CN102869386A

CN102869386A - 用于治疗红细胞增多症的antimiR-451

Info

Publication number: CN102869386A
Application number: CN2011800142685A
Authority: CN
Inventors: E.N.奥尔森; D.M.帕特里克
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2010-01-20
Filing date: 2011-01-20
Publication date: 2013-01-09
Also published as: US20140011859A1; EP2536436A1; JP2013530160A; US9340782B2; EP2536436A4; WO2012148373A1

Abstract

本发明提供了治疗与异常红细胞生成有关的疾病和病症的方法。具体地，本发明提供了用于治疗受试者中的红细胞增多症的方法，其通过施用miR-451抑制剂进行。还公开了通过施用miR-451模拟物在受试者中增加红细胞计数和治疗贫血的方法。

Description

用于治疗红细胞增多症的antimiR-451

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年1月20日提交的美国临时申请No.61/296,783和2010年2月26日提交的美国临时申请No.61/282,546的权益，通过提及而将其完整收入本文。

关于政府资助的声明

本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号(Grant Number)HL093039下在政府支持下做出的。政府具有本发明的某些权利。

关于电子提交的文本文件的说明

通过提及将随此电子提交的文本文件的内容完整并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：MIRG_021_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日：2011年1月20日，文件大小6千字节)。

发明领域

本发明涉及通过调节微小RNA(miRNA)的活性或表达来治疗与异常红细胞生成有关的病症和疾病。具体地，本发明涉及通过调节miR-451的表达来治疗红细胞增多症或贫血。

发明背景

红细胞增多症，或红细胞总量(red blood cell mass)不适当的增加可以是先天性的或获得性的。原发性红细胞增多症，又称为真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)是一种源自已经获得了JAK2-V617F突变的髓样祖细胞的克隆扩张的获得性疾病。在95%的PV病例中观察到的此突变诱导红血球祖先的过度成熟，导致过度循环的成熟红血球。每100,000人约有2名具有PV，其中流行性在男性中比在女性中高。观察到由于红细胞总量增加直接所致的显著发病率和死亡率，包括脑血管事件、心肌梗死、深静脉血栓形成、和肺栓塞。距诊断时的中值存活是约13年，大于40%的死亡归因于血栓形成事件。目前，此疾病的主要疗法是通过静脉切开术控制红细胞总量。为了适当治疗PV，必须开发直接降低红细胞总量而没有显著毒性的治疗性化合物。

贫血(其是红细胞的正常数目减少或血液中血红蛋白的正常水平降低)是最常见的血液病症，并且可以由各种因素，包括过度失血(例如，出血)、对红细胞的过度破坏(例如，溶血)、和红细胞生成不足(例如，有缺陷的红细胞生成)引起。目前的贫血治疗经常取决于根本的原因，并且包括铁补充、外源红细胞生成素、和输血。特别地，再生障碍性贫血源自骨髓不能生成足够量的血细胞。再生障碍性贫血通常不响应常规的抗贫血治疗，并且可能需要骨髓移植物以改善状况。如此，不断需要针对贫血的其它治疗，特别是那些作用为增加血细胞生成的治疗。

最近，miRNA已牵涉在许多生物学过程中，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。miRNA指长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，其源自单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或通常编码多种紧密相关的miRNA的多顺反子转录物。见Carrington等的综述(Science,第301卷(5631):336-338,2003)。miRNA起靶mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列完美互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。许多miRNA是组织特异性的，容许它们以组织特异性方式调节遍在表达的基因。由于这些特性，有可能的是，对miRNA的调节可以以组织特异性方式在治疗上影响复杂的疾病状态。

发明概述

本发明部分基于如下的发现，miR-451是正常红细胞生成需要的，并且miR-451表达量的降低导致成熟红血球的显著减少。如此，miR-451表达的调控提供了一种治疗与异常红细胞生成有关的病症和疾病，诸如红细胞增多症和贫血的治疗性方法。因而，在一个实施方案中，本发明提供了一种在有此需要的受试者(包括人)中治疗红细胞增多症的方法，其通过对受试者施用miR-451的抑制剂来进行。在某些实施方案中，miR-451抑制剂是经修饰的或未修饰的反义寡核苷酸，其包含与整个或部分成熟miR-451序列至少部分互补的序列。在一些实施方案中，受试者的红细胞计数在施用miR-451抑制剂后降低。受试者可以诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症、原发性家族性和先天性红细胞增多症、或与红细胞增多症有关的疾病。

本发明还包括一种在受试者中增加红细胞计数的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用miR-451模拟物。miR-451模拟物可以是包含成熟miR-451序列、前体miR-451序列、或初级miR-451序列(primary miR-451sequence)的多核苷酸。在一些实施方案中，自载体表达包含miR-451序列的多核苷酸。受试者可以诊断为、患有、或有风险形成红细胞不发育或某种类型的贫血，诸如再生障碍性贫血。

本发明还提供了一种在受试者中调控成熟红血球与红血球前体的比率的方法。在一个实施方案中，该方法包括对所述受试者施用miR-451活性或表达的调控物。可以通过施用本发明的miR-451抑制剂实现成熟红血球与红血球前体的比率的降低。可以通过施用本发明的miR-451模拟物实现成熟红血球与红血球前体的比率的增加。在一些实施方案中，成熟红血球是CD71阴性且TER 119阳性的。

附图简述

图1：对自野生型小鼠分离的指定组织中miR-451表达的Northern印迹分析。BM，骨髓；Lg，肺；Sp，脾；K，肾；H，心脏；SkM，骨骼肌；Bl，膀胱；Lv，肝。

图2.A.对自野生型(WT；miR-451+/+)、杂合子(Het；miR-451+/-)、和miR-451敲除(KO；miR-451-/-)动物分离的骨髓组织中miR-451表达的Northern印迹(左侧小图)和定量实时RT-PCR分析(右侧小图)。使用RNU6B表达作为上样对照。B.8周龄野生型(WT；miR-451+/+)小鼠和缺乏两个miR-451等位基因(KO；miR-451-/-)的小鼠中的血细胞比容水平。

图3：于E14.5的整装(whole mount)野生型(miR-451+/+)或miR-451敲除(miR-451-/-)胚胎。箭头标示胎儿肝。miR-451敲除胚胎展现出苍白和胎儿肝大小的缩小。

图4：A.交配后14.5和16.5天对自野生型(miR-451+/+)、miR-451杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物分离的红血球的流式细胞术分析。在y轴上显示CD71+细胞，而在x轴上显示TER119+细胞。B.分别代表在16.5d.p.c.时来自WT(miR-451+/+)、miR-451Het(miR-451+/-)、和miR-451KO(miR-451-/-)动物的未成熟的和成熟的红血球的III和IV区中红血球的百分比。

