CN102864098B - 一株反硝化聚磷细菌H-hrb02及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株反硝化聚磷细菌及其筛选方法和应用效能，反硝化聚磷菌经鉴定属于假单胞菌属，是一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），命名为H-hrb02，已在中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2012年03月27日，保藏编号为CGMCC NO.5940。H-hrb02杆菌为非发酵革兰氏阴性菌，专性需氧菌（在硝酸盐培养基中除外），生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。本发明所提供的反硝化聚磷菌株H-hrb02能以多种有机物为碳源。将菌株（H-hrb02）进行活化培养后，具有优秀的反硝化和聚磷性能，可用于污水生物脱氮除磷工艺，吸磷率可高达92%，氮去除率高达87.7%。

Description

一株反硝化聚磷细菌H-hrb02及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种反硝化聚磷细菌H-hrb02及其应用效能，同时提供了这种细菌的筛选方法。

背景技术

当前，随着国民经济地迅速发展和城市化进程地不断深入，城市生活和工业废水的排放总量也在逐年增加。而农药、化肥和合成洗涤剂等的广泛使用，使得水体中的营养物质浓度不断升高，其中氮，磷是引起水体富营养化的主要原因之一。常规的生化处理工艺可以有效地降低污水中的BOD₅和SS，但当污水中同时存在的N，P等营养物的时候，只能去除污水中磷的10%-20%，大量含磷污水将直接排入环境水体。

传统的生物脱氮除磷工艺存在着自身难以解决的矛盾：聚磷菌和反硝化菌对碳源的竞争始终存在；聚磷菌、硝化菌和反硝化菌世代周期不同，菌群的混合会相互制约，***很难达到最佳的处理效果。反硝化聚磷菌DPB（Denitrification Phosphorus Removal Bacteria）的发现使脱氮除磷工艺有了更为广阔的发展前景。一旦在污水处理工艺当中引入这类具有反硝化功能的PAOs，将会对生物除磷的技术革新产生十分重要的意义。目前，在兼性厌氧反硝化聚磷菌的特性研究为基础的前提下，开展了以生物体内储存的聚羟基烷酸（PHA）为碳源的新工艺及反硝化聚磷菌与硝化菌相分离的双污泥***的研究，这些研究越来越受到学者的重视。

到目前为止，反硝化聚磷菌株主要集中在Pseudomonas菌属和Bacillus菌属，菌种较为单一，且研究多集中在降解基因和降解机理方面，实际应用研究有限。因此，从自然界筛选出对具有高效反硝化除磷效能的菌株Pseudomonasaeruginosa strain H-hrb02，对其生理生化特性及其脱氮除磷效能能进行深入的研究都是必需的，具有重要的现实意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种反硝化聚磷细菌H-hrb02及其筛选方法中其DNA的PCR扩增过程。

本发明的目的之二在于提供该菌株H-hrb02在水处理中的应用效能。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株反硝化聚磷细菌H-hrb02，其特征在于其为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）H-hrb02，属于假单胞菌属（Pseudomonas），已在中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2012年03月27日，保藏编号为CGMCC NO.5940。本发明所提供的反硝化聚磷菌株Pseudomonasaeruginosa strain H-hrb02，经鉴定为革兰氏阴性杆菌，专性需氧菌（在硝酸盐培养基中除外），生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长，菌体长度为1.5-5.0                                                

