CN102850397B - 多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102850397B CN102850397B CN201110177810.0A CN201110177810A CN102850397B CN 102850397 B CN102850397 B CN 102850397B CN 201110177810 A CN201110177810 A CN 201110177810A CN 102850397 B CN102850397 B CN 102850397B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- quinazoline
- chloroethyl
- bis
- phosphoric acid
- chloro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N CCOC(c1ccccc1)=O Chemical compound CCOC(c1ccccc1)=O MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 *c1cc2ncnc(N*)c2cc1**P(N)(N(CCCl)CCCl)=O Chemical compound *c1cc2ncnc(N*)c2cc1**P(N)(N(CCCl)CCCl)=O 0.000 description 1
- BMWHMYCBWXHIKK-UHFFFAOYSA-N CC(Oc1cc2c(Nc(cc3Cl)ccc3OCc3cccc(F)c3)ncnc2cc1OC)=O Chemical compound CC(Oc1cc2c(Nc(cc3Cl)ccc3OCc3cccc(F)c3)ncnc2cc1OC)=O BMWHMYCBWXHIKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAQHUJGJYUUQSI-UHFFFAOYSA-N NP(N(CCCl)CCCl)(OCCCCOc1cc2c(Nc3cccc(Br)c3)ncnc2cc1)=O Chemical compound NP(N(CCCl)CCCl)(OCCCCOc1cc2c(Nc3cccc(Br)c3)ncnc2cc1)=O KAQHUJGJYUUQSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYNQTSZBTIOFKH-UHFFFAOYSA-N Nc(c(C(O)=O)c1)ccc1O Chemical compound Nc(c(C(O)=O)c1)ccc1O HYNQTSZBTIOFKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPUWTVVBGBQQNC-UHFFFAOYSA-N OCCCC(Nc1cc2c(Nc(cc3Cl)ccc3OCc3cccc(F)c3)ncnc2cc1)=O Chemical compound OCCCC(Nc1cc2c(Nc(cc3Cl)ccc3OCc3cccc(F)c3)ncnc2cc1)=O KPUWTVVBGBQQNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJRNXXLTDWMENM-UHFFFAOYSA-N Oc(cc12)ccc1ncnc2O Chemical compound Oc(cc12)ccc1ncnc2O QJRNXXLTDWMENM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供一类如通式I所示的多靶点抗肿瘤化合物或其药用盐，尤其涉及EGFR，HER-2和DNA多靶点抗肿瘤化合物，还提供其制备方法和在抗肿瘤药物中的应用。研究显示本发明化合物具有显著的抗肿瘤活性，一些化合物的抗肿瘤活性由于阳性对照药拉帕替尼(Lapatinib)。
Description
技术领域
本发明涉及一类多靶点抗肿瘤化合物，尤其涉及EGFR，HER-2和DNA多靶点抗肿瘤化合物，还涉及其制备方法和应用，属于药物化学领域。
背景技术
肿瘤的发生与发展是一个多因素作用、多基因参与的复杂的生物学过程，单一药物单一靶点的治疗方法往往存在着疗效不佳、毒副作用大和容易出现耐药性的问题。目前，临床治疗中经常采用多种不同作用机制的药物联合治疗，以克服上述的问题。根据这一临床经验，科学家已经设计并合成了许多具有多靶点作用机制的小分子药物，药理实验证明，这种思路是可行的。
EGFR抑制剂是近年来上市的抗肿瘤药物，治疗效果显著，但是在临床应用中，已经发现受体的T790M部位发生突变，导致耐药性的出现；而且，很多细胞同时表达EGFR和HER-2受体，使得EGFR抑制剂的治疗效果明显降低。这就要求设计能同时作用于EGFR和HER-2，且对突变型受体有效的新型抑制剂。
环磷酰胺是一种应用多年的DNA烷化剂类抗肿瘤药物，但是严重的毒副作用限制了临床上的应用。为解决这一问题，科学家们设计了众多的开环环磷酰胺衍生物、环磷酰胺季铵盐衍生物和开环环磷酰胺季铵盐衍生物，药理实验结果显示这些化合物的毒性有了明显的降低，但是抗肿瘤活性也不如环磷酰胺。
虽然已经有科学家将EGFR抑制剂和DNA烷化剂结合起来设计了一系列的双靶点药物分子，但这类化合物的抗肿瘤活性一般，且不能作用于HER-2受体。基于多靶点作用的思路，并结合本实验组多年来关于环磷酰胺季铵盐衍生物的研究基础，我们提出了新的设计思路：将EGFR/HER-2抑制剂的母体结构与磷酰氮芥通过合适的连接臂结合，以寻找既能作用于EGFR和HER-2受体，又能对DNA产生烷化作用的高效低毒的多靶点抗肿瘤药物。
发明内容
本发明基于多靶点药物设计的思路，将抗肿瘤药物EGFR/HER-2抑制剂和烷化剂环磷酰胺的结构相融合，设计、合成了一类EGFR，HER-2和DNA多靶点抗肿瘤化合物。
本发明提供如通式I所示的一类多靶点抗肿瘤化合物
其中，R1选自氢，低级烷氧基；优选自氢、甲氧基或乙氧基。
R2为选自取代或未取代的苯基，所述取代的芳基是指苯基被一个或多个卤素、低级烷氧基或芳基烷氧基取代；优选自3-溴苯基、3-氯-4-氟苯基或3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯基。
X为CH2或者CO；
Y为O或者NH；
n为选自1-10的整数，或n为0时，X和Y不存在。
在本发明中所定义的：
所述“低级烷氧基”可以是碳原子数在1-6的烷氧基或取代的烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、异丙氧基、正丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等，当为取代的烷氧基时，取代基可以是例如卤素或取代苯基等。
所述“芳基烷氧基”可以是例如苄基氧基或低级取代的苄基氧基，所述低级取代基可以是设于苯环上的一个或多个卤素、氨基或1-3个碳的烷基、烷氧基等。
所述“卤素”为氯、氟或溴。
进一步，本发明还提供通式I化合物的制备方法。
其中，当X为CH2，Y为O或n为0而X和Y不存在时，R1、R2和n如前述通式I所定义时的化合物的合成路线如图1所示：
(1)关键中间体4，6-二羟基喹唑啉和4，6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉的合成
5-羟基-2-氨基苯甲酸与甲酰胺高温合环得4，6-二羟基喹唑啉；
或，香草酸经甲基化得到3，4-二甲氧基苯甲酸甲酯，经硝化反应得到2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲酸甲酯，再进行脱甲基反应和酯基水解反应得到2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸，再制备成2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，再经过催化氢化还原硝基得到2-氨基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，再与甲酸铵和甲酰胺于150℃下反应得到4，6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉；
7位R1取代的4，6-二羟基喹唑啉的合成方法与4，6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉的合成方法类似；
(2)式I化合物的合成
7位R1取代的4，6-二羟基喹唑啉的6-OH选择性乙酰化，得到7位R1取代的6-乙酰氧基-4-羟基喹唑啉，再用与氯化亚砜反应成为7位R1取代的6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉，不经纯化直接与取代苯胺反应得到7位R1取代的4-R2取代苯氨基-6-乙酰氧基喹唑啉，然后在氨水/甲醇体系中脱乙酰基得到7位R1取代的4-R2取代苯氨基-6-羟基喹唑啉；7位R1取代的4-R2取代苯氨基-6-羟基喹唑啉直接与二氯磷酰氮芥反应，或者先与卤代醇反应，所得产物再与二氯磷酰氮芥反应，即得到式I化合物。
其中，当X为CO，Y为NH时，R1、R2和n如前述通式I所定义时的化合物的合成路线如图2所示，具体如下：
(1)苯甲酰氧基取代的羧酸的合成
1.5当量的二醇与1.0当量的苯甲酰氯反应，得到苯甲酰氧基取代的醇，再经过Jone’s试剂氧化，得到苯甲酰氧基取代的羧酸，再在SOCl2/CHCl3中回流制得苯甲酰氧基取代的酰氯，直接用于下一步反应；
(2)式I化合物的合成
4位R1取代的2-氨基苯甲酸和甲酰胺在高温下合环得到7位R1取代的4，6-二羟基喹唑啉，进一步硝化反应得到7位R1取代的6-硝基-4-羟基喹唑啉，再用氯化亚砜转变为7位R1取代的6-硝基-4-氯喹唑啉，不经纯化直接与取代苯胺反应得到7位R1取代的4-R2取代苯氨基-6-硝基喹唑啉，进一步用锡粉-盐酸还原硝基得到7位R1取代的4-R2取代苯氨基-6-氨基喹唑啉；再与上述苯甲酰氧基取代的酰氯反应，所得产物不经分离，直接在氢氧化钠/甲醇/水体系中脱除苯甲酰基得到4-R2取代苯氨基-6-羟基取代的酰氨基喹唑啉，再在氢化钠作用下，与二氯磷酰氮芥反应得到式I化合物。
本发明的合成方法还包括将得到的通式(I)产物进一步与相应的酸反应制成药用盐，例如对甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，盐酸盐或马来酸盐等。
本发明进一步提供了所述多靶点抗肿瘤化合物的药物组合物，其中含有治疗有效量的所述化合物或其药用盐，以及一种或多种药学上可接受的载体，可将化合物本身或其药用盐与可药用赋形剂、稀释剂等的混合物以片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形式非口服给药。该药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的本发明的多靶点抗肿瘤化合物或其药用盐作为活性成分，更优选含有重量比为0.5％-99.5％的活性成分。
上述制剂可通过常规制药方法制备。可用的药用辅剂的例子包括赋形剂(例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠；***胶；右旋糖酐；硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钙；硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、粘合剂(例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇)、崩解剂(例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮)、润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡、硼酸、苯甲酸钠、亮氨酸)、稳定剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、矫味剂(例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等)、稀释剂和注射液用溶剂(例如水、乙醇和甘油等)。
本发明还提供了所述化合物或其药用盐在抗肿瘤方面的应用，研究显示其具有显著的抗肿瘤活性，其中一些化合物对HCT116，MDA-MB-468和SK-BR-3三种肿瘤细胞株生长的抑制作用优于阳性对照药物拉帕替尼。初步作用机制研究结果表明：该类化合物既对EGFR/HER-2有抑制活性，又有DNA烷化作用，属于不可逆性抑制剂。
附图说明
图1为本发明通式I化合物的合成路线1。
图2为本发明通式I化合物的合成路线2。
图3为本发明化合物EMB-3的EGFR磷酸化实验(p-EGFR：磷酸化的EGFR)结果图。
图4为本发明化合物EMB-3对DNA的损伤作用(a.p＜0.05，versus control)结果图。
图5为本发明化合物EMB-3对细胞周期的影响结果图。
缩略表
具体实施方式
实施例1：4-(3-溴苯胺基)喹唑啉酚N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-1)的制备
1a：4，6-二羟基喹唑啉的制备
将5-羟基-2-氨基苯甲酸(21.44g，140mmol)加到22mL甲酰胺中，150℃下反应0.5h，待冷却后，加入200mL水，搅拌1h，析出大量白色固体，抽滤，水洗，烘干，得14.40g，产率63％。mp＞300℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.25(s，1H)，7.40(s，1H)，7.52(s，1H)，7.90(s，1H)，10.07(s，1H)，12.03(s，1H).
