CN102863530A

CN102863530A - 一种脂肪细胞分化代谢产物igf-1抗体及包含该抗体的芯片以及应用

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Publication number: CN102863530A
Application number: CN2012103633859A
Authority: CN
Inventors: 李彬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种脂肪细胞分化代谢产物的IGF-1单克隆抗体及包含该抗体的芯片。本发明所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。包含此抗体的芯片可直接应用于医疗及科研机构对心脑血管疾病、动脉硬化等疾病进行检测和预防的研究，在临床诊断领域中具有极高的应用价值，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题，用本发明所述芯片进行大众人群的体检和临床诊断省时、省力、简便、快速，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种脂肪细胞分化代谢产物IGF-1抗体及包含该抗体的芯片以及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种脂肪细胞分化代谢产物IGF-1抗体及包含该抗体的芯片以及应用。

背景技术

正常的脂肪代谢是机体生长发育的重要生理过程，其机制是复杂多向的机体整体变化，涉及到众多蛋白、细胞因子的上调或下调，而异常的脂肪代谢将导致肝脏损伤、高血压、内分泌失调、肥胖等疾病的发生，这些疾病的发病机理是一个漫长的发展过程，与个体的生活及饮食等***和诊断技术还仅局限于传统的检测方法对单一疾病的诊断，而脂肪细胞分化标志物芯片的研制可将相关疾病进行横向比对，控制其并发症的发生，更加有效地指导临床用药，提高了诊疗水平，缩短了与国际同行之间的差距。随着中国老龄化进程的加快，以上疾病的发病率会逐年增多，此芯片的研制将在正常体检、疾病的预防和控制方面做出积极和重大的贡献。

本发明包括IGF-1在内的45种单克隆抗体与脂肪细胞分化代谢产物中的蛋白质的结合具有高度特异性，涵盖脂肪因子、疾病相关因子及细胞分化标志因子等。所制成的抗体芯片实现了对糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、肥胖等疾病高通量检测技术平台，自主研发脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片检测试剂盒（抗体芯片）完全是由中国人自主开发，应用这一芯片，可通过多种方式、多种渠道、多层面检测脂肪细胞分化代谢产物的效价和含量，将检测灵敏度由ug提高到ng级，从而达到更准确、更全面的效果，其检测结果即可定性也可定量。脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片检测试剂盒（抗体芯片）对促进我国生物高技术前沿领域的发展具有重大鼓舞作用，对提升我国生物芯片技术、产品和市场的国际竞争力具有重大意义，此方法完全符合分子免疫学原理。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用及进行药物产品的定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。

发明内容

本发明的目的在于提供脂肪细胞分化代谢产物IGF-1的单克隆抗体及包含该抗体的芯片以及应用。

本发明的整体技术构思是：利用细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验进行特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于芯片的点样，结合CY3标记的补体C3抗体与被检产品建立了完整的检测***检测检测45种脂肪分化代谢蛋白质含量的方法.此抗体芯片具有灵敏度高,特异性好、操作简单、高通量等优点,可用于临床和体检血清的监测和质控。

本发明提供的IGF-1单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有与脂肪细胞分化代谢产物IGF-1特异性结合的特性。

作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP．A-0120694和EP．A．0125023中描述。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP．A．184187，GB 2188638A或．EP．A．239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。

如上所述，本发明还提供了用于实施本发明抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种：根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。

本发明所述芯片上还包含特异性结合以下脂肪细胞分化代谢产物的抗体：TNF-α、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4、LPL、PGAR、UCPs、PPAR-γ、C/EBP、ADD1、SREBP1、NPY、MC-4R、POMC、α-MSH、AgRP、orexin、GH、IGF-1、Acrp30、VEGF、HBEGF、HGF、AngⅡ、ACE、AGT、FA transporter、eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP、PEPCK、A2-肾上腺素能受体。

本发明还提供包含所述抗体芯片的试剂盒，其特征在于，还包含信标分子标记的C3补体抗体，所述信标分子优选为CY3。

在具体实施方式中，本发明公开了脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，它包括如下工艺步骤：

（1）动物免疫：将自主设计合成的IGF-1多肽（HPLC检测纯度大于90%，序列PTGYG SSSRRAPQTG）1ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度脂肪细胞分化代谢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；

（2）分离脾细胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；

（3）细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1：10比例混合，30秒内逐渐加入45%PEG（分子量：4000），静止90秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；

（4）筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；

（5）单克隆抗体纯化保存：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44（吸光单位）浓度为1mg/ml。