图5：以5X(左侧小图)或40X(右侧小图)放大的自成年野生型(miR-451+/+)或miR-451敲除(miR-451-/-)小鼠分离的脾的组织学切片。用苏木精和曙红对切片染色。miR-451敲除脾展现出红血球前体的显著扩张。

图6.A.对自成年野生型(miR-451+/+)、miR-451杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物分离的骨髓的流式细胞术分析。在y轴上显示CD71+细胞，而在x轴上显示TER119+细胞。B.来自野生型(miR-451+/+)、miR-451杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物的骨髓组织中CD71-/TER119+成熟红血球(IV区)的百分比。

图7.苯肼(PHZ)溶血应激研究后miR-451野生型(WT)和敲除(KO)动物的血细胞比容。miR-451动物展现出在产生高红血球生成率中的缺陷。

图8.A.显示YWHAZ中针对miR-451(SEQ ID NO:3)的不同物种间的保守3’-UTR结合位点(SEQ ID NO:11-14)的示意图。miR-451种子区以红色突出显示。B.实时RT-PCR分析显示与野生型(WT)动物相比miR-451敲除(KO)动物中YWHAZ转录物的显著上调且编码14-3-3蛋白的其它转录物无显著变化。

图9：miR-451对红血球分化的可能的调节途径的示意图。miR-451可以抑制YWHAZ(即编码蛋白伴侣分子14-3-3zeta的基因)的表达，由此破坏自生长因子受体的下游信号传导。

图10.A.来自自静脉内注射错配对照反义寡核苷酸(mm-451)或与成熟miR-451具有互补序列的反义寡核苷酸(anti-451)的小鼠分离的骨髓的Northern印迹分析。B.对自注射错配对照反义寡核苷酸(mm-451)或靶向miR-451的反义寡核苷酸(anti-451)的动物分离的骨髓的流式细胞术分析。在y轴上显示CD71+细胞，而在x轴上显示TER119+细胞。C.分别代表未成熟的和终末分化的红血球的II和IV区中的红血球百分比。

图11：antimiR-451在体内阻抑miR-451表达。对自用盐水、25mg/kg错配物、或25mg/kg antimiR-451处理的动物的骨髓收获的RNA的Northern印迹分析揭示仅在antimiR处理组中阻抑成熟的miR-451。展现出总RNA的经溴化乙啶染色的丙烯酰胺凝胶作为上样对照显示。每道代表单独的动物。

图12:antimiR-451在PV的异种移植物模型中降低血细胞比容。对用antimiR-451(antimiR)或错配antimiR(错配物)处理的移植有用野生型人JAK2激酶(WT)或组成性活性JAK2-V617F(VF)感染的干细胞的小鼠的血细胞比容的分析揭示了仅在VF-antimiR组中的血细胞比容降低。对WT-错配物、WT-antimiR、和VF-错配物，n=1。对于VF-antimiR，n=4。

图13：antimiR-451削弱人CD34阳性造血细胞中的红系(erythroid)分化。用antimiR-451或错配antimiR核转染(nucleofect)人CD34+干细胞。容许这些细胞自发分化10天，此时通过流式细胞术分析红血球分化。就红血球标志物CD71和Ter119染色细胞。最多分化的红血球在4区(R4)中，而不太分化的红系细胞在2区(R2)中。每个区中门控的百分比在各自的门内列出。清楚的是，在与经错配antimiR核转染的细胞相比时，用antimiR-451对这些细胞的核转染降低红系分化。

发明详述

本发明部分基于如下的发现，即miR-451是哺乳动物红血球成熟需要的。缺乏两个miR-451等位基因的小鼠展现出成熟红血球的几乎完全消除，而杂合子动物具有成熟红血球的正常水平的大约一半。因此，可以采用miR-451表达的调控来调节成熟红血球或红细胞生成。因而，本发明提供了治疗与成熟红细胞的异常水平有关的疾病和病症，诸如红细胞增多症和贫血的方法。

在人类中，miR-451自染色体17的基因间区与miR-144一起表达。人和小鼠的miR-451的pre-miRNA编码序列在下文分别以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2显示。SEQ ID NO:3中提供了成熟miR-451序列。SEQ ID NO:15中提供了小鼠pri-miR-144/451序列。预测的pri-miR-144/451序列位置在染色体17上在基因组坐标24212513-24212762处(Saini等(2008)BMC Genomics,第9卷:564，通过提及而将其收入本文)。本发明还包括人pri-miR-144/451序列的用途。

人pre-miR-451(SEQ ID NO:1)

5’-CUUGGGAAUG GCAAGGAAAC CGUUACCAUU ACUGAGUUUAGUAAUGGUAA UGGUUCUCUU GCUAUACCCA GA-3’

小鼠pre-miR-451(SEQ ID NO:2)

5’-CUUGGGAAUG GCGAGGAAAC CGUUACCAUU ACUGAGUUUAGUAAUGGUAA CGGUUCUCUU GCUGCUCCCA CA-3’

成熟的miR-451(SEQ ID NO:3)

5’-AAACCGUUAC CAUUACUGAG UU-3’

小鼠pri-miR-144/451(SEQ ID NO:15)

5’-CAGGCTCTCCCTGTGCAGAGGATTCCCTGGACGAGGCTCCAGCTCCACTCCAGCTCCAGGTAAGCAGTCCTTGGAGTGGCTGTCAGCCTGCTTATAGGTCTGCCCAGAGGGAAGCTCCTGCCTCACAACTTCGTTTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGACCCGAGTAGACCTTAGCTTCCTTCTCTAAGCCACCTGGGGTTATCCTGGACCACAGGATCAGGGAGATGCTGCTCTGGGAGGGAAGTGGAGGAGCAGAGGTAGGGACTTAGGTGTCCCTGACTGACCCTGAGCCAATCCCCTGGCTCACTCCAGGCCTGCTGCTCACCTCCTCCTCCAGGACCTTGGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGTGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTCTGGGTACCCCACCTCCAGAGCCTGCCTGGTTTGCAGCAGAGATGCAGAAGTACACGGGCTCACTGCTCGGCCTAATCAAGCCTGCTGACAGCTGTGGCACTTGGGAATGGCGAGGAAACCGTTACCATTACTGAGTTTAGTAATGGTAACGGTTCTCTTGCTGCTCCCACAAACTGTGCCAAGAAGAGCTCATGACCCTGGAGCAGACTGCTGGAAGAAAAGGACACCCAGGCTGACAAGAGAATGGGGTTGGGGGAAAGGGTACATTTTCCTCTTCACTGTGCCAAAGAAATAAAAGATAAGAATAAGAGCACTTGTCATTTAACTTTATTAGCATCCGAGGCTGGGTGGTTGGATG-3’