1b：6-乙酰氧基-4-羟基-喹唑啉的制备
将4，6-二羟基喹唑啉(23.55g，145.24mmol)和27mL吡啶加到220mL乙酸酐中，100℃下反应2h，待冷却后，倒入碎冰中，析出大量固体，抽滤，烘干，得白色固体22.40g，产率76％。mp＞300℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ2.32(s，3H)，7.60(dd，J＝2.7，8.7Hz，1H)，7.73(d，J＝8.7Hz，1H)，7.83(d，J＝2.7Hz，1H)，8.11(s，1H)，12.35(s，1H).
1c：4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基喹唑啉的制备
将6-乙酰氧基-4-羟基-喹唑啉(0.62g，3mmol)和DMF(0.1mL)加到10mL二氯亚砜中，回流应6h。减压蒸去氯化亚砜，再以氯仿(10mL×3)旋蒸带走残留的氯化亚砜，得到黄色固体。加入20mL异丙醇，3-溴苯胺(0.62g，3.6mmol)和三乙胺(0.36g，3.6mmol)，室温下搅拌6h，再回流3h使反应完全，冷却，抽滤，依次以异丙醇、水和***洗，烘干，得淡黄色固体，0.74g，产率69％。mp 238-239℃
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ2.40(s，3H)，7.44-7.54(m，2H)，7.78(d，J＝7.5Hz，1H)，7.93-8.09(m，3H)，8.67(s，1H)，8.99(s，1H)，11.39(s，1H).
1d：4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉的制备
将4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基喹唑啉(1.40g，3.91mmol)和浓氨水8mL加到30mL甲醇中，室温反应2h，蒸去溶剂，加入30mL水，搅拌10min，抽滤，水洗，烘干，得1.16g，产率94％。mp＞300℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.28-7.37(m，1H)，7.46(d，J＝9.0Hz，1H)，7.71(d，J＝9.0Hz，1H)，7.80(s，1H)，8.27(s，1H)，8.52(s，1H)，9.60(s，1H)，10.11(s，1H).
1e：4-(3-溴苯胺基)喹唑啉酚N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯的制备
将4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉(0.32g，1mmol)置于100mL三口瓶中，N2保护，加入40mL无水四氢呋喃，于0℃下滴加正丁基锂(0.63mL，1.6M的正己烷溶液)，反应1h后，将此反应液滴加到置于0℃下的二氯磷酰氮芥(0.31g，1.2mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液中并反应3h，再通氨气30min。往反应体系加入25mL饱和食盐水，调PH至中性，分液，水层再以乙酸乙酯萃取(25mL×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(E→E∶MeOH＝25∶1)分离得到白色固体，0.22g，产率42％。mp 200-202℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.41-3.46(m，4H)，3.66-3.71(m，4H)，7.32-7.40(m，2H)，7.85-7.91(m，3H)，8.21(s，1H)，8.27(s，1H)，8.64(s，1H)，
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ42.44，48.92(d，JP-C＝4.0Hz)，113.28，115.59，120.87，121.33，124.35，126.25，127.86，129.44，130.49，140.83，146.83，149.02(d，JP-C＝7.0Hz)，153.62，157.25.
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ15.59.
Anal.Cald for C18H19BrCl2N5O2P：C，41.64；H，3.69；N，13.49；Found：C，41.70；H，3.83；N，13.53.
实施例2：2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)乙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-2)的制备
2a：4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙氧基)喹唑啉的制备
将4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉(0.32g，1.00mmol)，2-氯乙醇(0.10g，1.25mmol)，碳酸钾(0.28g，2.00mmol)和碘化钾(0.017g，0.10mmol)加到10mL乙腈中，回流12h，减压蒸去溶剂，加入20mL水，以乙酸乙酯萃取(30mL×2)，合并有机相，饱和食盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(P∶E＝1∶2→1∶5)分离得到淡黄色固体0.22g，产率60％。mp 213-215℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ3.57(br s，1H)，3.85(t，J＝4.8Hz，2H)，4.21(t，J＝4.8Hz，2H)，7.30-7.43(m，2H)，7.54(dd，J＝2.4，9.0Hz，1H)，7.79(d，J＝9.0Hz，1H)，7.92-7.94(m，2H)，8.21(s，1H)，8.57(s，1H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ59.52，70.41，102.80，115.74，120.81，121.36，124.25，124.86，126.10，129.62，130.56，141.05，145.17，152.22，156.72，157.08.
Anal.Calcd for C16H14BrN3O2：C，53.35；H，3.92；N，11.67.Found：C，53.36；H，3.95；N，11.69.
2b：2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)乙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯的制备
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙氧基)喹唑啉。产率37％。mp 143-144℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.07(br s，2H)，3.38-3.64(m，8H)，4.20-4.47(m，4H)，7.22-7.25(m，2H)，7.35(d，J＝2.0，8.8Hz，1H)，7.79(d，J＝9.2Hz，1H)，7.98-8.01(m，2H)，8.25(s，1H)，8.70(s，1H)，9.08(br s，1H)
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ42.54，48.93(d，JP-C＝4.0Hz)，62.87(d，JP-C＝4.0Hz)，68.05(d，JP-C＝7.0Hz)，102.98，115.67，120.73，121.34，124.20，124.71，126.08，129.55，130.49，140.98，145.10，152.26，156.55，156.75
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ18.68.
Anal.Cald for C20H23BrCl2N5O3P：C，42.65；H，4.12；N，12.43；Found：C，42.67；H，4.16；N，12.45.
实施例3：3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-3)的制备
3a：4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)喹唑啉的制备
制备方法同实施例2a，其中2a的2-氯乙醇替换为3-氯丙醇。产率60％。mp 184-186℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.94-2.02(m，2H)，3.62-3.68(m，2H)，4.24(t，J＝6.3Hz，2H)，4.68(t，J＝5.1Hz，1H)，7.30-7.40(m，2H)，7.52(dd，J＝2.4，9.0Hz，1H)，7.75(d，J＝9.0Hz，1H)，7.93-7.94(m，1H)，8.20(t，J＝1.8Hz 1H)，8.57(s，1H)，9.70(s，1H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ32.13，57.31，65.63，102.81，115.77，120.80，121.36，124.26，124.73，126.05，129.56，130.52，141.08，145.12，152.16，156.71，157.12.
