CN102841006A - 一种植物组织透射电镜样品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种植物组织透射电子显微镜样品的制备方法，包括：采用乙醇对组织样品进行逐级脱水后用环氧丙烷置换出乙醇，接着在不同真空度条件下进行Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液的梯度渗透，渗透了Spurr树脂的样品于70℃下聚合12小时后进行切片处理，然后样品切片置于经过丙酮浸泡且没有支持膜的铜网上，用高锰酸钾-柠檬酸钠溶液染色后进行透射电子显微镜观察。本方法有效的克服了传统方法中Spurr树脂不能完全渗透到植物组织内部，造成超薄切片中组织细胞微细结构信息保留不完整的缺点，同时有效的降低了污染物对样品观察的影响，增加了样品的清晰度。

Description

一种植物组织透射电镜样品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备植物组织细胞样品的方法，特别是涉及一种在电子显微镜下观察植物组织细胞的样品的制备方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

近年来，随着农、林业经济的不断发展，研究植物资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大量的植物组织细胞内部结构信息，已经成为科学工作者保护森林资源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物组织的细胞壁厚，结构致密，药液渗透不够充分，因此难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而限制了透射电镜在植物研究中的应用。

传统的植物组织透射电镜样品制备时，采用乙醇或丙酮脱水后直接利用不同比例的树脂和乙醇或丙酮混合溶液在常压下进行渗透，然后放入纯包埋剂中渗透数小时或过夜，再进行包埋。这种传统的方法包埋幼嫩的植物组织，如根尖、叶、芽组织后，切片效果还较为理想，但是当这种传统的包埋方法用于高度木质化的茎、枝条时，由于茎、枝条的组织结构致密，往往造成树脂难以完全渗透。在切片时出现样品受到玻璃刀或者钻石刀的挤压发生形变，甚至破裂，引起植物组织碎裂，制成的切片出现皱褶，搓板样震颤以及无法切下厚度适中的连续切片，切片遇水碎裂散开，最终影响样品透射电镜图片的质量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种植物组织透射电子显微镜样品的制备方法，本发明方法制备的样品中Spurr树脂完全渗透到植物组织细胞中，Spurr树脂充满整个植物组织细胞，样品切片中组织细胞的微细结构信息保留完整，有效的降低了污染物对样品观察的影响，增加了样品的清晰度，而且避免了切片过程中出现的样品形变，切片皱褶，搓板样震颤以及无法切下厚度适中的连续切片等问题。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种植物组织透射电镜样品的制备方法，包括在真空状态下对样品进行Spurr树脂的渗透处理。

其中，所述真空状态的绝对压力低于0.09MPa；所述Spurr树脂中二氧化乙烯基环己烯（ERL4221）、聚丙二醇二缩水甘油醚（DER736）、壬烯基丁二酸（NSA）、二甲基胺基乙醇（DMAE）的重量份配比为10：8-9：24-26：0.4-0.6，优选为10：8-8.5：26：0.5。

特别是，所述的渗透处理是将植物样品依次置于Spurr树脂与环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂进行渗透处理，使Spurr树脂完全渗入植物样品细胞中。

其中，所述Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液中Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比为1-3:1.

特别是，所述渗透处理是采用Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比依次为：1:1、2:1、3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂进行渗透处理，使Spurr树脂完全渗入植物样品细胞中。

特别是，采用体积之比为1:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.07-0.09MPa，优选为0.08MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为2:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.05-0.06MPa，优选为0.06MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.03-0.04MPa，优选为0.04MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用Spurr树脂进行渗透处理时的绝对压力≤0.02MPa，优选为0.01MPa；渗透时间为20-30h，优选为24h，即采用Spurr树脂渗透时间为20-30h，优选为24h。

特别是，还包括用环氧丙烷对植物组织样品进行浸泡，使环氧丙烷充满植物组织。

本发明另一方面提供一种植物组织透射电镜样品的制备方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1）软化处理

将植物样品于沸水中煮制处理后置于超纯水中进行浸泡，重复煮制和浸泡直至植物样品沉入水底，制得软化植物组织；

2）脱水处理

将软化植物组织置于体积百分比浓度为30-100%的乙醇溶液中浸泡，脱除植物组织中的水分，制得乙醇植物组织；

3）置换处理

将乙醇植物组织依次置于环氧丙烷与乙醇的混合溶液、环氧丙烷中，浸泡、脱出乙醇，直至环氧丙烷完全置换出乙醇，制得环氧丙烷植物组织；

4）渗透处理

将环氧丙烷植物组织依次置于Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂中浸泡，进行渗透处理，Spurr树脂渗透到植物组织细胞中，制得树脂渗透植物组织；

