CN102858987B

CN102858987B - 利用烯酸还原酶还原肉桂醛衍生物的方法

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Publication number: CN102858987B
Application number: CN201180016527.8A
Authority: CN
Inventors: B·豪尔; R·施蒂默尔; C·斯蒂克勒; K·费伯
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2011-02-01
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2031-02-01
Also published as: US20120301931A1; WO2011092345A1; JP2013517786A; EP2531606A1; EP2531606B1; ES2487218T3; CN102858987A; US8597915B2; JP5833571B2

Abstract

本发明涉及用于在含有某些有机共溶剂的水性反应介质中产生不对称芳香醛的新的酶促催化方法。

Description

利用烯酸还原酶还原肉桂醛衍生物的方法

本发明涉及新的酶促催化方法，其用于在含有某些有机共溶剂的水性反应介质中产生不对称的芳香醛。

发明背景

由于醛的挥发性和嗅觉感知性质，它们构成香味和香料应用中重要的有效成分(a)C.Chapuis,D.Jacoby,Appl.Catal.A:Gen.2001,221,93-117;b)D.Pybus,C.Sell,The chemistry of fragrances,RSCPaperbacks,Royal Society of Chemistry,Cambridge,1999)。因为α-和β-取代的醛的对映体通常在气味上有很大的不同(a)A.Abate,E.Brenna,C.Fuganti,F.G.Gatti,S.Serra,Chem.Biodivers.2004,1,1888-1898;b)L.Doszczak,P.Kraft,H.-P.Weber,R.Bertermann,A.Triller,H.Hatt,R.Tacke,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3367-3371;c)E.Brenna,C.Fuganti,S.Serra,Tetrahedron:Asymmetry 2003,14,1-42)，所以通常需要它们以非消旋形式应用。尽管β-取代的醛是手性稳定的，但是α-取代的醛类似物易于外消旋化，这需要制备它们的复杂的方法。其中，通过不对称的氢化作用去对称化共轭的烯醛是一个选择的方法(L.A.Saudan,Acc.Chem.Res.2007,40,1309-1319)。然而已经报导了使用含有手性修饰的均相（过渡金属）催化剂的很多方案(例如参见:a)S.Akutagawa,Appl.Catal.A:Gen.1995,128,171-207;b)S.Bovo,A.Scrivanti,M.Bertoldini,V.Beghetto,O.Matteoli,Synthesis 2008,2547-2550;c)W.S.Knowles,R.Noyori,Acc.Chem.Res.2007,40,1238-1239;d)A.J.Minnaard,B.L.Feringa,L.Lefort,J.G.de Vries,Acc.Chem.Res.2007,40,1267-1277),而近来更多地开发了依靠烟酰胺-模拟物（‘汉栖酯’）作为氢化物来源还原烯醛的金属依赖的有机催化剂(a)J.W.Yang,M.T.H.Fonseca,N.Vignola,B.List,Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,108-110;b)H.Adolfsson,Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,3340-3342;c)S.G.Ouellet,A.M.Walji,D.W.C.MacMillan,Acc.Chem.Res.2007,40,1327-1339;d)K.Akagawa,H.Akabane,S.Sakamoto,K.Kudo,Tetrahedron:Asymmetry 2009,20,461-466)。至今，手性表面修饰的多相催化剂是没有竞争力的(a)D.J.Watson,R.J.B.R.J.Jesudason,S.K.Beaumont,G.Kyriakou,J.W.Burton,R.M.Lambert,J.Am.Chem.Soc.2009,131,14584-14589;b)A.Tungler,E.Sipos,V.Hada,Curr.Org.Chem.2006,10,1569-1583)。作为多种化学-催化方法的备选，通过使用多种类型的氧化还原酶已经设想了生物-还原(S.Serra,C.Fuganti,E.Brenna,Trends Biotechnol.2005,23,193-198)。为了避开使人厌烦的蛋白质纯化和外部辅因子-再循环，利用全微生物细胞（最显著的是面包酵母）还原烯醛。由于存在竞争性烯-和羰基-还原酶，烯醛的化学和立体选择性生物还原是不可能的，因为不希望的羰基还原常常压倒了所希望的C=C-键还原，从而通过形成対应的烯丙型醇和/或饱和醇引起底物和产物的消耗(a)M.Majeric,A.Avdagic,Z.Hamersak,V.Sunjic,Biotechnol.Lett.1995,17,1189-1194;b)C.Fuganti,S.Serra,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,2000,3758-3764;c)P.D'Arrigo,C.Fuganti,G.Pedrocchi-Fantoni,S.Servi,Tetrahedron 1998,54,15017-15026;d)G.Fronza,C.Fuganti,P.Grasselli,L.Majori,G.Pedrocchi-Fantoni,F.Spreafico,J.Org.Chem.1982,47,3289-3296;e)G.Fronza,C.Fuganti,M.Pinciroli,S.Serra,Tetrahedron:Asymmetry 2004,15,3073-3077;f)V.Sunjic,M.Majeric,Z.Hamersak,Croat.Chem.Acta1996,69,643-660)。

只是最近，可获得充足量的来自老黄酶家族的氧稳定的烯还原酶，其通过留下未被接触的C=O-部分允许在烯酮和烯醛中活化的C=C键的化学和立体选择性生物还原(参见综述，:a)R.Stuermer,B.Hauer,M.Hall,K.Faber,Curr.Opin.Chem.Biol.2007,11,203-213;b)S.K.Padhi，D.J.Bougioukou,J.D.Stewart,J.Am.Chem.Soc.2009,131,3271-3280;c)J.F.Chaparro-Riggers,T.A.Rogers,E.Vazquez-Figueroa,K.M.Polizzi,A.S.Bommarius,Adv.Synth.Catal.2007,349,1521-1531;d)M.Kataoka,A.Kotaka,R.Thiwthong,M.Wada,S.Nakamori,S.Shimizu,J.Biotechnol.2004,114,1-9。对于α-甲基肉桂醛的立体选择性的生物还原，见A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29)。受我们最近的结果鼓舞(a)M.Hall,C.Stueckler,W.Kroutil,P.Macheroux,K.Faber,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3934-3937;b)M.Hall,C.Stueckler,H.Ehammer,E.Pointner,G.Oberdorfer,K.Gruber,B.Hauer,R.Stuermer,W.Kroutil,P.Macheroux,K.Faber,Adv.Synth.Catal.2008,350,411-418;c)M.Hall,C.Stueckler,B.Hauer,R.Stuermer,T.Friedrich,M.Breuer,W.Kroutil,K.Faber,Eur.J.Org.Chem.2008,1511-1516.)，我们研究了这些酶在制备非外消旋的α-甲基二氢肉桂醛衍生物中的应用，所述非外消旋的α-甲基二氢肉桂醛衍生物用于香料应用中(对于α-甲基肉桂醛的立体选择性的生物还原，参见:A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29)。

仍需要制备α-取代的芳香醛的对映体形式的改进的酶促方法。

发明概述

通过提供所附权利要求中限定的酶促催化方法令人惊奇地解决了这种问题。

具体地，根据本发明通过使用不同的经克隆和过表达的烯-还原酶酶促还原对应的前体（即，肉桂醛前体）获得了在香料(Lilial^TM,Helional^TM)中作为嗅觉成分使用的非外消旋的芳基-取代的醛，例如α-甲基二氢肉桂醛衍生物。尽管使用YqjM和同工酶OPR1获得了(R)-对映体(对映体过量最大值53%)，但是在优化的反应条件下在叔-丁基甲醚作为共溶剂的存在下，使用OPR3、NCR和OYEs 1-3供应了高达97%的对映体过量的(S)-醛。使用NCR和OYE1-3将α-甲基肉桂醛还原的立体化学结果[以前报导的是(R)]明确地校正到(S)。

附图描述

图1.在使用OYE3还原1a中反应速率和立体选择性对有机共溶剂(叔-丁基甲醚,体积:体积)的比例的依赖性。

发明详述

1.具体的实施方案

特别地，本发明涉及以下的实施方案：

1.在第一个实施方案中，本发明提供用于产生、特别是不对称合成通式1的醛化合物的生物催化方法，特别是酶促催化方法

其中

R¹和R²彼此独立地代表线性的或者分枝的，任选地被取代的烷基，如C₁-C₈或C₁-C₆烷基；烯基，如C₂-C₈或C₂-C₆烯基；炔基，如C₂-C₈或C₂-C₆炔基；烷氧基，如C₁-C₈或C₁-C₆烷氧基；烯氧基，如C₂-C₈或C₂-C₆烯氧基；-H,-OH,-SH,-卤素，如F,Cl或Br;-NH₂,或-NO₂;