m，宽度为0.5-1m，细长且长短不一，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。

反硝化聚磷细菌H-hrb02的筛选方法，常规提取反硝化聚磷细菌的DNA后，DNA经PCR扩增，得到反硝化聚磷菌基因的碱基序列，PCR扩增过程的具体步骤为：

a. PCR体系建立（25μL）：

10×PCR Buffer                            2.5μL

dNTPs（浓度为2.5mmol/L）           2μL

引物1                                        0.5μL

引物2                                        0.5μL

DNA模板                                   0.5μL

rTaq DNA聚合酶（5U/μL）           0.5μL

加无菌去离子水至                        25μL

b. PCR程序设定：

预变性 95℃3min

95℃预变性5min, 94℃变性1min, 58℃复性30s, 72℃延伸3min, 共30个循环,最后72℃延伸10min；

c.引物序列：

引物1     5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

引物2     5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’。

本发明所提供的反硝化聚磷菌株的用途是在含氮磷废水处理中的脱氮除磷效能应用。

处理方法为：挑取H-hrb02菌落，富集24小时后，以每1L水样接种100ml菌液的比例接种至缺磷培养基和富磷培养基中，培养时间为80小时。

所述的缺磷培养基配制如下（PO₄ ^3--P为4mg/L）：CH₃COONa 3.23g/L；Na₂HPO₄·2H₂O 23mg/L；NH₄Cl 152.8mg/L；MgSO₄·7H₂O 81.12mg/L；K₂SO₄ 17.83mg/L；CaCl₂·2H₂O 11mg/L；HEPES buffer 7g/L；微量元素 2ml/L；琼脂 15g/L ；H₂O 1000ml；pH 7.2。121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述的富磷培养基配制如下（PO₄ ^3--P为8mg/L）：CH₃COONa 3.23g/L；KH₃PO₄ 25mg/L；NH₄Cl 305.52mg/L；MgSO₄·7H₂O 91.26mg/L；CaCl₂·2H₂O 25.68mg/L；PIPES buffer 8.5g/L；微量元素 2ml/L；琼脂 15g/L ；H₂O 1000ml；pH 7.2。121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述微量元素的配制如下：FeCl₃ 0.90g/L，H₃BO₃ 0.15g/L，CuSO₄·5H₂O 0.03g/L，KI 0.18g/L，MnCl₂·4H₂O 0.06g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.12g/L，CoCl₂ 0.15g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g/L，EDTA 10.00g/L。

本发明所提供的铜绿假单胞菌属H-hrb02菌的基因具有优秀的反硝化和聚磷性能。它能够同时具有反硝化和除磷功能，在适当条件下，吸磷率可高达92%,氮去除率高达87.7%，这些特点在水处理领域具有重大意义。 

附图说明

图1是菌株（铜绿假单胞菌属H-hrb02菌）的透射电镜观察图。

图2是菌株（铜绿假单胞菌属H-hrb02菌）的个体原子力照片。

图3是菌株（铜绿假单胞菌属H-hrb02菌）的生长曲线。

图4是菌株（铜绿假单胞菌属H-hrb02菌）吸磷效能。

具体实施方式

实施方式一：本实施方式铜绿假单胞菌属H-hrb02菌（Pseudomonasaeruginosa strain H-hrb02）是通过以下步骤测得：

1. 铜绿假单胞菌属H-hrb02菌的分离、纯化和筛选：

a．取SBR反应器运行稳定时某周期缺氧段末的活性污泥作为分离用泥

b．采用稀释混合平板法进行分离。反硝化菌使用反硝化培养基进行分离，聚磷菌使用富磷培养基进行分离。

具体分离步骤为：从SBR反应器缺氧段末取10mL活性污泥至装有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠。将三角瓶放入摇床中充分振荡,使细菌呈单细胞状态分散于水中。然后，从三角瓶内的污泥菌悬液中取1mL悬液接入装有9mL无菌水的试管内，得到10-1梯度的菌悬液，继续此步骤，依次得到10-2、10-3、10-4……10-7梯度的菌悬液，各取1mL水样放入培养皿种，待培养基快凝却时倒入培养皿中，混匀，待培养基凝固后倒置培养皿于30℃恒温培养箱中培养2～3天后，挑选一个合适梯度的培养皿。然后分别选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在平板培养基上进行三区划线分离，重复3～4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用，所有操作均在无菌条件下进行。

c．对己分离出来的菌株在富磷培养基中进行吸磷试验，同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色（亚甲基蓝染色法）和PHB颗粒染色（苏丹黑染色法）检验。对于硝酸还原性为阳性并产气，菌体内又含有聚磷颗粒或PHB颗粒，在好氧或缺氧条件下能过量吸磷的细菌即为试验所需的反硝化聚磷菌种属。    

