（Acetobacter orleanensis），Acetobacter indonesiensis，Acetobacter orientalis，醋化醋酸杆菌（Acetobacter aceti），液化醋酸杆菌（Acetobacter liquefaciens），巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus），汉氏醋酸杆菌（Acetobacter hansenii），须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis），石竹伯克氏菌（Burkholderia caryophylli）和Burkholderia graminis。
36.权利要求34的方法，其中所述能够将肌醇转化为鲨肌醇的微生物包括冻干培养物和冷冻培养物。
37.权利要求34的方法，其中步骤（a）在大约20℃至大约40℃下进行。
38.权利要求34的方法，其中步骤（a）在大约26℃至大约30℃下进行。
39.权利要求33的方法，其中所述步骤（b）的碱性化合物包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，硼氢化钠，碳酸钙及其组合。
40.权利要求39的方法，其中所述步骤（b）的碱性化合物包括氢氧化钠。
41.权利要求40的方法，其中步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量是足以使发酵混合物的pH增加至大约10至大约13的水平的量。
42.权利要求40的方法，其中步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量是足以使发酵混合物的pH增加至大约12至大约13的水平的量。
43.权利要求39的方法，其中所述步骤（b）的碱性化合物包括硼氢化钠。
44.权利要求40的方法，其中步骤（b）中加入到发酵混合物中的碱性化合物的量是足以使发酵混合物的pH增加至大约6至大约8的水平的量。
45.权利要求33的方法，其中步骤（b）包括直接注入蒸汽以使发酵混合物的温度增高。
46.权利要求45的方法，其中所述发酵混合物的温度增高至大约100℃至大约150℃。
47.权利要求45的方法，其中所述发酵混合物的温度增高至大约115℃至大约130℃。
48.权利要求45的方法，其中所述发酵混合物的温度增高至大约50℃至大约70℃。
49.权利要求45的方法，其中所述发酵混合物的温度增高至大约85℃至大约95℃。
50.权利要求33的方法，其中随后使步骤（b）的反应产物冷却至大约15℃至大约26℃。
51.权利要求33的方法，其中随后使步骤（b）的反应产物冷却至大约18℃至大约24℃。
52.权利要求33的方法，其中步骤（b）进一步包括随后通过加入硫酸使发酵混合物酸化。
53.权利要求52的方法，其中加入到发酵混合物中的硫酸的量是足以使发酵混合物的pH降低至大约3.5或更低的水平的量。
54.权利要求53的方法，其中使发酵混合物的pH降低至大约3.5或更低的水平后，随后将发酵混合物加热至大约80℃至大约100℃。
55.权利要求33的方法，其中步骤（c）包括将水加入到粗鲨肌醇中，随后对反应混合物进行加热，并随后冷却以产生鲨肌醇结晶。
56.权利要求33的方法，其中将水加入到由步骤（b）产生的粗鲨肌醇中后，将水和粗鲨肌醇的反应混合物加热至高于80℃。
57.权利要求56的方法，其中随后使步骤（c）中产生的水和粗鲨肌醇的反应混合物冷却至大约8℃至大约16℃。
58.权利要求57的方法，其中对步骤（e）中产生的粗鲨肌醇和水的经冷却溶液进行固体分离过程，并干燥以产生鲨肌醇结晶。
59.权利要求58的方法，其中所述固体分离过程包括篮式离心和螺旋倾析离心。
60.权利要求58的方法，其中所述干燥过程包括在流化床干燥器，箱式干燥器，滚筒式干燥器和unidryer中利用热空气。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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