应当理解，在需要脱氧核糖核苷酸的实施方案中使用本文中所公开的RNA序列时，用胸苷残基替换尿苷残基。类似地，在需要核糖核苷酸的实施方案中使用本文中所公开的DNA序列时，用尿苷残基替换胸苷残基。

在一个实施方案中，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗红细胞增多症的方法，其通过施用miR-451活性或表达的抑制剂来进行。如本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬和猫)、实验室动物(例如，啮齿类诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽类(例如，家养的、野生的和猎禽诸如鸡、火鸡及其它家禽(gallinaceous birds)、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。

红细胞增多症是一种以红细胞总量增加为特征的骨髓增生性病症。认为原发性红细胞增多症或真性红细胞增多症是导致红细胞过度生成的骨髓异常引起的。本发明的方法提供了红细胞增多症的治疗，其通过对有此需要的受试者施用miR-451抑制剂，由此导致成熟红血球或红细胞的数目减少来进行。在一个实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞计数在施用miR-451的抑制剂后降低。例如，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞计数在施用miR-451抑制剂后可以降低约10%、20%、30%、或约40%。在另一个实施方案中，受试者的红细胞计数降低至正常的红计数水平内。正常的红细胞计数是约4.2至约5.4百万个细胞/μL(对于女性)、约4.7至约6.1百万个细胞/μL(对于男性)、和约4.6至约4.8百万个细胞/μL(对于儿童)。在某些实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症、原发性家族性和先天性红细胞增多症、或与红细胞增多症有关的疾病。与红细胞增多症有关的疾病包括但不限于肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、睡眠呼吸暂停、多发性骨髓瘤、或肺动脉高压。如此，本发明还涵盖通过施用miR-451抑制剂治疗与红细胞增多症有关的疾病的方法。

在另一个实施方案中，本发明包括通过施用miR-451抑制剂治疗或预防受试者中的其它骨髓增生性病症的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗特发性血小板增多症(又称为特发性血小板增多(essential thromobocytosis))的方法，包括对受试者施用miR-451抑制剂。特发性血小板增多症是一种以血小板的过度生成为特征的疾病。在一些实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者中的血小板计数相比，受试者的血小板计数在施用miR-451抑制剂后降低。在其它实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，施用miR-451抑制剂后受试者中发生脾扩大的降低。

在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗或预防骨髓纤维化的方法，包括对受试者施用miR-451抑制剂。患有原发性或特发性骨髓纤维化的患者的骨髓用胶原***纤维替换，引起进行性全血细胞减少症(progressive pancytopenia)。在某些实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的骨髓的纤维含量在施用miR-451抑制剂后降低。在其它实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞、白细胞、和/或血小板计数在施用miR-451抑制剂后增加。

在又一个实施方案中，本发明提供了在受试者中预防或治疗白血病的方法，其通过施用miR-451抑制剂进行。在一些实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症，并且有风险形成白血病。在某些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在其它实施方案中，白血病是慢性骨髓性白血病(CML)。在又一些实施方案中，白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或急性骨髓性白血病(AML)。

miR-451活性或表达的抑制剂可以是靶向整个或部分成熟miR-451序列的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰(例如，糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可以包含一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰(BSN)，所述修饰对含有BSN的寡核苷酸与其互补微小RNA靶标链间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸”。锁定核酸(LNA)含有2’-O,4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块为“锁定”构象。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’,4’-C-桥接的2’脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。见例如美国专利No.6,403,566和Wang等(1999)Bioorganic and MedicinalChemistry Letters,第9卷:1147-1150，通过提及而将这两篇都完整收入本文。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷，其具有结构C中所显示的结构。靶向miR-451的反义寡核苷酸可以含有BSN(LNA、CDNA等)或其它经修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。

或者，反义寡核苷酸可以包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链，而非糖-磷酸酯主链。还涵盖对反义寡核苷酸的其它修饰的糖或磷酸二酯修饰。例如，反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于糖修饰，诸如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代(morpholino)、或膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参加例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，通过提及而完整收入本文)。在一个实施方案中，靶向miR-451的反义寡核苷酸含有对每个碱基的2’O-甲基糖修饰，并且通过硫代磷酸酯联接来连接。反义寡核苷酸，特别是那些具有较短长度(例如小于15个核苷酸)的反义寡核苷酸可以包含一处或多处亲和力增强性修饰，诸如但不限于LNA、二环核苷、膦酰基甲酸酯(phosphonoformate)、2’O烃基修饰等。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2’-O-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5’和3’两端都含有2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且中央有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够触发RNA酶H依赖性的对RNA靶物的降解机制。增强稳定性和提高功效的对反义寡核苷酸的其它修饰(诸如美国专利No.6,838,283中记载的那些，通过提及而完整收入本文)是本领域已知的，而且适合于在本发明的方法中使用。例如，为了便于体内投递和稳定性，可以将反义寡核苷酸在其3’端与类固醇诸如胆固醇模块、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体连接。

可用于抑制miRNA活性的优选的反义寡核苷酸长约5至约25个核苷酸，长约10至约30个核苷酸、或长约20至约25个核苷酸。在某些实施方案中，靶向miR-451的反义寡核苷酸长约8至约18个核苷酸，且在其它实施方案中，长约12至约16个核苷酸。可以使用与miR-451互补的任何8聚体或更长的，即与miRNA的5’端互补并沿着miRNA的完整互补序列推进的任何antimiR。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-AACUCAGUAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:4)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-AACGGUUU-3’(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-GUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:7)。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-UGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:8)。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-AAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:9)。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸具有序列5’-GUAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:10)。其它合适的miR-451的抑制剂是包含选自下组的序列的反义寡核苷酸：5’-AGUAAUGGUAACGGU U-3’(SEQ ID NO:16)、5’-GUAAUGGUAACGGUU-3’(SEQ ID NO:17)、5’-UAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:18)、5’-UAAUGGUAACGGUU-3’(SEQ ID NO:19)和5’-UAACGGUU-3’(SEQ ID NO:20)。反义寡核苷酸可以包含与整个或部分的成熟miR-451序列至少部分互补，例如与整个或部分的成熟miR-451序列至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与整个或部分的成熟miR-451序列基本上互补，即，与靶多核苷酸序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与整个或部分的成熟miR-451序列100%互补的序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:3至少部分互补。