具体试验如下：好氧吸磷试验：对己分离出来的各菌株首先进行富集培养（种子液），即将待测菌株在缺磷培养基中30℃厌氧（充氮气）培养24h，摇床转速为140rpm（revolutions per minute），以尽量耗尽菌体内的PHB颗粒。将富集培养好的菌液离心（8,000rpm，8min），无菌蒸馏水洗涤，再离心（8,000rpm， 8min），取菌沉淀投入到富磷培养基中，整个过程均需在无菌条件下，然后进行好氧吸磷（140rpm，30℃）试验。期间定时取培养液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，检测滤液中PO₄ ^3--P浓度的变化。硝酸盐还原产气试验：取各斜面菌种，接种在带杜氏小管的硝酸盐还原培养基（牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；KNO₃，1g/L；pH，7.4；121℃高压蒸汽灭菌20min）中，每个菌株作2个平行试验，同时另外留2管不接种做对照。30℃恒温培养，分别在1天、3天、5天后检测结果：检查杜氏小管内是否产气，如有气泡表明有氮气产生；在比色瓷盘中加入少量培养液，滴入1～2滴格里斯试剂A液（对氨基苯磺酸, 0.5g；10%左右稀醋酸，150ml）和B液（α-苯胺，0.1g；10%左右稀醋酸，150ml；H2O，20ml）。在对照管中同样加入A液和B液各1～2滴。若溶液变为红色，橙色，或棕色等，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色出现则可加入1～2滴二苯胺试剂（0.5g二苯胺溶于100ml浓H2SO4，并加20ml蒸馏水稀释，存于棕色瓶中），如不呈蓝色反应，则仍为阳性反应。若呈蓝色反应，则为阴性反应。

2. 菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）的生理生化分析：菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版操作，鉴定结果为铜绿假单胞菌属H-hrb02菌为非发酵革兰氏阴性菌，专性需氧菌（在硝酸盐培养基中除外），生长温度范围25-42℃，最适生长温度为25-30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。菌体长度为1.5-5.0

m，宽度为0.5-1

m，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。该菌株不需要有机生长因素。营养多样化；单个菌株的生长可利用76—82种或更多的不同有机化合物。对菌株进行革兰氏染色，氧化酶，接触酶，葡萄糖氧化发酵，产吲哚，V.P.测定，M.R.测定，明胶液化，淀粉水解，柠檬酸盐利用，硝酸盐还原等主要生理生化指标试验，结果如表2所示。

本实施方式步骤1中，反硝化培养基配制如下：柠檬酸钠 5.0g/L；K₂HPO₄ 1.0g/L；KH₂PO₄ 1.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；KNO₃ 2.0g/L，琼脂 15g/L。pH 7.2。121℃高压蒸汽灭菌20min。

实施方式二：基因的16S rDNA测序，16S rDNA基因的PCR扩增具体步骤如下：

a. PCR体系建立（25μL）：

10×PCR Buffer                      2.5μL

dNTPs（浓度为2.5mmol/L）           2μL

引物1                              0.5μL

引物2                              0.5μL

DNA模板                           0.5μL

rTaq DNA聚合酶（5U/μL）           0.5μL

加无菌去离子水至                    25μL

b. PCR程序设定：

预变性 95℃3min

95℃预变性5min, 94℃变性1min, 58℃复性30s, 72℃延伸3min, 共30个循环,最后72℃延伸10min；

c.引物序列：

引物1        5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

引物2        5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’

铜绿假单胞菌H-hrb02基因序列如SEQ IDNo.1所示。

实施方式三：本实施方式铜绿假单胞菌H-hrb02能以多种有机物为碳源，可用于污水生物脱氮除磷。对铜绿假单胞菌H-hrb02生物脱氮除磷能力进行检测：

1.铜绿假单胞菌H-hrb02生长曲线测定。按照测定细菌生长曲线的标准方法对菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）的生长曲线进行测定，每隔2h取培养液，采用光电比浊法，在600nm波长处测定菌液的OD₆₀₀（Optical Density），然后经0.22μm微孔滤膜过滤，检测滤液PO₄ ^3--P，pH值等指标。获得铜绿假单胞菌H-hrb02生长曲线如图3所示。从图3中可以看出，这菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）的生长曲线比较典型，潜伏期较短，为2h左右，这可能是因为菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）的活性较强，且接种前后的培养条件相似，接入后在较短时间内即可适应新的环境。菌株的对数生长期约为14～16h，18h以后开始进入稳定期和衰亡期。从图中还可得知菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）接入培养液中后就开始吸磷，但主要发生在对数生长期，在这个时期，微生物生长代谢最旺盛，吸磷量随着对数期菌株的生长而逐渐增多。吸磷率在菌株进入稳定期后达到最大，接着出现了释磷现象，但释磷量很小。