Anal.Calcd for C17H16BrN3O2：C，54.56；H，4.31；N，11.23.Found：C，54.63；H，4.37；N，11.41.
3b：3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯的制备
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)喹唑啉。产率30.71％。mp 158-159℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.12-2.18(m，2H)，3.26-3.33(m，4H)，3.65(t，J＝7.2Hz，4H)，4.03-4.08(m，2H)，4.28(t，J＝5.6Hz，2H)，7.32(d，J＝7.6Hz，1H)，7.38(t，J＝8.0Hz，1H)，7.55(d，J＝8.8Hz，1H)，7.77(d，J＝9.2Hz，1H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H)，7.96(s，1H)，8.21(s，1H)，8.56(s，1H)，
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ29.85(d，JP-C＝7.0Hz)，42.56，48.86(d，JP-C＝4.0Hz)，61.28(d，JP-C＝5.0Hz)，65.05，103.10，115.76，120.80，121.32，124.25，124.67，126.07，129.61，130.52，141.04，145.18，152.22，156.75，156.87
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ18.12.
Anal.Cald for C21H25BrCl2N5O3P：C，43.70；H，4.37；N，12.13；Found：C，43.51；H，4.65；N，11.84.
实施例4：4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-4)的制备
4a：4-(3-溴苯氨基)-6-(4-羟基丁氧基)喹唑啉的制备
制备方法同实施例2a，其中2a的2-氯乙醇替换为4-氯丁醇。产率68％。mp 202-204℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.60-1.69(m，2H)，1.82-1.91(m，2H)，3.48-3.53(m，2H)，4.18(t，J＝6.0Hz，2H)，4.50(t，J＝4.8Hz，1H)，7.29-7.40(m，2H)，7.52(d，J＝9.0Hz，1H)，7.75(d，J＝9.0Hz，1H)，7.91-7.94(m，2H)，8.20(s，1H)，8.56(s，1H)，9.65(s，1H).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ25.50，29.05，60.42，68.43，102.92，115.76，120.79，121.32，124.24，124.62，126.04，129.56，130.50，141.04，145.07，152.13，156.69，157.06
Anal.Calcd for C18H18BrN3O2：C，55.68；H，4.67；N，10.82.Found：C，55.68；H，4.77；N，10.84.
4b：4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯的制备
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(4-羟基丁氧基)喹唑啉。产率36％。mp 70-71℃
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.80-1.93(m，4H)，3.13(s，2H)，3.39-3.45(m，4H)，3.59(t，J＝6.4Hz，4H)，3.97-4.12(m，4H)，7.18-7.22(m，2H)，7.33(dd，J＝2.0，4.8Hz，1H)，7.72-7.77(m，2H)，7.84-7.85(m，1H)，8.03(s，1H)，8.64(s，1H)，9.40(br s，1H)
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ24.79，26.70(d，JP-C＝7.0Hz)，42.26，48.73(d，JP-C＝5.0Hz)，64.69(d，JP-C＝4.0Hz)，67.63，102.72，116.05，120.88，121.94，124.53，125.03，126.62，129.10，129.81，140.49，144.85，152.36，156.84，157.28
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ17.98.
Anal.Cald for C22H27BrCl2N5O3P：C，44.69；H，4.60；N，11.84；Found：C，44.63；H，4.72；N，11.68.
实施例5：3-(6-(4-(3-溴苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-5)的制备
5a：3，4-二甲氧基苯甲酸甲酯
将香草酸(3.36g，20mmol)，碘甲烷(5mL，100mmol)和碳酸钾(6.91g，50mmol)加到50mL丙酮中，回流9h，抽滤，丙酮洗，母液浓缩后以闪柱(P∶E＝8∶1)分离得到白色固体，2.65g，产率67％.mp 56-57℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.90(s，3H)，3.93(s，3H)，3.94(s，3H)，6.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.55(d，J＝2.0Hz，1H)，7.69(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H).
5b：2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲酸甲酯
将3，4-二甲氧基苯甲酸甲酯(0.98g，5mmol)溶于CHCl3(25mL)中，0℃下滴加浓硝酸和浓硫酸的混酸(1mL∶1mL)，然后自然升至室温并反应1h，再以水洗(25mL)，水层以CHCl3(25mL)萃取；合并有机相，饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，析出固体，抽滤得淡黄色固体，0.87g；母液浓缩后以乙酸乙酯-石油醚重结晶得0.17g。共计1.04g，产率86％。mp144-145℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.92(s，3H)，3.98(s，3H)，3.99(s，3H)，7.09(s，1H)，7.46(s，1H).
5c：2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸
将NaOH(1.22g)溶于水中(5mL)，加入2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲酸甲酯(0.96g)，回流17h。冷却，以浓盐酸调PH至1～2使析出大量黄色固体，抽滤，水洗至中性，烘干，得黄色固体0.74g，产率87％。mp 182-184℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.03(s，3H)，6.14(br s，1H)，7.27(s，1H)，7.48(s，1H).
5d：2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯
0℃下将1mL氯化亚砜滴加到50mL甲醇中，搅拌5min后，加入2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸(0.64g，3mmol)，50℃下反应12h，蒸干溶剂，以闪柱(P∶E＝3∶2)分离得到淡黄色固体0.50g，产率73％。mp 150-151℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.80(s，3H)，3.91(s，3H)，7.07(s，1H)，7.62(s，1H)，10.94(br s，1H).
5e：2-氨基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯
将2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(0.70g，3.08mmol)和0.07g钯碳(10％)加到10mL乙酸乙酯中，4atm下催化氢化12h，抽滤，浓缩，闪柱(P∶E＝3∶1→2∶1)分离得到白色固体0.57g，产率94％。mp 158-159℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.71(s，3H)，3.74(s，3H)，6.24(br s，2H)，6.31(s，1H)，7.08(s，1H)，8.30(s，1H).
5f：4，6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉
将2-氨基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(2.0g，10mmol)和甲酸铵(0.95g，15mmol)加到8mL甲酰胺中，150℃下反应4h，冷却，加入50mL水，搅拌30min，抽滤，水洗，烘干，得淡黄色固体1.50g，产率77％。mp 296-298℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ3.90(s，3H)，7.10(s，1H)，7.38(s，1H)，7.91(s，1H)，9.82(br s，1H)，11.95(br s，1H).
5g：6-乙酰氧基-7-甲氧基-4-羟基-喹唑啉
制备方法同实施例1b，其中1b的4，6-二羟基喹唑啉替换为4，6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉。产率87％。mp 290-292℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.30(s，3H)，3.92(s，3H)，7.28(s，1H)，7.75(s，1H)，8.08(s，1H)，12.21(br s，1H).
5h：4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例1c，其中1c的6-乙酰氧基-4-羟基喹唑啉替换为6-乙酰氧基-7-甲氧基-4-羟基喹唑啉。产率48％。mp 180-182℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.39(s，3H)，4.01(s，3H)，7.42-7.48(m，3H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)，8.07(s，1H)，8.66-8.69(m，1H)，8.94(s，1H)，11.19(br s，1H).
5i：4-(3-溴苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例1d，其中1d的4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉。产率79％。mp 280-282℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.98(s，3H)，7.22-7.34(m，3H)，7.81(s，1H)，7.90(d，J＝7.6Hz，1H)，8.25(s，1H)，8.50(s，1H)，9.44(s，1H)，9.50(br s，1H).
5j：4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例2a，其中2a的2-氯乙醇替换为3-氯丙醇，4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉。产率78％。mp251-253℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.96-2.02(m，2H)，3.61-3.66(m，2H)，3.95(s，3H)，4.23(t，J＝6.4Hz，2H)，4.61(t，J＝4.8Hz，1H)，7.21-7.37(m，3H)，7.85(s，1H)，7.88(d，J＝8.4Hz，1H)，8.15(s，1H)，8.52(s，1H)，9.53(br s，1H)。
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ32.10，55.94，57.37，66.05，102.38，107.21，109.03，120.63，121.33，124.08，125.71，130.45，141.32，147.00，148.59，152.66，154.58，156.00。
Anal.Calcd for C18H18BrN3O3：C，53.48；H，4.49；N，10.39.Found：C，53.31；H，4.62；N，10.09.
5k：3-(6-(4-(3-溴苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉。产率30％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.20-2.33(m，2H)，3.09(d，J＝4.8Hz，2H)，3.42-3.49(m，4H)，3.62(t，J＝6.0Hz，4H)，3.96(s，3H)，4.17-4.37(m，4H)，7.18-7.21(m，3H)，7.89-7.92(m，2H)，8.04(s，1H)，8.63(s，1H)，9.27(s，1H).
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ29.46(d，JP-C＝5.0Hz)，42.39，48.76(d，JP-C＝5.0Hz)，56.03，62.93(d，JP-C＝6.0Hz)，67.00，105.14，107.54，109.70，120.40，122.04，124.58，126.18，129.93，141.07，147.60，148.08，153.65，155.20，156.83.