（6）将C3补体抗体进行CY3标记

（7）脂肪细胞分化代谢产物芯片微阵列点样：（每张芯片包括4-8个阵列，1个标准，3-7个检测）标准阵列检测范围0.01～100ng/ml，检测阵列45种抗体（每种抗体2个点）。

本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是：

步骤（1）将自主设计合成的IGF-1多肽（HPLC检测纯度大于90%）1ml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，每只腹腔注射0.2ml，间隔2周注射一次；采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清。

步骤（2）中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9×10⁵/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞。

步骤（3）中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。

步骤（4）中是将细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

步骤（5）中选用的BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×10⁵杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1.44时浓度为1mg/ml。

步骤（6）中选用的是CY3对补体C3抗体的标记

步骤（7）中选用脂肪细胞分化代谢产物芯片微阵列点样：（每张芯片包括4-8个阵列，1个标准，3-7个检测）标准阵列检测范围0.01～100ng/ml，检测阵列45种抗体（每种抗体2个点）。

本发明所取得的进步在于：所获得的抗人IGF-1单克隆抗体经AKTA蛋白纯化仪FPLC纯化，其效价高、特异性非常好，与另44种与脂肪细胞分化代谢产物相关的单克隆抗体经有限稀释点于芯片上，与标记的补体C3抗体和检测样本进行杂交，借助目前先进的芯片检测仪器进行检测。此技术与传统的检测方法比较，具有快速、操作便捷、高通量检测的特点；并可快速、准确地进行定性和定量检测。

本发明将自主设计合成的IGF-1多肽经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人IGF-1单克隆抗体，此抗体与44种与脂肪细胞分化代谢产物相关的单克隆抗体制成的抗体芯片可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为脂肪细胞分化代谢产物的检测试剂，抗人脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。

具体实施方式

本发明公开了一种脂肪细胞分化代谢产物IGF-1抗体及包含该抗体的芯片以及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在进一步阐述本发明之前，我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”（大约25kDa或大约214个氨基酸）包含一个由NH₂-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”（大约50kDa或大约446个氨基酸），同样包含一个可变区（大约116个氨基酸），以及重链恒定区之一，例如γ（大约330个氨基酸）。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)₂和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。

抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab')₂，以及双功能杂合抗体（例如文献，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.，1987；17，105)以及以单链形式(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；85，5879和Bird等，Science，1988；242，423，在此引用作为参考）存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区（也称为“互补决定区”或CDR）组成，这些超变区被框架区（FR）间隔。框架区和互补决定区的范围已被精确定义（参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest，"E.Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat***。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。

嵌合抗体是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如γ1和γ3。例如治疗用嵌合抗体是一种嵌合蛋白质，它由来源于兔抗体可变区片段或抗原结合区片段和人抗体恒定区或效应区结合（如由A.T.C.C.保藏登记号CRL 9688的细胞制备的抗Tac嵌合抗体），当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。

可以理解本发明设计和生产的人源化抗体可能会替代某些保守性氨基酸，这些氨基酸对抗原结合或抗体其他功能基本上没有影响。换而言之，gly和ala；val、ile和leu；asp和glu；asn和gln；ser和thr；lys和arg；phe和tyr，以上各组合内部的氨基酸可相互取代。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按Chothia和他人所述(Chothia，Structural determinants inthe sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Biol.1998；278，457)。

VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能具有κ和λ同种型。K-1抗体具有κ-1同种型而K-2抗体具有κ-2同种型，Vλ是可变的λ轻链。

“相应的氨基酸”，是指当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置（也就是它们彼此对应）的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域普通技术人员已知（参见如Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)，有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或***1、2、3或4个残基或者至多约15个残基（特别是在L3和H3CDR中），从而完成一次比对。

“可取代位置”，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们可以被如何取代在下面将进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：本发明所述脂肪细胞分化代谢产物抗体的制备

脂肪细胞分化代谢产物抗体的制备方法，包括如下工艺步骤：

（1）动物免疫：将自主设计合成IGF-1多肽（PTGYG SSSRRAPQTG）1ml充分乳化，分别免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人脂肪细胞分化代谢产物，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；

（3）细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1：10比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；

（4）筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；

（5）单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1：10000的阳性孔的上清，与多种其它基因工程药物进行特异性筛选。

（6）单克隆抗体纯化保存：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44（吸光单位）浓度为1mg/ml。

步骤（1）将自主设计合成IGF-1多肽1ml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在9周，每只腹腔注射0.2ml，间隔2周注射一次；测定抗血清。

步骤（2）进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成：

a、包被:

以50mmol/L、pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤（1）中的自主设计合成IGF-1多肽包被96孔聚乙烯板，4微克/孔，真空抽干，密封4℃保存备用。

b、封闭:

每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200μl洗涤、内含1%山羊血清；

c、加样:

每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50μl（1:5000稀释），每板设一正常对照、阳性对照及空白（磷酸盐缓冲液），洗涤；

d、加入酶标二抗每孔100μl，洗涤；

e、显色:

每孔加入底物100μl；

f、比色:

以空白调零，405nm波长测定光密度（O.D）；

g、结果判断:P/N=测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N≥2.1为阳性。

步骤a中的聚乙烯板规格为200μl/孔、真空抽干温度为4℃，洗涤采用0.05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3次。

步骤b中的工艺参数为每孔加入pH=7.4、含1%山羊血清磷酸盐缓冲液200μl，温度为37℃、时间1小时，洗涤3次。

步骤c中的工艺条件为每孔加入1:5000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50μl，每板设一正常对照、阳性对照及空白（磷酸盐缓冲液），温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。

步骤d中的工艺条件加入酶标二抗每孔100μl，温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。

步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。

步骤（3）中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9×10⁵/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞。

步骤（4）中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10的

比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。

步骤（5）中是将细胞培养至覆盖10％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，与多批次脂肪细胞分化代谢产物经ELISA筛选呈阳性表达。然后确定高分泌、高特异性细胞株扩大培养或冻存。

步骤（6）中选用的BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×10⁵杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1.44时浓度为1mg/ml。

实施例2：抗体芯片的制备方法

在实施例1基础上增加如下工艺步骤：

步骤（7）中选用的CY3标记补体C3抗体。

步骤（8）中选用的脂肪细胞分化代谢产物芯片微阵列点样：（每张芯片包括4-8个阵列，1个标准，3-7个检测）标准阵列检测范围0.01～100ng/ml，检测阵列45种抗体（每种抗体2个点）。

实施例3：本发明所述单抗各项指标检测

将实施例1筛选的IGF-1杂交瘤细胞株分泌的单抗进行序列分析，其重链可变区如下：

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYIMWWVRQAPGKGLEWVSV ISSSGGMTRY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDN GDYVGEKGFD IWGQGTMVTV SSAA（如SEQ ID No.1所示）

其轻链可变区如下：

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SNYLNWYQQKPGKAPKLLIY TASTLQSGVP SRFSGSASGT DFTLTINSLQ PEDFATYSCQQSYNSPWTFG QGTKVEIKRTS（如SEQ ID No.2所示）

实施例4：指标检测

本发明实施例1制备的IGF-1单克隆抗体的各项指标如下：

1、阳性克隆孔腹水酶联免疫吸附实验效价大于1：56000

2、该芯片所包含的45种脂肪细胞分化代谢产物相关抗体如下：

脂肪因子(adipokines)：TNF-α、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4、LPL、PGAR、UCPs、PPAR-γ、C/EBP、ADD1、SREBP1、NPY

与疾病相关的因子：MC-4R、POMC、α-MSH、AgRP、orexin、GH、IGF-1、Acrp30、VEGF、HBEGF、HGF、AngⅡ、ACE、AGT、FA transporter、eNOS、iNOS

各分化阶段标志因子：ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP、PEPCK、A2-adrenoreceptor。

此脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片经30批次的脂肪细胞分化代谢产物产品的特异性筛选表达均为阳性，与11种18批次的其它脂肪细胞分化代谢产物进行特异性筛选阳性表达为0。表明此芯片特异性很高，适合提供给医疗及科研机构进行脂肪细胞分化代谢产物的鉴定和质控评价，此抗体还可制成免疫组化或酶联免疫吸附实验试剂盒开展医学基础研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.IGF-1的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合IGF-1的特性。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

3.权利要求1至2任一项所述的单克隆抗体在制备糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、肥胖的检测试剂中的用途。

4.一种试剂，包含权利要求1至2任一项所述的单克隆抗体。

5.一种试剂盒，包含权利要求1至2任一项所述的单克隆抗体。

6.一种抗体芯片，包含权利要求1至2任一项所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的抗体芯片，其特征在于，还包含特异性结合以下脂肪细胞分化代谢产物的抗体：TNF-α、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4、LPL、PGAR、UCPs、PPAR-γ、C/EBP、ADD1、SREBP1、NPY、MC-4R、POMC、α-MSH、AgRP、orexin、GH、IGF-1、Acrp30、VEGF、HBEGF、HGF、Ang Ⅱ、ACE、AGT、FA transporter、eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP、PEPCK、A2-肾上腺素能受体。

8.包含权利要求6或7所述抗体芯片的试剂盒，其特征在于，还包含信标分子标记的C3补体抗体，所述信标分子优选为CY3。