反义寡核苷酸可以包含与miR-451的整个或部分前体miRNA序列(pre-miRNA)至少部分互补，例如与整个或部分的pre-miR-451序列至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含与位于pre-miR-451的茎-环区外部的序列至少部分互补的序列。在一个实施方案中，miR-451的抑制剂是具有与整个或部分的pre-miR-451序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，反义寡核苷酸可以包含与miR-451的整个或部分初级miRNA序列(pri-miRNA)至少部分互补的序列。例如，在一个具体的实施方案中，miR-451的抑制剂是具有与整个或部分的pri-miR-451序列SEQ ID NO:15或相应的人pri-miR-451序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。

本文中所描述的miR-451抑制剂可以与用于治疗红细胞增多症(例如，真性红细胞增多症)和其它骨髓增生性病症，诸如特发性血小板增多症、骨髓纤维化、和髓样白血病的其它治疗剂一起施用。例如，miR-451可以与治疗剂包括但不限于血液稀释剂(blood thinner)(例如，阿司匹林(aspirin))、干扰素-α、阿那格雷(anagrelide)、羟基脲、化疗剂、达沙替尼(dasatinib)(Sprycel)、INCB-18424、来他替尼(lestaurtinib)(CEP-701)、吉维司他(givinostat)(ITF-2357)、XL-019、MK-0683、PEG化的干扰素-α2a(Pegasys)、TAK-901和埃罗替尼(erlotinib)共施用。可以在施用其它治疗剂之前或之后施用miR-451抑制剂。在一些实施方案中，与其它治疗剂同时施用miR-451抑制剂。在某些实施方案中，在用于改善骨髓增生性病症的程序，诸如静脉切开术、血小板脱落(platelet apheresis)和骨髓移植之前或之后施用miR-451抑制剂。

本发明还包括在有此需要的受试者中增加红细胞计数的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用miR-451模拟物。如本文中所使用的，“miR-451模拟物”指产生由miR-451赋予的生物学效应的药剂。miR-451模拟物可以包括作为miR-451表达或活性的激动剂或以其它方式提高miR-451功能的药剂。在某些实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成贫血，诸如某种类型的小红细胞性、巨红细胞性或正常红细胞性贫血。在一个实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成再生障碍性贫血或红细胞不发育。在另一个实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成营养缺乏，诸如铁缺乏、维生素B12缺乏、或叶酸缺乏。在又一个实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成溶血性贫血。

miR-451模拟物可以与用于增加红细胞计数或治疗各类贫血的其它已知的治疗剂一起施用。例如，miR-451模拟物可以与红细胞生成素、口服铁补充(例如，以硫酸亚铁、富马酸亚铁、或葡萄糖酸亚铁)、叶酸、维生素B12、或阿法依伯汀(epoetin alfa)一起施用。miR-451模拟物治疗也可以与用于治疗贫血的其它程序，诸如输血或骨髓移植一起发生。例如，在一个实施方案中，可以在移植入骨髓受体中前将本发明的miR-451模拟物投递至自骨髓供体或骨髓受体自身获得的造血祖细胞。

在一些实施方案中，miR-451模拟物或激动剂是编码成熟miR-451序列的多核苷酸(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，miR-451模拟物或激动剂可以是包含miR-451的pri-miRNA序列的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:15)。在又一个实施方案中，miR-451模拟物或激动剂可以是包含miR-451的pre-miRNA序列的多核苷酸。例如，多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列。此类多核苷酸的长度可以是约18至约2000个核苷酸、长度为约70至约200个核苷酸、长度为约20至约50个核苷酸、或长度为约18至约25个核苷酸。包含成熟的miR-451、pre-miR-451、或pri-miR-451序列的多核苷酸可以是单链或双链的。多核苷酸可以含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸、肽核酸、糖修饰，诸如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰和主链修饰，诸如一个或多个硫代硫酸酯、吗啉代、或膦酰基羧酸酯连接。在一个实施方案中，将包含miR-451序列的多核苷酸与类固醇，诸如胆固醇、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽、或另一种小分子配体缀合。

在某些实施方案中，可以自表达载体表达包含成熟的miR-451、pre-miR-451、或pri-miR-451序列的多核苷酸。另外，可以通过施用编码miR-451抑制剂的表达载体对受试者投递本文中所描述的任何miR-451抑制剂。“载体”指可用于将感兴趣核酸递送至细胞内部的物质组成。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲性化合物关联的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。在一个实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，从而以一般性的、例示性的意义说明本发明的应用，而且并非意图限制本发明。

在一个实施方案中，表达包含miR-451序列的多核苷酸的表达载体包含与包含成熟miR-451序列(例如，SEQ ID NO:3)、pre-miR-451序列(例如，SEQID NO:1或SEQ ID NO:2)、或pri-miR-451序列(例如，SEQ ID NO:15)的多核苷酸可操作连接的启动子。在另一个实施方案中，表达本发明的miR-451抑制剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中表达的反义寡核苷酸的序列与miR-451的成熟序列(例如，SEQ ID NO:3)部分或完全互补。如本文中所使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制通过RNA聚合酶进行的转录和多核苷酸表达的启动。如本文中所使用的，“启动子”指受到细胞的合成机构、或导入的合成机构识别，启动基因的特异性转录所需的DNA序列。合适的启动子包括但不限于RNA pol I、pol II、pol III、和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复)。在一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。特别感兴趣的是红血球祖细胞启动子，且更特别地，红血球特异性启动子，诸如HK1(deVooght等(2009)Haematologica,第94卷:1203-1210)、GATA1、GATA2、CEBP/α、PU.1和STAT5启动子。在某些实施方案中，与编码miR-451或miR-451抑制剂的多核苷酸可操作连接的启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是本领域中已知的，并且包括但不限于四环素启动子、金属硫蛋白IIA启动子、热激启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸响应元件、腺病毒晚期启动子、和诱导型小鼠***肿瘤病毒LTR。

本发明还提供了一种在受试者中调控成熟红血球与红血球前体的比率的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用miR-451活性或表达的调控剂。“miR-451活性或表达的调控剂”包括抑制或降低miR-451活性或表达的药剂，诸如如本文中所描述的miR-451抑制剂。miR-451活性或表达的调控剂还包括miR-451激动剂或模拟物，诸如包含miR-451序列的多核苷酸(例如，成熟的miR-451、pre-miR-451、或pri-miR-451)或提高miR-451表达的药剂，诸如转录因子或生长因子。