31P NMR(122MHz，CDCl3)：δ16.07.
Anal.Calcd for C22H27BrCl2N5O4P：C，43.51；H，4.48；N，11.53.Found：C，43.24；H，4.34；N，11.62.
实施例6：3-(6-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-6)的制备
6a：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉的制备
制备方法同实施例1c，其中1c的6-乙酰氧基-4-羟基喹唑啉替换为6-乙酰氧基-7-甲氧基-4-羟基喹唑啉，3-溴苯胺替换为3-氯-4-氟苯胺。产率78％。mp184-186℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.39(s，3H)，4.01(s，3H)，7.46(s，1H)，7.54(t，J＝8.8Hz，1H)，7.71-7.75(m，1H)，8.07(dd，J＝2.4，6.8Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.91(s，1H)，8.94(s，1H)，11.12(br s，1H).
6b：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉的制备
制备方法同实施例1d，其中1d的4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉。产率85％。mp 285-288℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.98(s，3H)，7.22(s，1H)，7.41(t，J＝9.2Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.82-7.86(m，1H)，8.21(dd，J＝2.4，6.8Hz，1H)，8.48(s，1H)，9.46(s，1H)，9.67(s，1H).
6c：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例2a，其中2a的2-氯乙醇替换为3-氯丙醇，4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉。产率91％。mp 280-282℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.95-2.03(m，2H)，3.61-3.65(m，2H)，3.94(s，3H)，4.23(t，J＝6.0Hz，2H)，4.62(t，J＝4.8Hz，1H)，7.21(s，1H)，7.44(t，J＝8.8Hz，1H)，7.78-7.83(m，2H)，8.12(dd，J＝2.4，6.8Hz，1H)，8.50(s，1H)，9.56(s，1H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ32.07，55.96，57.34，66.05，102.39，107.23，108.86，116.61(2JF-C＝21Hz)，118.91(2JF-C＝17.9Hz)，122.34(3JF-C＝6.8Hz)，123.50，136.84，146.92，148.58，152.66，153.27(1JF-C＝240Hz)，154.59，156.05.
Anal.Calcd for C18H17ClFN3O3：C，57.22；H，4.54；N，11.12.Found：C，56.97；H，4.70；N，10.95.
6d：3-(6-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉。产率46％。mp 150-152℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.19-2.29(m，2H)，3.19(d，J＝4.4Hz，2H)，3.39-3.50(m，4H)，3.61(t，J＝6.0Hz，4H)，3.93(s，3H)，4.16-4.36(m，4H)，7.09(t，J＝8.8Hz，1H)，7.15(s，1H)，7.72-7.76(m，1H)，7.84(s，1H)，7.96(dd，J＝2.4，6.4Hz，1H)，8.59(s，1H)，9.03(br s，1H).
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ29.45(d，JP-C＝4.0Hz)，42.27，48.65(d，JP-C＝5.0Hz)，56.00，62.89(d，JP-C＝5.0Hz)，66.98，105.10，107.43，109.47，116.12(2JF-C＝22Hz)，120.30(2JF-C＝19Hz)，121.84(3JF-C＝6Hz)，124.02，136.26(3JF-C＝3Hz)，147.42，148.08，153.57，154.24(1JF-C＝244Hz)，155.19，156.86.
31P NMR(122MHz，CDCl3)：δ15.79.
Anal.Calcd for C22H26C13FN5O4P：C，45.49；H，4.51；N，12.06.Found：C，45.72；H，4.64；N，11.89.
实施例7：3-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMA-7)的制备
7a：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例1c，其中1c的6-乙酰氧基-4-羟基喹唑啉替换为6-乙酰氧基-7-甲氧基-4-羟基喹唑啉，3-溴苯胺替换为3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺。产率为52％。mp 194-196℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.37(s，3H)，3.95(s，3H)，5.25(s，2H)，7.17-7.21(m，1H)，7.25-7.34(m，4H)，7.45-7.51(m，1H)，7.72(dd，J＝2.8，5.2Hz，1H)，8.04(d，J＝2.8Hz，1H)，8.28(s，1H)，8.56(s，1H).
7b：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例1d，其中1d的4-(3-溴苯氨基)-6-乙酰氧基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉。产率86％.mp239-241℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.97(s，3H)，5.24(s，2H)，7.16-7.25(m，3H)，7.30-7.34(m，2H)，7.45-7.50(m，1H)，7.73(dd，J＝2.4，8.8Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.04(d，J＝2.4Hz，1H)，8.43(s，1H)
7c：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉
制备方法同实施例2a，其中2a的2-氯乙醇替换为3-氯丙醇，4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉。产率83％。mp 212-213℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.97-2.03(m，2H)，3.65(t，J＝6.0Hz，2H)，3.94(s，3H)，4.22(t，J＝6.4Hz，2H)，5.25(s，2H)，7.18-7.35(m，5H)，7.45-7.51(m，1H)，7.72(dd，J＝2.4，8.8Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.97(d，J＝2.4Hz，1H)，8.45(s，1H).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ32.08，55.91，57.36，66.03，69.54，102.48，107.19，108.80，114.14(2JF-C＝22Hz)，114.43，114.82(2JF-C＝21Hz)，121.19，122.19，123.45(4JF-C＝3Hz)，124.02，130.68(3JF-C＝8Hz)，133.55，139.79(3JF-C＝7Hz)，146.73，148.45，149.51，152.84，154.46，156.24，162.33(1JF-C＝242Hz).
Anal.Calcd for C25H23ClFN3O4：C，62.05；H，4.79；N，8.68.Found：C，61.79；H，4.77；N，8.65.
7d：3-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例1e，其中1e的4-(3-溴苯氨基)-6-羟基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-(3-羟基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉。产率29％。mp137-138℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.19-2.25(m，2H)，3.20(d，J＝4.8Hz，2H)，3.38-3.45(m，4H)，3.57(t，J＝6.4Hz，4H)，3.91(s，3H)，4.13-4.33(m，4H)，6.88(d，J＝8.8Hz，1H)，6.98-7.02(m，1H)，7.14-7.22(m，3H)，7.31-7.36(m，1H)，7.65(d，J＝2.4，8.8Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.85(d，J＝2.8Hz，1H)，8.57(s，1H)，9.21(s，1H).
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ29.46(d，JP-C＝5.0Hz)，42.32，48.74(d，JP-C＝5.0Hz)，55.96，62.84(d，JP-C＝6.0Hz)，66.77，70.35，104.77，107.40，109.45，113.90(2JF-C＝22Hz)，114.24，114.75(2JF-C＝21Hz)，121.87，122.41(4JF-C＝2Hz)，122.90，124.57，130.06(3JF-C＝8Hz)，133.67，139.22(3JF-C＝8Hz)，147.27，147.96，150.20，153.71，154.99，157.00，162.91(1JF-C＝245Hz).
31P NMR(122MHz，CDCl3)：δ15.75.
Anal.Calcd for C29H32Cl3FN5O5P：C，50.71；H，4.70；N，10.20.Found：C，50.56；H，4.88；N，9.97.
实施例8：2-氧代-2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)乙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMB-1)的制备
8a：2-苯甲酰氧基乙醇
将乙二醇(4.65g，75mmol)溶于CHCl3(50mL)中，搅拌下加入Na2CO3(5.30g，50mmol)，再滴加苯甲酰氯(7.03g，50mmol)，然后回流10h。冷却，加入100mL水，振摇后分液，水层以CHCl3萃取(30mL×2)；合并有机相，以饱和食盐水洗(50mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(硅胶，P∶E＝10∶1→2∶1)分离得无色油状物6.30g，产率为76％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.13(t，J＝5.4Hz，1H)，3.94-3.99(m，2H)，4.47(t，J＝4.5Hz，1H)，7.43-7.61(m，3H)，8.05-8.08(m，2H).
8b：2-苯甲酰氧基乙酸
将16.9mL浓硫酸溶于200mL水中，冰水浴下加入CrO3(14.30g，143mmol)，搅拌使溶解，然后缓慢滴加2-苯甲酰氧基乙醇(6.30g，37.91mmol)的丙酮溶液(80mL)。滴加完毕后，升至室温反应2h，然后加入100mL水，以乙酸乙酯萃取(50mL×3)；合并有机相，饱和食盐水洗至中性，然后以NaOH溶液碱化至pH＝7～8，以水萃取(70mL×2)；合并水层，酸化至pH＝3～4，以乙酸乙酯萃取(50mL×3)；合并乙酸乙酯层，以饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(硅胶，P∶E∶HOAc＝4mL∶1mL∶2drops)分离得到白色固体，2.40g，产率为35％。mp 111-112℃。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.91(s，2H)，7.43-7.63(m，3H)，8.07-8.11(m，2H)，10.15(br s，1H)。
8c：4-羟基喹唑啉
将邻氨基苯甲酸(6.86g，50mmol)加到10mL甲酰胺中，150℃下反应6h，冷却，加入100mL水，搅拌1h，析出大量白色固体，抽滤，水洗，烘干，得3.93g，产率53％.mp 214-216℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.52(t，J＝7.6Hz，1H)，7.67(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82(t，J＝7.6Hz，1H)，8.09(s，1H)，8.12(d，J＝8.0Hz，1H)，12.22(br s，1H).