特别地，H或线性的或者分枝的烷基，如C₁-C₆或C₁-C₄烷基；烯基，如C₂-C₆烯基；炔基，如C₂-C₆炔基；烷氧基，如C₁-C₆或C₁-C₄烷氧基；烯氧基，如C₂-C₆烯氧基；或者更特别地，H或者分枝的C₃-C₆烷基或者C₃-C₆烯基；

或者R¹和R²一起代表通式–O-R⁴-O-的基团，其中R⁴代表任选地被取代的亚烷基，如C₁-C₄亚烷基或亚烯基，如C₂-C₆或者C₃-C₆亚烯基；和

R³代表H,烷基,如C₁-C₆烷基;或烷氧基，如C₁-C₆烷氧基,特别是C₁-C₄烷基；

其中如果所述化合物在2位含有不对称碳原子，那么所述化合物是(R)或(S)构型；

所述方法包括：

a)水性反应介质中酶促还原（在分子氧的存在或者缺失下，即需氧或者厌氧条件下）通式II的（特别是E-构型）化合物，

其中

R¹,R²和R³如上文定义,

所述水性反应介质包含通式III的至少一种醚化合物作为共溶剂

R⁵-O-R⁶(III)

其中

R⁵和R6彼此独立地代表线性的或者分枝的烷基;

并且也含有至少一种还原酶，特别地，其能使通式II所述化合物在位置C2/C3处还原或者氢化，催化所述的还原步骤，所述水性反应介质还含有用于所述还原酶的至少一种辅因子（还原当量）；

和

b)任选地以基本上纯的立体异构体或者立体异构体的混合物的形式分离通式I的所述化合物。

2.实施方案1的方法，其中所述共溶剂选自通式IV的不对称醚化合物，其中R⁵和R⁶是不同的，特别是不同的C₁-C₈烷基。

3.实施方案2的方法，其中所述共溶剂选自通式IV的不对称醚化合物，其中残基R⁵和R⁶中的一个或者两个残基是分枝的烷基，特别是分枝的C₃-C₈烷基（即含有至少一个（如1或2个）仲或者叔碳原子）。

4.实施方案3的方法，其中所述共溶剂是叔-丁基烷基醚，特别是叔-丁基C₁-C₄烷基醚，如叔-丁基甲醚。

5.前面实施方案的一个的方法，其中所述共溶剂在反应介质中以0.1至80，例如1至50,5至40或者10至30的体积百分比的比例存在。

6.前面实施方案的一个的方法，其中所述还原酶选自以下组成的组：

a)OYE1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:1至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物的位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；

b)OYE2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:2至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；

c)OYE3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:3至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；

d)OPR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:4至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；

e)OPR3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:5至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；

f)NCR，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:7至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用；或者

g)YqjM，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者包含具有与所述的SEQ ID NO:6至少50%的同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性的序列，并且所述序列仍保留预期的酶活性（或功能），即作为还原酶，特别是作为能还原，即，使通式II的化合物在位置C2/C3处氢化（并且任选地也氧化，即，使通式I的化合物在位置C2/C3处脱氢）的还原酶应用。

每种所述的酶属于烯醇化物还原酶类（Ec 1.3.1.X）。

特别地，这些酶是或者来源于以下：

OPR1:番茄（Solanum lycopersicon）

OPR3:番茄（Solanum lycopersicon）

YqjM:枯草芽孢杆菌NamA（Bacillus subtilis NamA）

OYE 1:卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）

OYE2和OYE3:酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

NCR:运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）

7.前面实施方案的一个的方法，其中在NADH或NADPH作为还原当量或者辅因子的存在下（或者在NAD⁺或NADP⁺存在下的相应逆反应）进行反应。

8.前面实施方案的一个的方法，其中将还原反应偶联到辅因子再循环反应，特别是酶促辅因子再循环反应。

9.实施方案8的方法，其中通过偶联到催化葡萄糖氧化的葡糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)再循环被氧化的辅因子NAD+，从而形成葡糖酸内酯和再生NADH。

10.前面实施方案的一个的方法，其中涉及的酶以溶解的、分散的或者固定的形式存在于反应介质中。

11.前面实施方案的一个的方法，其中将反应介质缓冲到pH 6.5至8.5,如pH 7.0至8.0。

12.前面实施方案的一个的方法，其中反应温度是在5至60,10至50,特别地20至40℃的范围内。

本发明也包括实施方案1至12中定义的转化的相应的逆反应，即通式I的化合物至通式II的化合物的生物催化氧化（脱氢）。

2.特定术语的解释

除非另外说明，将应用以下的含义:

术语“生物催化”或者“酶催化”方法指的是，在本文定义的酶的催化活性的存在下（即在经分离的纯的或初制的酶或者含有或表达这种酶活性的整个微生物细胞的存在下）进行的任何方法。

术语“立体特异性”意指通过酶形成的几种立体异构体或者对映体中的一种，其具有至少90%ee,优选地至少95%ee,特别地至少98%ee,或者至少99%ee的高对映体过量或者纯度。根据下面的通式计算ee%值

ee%=[X_A-X_B]/[X_A+X_B]*100,

其中X_A和X_B分别指的是对映体A或B的摩尔分数。

“立体异构体”的实例是E-和Z-异构体，或者特别是R-和S-对映体。

术语“基本纯的”意在描述一种分子，其通过本领域的技术人员使用的一种或者多种纯度或者同质性特征被认为是同质的。

“基本纯的”蛋白质或者酶指的是如通过聚丙烯酰胺--十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带证明，希望被纯化的蛋白质基本不含污染性细胞组分。“基本纯的”酶或者蛋白质对于一些参数将显示在标准实验偏差中的恒定的和可重复的特征，所述参数如下：分子量、层析迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封闭或者未封闭的N-末端、HPLC洗脱图谱、生物学活性和其他的此类参数。例如，“基本纯的”蛋白质或者酶指的是如通过聚丙烯酰胺--十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带证明，希望被纯化的蛋白质基本不含污染性细胞组分。然而，该术语不是意在排除所述酶或者蛋白质与其他化合物的人工或者合成的混合物。另外，该术语不是意在排除从重组宿主任选地分离的融合蛋白。

在通式I、II和III中的化合物中，将应用下面的含义：

烷基以及来源于例如烷氧基的残基的烷基片段，代表具有1至4,1至6、1至8或者1至10个碳原子的饱和的，线性的或者分枝的烃链，如

C₁-C₆-烷基，如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基-丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1－二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。

C₁-C₆烷氧基，如C₁-C₄烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基或1,1-二甲基乙氧基；以及例如戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1,1,2-三甲基丙氧基、1,2,2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基或者1-乙基2-甲基丙氧基；

烯基：单一的或者多种的，特别是单一非饱和的直链或者分枝的烃残基，其具有2至4个、2至6个、2至8个或2至10个碳原子和任一位置的双键，所述烃残基如C₂-C₆-烯基、如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基。

烯氧基：上述烯基的连接氧的类似物，如相应的C₂-C₆烯氧基。

炔基：上述烯基的类似物，其中碳-碳双键被替换成三键。

亚烷基：具有多达7个碳原子的直链或者分枝的烃桥，如C₁-C₇-亚烷基，如-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-、-(CH₂)₂-CH(CH₃)-、-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-、(CH₂)₄-、-(CH₂)₅-、-(CH₂)₆、-(CH₂)₇-、-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-或者–CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-，或者C₁-C₄-亚烷基，其选自-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-、-(CH₂)₂-CH(CH₃)-、-CH₂-CH(CH₃)-CH₂。

亚烯基:代表具有2至8个碳原子的上述亚烷基的单一的或者多种的、特别是单一非饱和的类似物、特别是C₂-C₇-亚烯基或C₂-C₄-亚烯基，如-CH=CH-、-CH=CH-CH₂-、-CH₂-CH=CH-、-CH=CH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH=CH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH=CH-、-CH(CH₃)-CH=CH-、-CH₂-C(CH₃)=CH-。