如本文中所使用的，“成熟的红血球”指终末分化的红细胞。在一些实施方案中，成熟的红血球是CD71阴性且TER 119阳性的。“红血球前体”指生成网织红细胞和成熟的红细胞的祖细胞，包括BFU-E和CFU-E。红血球前体通常在CD71、红细胞生成素受体和c-kit方面呈阳性。在一个实施方案中，调控剂是miR-451抑制剂，并且成熟红血球与红血球前体的比率在施用miR-451抑制剂后在受试者中降低。本文中所描述的任何miR-451抑制剂，诸如包含与整个或部分的miR-451序列至少部分互补的序列的经修饰的或未修饰的反义寡核苷酸适合于在该方法中使用。

在另一个实施方案中，调控剂是miR-451模拟物，并且成熟红血球与红血球前体的比率在施用miR-451模拟物后在受试者中增加。在一个实施方案中，miR-451模拟物是包含成熟miR-451序列的多核苷酸。其它合适的miR-451模拟物在本文中描述，并且包括包含编码miR-451序列的多核苷酸的表达载体。

本发明还涵盖用于在治疗后清除或消除miR-451抑制剂的方法。该方法可以包括施用miR-451模拟物或包含miR-451抑制剂结合位点的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在治疗后清除或消除miR-451模拟物的方法。例如，可以施用miR-451抑制剂或包含来自miR-451靶物的结合区的多核苷酸以清除miR-451模拟物。优选地，结合位点区含有与miR-451的种子区互补的序列。种子区是miRNA中跨越成熟miRNA的碱基2-8的5’部分，其对于靶物识别是重要的。在一些实施方案中，结合位点区可以含有来自miR-451的一种或多种靶物，诸如YWHAZ(14-3-3zeta)、CAB39、VAPA、或CUGBP2的3’UTR的序列。

本发明还包括调节细胞中YWHAZ(14-3-3zeta)、CAB39、VAPA、或CUGBP2表达的方法，包括使细胞与miR-451的调控剂接触。在一个实施方案中，YWHAZ(14-3-3zeta)、CAB39、VAPA、或CUGBP2的表达在施用miR-451模拟物后在细胞中降低。在另一个实施方案中，YWHAZ(14-3-3zeta)、CAB39、VAPA、或CUGBP2的表达在施用miR-451抑制剂后在细胞中升高。细胞可以是体外的或体内的。在一个实施方案中，细胞是红血球前体、网织红细胞、或红血球。

本发明还涵盖药物组合物，其包含miR-451的抑制剂或模拟物和药学可接受载体。在涵盖临床应用的情况中，会以适合于意图应用的形式制备药物组合物。一般地，这会需要制备基本上没有热原，及其它对人或动物可能有害的杂质的组合物。

在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的miR-451抑制剂。例如，药物组合物包含有效剂量的如本文中所描述的靶向miR-451的经修饰的或未修饰的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，药物组合物包含具有选自下组的序列的经修饰的或未修饰的反义寡核苷酸：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。在另一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的miR-451模拟物或miR-451激动剂。“有效剂量”指足以实现有益的或期望的临床结果的量。有效剂量的本发明的miRNA抑制剂或miRNA激动剂/模拟物可以是约1mg/kg至约100mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、或约5mg/kg至约25mg/kg。将什么认为是有效剂量的精确确定可以基于每名患者的个体因素，包括其体型、年龄、要治疗病症的类型(例如红细胞增多症或特定类型的贫血)、和抑制剂或激动剂(例如表达构建体、反义寡核苷酸、多核苷酸双链体等)的性质。因此，本领域普通技术人员通过此公开内容和本领域的知识可以容易地确定剂量。在一些实施方案中，在特定治疗期里对受试者施用多个剂量。例如，可以每天、每周、每月、每两个月、每三个月、或每六个月对受试者施用一剂miR-451抑制剂或miR-451模拟物/激动剂。在某些实施方案中，受试者在第一时间点时接受初始剂量，其比一个或多个后续或维持剂量高。

可以使用胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束(micelle)、混合胶束、和脂质体作为miRNA功能的寡核苷酸抑制剂、编码miRNA激动剂的多核苷酸、或表达特定miRNA抑制剂或激动剂的构建体的递送运载体。适于将本发明的核酸递送至受试者的商业上可得到的脂肪乳剂包括

II、

III、Nutrilipid、和其它类似的脂质乳剂。一种作为体内递送运载体使用的优选的胶体***是脂质体(即人工膜囊泡)。此类***的制备和使用是本领域公知的。例示性的配制剂还披露于US 5,981,505；US 6,217,900；US6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；US5,837,533；US 6,747,014；及WO03/093449，通过提述完整并入本文。

一般会希望采用适宜的盐和缓冲剂来使得递送运载体稳定且容许被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的递送运载体，其包含溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中的抑制剂多核苷酸或miRNA多核苷酸序列(例如脂质体或其它复合物或表达载体)。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在对动物或人类施用时不产生不利的、变应性的、或其它不想要的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括对于配制药物(诸如对于人类施用合适的药物)可接受的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。涵盖任何常规介质或试剂在治疗性组合物中的用途，除非其与本发明的活性成分不相容。还可以将补充性活性成分掺入组合物中，只要它们不灭活所述组合物的载体或多核苷酸。

本发明的活性组合物可包括经典的药学制备物。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常用途径，只要靶组织经由该途径可及。这包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是经过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射。在某些实施方案中，本发明的药物组合物配制用于静脉内或皮下施用。此类组合物通常会作为如本文中所述的药学可接受组合物来施用。

活性化合物也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物生长。

适于注射使用的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体及用于临场制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。一般而言，这些制备物是无菌的，而且存在易于注射的流动性程度。制备物在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。适宜的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、它们的合适混合物、及植物油。可以通过例如使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需粒度(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现对微生物作用的预防，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，会优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的吸收的延长，例如单硬脂酸铝和明胶。

可如下制备无菌注射液，即以适宜的量将活性化合物根据需要与任何其它成分(例如上文所列)一起掺入溶剂中，接着过滤除菌。一般而言，如下制备分散体，即，将各种经灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和期望的其它成分(例如上文所列)的无菌运载体中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们自先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何附加的所需成分的粉末。

本发明的组合物一般可配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)等。也可以自无机碱(例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因)等衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。

配制后，优选以与剂型相容的方式和以治疗上有效的量施用溶液。所述配制剂可以容易地以多种剂量形式来施用，诸如注射液、药物释放胶囊等等。例如，为了以水溶液形式胃肠外施用，一般将溶液适当缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，采用无菌水介质，正如本领域技术人员所知的，特别是根据本公开内容来进行。举例而言，可以将单剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且或是添加至1000ml皮下输注液或是在建议的输注部位注射(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中，负责施用的人会为各受试者确定适宜的剂量。此外，对于人类施用，制备物应当符合FDA生物制剂标准办公室要求的无菌度、热原度、一般安全和纯度标准。