8d：4-羟基-6-硝基喹唑啉
0℃下将4-羟基喹唑啉(3.93g，26.89mmol)加到8mL浓硫酸和8mL浓硝酸配成的混酸中，搅拌下加入，然后于90-95℃下反应1h，冷却，倒入冰水中，析出大量黄色固体，抽滤，水洗，烘干，得4.41g，产率85％。mp 275-277℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.87(d，J＝8.8Hz，1H)，8.32(s，1H)，8.55(dd，J＝2.4，8.8Hz，1H)，8.81(d，J＝2.4Hz，1H)，12.75(br s，1H).
8e：4-(3-溴苯氨基)-6-硝基喹唑啉
将4-羟基-6-硝基喹唑啉(4.4g，23mmol)加到SOCl2(30mL)中，加入0.1mL DMF，回流至澄清，减压蒸去SOCl2，加入i-PrOH(140mL)，间溴苯胺(3.96g，23mol)和三乙胺(2.33g，23mmol)，回流6h。冷却，析出黄色固体，抽滤，依次以异丙醇，水和***洗，烘干，得黄色固体5.88g，产率为74％。mp 268-269℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.36-7.43(m，2H)，7.90-7.97(m，2H)，8.20(s，1H)，8.57(dd，J＝1.2，9.0Hz，1H)，8.78(s，1H)，9.65(s，1H)，10.48(s，1H)
8f：4-(3-溴苯氨基)-6-氨基喹唑啉
将锡粉(5.07g，42.75mmol)加到22mL浓盐酸中，搅拌下加入4-(3-溴苯氨基)-6-硝基喹唑啉(2.95g，8.55mmol)，反应过夜，加入200mL水和200mL乙酸乙酯，剧烈搅拌下以氢氧化钠调节PH至8-9，水层再以100mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得产物2.52g，产率94％。mp 263-265℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ5.64(br s，2H)，7.22-7.35(m，4H)，7.56(d，J＝9.0Hz，1H)，7.90(d，J＝8.4Hz，1H)，8.24(t，J＝1.8Hz，1H)，8.39(s，1H)，9.46(br s，1H).
8g：4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉
将2-苯甲酰氧基乙酸(0.91g，5mmol)溶于15mL氯仿中，0℃下滴加SOCl2(2mL)，再回流4h。减压蒸去CHCl3和SOCl2，加入THF(10mL)配成溶液，滴加到4-(3-溴苯氨基)-6-氨基喹唑啉(1.58g，5mmol)和Na2CO3(0.53g，5mmol)的THF混悬液(50mL)中，室温反应12h。蒸去THF，加入甲醇(50mL)，水(10mL)和NaOH(0.80g，20mmol)，搅拌至体系成为澄清溶液；减压蒸干，加入50mL水，以乙酸乙酯萃取(30mL×2)，饱和食盐水洗(30mL×2)，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，闪柱(硅胶，P∶E＝1∶6→E)分离得黄色固体，1.75g，产率为93.78％。mp 232-234℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ4.09(d，J＝5.7Hz，2H)，5.86(t，J＝5.7Hz，1H)，7.28-7.38(m，2H)，7.80(d，J＝9.0Hz，1H)，7.88(d，J＝7.8Hz，1H)，8.08(dd，J＝1.8，9.0Hz，1H)，8.18(d，J＝1.8Hz，1H)，8.59(s，1H)，8.71(s，1H)，9.85(s，1H)，9.93(s，1H)
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ61.88，112.46，115.41，120.83，121.37，124.28，126.11，127.60，128.49，130.54，136.22，141.10，146.77，153.33，157.31，171.29
Anal.Cald for C16H13BrN4O2：C，51.49；H，3.51；N，15.01；Found：C，51.44；H，3.60；N，14.75.
8h：2-氧代-2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)乙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
将4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉(0.38g，1mmol)置于100mL三口瓶中，N2保护，加入40mL无水四氢呋喃，于0℃下加入NaH(0.048g，1.2mmol，60％的矿物油分散体系)，0℃下反应1h后将此反应液滴加到置于0℃下的二氯磷酰氮芥(0.31g，1.2mmol)的四氢呋喃溶液中(10mL)，0℃下反应3h，再通氨气30min。往反应体系加入50mL饱和食盐水，调PH至中性，分液，水层再以乙酸乙酯萃取(50mL×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(E→E∶CH3OH＝15∶1→8∶1)分离得到淡黄色泡状固体，0.17g，产率18％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.52(d，J＝5.4Hz，2H)，3.54-3.61(m，4H)，3.72(t，J＝5.7Hz，4H)，4.72-4.93(m，2H)，7.11-7.21(m，2H)，7.56-7.61(m，3H)，7.85(s，1H)，7.96(br s，1H)，8.27(s，1H)，8.59(s，1H)，9.32(br s，1H).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ42.32，48.13(d，JP-C＝4.0Hz)，64.61(d，JP-C＝3.0Hz)，112.76，115.46，120.88，121.31，124.38，126.08，127.43，128.44，130.33，135.83，141.01，146.70，153.31，157.30，166.18
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ10.94.
HRMS(ESI+)m/z calcd for C20H22BrCl2N6O3P(M+H)+，574.00514，found574.00532
实施例9：3-氧代-3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMB-2)的制备
9a：3-苯甲酰氧基丙醇
制备方法同实施例8a，其中8a的乙二醇替换为1，3-丙二醇。产率为72％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.94(br s，1H)，1.98-2.06(m，2H)，3.78(t，J＝6.0Hz，2H)，4.50(t，J＝6.0Hz，2H)，7.42-7.47(m，2H)，7.55-7.60(m，1H)，8.03-8.06(m，2H)。
9b：3-苯甲酰氧基丙酸
制备方法同实施例8b，其中8b的2-苯甲酰氧基乙醇替换为3-苯甲酰氧基丙醇。产率为68％。mp 66-68℃。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.83(t，J＝6.3Hz，2H)，4.58(t，J＝6.3Hz，2H)，7.40-7.59(m，3H)，8.00-8.07(m，2H)，9.73(br s，1H)。
9c：4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙酰氨基)喹唑啉
制备方法同实施例8g，其中8g的2-苯甲酰氧基乙酸替换为3-苯甲酰氧基丙酸。产率为51％。mp 216-218℃。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ2.56(t，J＝6.3Hz，2H)，3.74-3.80(m，2H)，4.75(t，J＝5.1Hz，1H)，7.27-7.37(m，2H)，7.77-7.89(m，3H)，8.17(s，1H)，8.57(s，1H)，8.73(d，J＝1.8Hz，1H)，9.93(s，1H)，10.26(s，1H).
13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ40.96，59.20，112.56，116.86，122.26，123.12，126.44，128.21，128.30，128.85，131.26，138.36，141.83，147.40，154.53，159.48，172.86
Anal.Cald for C17H15BrN4O2：C，52.73；H，3.90；N，14.47；Found：C，52.48；H，4.03；N，14.28.
9d：3-氧代-3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丙醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例8h，其中8h的4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(3-羟基丙酰氨基)喹唑啉。产率33％。mp 148-150℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.52(d，J＝5.4Hz，2H)，3.14-3.44(m，10H)，4.48-4.66(m，2H)，7.30-7.38(m，2H)，7.75(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.90(s，1H)，8.19(t，J＝2.0Hz，1H)，8.51(s，1H)，8.69(s，1H)
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ34.12，41.99，48.23(d，JP-C＝4.0Hz)，62.22(d，JP-C＝5.0Hz)，115.25，121.05，121.35，124.26，124.54，126.52，128.94，130.60，132.57，134.87，140.65，149.40，155.19，157.56，170.91(d，JP-C＝5.0Hz)
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ7.33.
HRMS(ESI+)m/z calcd for C21H24BrCl2N6O3P(M+H)+，588.02079，found588.02092.