任选的取代基可以选自-COOH、-COO-烷基、–OH、-SH、-CN、氨基、-NO₂、烷基或者烯基，烷基或者烯基如上文定义。

3.本发明的进一步实施方案

3.1根据本发明的蛋白质

虽然本发明不限于具体提到的酶/蛋白质，但是也扩展到它们的功能等同物。

在本发明的范围内，具体公开的酶的“功能等同物”或者“类似物”或者“功能突变”是具有希望的生物学功能或者活性，例如酶活性的所述酶的多种多肽。

例如，“功能等同物”指的是酶，其在用于酶活性的测试中显示出如本文定义的酶的至少1%至10%，或者至少20%，或者至少50%,或者至少75%,或者至少90%更高的或者更低的活性。

根据本发明，“功能等同物”也特别指的是突变体，其在上文指出的氨基酸序列的至少一个序列位置中具有与具体指出的氨基酸不同的氨基酸，但是仍然具有前述的生物学活性的一种。因此，“功能等同物”包括通过一个或者多个，如1至20个、1至15个、1至10个或1至5个氨基酸的添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体，其中指出的改变可以在任一序列位置发生，条件是所述改变导致了具有根据本发明的性质谱的突变体。如果在突变体和未改变的多肽之间的反应性的模式在性质上一致，即如果例如以不同的速率转化相同的底物，那么尤其也提供了功能等同物。在下表中显示了适合的氨基酸取代的实例：

在上文的意义中“功能等同物”也是所描述的多肽的“前体”以及多肽的“功能衍生物”和“盐”。

在这种情况下“前体”是多肽的天然或者合成的前体，其具有或者不具有希望的生物学活性。

表述“盐”指的是根据本发明的蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。可以以已知的方式产生羧基盐，并且其包含无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，和与有机碱、例如胺、如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等形成的盐。本发明也覆盖了酸加成盐，例如与无机酸，如盐酸或者硫酸形成的盐，和与有机酸，如乙酸和草酸形成的盐。

也可以使用已知的技术在功能的氨基酸侧基上或者在多肽的N-末端或者C-末端产生根据本发明多肽的“功能衍生物”。这种衍生物包含例如羧酸基团的脂肪族的脂，通过与氨或者与伯胺或者仲胺反应可获得的羧酸基团的酰胺，通过与酰基反应产生的自由氨基的N-酰基衍生物或者通过与酰基反应产生的自由羟基的O-酰基衍生物。

“功能等同物”当然也包括可以从其他生物获得的多肽以及天然出现的变体。例如，通过序列比较可以确定同源序列区的区域，并且在本发明的具体的参数的基础上可以确定等同的酶。

“功能等同物”也包含片段，优选地例如显示了希望的生物学功能的根据本发明的多肽的独立结构域或者序列基序。

此外，“功能等同物”是融合蛋白，其具有上文指出的多肽序列或者从其衍生的功能等同物的一种，和具有以功能性N-末端或者C-末端结合（即没有融合蛋白部分的基本相互的功能损伤）的至少一种另外的功能不同的异源序列。这些异源序列的非限制性的实例是例如信号肽，组氨酸锚或者酶。

根据本发明也包括的“功能等同物”是具体公开的蛋白质的同源物。这些同源物具有上文指出的百分比同一性的值。所述值指的是与具体公开的氨基酸序列的同一性，并且可以根据Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算。

从BLAST比对，算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或者通过应用下面给出的Clustal设定也可以计算百分比同一性的值。通常的百分比同一性值是例如在50%以内或者以上，例如，至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%。

根据本发明的同源多肽的百分比同一性特别地指的是相对于本文具体描述的氨基酸序列中的一种的全长的氨基酸残基的百分比同一性。

在存在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的“功能等同物”包含上文指定类型的蛋白质，其为通过改变糖基化模式可以获得的去糖基化或者糖基化的形式以及修饰的形式。

通过诱变例如点突变，蛋白质的延长或者缩短可以产生根据本发明的蛋白质或者多肽的这种功能等同物或者同源物。

通过筛选突变体，例如缩短突变体的组合数据库可以鉴定根据本发明的蛋白质的这种功能等同物或者同源物。例如，通过在核酸水平上的组合诱变，例如，通过合成寡核苷酸的混合物的酶连接可以产生蛋白质变体的多样化数据库。有许多方法可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的同源物的数据库。可以在DNA自动合成仪中进行简并的基因序列的化学合成，之后可以将合成基因连接到合适的表达载体中。简并的基因组的使用使得有可能在混合物中提供全部序列，其编码一组所希望的潜在蛋白质序列。本领域的技术人员已知简并寡核苷酸的合成方法(例如，Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人，(1984)Science 198:1056;Ike等人，(1983)NucleicAcids Res.11:477)。

在现有技术中，已知用于筛选通过点突变或者缩短产生的组合数据库的基因产物和用于筛选cDNA文库的具有所选择性质的基因产物的几种技术。这些技术可以适应于通过根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因库的快速筛选。用于筛选大的基因库的最常用的技术是基于高通量分析，所述技术包括在可被复制的表达载体中克隆基因库，用得到的载体数据库转化适合的细胞并在这样的条件下表达组合基因，其中所希望的活性的检测促进了编码基因的载体的分离，检测所述基因的产物。递归集合诱变(REM)是增加数据库中的功能突变体的频率的技术，可将所述递归集合诱变与筛选测试组合使用以便鉴定同源物(Arkin and Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等人，(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。

3.2编码核酸序列

本发明也涉及编码本文定义的酶/蛋白质的核酸序列。

本发明也涉及与本文具体公开的序列具有一定程度的“同一性”的核酸。两种核酸之间的“同一性”指的是在核酸全长的情况下的核苷酸的同一性。

例如用Informax公司(USA)的Vector NTI Suite 7.1程序利用Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequencealignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)用以下设定可以计算同一性：

多重比对参数:

配对比对参数：

备选地根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,网页:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和以下的设定可以确定同一性：

以已知的方式通过从核苷酸的结构单元的化学合成，例如通过双螺旋的个别重叠的互补核酸结构单元的片段缩合可以产生本文提到的全部核酸序列（单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA）。以已知的方式例如通过亚磷酰胺法(Voet,Voet,2nd edition,Wiley Press,NewYork,pages 896-897)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等人.(1989)中描述了用DNA聚合酶的克列诺片段和连接反应以及一般的克隆技术积聚合成的寡核苷酸和填补空位，参见下文。

本发明也涉及编码上文的多肽和它们的功能等同物中的一种的核酸序列（单链和双链的DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA），所述功能等同物例如使用人工核苷酸类似物可被获得。

本发明涉及编码根据本发明的多肽或者蛋白质或者它们的生物学活性区段的分离的核酸分子和可被用作例如鉴定或者扩增根据本发明的编码核酸的杂交探针或者引物的核酸片段。

根据本发明的核酸分子可以额外地含有来自编码基因区的3'和/或5'端的非翻译序列。

本发明进一步地涉及与具体描述的核苷酸序列或者它的区段互补的核酸分子。

根据本发明的核苷酸序列使得有可能产生可以用于鉴定和/或克隆在其他的细胞类型和生物中的同源序列的探针和引物。这种探针或者引物通常包含核苷酸序列区，其在“严格”条件（见下面）下与根据本发明的核酸序列的有义链或者相应的反义链的至少约12个，优选地至少约25个，例如约40,50或者75个连续的核苷酸杂交。

“分离的”核酸分子与在该核酸的天然来源中存在的其他的核酸分子分离，并且如果所述“分离的”核酸分子通过重组技术产生，那么它可以基本上不含其他的细胞物质或者培养基，如果所述“分离的”核酸分子是被化学合成的，那么它可以不含化学前体或者其他的化学品。

用分子生物学的标准技术和根据本发明提供的序列信息可以分离根据本发明的核酸分子。例如，使用具体公开的全序列之一或者它的片段作为杂交探针和标准杂交技术(例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989中描述的)可以从合适的cDNA文库中分离cDNA。另外，通过聚合酶链反应，使用在这种序列的基础上构建的寡核苷酸引物可以分离包含公开的序列之一或者其片段的核酸分子。以这种方式扩增的核酸可被克隆到适合的载体中并可通过DNA测序被表征。通过标准的合成方法，例如使用DNA自动合成仪也可以产生根据本发明的寡核苷酸。