本发明通过以下其它实施例进一步例示，所述实施例不应解释为限制性的。根据本公开内容，本领域技术人员应当领会，可以在不背离本发明的精神和范围的前提下对公开的具体实施方案做出许多变化，并且仍获得相似或类似的结果。

实施例

实施例1：miR-451敲除小鼠展现出红血球成熟的缺陷。

通过野生型小鼠的多种组织中的Northern印迹分析评估了miR-451表达，并且发现在造血组织，包括脾和骨髓中高度表达(图1)。为了进一步检查miR-451在这些组织中的功能，创建了miR-451敲除小鼠。为了生成miR-451靶向性载体，将在位于miR-144和miR-451 pre-miR序列间的保守性较差的DNA元件上游延伸的4.3kb片段(5’臂)用SacII和NotI消化，并连接入pGKneoF2L2dta靶向质粒中在loxP位点和侧翼为Frt的新霉素盒上游。将自miR-451pre-miR外部的保守性较差的区域下游延伸的3.2kb片段(3’臂)用SalI和HindIII消化，并连接入载体中在新霉素抗性和Dta阴性选择盒间。通过用5’和3’探针的Southern印迹分析鉴定了携带破坏的等位基因的靶定ES细胞。鉴定了三个miR-451靶定的ES克隆，并用于胚泡注射。将所得的嵌合小鼠与C57BL/6繁殖以获得突变体等位基因的种系传递。通过将miR-451neo/neo小鼠与含有遍在表达的CAG-cre转基因的C57BL/6小鼠繁殖生成了miR-451全突变体小鼠(global mutant mice)。

miR-451的靶向性缺失揭示了miR-451杂合动物中骨髓中miR-451的单倍性不足的水平，及miR-451敲除(KO)动物中成熟miR-451的完全丧失(图2A)。miR-451KO动物以孟德尔比率出生(表1)。然而，与野生型同窝出生者相比，成年敲除动物(8周龄)中的血细胞比容显著降低(图2B)。另外，miR-451KO动物在胚胎日E14.5时展现出胎儿贫血，如通过整装(whole mount)分析证明的(图3)。

表1：源自miR-451杂合子杂交的后代分布

缺乏一个或两个miR-451等位基因的动物展现出红血球成熟的缺陷。将自miR-451野生型、杂合子、和敲除小鼠分离的骨髓和胎儿肝细胞在DMEM/10%FBS中重悬。将新鲜分离的骨髓和胎儿肝细胞于4°C在PBS/2%FBS中在存在小鼠IgG(200μg/mL,BD Pharmingen,San Diego,CA)以封闭Fc受体的情况中免疫染色。将细胞与PE缀合的抗Ter119(1μg/mL BDPharmingen,San Diego,CA)、FITC缀合的抗CD71(EBiosciences,1μg/mL,City)抗体一起温育15分钟，接着与APC缀合的膜联蛋白V一起温育15分钟。在Becton Dickinson FACSCalibur (Franklin Lakes,NJ)上实施流式细胞术。在胚胎日E16.5时，杂合动物中成熟的CD71^-/TERl19⁺红血球群体有显著减少，敲除动物中的减少程度扩大，如通过流式细胞术评估的(图4A和B)。成年脾的组织学分析揭示了与野生型同窝出生者相比，miR-451敲除小鼠中红血球前体增加(图5)。对成年骨髓的流式细胞术分析揭示了类似的红血球分化缺陷，其中杂合动物中成熟的CD71^-/TERl19⁺红血球群体减少，及敲除者中减少程度的扩大(图6A和B)。

为了在miR-451敲除动物中评估红细胞生成，用溶血剂苯肼攻击野生型和miR-451敲除动物两者。以40mg/kg剂量皮下注射苯肼，如先前所描述的(Socolovsky等(2001)Blood,第98卷:3261-3273)。在苯肼注射后3、6、和9天时在经处理的动物中测量血细胞比容。如在图7中所显示的，miR-451敲除动物在苯肼攻击后展现出血细胞比容的显著缺乏，提示了miR-451敲除动物不能实现较高的红血球生成率。

这些数据指示了miR-451决定性地调节红血球分化的过程。为了进一步阐明miR-451调节红血球分化的机制，使用靶物预测软件鉴定miR-451的潜在靶物。基于此分析，miR-451可以通过抑制蛋白伴侣/支架分子YWHAZ(14-3-3zeta)的表达调节红血球分化。YWHAZ(14-3-3zeta)在其3’UTR中含有保守的miR-451结合位点(图8A)，并且此蛋白质的表达在miR-451敲除动物中显著上调(图8B)。已经显示了YWHAZ(14-3-3zeta)在造血细胞中高度富集，并且可能通过调控生长因子受体(图9)，诸如红细胞生成素(EPO)受体下游的信号影响RBC的分化(Barry等(2009)J.Biol.Chem.,第284卷:12080-12090)。

实施例2：靶向miR-451的反义寡核苷酸消除miR-451表达，并且在体内减少成熟红血球的数目。

为了检查miR-451敲低在与异常红细胞生成有关的病症中的治疗潜力，我们设计了反义寡核苷酸(anti-451)以特异性诱导miR-451的降解。反义寡核苷酸与成熟的miR-451序列互补，并且具有序列5’-AACUCAGUAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:4)。使用错配序列5’-AACAGUAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:5)作为对照。anti-miR-451和错配对照(mm-451)中的所有核苷是2’-OMe修饰的，并且5’端的2个和3’端的4个碱基含有核苷间的硫代磷酸酯。经由羟脯氨醇或碳氢化合物(C4-C8)接头将胆固醇附接于过客链(passenger strand)的3’端。给野生型C57BL/6小鼠静脉内注射盐水、80mg/kg anti-451、或80mg/kg错配对照两次。两次注射相隔24小时。在第二次注射后48小时自动物收获骨髓以进行表达和FAC分析。在miR-451方面对骨髓的Northern印迹分析表明anti-451在体内有效降低miR-451水平，而错配对照没有影响(图10A)。对自经处理动物分离的骨髓的流式细胞术分析揭示与接受错配对照的动物相比，在用anti-miR-451寡核苷酸处理的动物中成熟的CD71^-/TERl19⁺红血球数目减少和未成熟的红血球数目的相应增加(图10B和C)。