实施例10：4-氧代-4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMB-3)的制备
10a：4-苯甲酰氧基丁醇
制备方法同实施例8a，其中8a的乙二醇替换为1，4-丁二醇。产率为82％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.69-1.78(m，2H)，1.83-1.92(m，2H)，3.73(t，J＝6.3Hz，2H)，4.37(t，J＝6.3Hz，2H)，7.41-7.46(m，2H)，7.53-7.58(m，1H)，8.04-8.06(m，2H)。
10b：4-苯甲酰氧基丁酸
制备方法同实施例8b，其中8b的2-苯甲酰氧基乙醇替换为4-苯甲酰氧基丁醇。产率为35％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.08-2.71(m，2H)，2.55(t，J＝6.0Hz，2H)，4.39(t，J＝6.3Hz，2H)，7.44(t，J＝7.5Hz，1H)，8.02(dd，J＝1.5，7.5Hz，2H)，10.79(brs，1H)。
10c：4-(3-溴苯氨基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉
制备方法同实施例8g，其中8g的2-苯甲酰氧基乙酸替换为4-苯甲酰氧基丁酸。产率为50％。mp 175-176℃
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.77-1.86(m，2H)，2.47(t，J＝7.5Hz，2H)，3.47-3.53(m，2H)，4.59(t，J＝4.8Hz，1H)，7.28-7.38(m，2H)，7.77-7.88(m，3H)，8.18(s，1H)，8.59(s，1H)，8.76(s，1H)，9.92(s，1H)，10.28(s，1H).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ28.38，33.08，60.23，111.65，115.50，120.89，121.27，124.34，125.99，127.21，128.45，130.41，137.16，141.14，146.53，153.04，157.29，171.81
Anal.Cald for C18H17BrN4O2：C，53.88；H，4.27；N，13.96；Found：C，53.58；H，4.35；N，13.68.
10d：4-氧代-4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例8h，其中8h的4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉替换为4-(3-溴苯氨基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉。产率44％。
1H NMR(300MHz，CDCl3，)：δ2.01-2.07(m，2H)，2.52(d，J＝5.4Hz，2H)，3.32-3.46(m，6H)，3.59(t，J＝8.4Hz，4H)，4.01-4.11(m，2H)，7.14-7.22(m，2H)，7.62-7.67(m，3H)，7.97(s，1H)，8.50-8.61(m，3H)，9.95(s，1H)
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ26.41(d，JP-C＝5.0Hz)，33.07，42.55(d，JP-C＝6.0Hz)，48.81，64.57(d，JP-C＝5.0Hz)，111.08，115.40，120.67，122.11，124.86，126.86，128.24，129.93，136.69，140.14，146.21，153.32，157.38，171.98
31P NMR(122MHz，DMSO-d6)：δ18.08.
Anal.Cald for C22H26BrCl2N6O3P：C，43.73；H，4.34；N，13.91；Found：C，43.81；H，4.55；N，14.07.
实施例11：4-氧代-4-(6-(4-(3-氯-4氟苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMB-4)的制备
11a：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-硝基喹唑啉
制备方法同8e，其中8e的3-溴苯胺替换为3-氯-4-氟苯胺。产率65％。mp278-280℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.50(t，J＝9.2Hz，1H)，7.84(d，J＝8.4Hz，1H)，7.97(d，J＝8.8Hz，1H)，8.17(d，J＝4.8Hz，1H)，8.59(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，8.79(s，1H)，9.64(s，1H)，10.56(br s，1H).
11b：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-氨基喹唑啉
制备方法同实施例8f，其中8f的4-(3-溴苯氨基)-6-硝基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-硝基喹唑啉。产率92％。mp 253-255℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ5.63(s，2H)，7.26(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，7.13(d，J＝2.0Hz，1H)，7.41(t，J＝8.4Hz，1H)，7.55(d，J＝9.2Hz，1H)，7.81-7.85(m，1H)，8.21(dd，J＝2.4，6.8Hz，1H)，8.37(s，1H)，9.48(s，1H).
11c：4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉
制备方法同实施例8g，其中8g的2-苯甲酰氧基乙酸替换为4-苯甲酰氧基丁酸，4-(3-溴苯氨基)-6-氨基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-氨基喹唑啉。产率为79％。mp 208-209℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.77-1.84(m，2H)，2.46(t，J＝7.6Hz，2H)，3.48(t，J＝6.4Hz，2H)，7.44(t，J＝8.4Hz，1H)，7.77-7.86(m，3H)，8.13(dd，J＝2.4，6.8Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.70(d，J＝1.6Hz，1H)，10.29(s，1H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ28.38，33.08，60.22，111.44，115.37，116.61(2JF-C＝21.0Hz)，118.91(2JF-C＝18.6Hz)，122.70(3JF-C＝6.8Hz)，123.83，127.18，128.49，136.68，137.08，146.47，153.05，153.48(1JF-C＝241Hz)，157.34，171.74
Anal.Cald for C18H16ClFN4O2：C，57.68；H，4.30；N，14.95；Found：C，57.48；H，4.30；N，14.90.
11d：4-氧代-4-(6-(4-(3氯-4氟苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例8h，其中8h的4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉替换为4-(3氯-4氟苯胺基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉。产率32％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.00-2.06(m，2H)，2.46-2.58(m，2H)，3.40-3.63(m，10H)，3.99-4.09(m，2H)，7.05(t，J＝8.8Hz，1H)，7.52-7.67(m，3H)，7.83(dd，J＝2.4，6.4Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.54(s，1H)，8.73(s，1H)，10.03(s，1H)
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ26.56(d，JP-C＝5.0Hz)，33.02，42.26，48.74(d，JP-C＝5.0Hz)，64.50(d，JP-C＝5.0Hz)，111.03，115.27，116.25(d，2JF-C＝22.0Hz)，120.52(d，2JF-C＝18.0Hz)，121.99(3JF-C＝7.0Hz)，124.25，126.77，128.45，135.32，136.52，146.44，153.36，154.65(1JF-C＝232Hz)，157.39，171.98
31P NMR(122MHz，CDCl3)：δ18.00.
Anal.Cald for C22H25C13FN6O3P：C，45.73；H，4.36；N，14.54；Found：C，45.79；H，4.66；N，14.43.
实施例12：4-氧代-4-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯(EMB-5)的制备
12a：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-硝基喹唑啉
制备方法同8e，其中8e的3-溴苯胺替换为3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺。产率97％。mp 279-281℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ5.30(s，2H)，7.18-7.22(m，1H)，7.31-7.36(m，3H)，7.46-7.51(m，1H)，7.71(d，J＝8.8Hz，1H)，7.98-8.04(m，2H)，8.68(t，J＝6.8Hz，1H)，8.88(d，J＝10.0Hz，1H)，9.71(d，J＝6.0Hz，1H)，11.19(br s，1H).
12b：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-氨基喹唑啉
制备方法同实施例8f，其中8f的4-(3-溴苯氨基)-6-硝基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-硝基喹唑啉。产率97％。mp 250-252℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ5.28(s，2H)，7.17-7.21(m，1H)，7.28-7.39(m，5H)，7.45-7.51(m，1H)，7.59(d，J＝9.2Hz，1H)，7.65(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，7.94(d，J＝2.4Hz，1H)，8.52(s，1H).
12c：4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉
制备方法同实施例8g，其中8g的2-苯甲酰氧基乙酸替换为4-苯甲酰氧基丁酸，4-(3-溴苯氨基)-6-氨基喹唑啉替换为4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-6-氨基喹唑啉。产率为51％。mp 209-211℃
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.77-1.84(m，2H)，2.46(t，J＝7.2Hz，2H)，3.49(t，J＝7.2Hz，2H)，5.26(s，2H)，7.17-7.35(m，4H)，7.45-7.51(m，1H)，7.69-7.85(m，3H)，7.98(d，J＝2.0Hz，1H)，8.51(s，1H)，8.68(s，1H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ28.41，33.09，60.24，69.52，111.57，114.15(2JF-C＝26.0Hz)，114.34，114.83(2JF-C＝20.4Hz)，115.36，121.15，122.47，123.45，124.26，127.05，128.41，130.70(3JF-C＝8.0Hz)，133.41，136.93，139.80(3JF-C＝6.8Hz)，146.40，149.69，153.27，157.45，162.35(1JF-C＝241Hz)，171.70
Anal.Cald for C25H22ClFN4O3：C，62.44；H，4.61；N，11.65；Found：C，62.17；H，4.68；N，11.38.
12d：4-氧代-4-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N，N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯
制备方法同实施例8h，其中8h的4-(3-溴苯氨基)-6-(2-羟基乙酰氨基)喹唑啉替换为4-(3氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-6-(4-羟基丁酰氨基)喹唑啉。产率26％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.95-2.01(m，2H)，2.48(d，J＝4.8Hz，2H)，3.36-3.43(m，4H)，3.52-3.60(m，6H)，3.97-4.06(m，2H)，5.04(s，2H)，6.83(d，J＝9.2Hz，1H)，6.97-7.01(m，1H)，7.16-7.20(m，2H)，7.29-7.35(m，1H)，7.46(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，7.57(d，J＝8.8Hz，1H)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H)，7.73(d，J＝2.0Hz，1H)，8.52(s，2H)，8.67(br s，1H)，10.01(br s，1H)
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ26.44(d，JP-C＝6.0Hz)，32.97，42.27，48.76(d，JP-C＝5.0Hz)，64.46(d，JP-C＝5.0Hz)，70.22，111.09，113.86(2JF-C＝22.0Hz)，113.97，114.77(2JF-C＝21.0Hz)，115.25，122.10，122.40(4JF-C＝2.0Hz)，122.88，124.81，126.65，128.21，130.08(3JF-C＝8.0Hz)，132.62，136.46，139.06(3JF-C＝7.0Hz)，146.22，150.65，153.58，157.57，162.88(1JF-C＝245Hz)，171.89.