例如通过常见的杂交技术或者PCR技术可以从其他的细菌，例如经由基因组文库或者cDNA文库可以分离根据本发明的核酸序列或者它的衍生物、这些序列的同源物或者部分。这些DNA序列在标准条件下与根据本发明的序列杂交。

“杂交”指的是多核苷酸或者寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补的序列的能力，而在这些条件下在非-互补的配偶体之间的非特异的结合不发生。为此，序列可以是90%-100%互补的。例如在RNA印迹法或者DNA印迹法或者在PCR或RT-PCR的引物结合中利用了互补序列能彼此特异地结合的性质。

将保守区的短核苷酸有利地用于杂交。然而，也可能将根据本发明的核酸的较长片段或者全序列用于杂交。取决于使用的核酸（寡核苷酸，较长的片段或者全序列）或者取决于用于杂交的核酸类型-DNA或RNA，这些标准条件不同。例如，DNA:DNA杂合体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂合体的解链温度低约10°C。

例如，取决于特定的核酸，标准条件指的是在具有0.1SSC至5x SSC(1X SSC=0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.2)或者额外地存在50%的甲酰胺的水性缓冲液中在42°C和58°C之间的温度，例如在5x SSC,50%甲酰胺中42°C下。有利地，对于DNA:DNA杂合体，杂交条件是0.1x SSC和约20°C至45°C之间，优选地约30°C至45°C之间的温度。对于DNA:RNA杂合体，杂交条件有利地是0.1x SSC和约30°C至55°C之间，优选地约45°C至55°C之间的温度。这些指出的用于杂交的温度是在缺少甲酰胺的情况下具有近似100个核苷酸的长度和50%的G+C含量的核酸的理论解链温度值的实例。在相关的遗传学教科书，例如Sambrook等人,1989中描述了用于DNA杂交的实验条件，并且使用本领域技术人员已知的公式，例如取决于核酸长度，杂合体的类型或者G+C含量可以计算所述实验条件。本领域的技术人员可以从以下的教科书中获得关于杂交的进一步的信息：Ausubel等人(eds),1985,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York;Hames and Higgins(eds),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford;Brown(ed),1991,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。

特别地可以在严格条件下进行“杂交”。例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,in:Molecular Cloning(A Laboratory Manual),2ndedition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,pages 9.31-9.57或者在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中描述了这种杂交条件。

“严格的”杂交条件特别地指的是：在42°C在溶液中温育过夜，接着在65°C用0.1x SSC洗涤滤器，所述溶液由50%甲酰胺、5x SSC(750mMNaCl,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性的被剪切的鲑精DNA组成。

本发明也涉及具体公开的衍生物或者可衍生的核酸序列。

因此，根据本发明进一步的核酸序列可以来源于本文具体公开的序列并且可以通过添加、取代、***或者缺失单个或者几个核苷酸与所述公开的序列不同，并且还编码具有所希望的性质谱的多肽。

本发明也包括核酸序列，其包含所称作的沉默突变，或者根据特定来源或者宿主生物的密码子使用与具体指出的序列比较已经被改变，以及天然发生的变体，例如所述核酸序列的剪接变体或者等位变体。

本发明也涉及通过保守的核苷酸取代（即，用具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换讨论的氨基酸）可以获得的序列。

本发明也涉及由于序列多态性来源于具体公开的核酸的分子。由于天然变异，这些遗传多态性可在群体中的个体之间存在。这些天然变异在基因的核苷酸序列中通常产生1%至5%的变化。

根据本发明的核酸序列衍生物指的是例如等位变体，其在衍生的氨基酸水平上，在整个序列范围内（在氨基酸水平的同源性方面，参考上文给出的针对多肽的细节）具有至少60%的同源性，优选地至少80%的同源性，更特别优选地至少90%的同源性。有利地，在序列的部分区域同源性可以更高。

此外，也可以将衍生物理解为根据本发明的核酸序列的同源物，例如动物的、植物的、真菌的或者细菌的同源物，编码和非编码DNA序列的缩短序列，单链DNA或者RNA。例如，在本文具体公开的序列中给出的整个DNA区域上，同源物在DNA水平上具有至少40%，优选地至少60%，特别优选地至少70%，更特别优选地至少80%的同源性。

此外，可将衍生物理解为，例如与启动子的融合物。通过至少一个核苷酸的交换、至少一个***、倒位和/或缺失可以修饰待添加到所述的核苷酸序列的启动子，而不损伤启动子的功能性或者功效。此外，通过改变启动子的序列，或者可以用甚至不同属的生物的更有效的启动子完全交换所述启动子，可以增加启动子的功效。

3.3制备功能突变体

技术人员也知道产生功能突变体的方法。

取决于应用的技术，技术人员可以在基因区或者非编码核酸区（例如，其可以对于调节基因表达是重要的）中产生任意突变或者定向突变，并且之后，可以产生适合的基因文库。因此，需要的分子生物学方法在本领域已知，并且例如由Sambrook and Russell,Molecular Cloning.3.Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001描述。

技术人员已知修饰基因和因此修饰编码的蛋白质的方法，例如

-位点特异性诱变，其中特异地替换基因的单个或者多个核苷酸(Trower MK(Ed.)1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey)，

-饱和诱变，其中在基因的任一位置可以交换或者添加任一氨基酸的密码子(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res22:1593;Barettino D,Feigenbutz M,Valcárel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1)，

-易错聚合酶链反应(PCR)，其中通过不正确的功能DNA-聚合酶的作用突变核苷酸序列(Eckert KA,Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res18:3739);

-SeSaM法（序列饱和法），其中通过聚合酶避免优选的取代(Schenk等人,Biospektrum,Vol.3,2006,277-279)，

-在增变株中的基因传代，例如由于缺损DNA-修复机制，所述基因传代显示了核苷酸序列突变的发生增多(Greener A,Callahan M,JerpsethB(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.colimutator strain.In:Trower MK(Hrsg.)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey)或者，

-DNA-改组，其中形成并消化了密切相关的基因池，其中将片段用作PCR反应的模板，并且其中形成了全长的嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。

通过应用所称作的定向进化技术(参见，例如Reetz MT und JaegerK-E(1999),Topics Curr Chem 200:31;Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods for optimizing industrial enzymes by directedevolution,In:Demain AL,Davies JE (Hrsg.)Manual of industrialmicrobiology and biotechnology.American Society for Microbiology)，技术人员将能大规模的特异地制备功能突变体。在第一步中，例如通过应用上文提到的方法的任一种，产生了特定蛋白质的文库。之后例如通过应用细菌或者噬菌体展示***，表达所述的文库。

可以选择这些基因并且将其再进行突变，所述基因表达显示希望的特征谱的功能突变体。可以迭代地重复突变和选择或筛选的步骤直到获得的突变体中的一种显示希望的特征谱。

通过迭代法可以进行有限数目的突变，例如1到5轮突变，并且可以评估所述突变对酶特征的影响，还可以逐步地选择进一步被改进的突变体。之后可以将所述的被选择的突变体以基本上相同的方式再进行突变。以这种方式可以显著地减少待评估的单突变体的数目。

基于应当有可能产生具有希望的被修饰的特征谱的进一步的酶/蛋白质，本发明的教导提供了关于所讨论的酶/蛋白质的结构和序列的重要信息。特别地，可以限定所称作的热点，即序列区，其可以潜在地适合进一步突变以便修饰或者产生酶/蛋白质的希望特征。

3.4根据本发明使用的构建体

本发明也涉及表达构建体，其含有在调节性核酸序列的遗传控制下的编码根据本发明的多肽或融合蛋白的核酸序列，以及包含这些表达构建体中的至少一种的载体。

根据本发明，“表达单位”指的是具有表达活性且包含本文定义的启动子的核酸，并且所述启动子与待表达的核酸或者基因功能性结合之后调节这种核酸或者这种基因的表达，即转录和翻译。因此，在上下文中，启动子也被称作“调节性核酸序列”。除了启动子之外，可以存在其他的调控元件，例如增强子。

根据本发明，“表达盒”或者“表达构建体”指的是与待表达的核酸或者待表达的基因功能结合的表达单位。因此，与表达单位比较，表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，而且包含由于转录和翻译应当表达为蛋白质的核酸序列。

在本发明的上下文中，术语“表达”或“过表达”描述产生或增强一种或者多种酶在微生物中的细胞内活性，所述酶通过相应的DNA编码。为此，有可能例如在生物中***基因，用另一种基因替换存在的基因，增加基因的拷贝数目，使用强启动子或者使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且可以任选地组合这些措施。