2.铜绿假单胞菌H-hrb02脱氮除磷效能测定

a. 铜绿假单胞菌H-hrb02脱氮效能测定：

将菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）按照具体实施方式一方法进行活化，富集培养，菌悬液离心（8,000rpm，10min），弃上清液，菌沉淀转接至不含乙酸钠的富磷培养基中，在好氧状态下培养48h。从表1可以看出，菌株H-hrb02有良好的好氧反硝化效果。一般来说传统反硝化理论认为，由于溶解氧会与NO^3- 竞争电子受体，溶解氧（DO）的存在会对反硝化过程起到抑制作用，从而抑制反硝化的进行。但是，好氧反硝化理论的提出转变了传统观念，其理论认为由于菌体中存在周质硝酸盐还原酶，因此菌株可利用硝态氮和氧气同时作为电子受体进行协同呼吸。综上，菌株H-hrb02为高效的反硝化聚磷菌。 

b. 铜绿假单胞菌H-hrb02吸磷效能测定：

将菌株（铜绿假单胞菌H-hrb02）按照具体实施方式一方法进行活化，富集培养，菌悬液离心（8,000rpm，10min），弃上清液，菌沉淀转接至富磷培养基溶解氧为2.5，为保证培养基中环境稳定，避免菌株在吸磷过程中引起的pH值较大范围波动，向培养基中加入HEPES（氢离子缓冲剂），其作用为较长时间控制环境中的pH范围。由图4可以看出，菌株H-hrb02在12h时吸磷率达到85%。说明菌株H-hrb02短时间内除磷效果良好。但由图4中看出随着培养时间的延长除磷率逐渐下降，菌株H-hrb02出现了释磷现象。分析其原因可能为随着反应时间的延长，可利用的NO^3--N不足，导致菌株没有足够的电子受体使得除磷率下降。另一个原因可能是培养基中碳源不足不能为微生物的生长和繁殖提供营养物质和能量。并且足够的有机物质是聚磷菌合成PHB的必要条件，当不能合成PHB时就直接影响到反硝化聚磷菌的生长与繁殖，从而抑制了除磷效率。

DNA序列表

铜绿假单胞菌H-hrb02 16S rDNA  SEQ. ID. No.1：

1 gattgcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat aacgtccgga

61 aacgggcgct aataccgcat acgtcctgag ggagaaagtg ggggatcttc ggacctcacg

121 ctatcagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac

181 gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact

241 cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc

301 cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggatcgta aagcacttta agttgggagg aagggcagta

361 agttaatacc ttgctgtttt gacgttacca acagaataag caccggctaa cttcgtgcca

421 gcagccgcgg taataat

Claims (3)

1.一株反硝化聚磷细菌H-hrb02，其特征在于其为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）H-hrb02，属于假单胞菌属（Pseudomonas），已在中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2012年03月27日，保藏编号为CGMCC NO.5940。

2.根据权利要求1所述的反硝化聚磷细菌H-hrb02在含氮磷废水处理中的脱氮除磷效能应用。

3.根据权利要求2所述的反硝化聚磷细菌H-hrb02的脱氮除磷效能应用，其特征在于处理方法为：挑取H-hrb02菌落，富集24小时后，以每1L水样接种100ml菌液的比例接种至缺磷培养基和富磷培养基中，培养时间为80小时；

所述缺磷培养基的配制如下：PO₄ ^3--P为4mg/L；CH₃COONa 3.23g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 23mg/L，NH₄Cl 152.8mg/L，MgSO₄·7H₂O 81.12mg/L，K₂SO₄ 17.83mg/L，CaCl₂·2H₂O 11mg/L，HEPES buffer 7g/L，微量元素 2ml/L，琼脂 15g/L，H₂O 1000ml，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

所述富磷培养基的配制如下：PO₄ ^3--P为8mg/L；CH₃COONa 3.23g/L，KH₃PO₄ 25mg/L，NH₄Cl 305.52mg/L，MgSO₄·7H₂O 91.26mg/L，CaCl₂·2H₂O 25.68mg/L，PIPES buffer 8.5g/L，微量元素 2ml/L，琼脂 15g/L，H₂O 1000ml，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

所述微量元素的配制如下：FeCl₃ 0.90g/L，H₃BO₃ 0.15g/L，CuSO₄·5H₂O 0.03g/L，KI 0.18g/L，MnCl₂·4H₂O 0.06g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.12g/L，CoCl₂ 0.15g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g/L，EDTA 10.00g/L。

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