这些结果提示了可以在体内有效调控miR-451表达，而且miR-451抑制剂提供在治疗与异常红细胞生成有关的病症，诸如红细胞增多症中的新治疗工具。

实施例3：用截短的抑制剂的反义寡核苷酸处理在体内降低miR-451水平并改变红细胞数目。

设计靶向成熟的miR-451序列的另一系列的合成寡核苷酸，其长度范围为8至16个核苷酸以靶向微小RNA的种子区，并***地向微小RNA的更为3’端延伸。这些寡核苷酸含有一个或多个二环核苷(例如，LNA)，并且其序列在下文列出：

8个nt的寡聚物：5’-AACGGUUU-3’(SEQ ID NO:6)

10个nt的寡聚物：5’-GUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:7)

12个nt的寡聚物：5’-UGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:8)

14个nt的寡聚物：5’-AAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:9)

16个nt的寡聚物：5’-GUAAUGGUAACGGUUU-3’(SEQ ID NO:10)

在上文所列的5种寡核苷酸外，还设计了长度范围为14至22个核苷酸且具有与成熟miR-451序列互补的序列的anti-miR-451寡核苷酸。这些anti-miR-451寡核苷酸中的所有核苷是2’-OMe修饰的，并且含有连接所有碱基的核苷间的硫代磷酸酯。

给小鼠静脉内注射上文所描述的anti-miR-451寡核苷酸之一，并在处理2天后收集多种组织。进行miR-451的Northern印迹分析以测定每种anti-miR-451寡核苷酸在阻抑miR-451表达中的效率。另外，自经处理的小鼠获得骨髓和血液样品以进行FAC分析和测定血细胞比容。预期结果显示anti-miR-451寡核苷酸在体内可以有效阻抑miR-451表达，并且miR-451表达的降低会与血细胞比容和成熟的CD71-/TER119+红血球的数目降低相关联。

实施例4：antimiR-451降低真性红细胞增多症的异种移植物模型中的血细胞比容。

为了检查antimiR-451和错配对照antimiR寡核苷酸在体内对miR-451表达的影响，连续两天用盐水、25mg/kg错配寡核苷酸、或25mg/kg antimiR-451处理C57BL/6小鼠。antimiR-451寡核苷酸与成熟miR-451的16个核苷酸互补，并且具有序列5’-AGTAATGGTAACGGTT-3’(SEQ ID NO:21)。错配的对照antimiR针对秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA(其在哺乳动物中不表达)，并且具有序列5’-TCCTAGAAAGAGTAGA-3’(SEQ ID NO:22)。antimiR-451和错配对照antimiR两者都含有脱氧核糖核苷酸(DNA)和锁定核酸(LNA)核苷的组合(9个LNA和7个DNA)，并且含有完全硫代磷酸酯化的主链。

给雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)注射两次盐水、25mg/kg antimR-451、或25mg/kg错配对照antimiR。相隔24小时实施注射。在第二次注射后48小时处死小鼠，并通过用DMEM+10%胎牛血清冲洗股骨和胫骨收获骨髓。自骨髓收获RNA，并实施微小RNA Northern印迹。Northern印迹分析显示了antimiR-451处理组中缺乏成熟的miR-451，然而，miR-451水平在错配或盐水处理组中不受影响(图11)。

为了检查antimiR-451对真性红细胞增多症(PV)血液学参数的影响，我们利用了PV的鼠异种移植物模型(Wernig等(2006)Blood,第107卷(11):4274-4281)。此模型近似地重演了人PV的许多参数，并且是此疾病的公认小鼠模型。成年同基因BALB/C动物购自Charles River Laboratories。首先给供体小鼠注射5-氟尿嘧啶以刺激原始造血干细胞的***。4天后，自这些动物收获骨髓，将红细胞选择性裂解，并将这些细胞在含有设计为支持生长并刺激病毒识别蛋白表达的细胞因子混合物的培养基中培养。次日，用表达JAK2-V617F突变体人激酶或作为对照的野生型人JAK2激酶的逆转录病毒感染这些细胞。这两种病毒构建体均从内部核糖体进入位点表达GFP。将这些细胞再次培养过夜以容许病毒基因组***和相应的JAK2同等型的表达。感染后一天，重复感染过程，并将细胞在适合于静脉内注射的培养基中悬浮。

用900cGy照射接受动物，并将约4-10x 10⁵个重悬细胞静脉内注射入接受动物中。然后，将这些动物纳入通过施用抗生素得到的无菌环境中。然后，每7天为动物抽静脉血。在这些时间，通过流式细胞术监测GFP阳性细胞的百分比，并利用Hemavet 850(Drew Scientific,Dusseldorf Germany)测量血液学参数。GFP阳性百分比代表转导的植入细胞的百分比。植入和血液学修饰在移植后2-3周时是可觉察的。植入是完全的，并且这些参数的变化在移植后5周时处于稳定状态。野生型人JAK2激酶的表达对血液学参数没有影响，并且因此是合适的对照。

在移植后5周，连续两天给PV和对照动物两者静脉内注射两次负荷剂量25mg/kg的antimiR-451(SEQ ID NO:21)或错配对照(SEQ ID NO:22)寡核苷酸。然后，每三天给这些动物静脉内注射更低的剂量(10mg/kg)以维持对miR-451的充分敲低。使用Hemavet 850(Drew Scientific,Dusseldorf Germany)每7天测量血液学参数。在第一次注射后6-8周继续注射和血液学参数的监测。令人感兴趣地，我们观察到PV小鼠中在开始antimiR-451疗法后4周的血细胞比容降低(图12)。此降低仅在用antimiR-451处理的PV小鼠而非用错配对照寡核苷酸处理的PV小鼠中观察到。

这些实验的结果显示了靶向miR-451成熟序列的反义寡核苷酸在体内有效抑制miR-451表达，并且用antimiR-451寡核苷酸的处理在PV的小鼠模型中降低血细胞比容。如此，miR-451代表一种用于治疗骨髓增生性病症，诸如红细胞增多症的新的治疗性靶物。

实施例5：antimiR-451削弱人CD34阳性造血细胞的红系分化。

miR-451的小鼠突变体展现出在红血球分化方面的胚胎和成年缺陷两者(见实施例1)。为了检查antimiR-451影响人造血干细胞的分化样式的能力，我们购买了人CD34阳性细胞，并且使用Amaxa人CD34⁺细胞Nucleofector试剂盒(Lonza,USA)实施了antimiR-451(SEQ ID NO:21)或错配对照(SEQ ID NO:22)的核转染。将冷冻的纯化的CD34+人细胞融化，并培养1-2小时，之后进行核转染。将1x 10⁶个细胞在12孔板的单个孔中分配。将细胞以200x g旋转，并在核转染溶液(Lonza,USA)中重悬。接着，将100μL细胞悬浮液添加至antimiR-451或错配antimiR(关于反义寡核苷酸的描述，见实施例4)，生成含有终浓度100nM antimiR-451或错配对照的溶液。将此溶液转移至小杯。在Nucleofector装置(Lonza,USA)上用U-008程序实施核转染。一旦完成程序，将细胞与500μL培养基合并。然后，每2-3天更换培养基，持续10天。