根据本发明的此类构建体优选地包含来自各自的编码序列的5'-上游启动子和3'-下游终止子序列，以及任选地包含通常的调控元件，在每种情况下所述调控元件与编码序列功能结合。

根据本发明，“启动子”，“具有启动子活性的核酸”或者“启动子序列”指的是与待转录的核酸功能结合的核酸调节这种核酸的转录。

在上下文中，“功能的”或者“有效的”结合指的是，例如将具有启动子活性的核酸的一种和待转录的核酸序列以及任选地其他的调控元件，例如能转录核酸的核酸序列，例如终止子以这样的方式顺序排列，使得每种调控元件在核酸序列的转录中可以实现它的功能。这不是必须需要化学意义上的直接结合。遗传控制序列，如增强子序列，也可以从来自更远位置或者甚至从其他的DNA分子对靶序列发挥它们的功能。这样的排列是优选的，其中将待转录的核酸序列放置在启动子序列之后（即，在3'端），以便两种序列互相共价结合。启动子序列和待转基因表达的核酸序列之间的距离可以少于200bp（碱基对），或者少于100bp，或者少于50bp。

除了启动子和终止子之外，可以提到的其他的调控元件的实例是靶向序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。例如在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述了合适的调节序列。

根据本发明的核酸构建体特别地包含选自如下的具体序列：本文具体指出的序列或者它们的衍生物和同源物，以及可以来源于本文具体指出的氨基酸序列的的核酸序列，有利地，所述核酸序列有效地或者功能地与用于控制例如增强基因表达的一种或者多种调节信号结合。

除了这些调节序列，在实际的结构基因之前可以仍然存在这些序列的天然调节并且其任选地可以已经被遗传地改变，以便关闭天然调节并且已经增强了基因的表达。核酸构建体也可以是更简单的设计，即在编码序列之前没有***任何额外的调节信号，并且没有去除天然启动子及它的调节。代替的是，沉默了天然调节序列以便不再发生调节并且增强了基因表达。

优选的核酸构建体也有利地含有与启动子功能结合的上述增强子序列的一种或者多种，其允许核酸序列的增强表达。在DNA序列的3'端也可以***额外的有利的序列，如其他的调控元件或者终止子。在构建体中可以含有根据本发明的核酸的一个或者多个拷贝。构建体也可以含有任选地用于构建体的选择的其他的标记，如抗生素抗性或者营养缺陷型互补基因。

在启动子例如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacI^q-，T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaP_BAD)SP6-、λ-P_R-或者在λ-P_L启动子中含有合适的调节序列的实例，发现所述启动子在革兰氏阴性细菌中有利地被应用。例如在革兰氏阳性启动子ace、amy和SPO2中，在酵母或者真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中含有其他的有利的调节序列。也可以将人工启动子用于调节。

为了表达，将核酸构建体***到宿主生物中，有利地***到载体，例如质粒或者噬菌体中，所述载体允许基因在宿主中的最优表达。除了质粒和噬菌体之外，也将理解载体指的是本领域技术人员已知的所有其他的载体，例如病毒，如SV40、CMV，杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒以及线性或者环状DNA。这些载体在宿主生物中可被自主地复制或者可随染色体复制。这些载体代表本发明进一步的实施方案。

合适的质粒，例如在大肠杆菌（E.coli）中为pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI;在nocardioform actinomycetes中为pJAM2；在链霉菌属（Streptomyces）中为pIJ101、pIJ364、pIJ702或者pIJ361;在芽孢杆菌属（bacillus）中为pUB110、pC194或pBD214;在棒杆菌属（Corynebacterium）中为pSA77或pAJ667;在真菌中为pALS1、pIL2或pBB116;在酵母中为2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或者在植物中为pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004或pDH51。前述的质粒代表可能的质粒的一小部分。其他的质粒是本领域的技术人员已知的并且将例如在书籍Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等人，Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0444904018)中发现。在实验部分也提到了其他适合的质粒。

在载体的进一步的实施方案中，可将含有根据本发明的核酸构建体或者根据本发明的核酸的载体以线性DNA的形式有利地***到微生物中并且通过异源或者同源重组整合进宿主生物的基因组中。这种线性DNA可以包含线性化的载体如质粒或者仅仅包含根据本发明的核酸构建体或者核酸。

为了异源基因在生物中的最优表达，根据生物中利用的特定的密码子选择改变核酸序列是有利的。在所讨论生物的其他已知基因的计算机评估的基础上可以很容易确定密码子选择。

根据本发明的表达盒的产生是基于合适的启动子与合适的编码核苷酸序列以及终止子信号或多腺苷酸化信号的融合。例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)并且在Ausubel,F.M.等人,C urrent Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中描述了用于此目的的通常的重组和克隆技术。

将重组核酸构建体或者基因构建体有利地***到用于在合适的宿主生物中表达的宿主特异的载体中，以允许该基因在该宿主中的最优表达。本领域的技术人员已知并且例如将在Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人,Publ.Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中发现所述载体。

3.5根据本发明可以使用的宿主

取决于上下文，术语“微生物”指的是根据本发明的起始微生物（野生型）或者遗传修饰微生物或者这两种。

根据本发明，术语“野生型”指的是相应的起始微生物，并且不必相应于天然存在的生物。

通过根据本发明的载体可以产生重组微生物，其已经被用例如根据本发明的至少一种载体转化并且可被用于根据本发明的发酵生产。

有利地，将上文描述的根据本发明的重组构建体***到合适的宿主***中并且表达。优选地，使用本领域技术人员熟悉的通常的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以便确保在各自的表达***中表达所述的核酸。例如在Current Protocols inMolecular Biology,F.Ausubel等人,Publ.Wiley Interscience,New York1997,或者Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中描述了合适的***。

根据本发明的宿主生物优选地含有编码根据上文定义的酶活性的本发明中描述的核酸序列、核酸构建体或者载体中的至少一种。

3.6本发明的产物酶促生产

以溶解的或者分散的形式，例如固定化形式，以用于进行生物转化的适当的蛋白质浓度，例如10至300μg/ml或者75至125μg/ml提供至少一种还原酶的等分试样。通常在缓冲反应介质中进行该反应，所述缓冲反应介质含有合适的缓冲液，例如含有合适浓度（约0.1至100mM)的底物和辅因子(NADH)（在适当的浓度范围中，如0.1至100mM)的Tris-HCl缓冲液（例如0.01至0.1M)。可以以从0.1%至80%的体积百分比的恰当的比例添加有机共溶剂。任选地可以将底物预先溶解在有机共溶剂中并且之后将其加入到水性介质中。可以在10°C至50°C内的适合的温度下，如在25至30°C下以合适的强度搅动或者震荡反应混合物一段合适的时间。在充分的反应时间，例如1至120h或者10至24h之后可以用例如EtOAc萃取产物。技术人员已知其他合适的萃取剂。

为了辅因子再循环，可以将需要的酶，即葡糖脱氢酶的等分试样以溶解的或者分散的形式，例如固定化形式并且以合适的比例(例如1至50U/ml，或5至15U/ml，或10U/ml)与也具有合适的浓度（如0.1至100mM)的共底物（如葡萄糖）一起加入到反应混合物中以驱动再循环反应，其优选地被偶联到主要的还原酶反应。

3.7发酵产生本发明的产物

本发明也涉及用于发酵产生通式(I)的化合物的方法。

可以以分批方法或者补料分批方法或重复补料分批方法连续地或者不连续地培养根据本发明使用的重组微生物。将在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag,Stuttgart,1991))的教科书中或者在Storhas(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))的教科书中发现培养的已知方法的综述。

待使用的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的需求。在美国细菌学协会的手册"Manual of Methods for General Bacteriology"(华盛顿,美国,1981)中给出了用于多种微生物的培养基的描述。

根据本发明可以使用的这些培养基通常包含一种或者多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源是糖，如单糖、二糖或者多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。通过复杂的化合物，如糖蜜或者来自糖精制的其他副产物也可以将糖加入到培养基中。加入多种碳源的混合物也可以是有利的。其他的可能的碳源是油和脂肪如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇如甘油、甲醇或乙醇，以及有机酸如乙酸或乳酸。

氮源通常是有机或者无机氮化合物或者含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气，或者铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸，或者复杂氮源、如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏和其他的物质。可以分别地或者作为混合物使用氮源。