31P NMR(122MHz，CDCl3)：δ18.10.
HRMS(ESI+)m/z calcd for C29H32Cl3FN6O4P(M+H)+，683.12668，found683.12562(M+H)+.
抗肿瘤活性试验
实验例1本发明化合物的抗肿瘤活性
对HCT116、MDA-MB-468和SK-BR-3细胞增殖的影响
体外培养HCT116、MDA-MB-468和SK-BR-3细胞。细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×104个/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，放置细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，用药组每孔加入细胞培养基稀释的药物100μL，每种药物设三个复孔，阴性对照组为含0.5％DMSO培养基。培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，37℃放置3h。每孔加入150μL DMSO，37℃摇床振荡5min，于492nm/620nm测吸光度(OD)。运用Prism Graphpad统计软件计算IC50值。
EMA-和EMB-系列化合物的细胞毒实验结果
选择SK-BR-3(HER-2高表达)，MDA-MB-468(EGFR高表达)，HCT116(EGFR和HER-2均低表达)三种肿瘤细胞模型，对EMA-和EMB-系列化合物的抗肿瘤活性进行了评价。活性结果列于表1中。
表1.化合物对三个肿瘤细胞株的IC50值
表1的数据显示，磷酰氮芥和喹唑啉环之间的连接臂以3～4个碳链长为佳；对SK-BR-3(HER-2高表达)，MDA-MB-468(EGFR高表达)，HCT116(EGFR和HER-2均低表达)三种肿瘤细胞模型，化合物EMA-3，4，5，6，7和化合物EMB-3，4，5的抗肿瘤活性优于对照品拉帕替尼。
实验例2本发明化合物EMB-3作用机理研究
1、实验方法：
使用Z’-LYTE Tyr 4激酶分析试剂盒(Invitrogen，US)和Tyr-4肽底物进行酶结合实验。
A、酶浓度优化
在检测不同酶浓度下的反应情况，选取最佳酶浓度进行实验。ATP浓度及孵育时间的优化同酶浓度的优化。
(1)如图所示，将EGFR在96孔板中倍比稀释至不同浓度，之后使用多道移液器从96孔板A1-12孔分别转移5μL酶溶液至368孔板；
(2)酶反应：在96孔板M-N行每孔加入5μL 1×激酶缓冲液，在N行中每孔加入5μL磷酸肽溶液，在A-M行每孔加入5μL肽/ATP混合物，震摇混匀后在25℃反应30min。
(3)切除反应：在A-N行各孔加入5μL切除液，震摇混匀后在25℃反应30min。
(4)终止反应和荧光检测：在反应各孔中加入5μl终止液，震摇混匀30s。用酶标仪检测(Ex.400nm，Em.445nm；Ex.400nm，Em.520nm)荧光强度。
(5)优化酶浓度，ATP浓度和反应时间，使磷酸化水平为20-40％进行后续实验。
B、检测化合物对EGFR磷酸化的抑制活性
(1)按照上述优化条件，配制1.33×激酶缓冲液，4×药物溶液，激酶/肽混合液，磷酸肽溶液，ATP溶液，切除液；
(2)按下图方式在368孔板中加入各溶液，进行酶反应，切除反应和终止反应。
(3)用酶标仪检测(Ex.400nm，Em.445nm；Ex.400nm，Em.520nm)荧光强度。
(4)依据以下公式计算Emission Ratio和酶磷酸化百分比。
(5)依据以下公式计算化合物对酶磷酸化的抑制百分比。
(6)以GraphPad Prism 5软件分析药物对EGFR磷酸化的IC50值。
C、细胞周期分析
(1)细胞长至70-80％密合时，换成含0.5％FBS的DMEM培养液同步化细胞过夜。之后用含不同药物浓度的DMEM孵育细胞24h，用0.125％胰酶-0.02％EDTA消化、收集细胞；
(2)离心细胞，用预冷的PBS洗细胞1次后，加入70％乙醇在-20℃固定细胞过夜；
(3)弃去乙醇溶液，用预冷的PBS洗细胞1次，加入含100μg/mL RNAse和50μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS溶液100μl避光孵育30min；
(4)用0.5mL PBS稀释细胞并制成单细胞悬液，立即用流式细胞仪(BDFACSCantoTM，USA)进行检测；
(5)细胞周期结果采用ModfitLT 3.0软件(Verity Software House，USA)进行分析。
D、彗星电泳实验
(1)药物配制：参考EMB-3对三种细胞作用的IC50，统一选择25μM为准，分别用25、75、250μM(记做1×、3×、10×)刺激细胞。平行重复三次，并设一空白对照孔，记做nc。
(2)细胞种板，待长至80～90％备用。加入刺激药物，37℃培养2h。
(3)细胞预冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1×106个/ml。
(4)铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制
第1层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，40℃预热，将预热45℃的100μL的0.5％正常熔点琼脂糖(NMA)铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，在置于4℃下10min使NMA凝固。
第2层凝胶的制备：将10μL细胞(约104个)和75μL的0.7％低熔点琼脂糖LMA混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第一层琼脂糖上，；立即盖上另一干净盖玻片，置4℃下10min使第2层LMA凝固。
第3层凝胶的制备：第2层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热37℃的75μL的0.7％低熔点琼脂糖LMA，如上盖上盖玻片4℃下凝固30min。
(5)细胞裂解移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的Lysis Buffer，4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。
(6)DNA碱解旋将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液，约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～60min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。
(7)单细胞电泳在电压25V，电泳20～30min。
(8)中和与染色电泳后将载玻片置于平皿。加入0.4mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次10min，弃去Tris-HCl缓冲液，每载玻片加20μL SYBR Green(1∶10,000)，盖上盖玻片，避光染色10min。
(9)观察、拍照和分析
分析软件：
1)图像分析软件：Komet 5.5
2)结果统计软件：Prism5.0&Excel
2、实验结果：
(1)EFGR受体结合实验
为证实该类化合物对EFGR具有抑制作用，选择化合物EMB-3为探针，进行了受体结合实验。如表2所示，EMB-3对EGFR的IC50值为0.112μM，尽管高于拉帕替尼(IC50＝0.018)，但仍能说明EMB-3具有较强的EGFR抑制作用。
表2.EMB-3和拉帕替尼对EGFR的IC50值
| 化合物 | EGFR抑制作用(IC50/μM) |
| EMB-3 | 0.112±0.019 |
| lapatinib | 0.018±0.009 |
(2)对EGFR磷酸化的抑制作用
为进一步证实EMB-3对EFGR的抑制作用，考察了EMB-3对EGFR磷酸化的影响。同时，考虑到磷酰氮芥基团对DNA具有烷化作用，推测该基团对受体结合口袋的氨基酸残基也具有烷化作用，从而不可逆性抑制EGFR/HER-2受体；因此，设计了洗脱实验，以考察化合物是否为不可逆性抑制剂。
如图3所示，EMB-3与MDA-MB-468细胞共孵育1h后，对表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化具有明显的抑制作用，且呈现出剂量依赖性。在洗脱实验中，将EMB-3与MDA-MB-468细胞共孵育1h，洗脱以除去未结合的EMB-3，孵育6h后，再以表皮生长因子诱导EGFR磷酸化，结果显示EGFR磷酸化仍然受到明显的抑制。这表明EMB-3确实通过抑制EGFR而杀伤细胞，而且属于不可逆性抑制剂。
(3)DNA损伤实验(彗星实验)
为进一步验证化合物对DNA的损伤作用，对EMB-3进行了彗星实验，以彗尾长度为指标，测定不同浓度的EMB-3对DNA的损伤作用。
如图4所示，对HCT116细胞和MDA-MB-468细胞，当EMB-3浓度为250μM时，具有明显的DNA损伤作用(p＜0.05versus control)；而对SKBR-3细胞，当浓度为75μM时，即显示出明显的DNA损伤作用(p＜0.05versus control)。这说明化合物EMB-3确实具有DNA损伤作用。
(4)细胞周期实验
还测试了化合物EMB-3对细胞周期的影响，以进一步研究化合物的抗肿瘤作用机制。
表3.EMB-3对细胞周期的影响
| G1(％) | S(％) | G2/M(％) | |
| 对照组 | 57.9±2.8 | 22.6±2.7 | 19.0±5.0 |
| 1μM | 64.1±3.5 | 19.6±4.8 | 16.3±8.3 |
| 2μM | 67.7±2.4 | 17.1±4.0 | 15.2±6.3 |
| 4μM | 66.9±1.3 | 17.1±3.4 | 16.0±4.7 |
| 8μM | 72.1±3.2 | 14.5±1.2 | 13.5±4.4 |
如表3和图5所示，EMB-3使大部分细胞停留在G1期，且呈现出剂量依赖性。考虑到EGFR抑制剂吉非替尼使细胞主要停留于G1期，DNA烷化剂环磷酰胺使细胞主要停留于G2/M期，这表明在低浓度下，EMB-3主要通过抑制EGFR/HER-2受体起到杀伤肿瘤细胞的作用。
Claims (6)
1.如通式I所示的一类多靶点抗肿瘤化合物或其药用盐
其中，R1选自氢、甲氧基或乙氧基；R2选自3-溴苯基、3-氯-4-氟苯基或3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯基；X为CH2，Y为O或者X为CO，Y为NH；n选自1-3或n为0时，X和Y不存在。
2.根据权利要求1所述的化合物为：
4-(3-溴苯胺基)喹唑啉酚N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)乙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氧)丁醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
3-(6-(4-(3-溴苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
3-(6-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
3-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉)氧)丙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