在核转染后，将细胞在培养基中温育10天，并容许自发分化。这些细胞自发分化成所有造血细胞谱系。在第10天，针对红系标志物CD71和Ter119染色细胞，并通过流式细胞术分析分化。于4°C在PBS/2%FBS中在存在小鼠IgG(200μg/mL,BD Pharmingen)以封闭Fc受体的情况中将细胞免疫染色。将细胞与PE缀合的anti-Ter119(1μg/mL,BD Pharmingen)、FITC缀合的anti-CD71(EBiosciences,1μg/mL)抗体一起温育15分钟。在Becton DickinsonFACSCalibur (Franklin Lakes,NJ)上实施流式细胞术。

最多分化的红血球在4区(R4)中，而不太分化的红系细胞在2区(R2)中(见图13)。每个区中门控的百分比在图13中相应的门内列出。令人感兴趣地，在与错配核转染的细胞相比时，用antimiR-451核转染的细胞展现出削弱的红系成熟(图13)。这些数据提示了用antimiR-451抑制miR-451导致对人红血球成熟的破坏，其与在miR-451突变体小鼠中看到的类似。

通过提述将本文中所讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请完整并入本文。应当理解，所公开的发明不限于所描述的具体的方法、方案和材料，因为这些可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，它们仅会由所附权利要求书来限制。

本领域技术人员会认可，或者仅使用常规实验便能够确定本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意欲被所附权利要求书所涵盖。

Claims

1.一种在有此需要的受试者中治疗红细胞增多症的方法，包括对所述受试者施用miR-451的抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述受试者的红细胞计数在施用所述miR-451的抑制剂后降低。

3.权利要求1的方法，其中所述miR-451的抑制剂是反义寡核苷酸。

4.权利要求3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-451序列至少部分互补的序列。

5.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3的序列至少部分互补的序列。

6.权利要求3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。

7.权利要求6的方法，其中所述糖修饰是2’-O-甲基修饰或锁定核酸修饰。

8.权利要求6的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯修饰。

9.权利要求3的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度是约8至约18个核苷酸。

10.权利要求3的方法，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、和SEQ ID NO:20。

11.权利要求3的方法，其中通过静脉内或皮下施用途径施用所述反义寡核苷酸。

12.权利要求1的方法，其中所述受试者诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症、原发性家族性和先天性红细胞增多症、或与红细胞增多症有关的疾病。

13.权利要求12的方法，其中所述与红细胞增多症有关的疾病是肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、睡眠呼吸暂停、多发性骨髓瘤、或肺动脉高压。

14.一种在受试者中调控成熟红血球与红血球前体的比率的方法，包括对所述受试者施用miR-451活性或表达的调控物。

15.权利要求14的方法，其中所述成熟红血球是CD71阴性且TER 119阳性的。

16.权利要求14的方法，其中所述miR-451活性或表达的调控物是miR-451抑制剂。

17.权利要求16的方法，其中所述受试者中所述成熟红血球与红血球前体的比率在施用所述miR-451抑制剂后降低。

18.权利要求16的方法，其中所述miR-451抑制剂是反义寡核苷酸。

19.权利要求18的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与成熟miR-451序列至少部分互补的序列。

20.权利要求19的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3的序列至少部分互补的序列。

21.权利要求18的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。

22.权利要求21的方法，其中所述糖修饰是2’-O-甲基修饰或锁定核酸修饰。

23.权利要求21的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯修饰。

24.权利要求14的方法，其中所述miR-451活性或表达的调控物是miR-451模拟物。

25.权利要求24的方法，其中所述受试者中所述成熟红血球与红血球前体的比率在施用所述miR-451模拟物后升高。

26.权利要求24的方法，其中所述miR-451模拟物是包含成熟miR-451序列的多核苷酸。

27.权利要求26的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的序列。

28.权利要求26的方法，其中自载体表达所述多核苷酸。

29.权利要求28的方法，其中所述载体是病毒载体。

30.一种在有此需要的受试者中增加红细胞计数的方法，包括对所述受试者施用miR-451模拟物。

31.权利要求30的方法，其中所述受试者诊断为、患有、或有风险形成再生障碍性贫血或红细胞不发育。

32.权利要求30的方法，其中所述miR-451模拟物是包含成熟miR-451序列的多核苷酸。

33.权利要求32的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3的序列。

34.权利要求32的方法，其中自载体表达所述多核苷酸。

35.权利要求34的方法，其中所述载体是病毒载体。

36.一种在有此需要的受试者中治疗骨髓增生性病症的方法，包括对所述受试者施用miR-451的抑制剂。

37.权利要求36的方法，其中所述骨髓增生性病症是真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、骨髓纤维化、或白血病。

38.权利要求37的方法，其中所述白血病是慢性骨髓性白血病(CML)或急性骨髓性白血病(AML)。

39.权利要求36的方法，其中所述miR-451的抑制剂是反义寡核苷酸。

40.权利要求39的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度是约8至约30个核苷酸，并且包含与成熟miR-451序列至少部分互补的序列。

41.权利要求40的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3的序列至少部分互补的序列。

42.权利要求40的方法，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、和SEQ ID NO:20。

43.权利要求39的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。

44.权利要求43的方法，其中所述糖修饰是2’-O-甲基修饰或锁定核酸修饰。

45.权利要求43的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯修饰。

46.权利要求39的方法，其中通过静脉内或皮下施用途径施用所述反义寡核苷酸。

47.一种药物组合物，其包含有效量的具有与成熟miR-451序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸和药学可接受载体，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。

48.权利要求47的药物组合物，其中所述至少一处糖修饰是二环糖核苷修饰或2’O-甲基修饰。

49.权利要求47的药物组合物，其中所述至少一处主链修饰是硫代磷酸酯修饰。

50.权利要求47的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸的长度是约8至约18个核苷酸。

51.权利要求47的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、和SEQ ID NO:20。

52.权利要求47的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸的有效量是约1mg/kg至约100mg/kg。

53.权利要求47的药物组合物，其中所述组合物配制用于静脉内或皮下施用。