可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。

不但含硫的无机化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物可被用作硫源，而且有机硫化合物如硫醇和硫醇类也可被用作硫源。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐可以被用作磷源。

可将螯合剂加入到培养基中以维持溶液中的金属离子。特别适合的螯合剂包含二羟基酚如儿茶酚或者原儿茶酸，或者有机酸如柠檬酸。

根据本发明使用的发酵培养基也可以含有其他的生长因子，如维生素或者生长促进剂，所述维生素或者生长促进剂包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常来自培养基的复杂组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可以将合适的前体加入到培养基中。培养基中的化合物的精确组成强烈地取决于特定的实验并且对于每种特定的情况必须被单独确定。在教科书"Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)p.53-73,ISBN 0 19 963577 3)中可以发现培养基优化的信息。也可以从商业供应商获得生长培养基，如Standard 1(默克)或者BHI(脑心浸液,DIFCO)等。

通过加热(在2.0巴和121°C下20min)或者通过过滤除菌将培养基的所有组分灭菌。组分可以一起被灭菌，或者如果需要，被单独灭菌。可以在生长的起始存在培养基的所有组分，或者其任选地可以连续地或者通过分批补料被添加。

培养的温度通常在15°C和45°C之间，优选地25°C和40°C之间，并且在实验期间可以保持不变或者变化。培养基的pH值应当在5至8.5之间，优选地在7.0左右。在生长期间通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制用于生长的pH值。可将消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯用于控制起泡沫。为维持质粒的稳定，可将具有选择作用的合适的物质，例如抗生素加入到培养基中。将氧气或者含有氧气的气体混合物，例如环境空气补入培养物中以维持需氧条件。培养的温度通常在20°C和45°C之间。继续培养直到已经形成了最大量的希望产物。通常在10小时至160小时内达到该目标。

任选地通过高频超声，通过高压例如在弗氏压碎器中，通过渗透裂解，通过去垢剂、水解酶或者有机溶剂的作用，通过匀浆器或者通过列出的方法中的几种的组合可以破裂细胞。

3.8酶的固定

如果根据本发明要求的酶是被固定的，那么它附着到惰性载体上。本领域已知并且例如在EP-A-1149849,EP-A-1 069 183和DE-OS 100193773以及本文引用的文献参考（在载体材料方面特别附上全部）中公开合适的载体材料。用于合适的载体材料的实例是粘土，粘土矿物质如高岭土、硅藻土、珍珠岩、硅石、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉，阴离子交换材料，合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、苯酚-甲醛树脂、聚氨基甲酸酯，以及聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。为制备结合载体的酶，通常是以细粉的形式使用载体材料，其中多孔的形式是优选的。载体材料的颗粒大小通常不超过5mm，特别地不超过2mm。在全细胞制品中存在至少一种酶的情况下，所述全细胞制品可以以游离的或者固定的形式存在。合适的载体材料是例如藻酸钙或者角叉菜胶。通过戊二醛可以直接连接酶以及细胞。在本领域已知多种固定方法(例如，J.Lalonde and A.Margolin，，Immobilization of Enzymes“in K.Drauz und H.Waldmann,EnzymeCatalysis in Organic Synthesis 2002,Vol.III,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim)。

3.9产物的分离

本发明的方法可以进一步地包括回收根据本发明产生的化合物的步骤。术语“回收”包括从培养基或者反应介质提取、收获、分离或者纯化化合物。可以根据本领域已知的任一常规分离或者纯化方法进行化合物的回收，所述方法包括但不限于，用常规树脂（例如，阴离子或者阳离子交换树脂，非离子吸附树脂等）处理、用常规吸附剂（例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等）处理、改变pH、溶剂萃取（例如，用常规的溶剂如乙醇、乙酸乙酯、己烷等）、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、调节pH值、冻干等。

实验部分

除非另外指出，通过应用在基因工程、通过培养微生物发酵产生化合物以及产物的分析和分离中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品已经进行了下面的实验。也参见上文引用的Sambrook等人和Chmiel等人。

材料和方法

a)一般方法

在硅胶Merck 60(F₂₅₄)上运行TLC板，并且通过用钼-试剂[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(100g/L),在H₂SO₄(10%)中的Ce(SO₄)₂·4H₂O(4g/L)]喷雾或者通过UV(254nm)显现化合物。

分别通过GC或者HPLC分析确定转化率和对映体过量。

在装备有FID检测器的Varian 3800气相层析仪上使用H₂作为载气(14.5psi)，使用非手性固定相[用于测定转化率(Varian CP-1301,6%氰丙基-苯基相毛细管柱,30m,0.25mm,0.25μm),柱A]或者手性固定相[用于测定对映体过量(Hydrodex-β-6TBDM，经修饰的β-环糊精毛细管柱,25mx 0.25mm),柱B]进行GC分析。使用20:1的分流比，进样器和检测器的温度分别是180°C和250°C。

在装备有Chiralcel OD-H柱(柱C,0.46x 25cm)或者Chiralcel OJ柱(柱D,0.46x 25cm)的Shimadzu***上进行手性HPLC分析用于测定对映体过量。

使用Bruker AMX光谱仪在360(¹H)和90(¹³C)MHz处在CDCl₃中测量核磁共振光谱。以Hz报告了相对于TMS(δ0.00)的化学位移并且给出了偶合常数(J)。在Perkin-Elmer旋光计341中在589nm(Na-线)处在1dm比色杯中测量了旋光度值([α]_D ²⁰)并且其以[(deg x mL)/(g x dm)]的单位给出。

使用Bio-Rad微量检验法用牛血清白蛋白作为标准测定蛋白质浓度。在Mini Protein装置(Bio-Rad,海德尔堡,德国)中进行SDS-PAGE。用考马斯亮蓝染色蛋白质(Serva,海德尔堡,德国)。

b)材料

从Biocatalytix/Codexis购买NADH和NAD⁺，从Fluka获得葡萄糖并且从Jülich Chiral Solutions获得葡糖脱氢酶。

BASF(Ludwigshafen)提供了(E)-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙烯醛(1a)，(E)-3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基丙烯醛(2a)和(E)-α-甲基肉桂醛(3a)。

(E)-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙烯醛(1a):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=1.37(s,9H),2.11(s,3H),7.27(s,1H)7.48-7.53(m,4H),9.59(s,CHO);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=10.96,31.15,34.89,125.72,130.07,149.96,195.70。

(E)-3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基丙烯醛(2a):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=2.07(s,3H),6.05(s,2H),6.9-7.08(m,3H)7.16(s,1H),9.53(s,1H);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=10.95,101.62,108.65,109.62,125.81,129.44,136.58,148.09,148.88,149.75,195.40。

(E)-α-甲基肉桂醛(3a):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=2.10(s,3H),7.28(s,1H),7.39-7.56(m,5H),9.61(s,CHO);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=10.94,128.72,129.57,130.03,135.16,138.39,149.80,195.55。

c)基因克隆

如在(Sambrook J&Russell DW(2001)Molecular Cloning:aLaboratory Manual,3^rd edn.Cold Spring.Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)中描述的进行DNA，PCR和重组质粒构建的常规操作。

将番茄（Lycopersicon esculentum）OPR1的可读框克隆到pET-21a中并且将其在大肠杆菌BL21细胞中过表达为被C-末端六组氨酸标记的蛋白质(C.Breithaupt,J.Strassner,U.Breitinger,R.Huber,P.Macheroux,A.Schaller,T.Clausen,Structure,2001,9,419-429)。在Ni-NTA亲和柱(Invitrogen)上根据制造商的方案纯化过表达的重组蛋白质。过表达番茄OPR3和来自枯草芽孢杆菌的YqjM并且如最近报导的(C.Breithaupt,R.Kurzbauer,H.Lilie,A.Schaller,J.Strassner,R.Huber,P.Macheroux,T.Clausen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006,103,14337-14342;K.Kitzing,T.B.Fitzpatrick,C.Wilken,J.Sawa,G.P.Bourenkov,P.Macheroux,T.Clausen,J.Biol.Chem.2005,280,27904-27913)将所述OPR3和YqjM纯化。