2-氧代-2-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)乙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
3-氧代-3-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丙醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
4-氧代-4-(6-(4-(3-溴苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
4-氧代-4-(6-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯；
4-氧代-4-(6-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)喹唑啉)氨基)丁醇N,N-二(2-氯乙基)磷酸二胺酯。
3.制备权利要求1或2所述化合物的方法，包括如下步骤：
其中，当X为CH2，Y为O或n为0而X和Y不存在时，R1、R2和n如前述通式I所定义时的化合物的合成路线如下：
(1)关键中间体4,6-二羟基喹唑啉和4,6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉的合成
5-羟基-2-氨基苯甲酸与甲酰胺高温合环得4,6-二羟基喹唑啉；
或，香草酸经与甲基化试剂反应得到3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯；然后硝化得到2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲酸甲酯；脱甲基化，同时酯基水解得到2-硝基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸；再经酯化、氨基还原得到2-氨基-4-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯；最后，与甲酸铵和甲酰胺于150℃下发生环化反应得到4,6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉；
7位R1取代的4,6-二羟基喹唑啉的合成方法与4,6-二羟基-7-甲氧基喹唑啉的合成方法类似；
(2)式I化合物的合成
7位R1取代的4,6-二羟基喹唑啉的6-OH选择性乙酰化，得到7位R1取代的6-乙酰氧基-4-羟基喹唑啉；然后4-OH氯化，不经纯化直接与取代苯胺反应得到7-R1-4-R2-6-乙酰氧基喹唑啉；在氨水/甲醇体系中脱乙酰基得到7-R1-4-R2-6-羟基喹唑啉；7-R1-4-R2-6-羟基喹唑啉直接与二氯磷酰氮芥反应，或者先与卤代醇反应，所得产物再与二氯磷酰氮芥反应，即得到式I化合物；
其中，当X为CO，Y为NH时，R1、R2和n如前述通式I所定义时的化合物的合成路线具体如下：
(1)苯甲酰基保护的ω-羟基酰氯的合成
1.5当量的二醇与1.0当量的苯甲酰氯反应，得到单苯甲酰基保护的二醇，经过Jone’s试剂氧化，得到苯甲酰基保护的ω-羟基羧酸，再在SOCl2/CHCl3中回流制得苯甲酰基保护的ω-羟基酰氯；
(2)式I化合物的合成
4位-R1取代的-2-氨基苯甲酸和甲酰胺在高温下合环得到7位-R1取代的-4-羟基喹唑啉，进一步硝化反应得到7位-R1取代的-6-硝基-4-羟基喹唑啉，再用氯化亚砜处理转变为7位-R1取代的-6-硝基-4-氯喹唑啉，不经纯化直接与取代苯胺反应得到7位-R1取代的-4-R2取代苯氨基-6-硝基喹唑啉，进一步用锡粉-盐酸还原硝基得到7位-R1取代的-4-R2取代苯氨基-6-氨基喹唑啉；7-R1-4-R2-6-氨基喹唑啉再与上述制备的苯甲酰基保护的ω-羟基酰氯反应，所得产物不经分离，直接在氢氧化钠/甲醇/水体系中脱除苯甲酰基得到7-R1-4-R2-6-(ω-羟基酰氨基)喹唑啉；最后，再在氢化钠作用下，7-R1-4-R2-6-(ω-羟基酰氨基)喹唑啉与二氯磷酰氮芥反应得到式I化合物；
4.如权利要求1或2所述化合物或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1或2所述化合物或其药用盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
6.如权利要求5所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110177810.0A CN102850397B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110177810.0A CN102850397B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102850397A CN102850397A (zh) | 2013-01-02 |
| CN102850397B true CN102850397B (zh) | 2015-02-18 |
Family
ID=47397424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110177810.0A Expired - Fee Related CN102850397B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102850397B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017049470A1 (en) * | 2015-09-23 | 2017-03-30 | Xw Laboratories Inc. | Prodrugs of gamma-hydroxybutyric acid, compositions and uses thereof |
| AU2016328150B2 (en) | 2015-09-23 | 2020-10-01 | Xw Laboratories Inc. | Prodrugs of gamma-hydroxybutyric acid, compositions and uses thereof |
| CN106986895A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-07-28 | 北京大学 | 喹唑啉类多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101501054A (zh) * | 2005-06-29 | 2009-08-05 | 施瑞修德制药公司 | 氨基磷酸酯烷化剂前体药物 |
-
2011
- 2011-06-29 CN CN201110177810.0A patent/CN102850397B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101501054A (zh) * | 2005-06-29 | 2009-08-05 | 施瑞修德制药公司 | 氨基磷酸酯烷化剂前体药物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ri-Dong Li,et al..Novel EGFR inhibitors prepared by combination of dithiocarbamic acid esters and 4-anilinoquinazolines.《Bioorg. Med. Chem. Lett.》.2011,第21卷3637-3640. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102850397A (zh) | 2013-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105153122B (zh) | [(吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基苯基丙-2-烯酰胺衍生物及盐、制备方法、应用 | |
| CN107382879B (zh) | 一种嘧啶类化合物、egfr抑制剂及其应用 | |
| CN103664892B (zh) | 喹啉衍生物的结晶 | |
| CN103153995B (zh) | 作为磷酸二酯酶(pdes)抑制剂的稠合杂环化合物 | |
| CN108699081B (zh) | 一种大环化合物及包含该化合物的组合物 | |
| CN107973791A (zh) | 稠环或三环芳基嘧啶化合物用作激酶抑制剂 | |
| CN111662296B (zh) | 一种含吡唑并嘧啶的异羟肟酸衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN107922425A (zh) | 制备parp抑制剂、结晶形式的方法及其用途 | |
| JP2003518475A (ja) | カルボン酸アミド、その化合物を含有する医薬組成物、その使用及び調製 | |
| US9102629B2 (en) | Polymorphic forms of 4-phenylamine quinazoline derivative, the preparation method and uses thereof | |
| WO2017016463A1 (zh) | Egfr抑制剂及其药学上可接受的盐和多晶型物及其应用 | |
| AU2020406824A1 (en) | Novel pyrimidine derivative and use thereof | |
| CN104292170A (zh) | 具有抗肿瘤作用的喹唑啉-芳基脲衍生物及其应用 | |
| CN102850397B (zh) | 多靶点抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 | |
| AU2010212560A1 (en) | Derivatives of azaindoles as inhibitors of protein kinases Abl and Src | |
| CN111499583B (zh) | 喹唑啉衍生物及其作为抗肿瘤药物的应用 | |
| CN106117182B (zh) | 喹唑啉-n-苯乙基四氢异喹啉类化合物及其制备方法和应用 | |
| ES2605621T3 (es) | Procedimiento para la preparación de derivados de imidazo[2,1-b][1,3] benzotiazol | |
| CN101357905B (zh) | 4-[3-氯-4-(3-氟-苄氧基)-苯胺基]-6-取代胺基-喹唑啉衍生物的制备方法 | |
| CN105461708A (zh) | 喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂及其制备和应用 | |
| CN103664876A (zh) | 喹啉类衍生物及其用途 | |
| CN103159741B (zh) | 一类酪氨酸激酶抑制剂的制备和用途 | |
| CN106866684B (zh) | 用于***的大环衍生物 | |
| CN109824583A (zh) | 一种苯基草酰胺类hiv-1抑制剂及其制备方法和应用 | |
| CN103450113B (zh) | 一种取代噻二嗪三酮类衍生物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150218 Termination date: 20200629 |