根据文献(A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29;K.Saito,D.J.Thiele,M.Davio,O.Lockridge,V.Massey,J.Biol.Chem.1991,266,20720-20724;K.Stott,K.Saito,D.J.Thiele,V.Massey,J.Biol.Chem.1993,268,6097-6106;Y.S.Niino,S.Chakraborty,B.J.Brown,V.Massey,J.Biol Chem.1995,270,1983-1991)进行来自酵母的老黄同工酶（来自卡氏酵母的OYE1，来自酿酒酵母的OYE2和OYE3）和运动发酵单胞菌还原酶（NCR）的克隆，纯化和表征。

N.C.Bruce(生物系,约克大学,约克市,英国)提供了NEM-还原酶(来自大肠杆菌),PETN-还原酶(来自阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）)和***酮-还原酶(来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）M10)a)C.E.French,S.Nicklin,N.C.Bruce,J.Bacteriol.1996,178,6623-6627;b)K.Miura,Y.Tomioka,H.Suzuki,M.Yonezawa,T.Hishinuma,M.Mizugaki,Biol.Pharm.Bull.1997,20,110-112;c)C.E.French,N.C.Bruce,Biochem.J.1994,301,97-103。

实施例:通过催化氢化合成参比物质

将(E)-烯烃(1a-3a,0.5mmol)溶解在THF(10mL)中并且使用Pd/C(10%,5mg)作为催化剂将所述(E)-烯烃在大气压和室温下在H₂下氢化。室温下过夜搅拌混合物之后，通过硅藻土过滤反应混合物并且浓缩从而以99%转化率产生外消旋的参比物质(外消旋-1b-3b)。因此，获得了：

外消旋-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙醛(Lysmeral^TM,Lilial^TM,rac-1b):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=1.11-1.12(d,3H,J=6.8Hz),1.33(s,9H),2.59-2.63(m,2H),3.05-3.09(m,1H),7.11-7.13(d,2H,J=8.2),7.32-7.35(d,2H,J=8.2),9.74-9.75(d,CHO,J=1.4);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=13.30,31.37,34.39,36.16,48.02,125.41,128.67,204.62。

外消旋-c-3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-甲基丙醛(Tropional^TM,Helional^TM,外消旋-2b):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=1.09-1.11(d,3H,J=6.8),2.52-2.66(m,2H),2.99-3.04(m,1H),5.95(s,2H),6.62-6.76(m,3H)9.72(s,CHO);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=13.18,36.40,48.22,100.91,108.25,109.30,121.94,132.50,146.11,147.73,204.41。

外消旋-2-甲基-3-苯基丙醛(外消旋-3b):¹H(360MHz,CDCl₃)δ=1.10-1,12(d,3H,J=6.8Hz),2.59-2.73(m,2H),3.09-3.14(m,1H),7.18-7.34(m,5H),9.74-9.75(d,CHO,J=1.3Hz);¹³C(90MHz,CDCl₃)δ=13.21,36.65,48.04,126.42,128.53,129.02,138.83,204.39。

实施例2:用不同的肉桂醛进行的生物还原实验

路线图1.α-甲基肉桂醛衍生物1a-3a的不对称的生物还原

2.1制备实验

(1)在标准条件下用于酶的生物还原的一般方法

将酶(OPR1、OPR3、YqjM、OYE1-3、NCR、NEM-还原酶,生物转化中的蛋白质浓度:75-125μg/mL)的等分试样加入到含有底物(10mM)和辅因子NADH(10mM)的Tris-HCl缓冲液(0.8mL,50mM,pH 7.5)中。在30°C和120rpm下震荡该混合物。24h小时之后，用EtOAc(2x 0.5mL)萃取产物。在Na₂SO₄之上干燥组合的有机相并且将其分别在非手性GC上分析以测定转化率和在手性GC或者在HPLC上分析以测定对映体过量。

(2)辅因子再循环的一般方法

将酶（参见上文）的等分试样加入到含有底物(10mM)、辅因子的氧化形式(NAD⁺,100μM)、共底物(葡萄糖,20mM)和再循环酶(葡糖脱氢酶,10U)的Tris-HCl缓冲液(0.8mL,50mM,pH 7.5)中。在30°C和120rpm下震荡该混合物24h并且将其如上文描述的处理。

(3)使用有机共溶剂进行酶促生物还原的一般步骤

以20%（体积：体积）的比率使用有机共溶剂（乙醇、i-Pr₂O、叔-BuOMe、乙酸乙酯和正己烷）。将底物(10mM)溶解在有机溶剂中(200μL,用于共溶剂浓度的研究，在50–250μL的t-BuOMe中)并且加入到含有辅因子NADH(10mM)或者辅因子再循环***（参见上文）的Tris-HCl缓冲液(0.75-0.95mL,50mM,pH 7.5)中，接着加入酶（参见上文）的等分试样。在30°C和120rpm下震荡该混合物24h并且将其如上文描述的处理。

2.2分析实验

(1)确定绝对构型

通过与文献数据比较1b-3b的旋光度值([α]_D ²⁰)确定产物1b-3b的绝对构型。通过比较3c(2-甲基-3-苯基丙-1-醇)的旋光度值独立地仔细检查了3b的绝对构型，所述3c通过使用NaBH₄化学还原3b(通过使用OYE2生物还原3a取得)获得。

表2.产物的旋光度值。

^a浓度[g/100mL];^b通过使用OYE2获得;^c2-甲基-3-苯基-1-丙醇。

⁽¹⁾D.Enders,H.Dyker,Liebigs Ann.Chem.1990,1107-1110。

⁽²⁾D.Enders,M.Backes,Tetrahedron:Asymmetry 2004,15,1813-1817。

⁽³⁾A.Baeza,C.Najera,J.M.Sansano,Eur.J.Org.Chem.2007,7,1101-1112。

⁽⁴⁾M.V.Rangaishenvi,B.Singaram,H.C.Brown,J.Org.Chem.1991，56,3286-3294。

⁽⁵⁾S.D.Bull,S.G.Davies,R.L.Nicholson,H.J.Sanganee,A.D.Smith,Org.Biomol.Chem.2003,1,2886-2899。

(2)确定转化和对映体过量

分别通过GC或HPLC分析测定转化和对映体过量。

表3.通过非手性的GC分析测定转化。

^a柱:A=Varian CP-1301,6%氰丙基-苯基相毛细管柱;

^b条件:E=14.5psi H₂，在180°C,保持11分钟。

^(f)A.Scrivanti,M.Bertoldini,V.Beghetto,U.Matteoli,Tetrahedron2008,64,543-548。

表4.通过手性的GC-和HPLC-分析测定反应体过量

^a柱:B=Chiralcel OJ柱(HPLC);C=Hydrodex-β-6TBDM,修饰的β-环糊精毛细管柱(GC);D=Chiralcel OD-H柱(HPLC);^b条件:F=正庚烷/异-丙醇99:1(无梯度)在18°C,流速1mL/分钟,ε=190nm,205nm,215nm;G=14.5psi H₂在130°C,保持0分钟,以加热速率1°C/分钟加热至165°C,以加热速率20°C/分钟加热至180°C,保持7分钟;H=正庚烷/异-丙醇98:2(无梯度)在18°C,0-15分钟:流速1mL/分钟,15-20分钟:流速1.5mL/分钟,ε=205nm,235nm,285nm。

2.3结果和讨论

对-叔-丁基肉桂醛(1b)的还原产物是铃兰的嗅觉成分(Brenna,C.Fuganti,S.Serra,Tetrahedron:Asymmetry 2003,14,1-42;A.Scrivanti,M.Bertoldini,V.Beghetto,U.Matteoli,Tetrahedron 2008,64,543-548)并且其被以商标名称Lilial^TM或Lysmeral^TM上市，而间-，对-亚甲二氧基醛2b是多种香料的有效成分并且其被以Helional^TM或者Tropional^TM上市(D.Enders,M.Backes,Tetrahedron:Asymmetry 2004,15,1813-1817.C.Chapuis,D.Jacoby,Appl.Catal.A:Gen.2001,221,93-117;D.Pybus,C.Sell,The chemistry of fragrances,RSC Paperbacks,Royal Society ofChemistry,Cambridge,1999)。

使用多种烯-还原酶证实在标准条件下在pH 7.5的纯的水性缓冲液中1a的生物还原是非常慢的（没有显示数据）。然而，通过添加少量的二异丙醚(5%,体积:体积)增强了亲脂底物的溶解度，显著地提高了反应速率（表5,1-7项）。在所有酶中，YqjM和同工酶OPR1产生(R)-1b，尽管以低的对映体过量(e.e._max 21%)产生。相反，虽然OPR3,NCR和OYEs 1-3以稍微增强的立体选择性提供了(S)-1b，但是对于合成目的(e.e._max 64%)，它们仍是不足够的。因为共溶剂似乎对反应速率有强烈的影响，所以我们预期它也可能对烯-还原酶的立体选择性有影响。二异丙醚的增加量(20%,体积:体积)引起反应速率的降低，而没有显著地改变立体选择性，当用乙酸乙酯或者正己烷（20%,体积:体积，没有显示数据）替换i-Pr₂O时观察了相似的效应（被降低的速率和被轻度减少的立体选择性）。转变至水-混溶的共溶剂乙醇(20%,体积:体积)提高了OPR1,NCR和OYEs 1-3的速率(c_max 80%)同时降低了立体选择性(e.e._max 51%,8-12项)。YqjM和OPR3是勉强有活性的（没有显示数据）。最终，转变至叔-丁基甲醚提供了理想溶液：用OYEs 1-3获得了极好的立体选择性并且具有反应速率的适度降低（e.e._max>95%,13-19项)。

为调谐***，使用OYE3以叔-丁基甲醚的增加比例还原1a。从图1可以推断，在增加共溶剂的量时观察了反应速率和立体选择性的清楚的逆相关(以转化率对e.e.作图)。总的来说，20%的(体积:体积)叔-丁基甲醚的级分似乎是活性降低和立体选择性增加之间好的折衷。因此，以这种共溶剂比例进行所有进一步的研究。

在优化的条件下，全部烯还原酶(20-26项)接受了2a。与前面的观察一致，YqjM和OPR1显示了提供(R)-2b的低偏爱性。用NCR和OYEs 1-3获得了(S)-2b的极好的立体选择性(e.e._max 96%)和速率(高达全部转化)。有趣地，结构和机理紧密相关的OYE-同源物N-乙基马来酰亚胺-(NEM)-还原酶，***酮-还原酶和季戊四醇四硝酸酯-(PETN)-还原酶显示不充足的立体选择性和活性，只有NEM-还原酶提供了分别具有e.e._max 57%和e.e._max18%的(S)-1b和(S)-2b(PETN-还原酶产生具有e.e._max max 14%的(R)-3b)。

表5.生物还原产物1b-3b的转化率和对映体过量

^a YqjM=来自枯草芽孢杆菌的老黄酶同源物(a)C.E.French,S.Nicklin,N.C.Bruce,J.Bacteriol.1996,178,6623-6627;b)K.Miura,Y.Tomioka,H.Suzuki,M.Yonezawa,T.Hishinuma,M.Mizugaki,Biol.Pharm.Bull.1997,20,110-112;c)C.E.French,N.C.Bruce,Biochem.J.1994,301,97-103);OPR1和OPR3=来自番茄的12-氧代植二烯酸（12-oxophytodienoic acid）还原酶的同工酶(D.Enders,H.Dyker,LiebigsAnn.Chem.1990,1107-1110.);NCR=来自运动发酵单胞菌的烟酰胺依赖的环己酮还原酶(对于α-甲基肉桂醛的立体选择性生物还原，参见:A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29.);OYE=来自卡氏酵母的老黄酶(OYE1)和来自酿酒酵母的老黄酶(OYE2,OYE3)(D.Enders,M.Backes,Tetrahedron:Asymmetry 2004,15,1813-1817)。

通过比较使用OYE2获得的1b和2b的旋光度值与文献数据推断产物1b和2b的绝对构型(具体参见实验部分)，其被证实对于两种底物都是(S)。然而，NCR和OYEs 1-3产生(S)-1b和(S)-2b的显著的立体选择性偏好与B.Rosche等人报导的(A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29)]这些酶对相近的同系物α-甲基二氢肉桂醛(3a)的(R)偏好相冲突。根据该报导，使用NCR和OYEs 1-3生物还原3a分别提供了50%e.e.和75%e.e.的(R)-3b。为阐明这种差异，我们使用所有的烯-还原酶（27-33项）重新研究了底物3a。再一次，通过比较旋光度值与文献数据推断通过使用OYE2获得的3b的绝对构型并且证实是(S)。使用NaBH₄化学还原经生物还原获得的醛(S)-3b产生2-甲基-3-苯基-1-丙醇(3c)仔细地检查这种结果，在3c的旋光度的基础上证实3c是(S)-构型的。总的来说，3a还原的立体化学结果很好地匹配了我们前面的结果，因为底物1a-3a代表结构上的同系系列，所以可以预期：虽然YqjM和OPR1提供了具有中度的立体选择性(使用OPR1是e.e._max 53%)的(R)-3b，但是OPR3,NCR和OYE1-3以高达96%e.e.产生了主要的(S)-3b。考虑到这些结果，必须将3b的立体化学分配-报告的是(R)(对于α-甲基肉桂醛的立体选择性生物还原，参见:A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29)—校正为(S)。因此，解释OYE1-3和NCR在2-甲基戊-2-烯醛和3a之间的立体化学“转换”的对接考虑是无效的。

2.4结论

通过克隆和过表达的烯-还原酶催化的α-甲基二氢肉桂醛衍生物1a和2a的不对称生物还原开发了用于芳香醛Lilial^TM(1b)和Helional^TM(2b)的便利的化学-酶促合成法。当在含有叔-丁基甲醚(20%,体积:体积)的水性-有机两相***中进行该反应时，尽管使用YqjM和OPR1以中度的e.e.形成了(R)-1b和(R)-2b，但是使用NCR和OYEs1-3以高达96%的e.e.产生了(S)-对映体。将使用NCR和OYE1还原α-甲基肉桂醛3a的立体化学结果-以前报告的是(R)(对于α-甲基肉桂醛的立体选择性生物还原，参见:A.Müller,B.Hauer,B.Rosche,Biotechnol.Bioeng.2007,98,22-29)—明确地校正为(S)。

将本文引用的文献全部并入本文作为参考

表6:SEQ ID Nos列表

命名	生物	类型	SEQ ID NO:
				OYE1	AS	1
OYE2		AS	2
				OYE2	AS	3
OPR1		AS	4
				OPR3	AS	5
YqiM		AS	6
				NCR	AS	7

AS 氨基酸序列

NS 核酸序列

Claims

1.用于产生通式I的醛化合物的酶促催化方法

其中R¹和R²彼此独立地代表线性的或者分枝的、任选被取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₁-C₈烷氧基、C₂-C₈烯氧基；-H、-OH、-SH、-卤素、-NH₂或者-NO₂；或者R¹和R²一起代表通式–O-R⁴-O-的基团，其中R⁴代表任选地被取代的亚烷基或亚烯基；并且R³代表C₁-C₆烷基或者C₁-C₈烷氧基；

所述方法包括:

a)在水性反应介质中酶促还原通式II的化合物，

其中

R¹,R²和R³如上面定义，

所述水性反应介质包含作为共溶剂的5％至40％的体积百分比的通式III的至少一种不对称醚化合物

R⁵-O-R⁶ (III)

其中

残基R⁵和R⁶的一个是分枝的C₃-C₈烷基，另一个是C₁-C₆烷基，并且所述水性反应介质还含有至少一种还原酶和至少一种辅因子；

其中所述还原酶选自以下酶组成的组：

i)OYE1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

ii)OYE2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

iii)OYE3，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

和

b)任选地以基本上纯的立体异构体或者立体异构体的混合物的形式分离通式I的所述化合物，

其中所述反应在NADH或NADPH作为辅因子的存在下进行。

2.权利要求1的方法，其中所述共溶剂是叔-丁基C₁-C₆烷基醚。

3.权利要求1或2的方法，其中所述还原反应被偶联到辅因子再循环反应。

4.权利要求1或2的方法，其中所述还原反应被偶联到酶促辅因子再循环反应。

5.权利要求3的方法，其中氧化的辅因子NAD通过偶联到葡糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化被再循环形成葡糖酸内酯和再生NADH。

6.权利要求1或2的方法，其中所述涉及的酶以溶解的、分散的或者固定的形式存在于反应介质中。

7.权利要求1或2的方法，其中所述反应介质被缓冲到6.5至8.5的范围内的pH。

8.权利要求1或2的方法，其中所述反应温度是在10至50℃的范围内。

9.权利要求1或2的方法，其中所述反应温度是在20至40℃的范围内。