其中，步骤1）中所述煮制处理的时间为20-30min，即每次煮制处理时间为20-30min；浸泡处理的超纯水的温度为15-25℃，浸泡时间为1-2h，即每次浸泡的时间为1-2h。

软化浸泡处理是利用热胀冷缩原理排除植物组织样品中的气泡，排出植物细胞壁内的气体，促进脱水剂乙醇进入细胞壁孔隙内，利于渗透树脂完全渗透，使整个植物组织细胞充满Spurr树脂。

其中，步骤2）中所述乙醇溶液的体积百分比浓度依次为：30%、50%、70%、90%、100%。

特别是，步骤2）中所述浸泡是将软化植物组织依次置于体积百分比浓度为：30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液中，脱除植物组织中的水分。

其中，采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水时间为10-25min；采用体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水时间为10-15min；采用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水时间为5-10min；采用体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水时间为3-5min,；采用体积百分比浓度为100%的乙醇（即无水乙醇）浸泡脱水时间为2-6min。

特别是，采用体积百分比浓度为100%的乙醇溶液对植物样品进行2次脱水处理，每次脱水处理时间为1-3min。

植物组织中存在的水分与（Spurr树脂）不相容，水的存在会影响包埋剂Spurr树脂的渗透，导致植物样品变脆，影响植物组织切片。采用浓度逐渐升高的乙醇溶液进行逐级脱水可以防止植物细胞壁破裂，保持植物组织细胞的完整性。

其中，步骤3）中所述置换处理过程中的环氧丙烷与乙醇的混合溶液中的环氧丙烷与乙醇的体积之比为1-3:1。

特别是，所述置换处理是采用环氧丙烷与乙醇的体积之比依次为1:1、2:1、3:1的环氧丙烷和乙醇混合溶液、环氧丙烷中依次进行置换，使乙醇被环氧丙烷完全置换。

其中，步骤3）中进行所述置换处理过程中环氧丙烷和乙醇混合溶液中环氧丙烷与乙醇的体积比依次为1:1、2:1、3:1；所述置换处理时间4-12min。

特别是，采用体积比依次为1:1、2：1、3:1的环氧丙烷和乙醇的混合溶液浸泡置换处理时，每个混合溶液浸泡时间分别为1-3min；采用环氧丙烷浸泡置换处理的时间为1-3min。

环氧丙烷与Spurr树脂的相容性优于乙醇与Spurr树脂的相容性，利用环氧丙烷置换出乙醇有利于Spurr树脂充分渗透至植物组织中。当树脂渗透充分时，木材组织与树脂完全融为一体，利于切片时保持植物组织细胞的完整性。采用体积比逐渐升高的渗透梯度可以保持植物组织内外的Spurr树脂的浓度差，有利于Spurr树脂的渗透。

其中，在所述步骤4）中在真空度状态下进行所述的渗透处理。

特别是，所述的真空状态的绝对压力低于0.09MPa。

其中，所述渗透处理过程中所述的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液中的Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比为1-3:1。

特别是，所述Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液中Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比依次为：1:1、2:1、3:1。

特别是，所述渗透处理是采用Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比依次为：1:1、2:1、3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂进行渗透处理，使Spurr树脂完全渗入植物样品细胞中。

特别是，采用体积之比为1:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.07-0.09MPa，优选为0.08MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为2:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.05-0.06MPa，优选为0.06MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.03-0.04MPa，优选为0.04MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用Spurr树脂进行渗透处理时的绝对压力≤0.02MPa，优选为0.01MPa；渗透时间为20-30h，优选为24h，即采用Spurr树脂渗透时间为20-30h，优选为24h。

其中，还包括对树脂渗透植物组织进行切片处理后将样品薄片平铺于铜网上，然后进行染色处理。

特别是，将树脂渗透植物组织置于包埋板中，加入Spurr树脂使之浸满包埋板的凹槽，在温度为70℃下，植物组织内外的Spurr树脂进行聚合反应12-16h后于切片机中对植物组织进行所述的切片处理。

其中，所述的切片处理是将树脂渗透植物组织样品切成厚度为70-90nm的薄片；染色处理时间为30-40秒。

特别是，所述铜网的网眼孔径为200目。

尤其是，所述铜网没有支持膜。所述铜网经过丙酮浸泡。浸泡次数为2-3次，浸泡时间为1-2min/次。

使用没有支持膜的铜网避免了支持膜上污染物对样品的干扰，同时减少了电子束穿过样品的距离，增加了切片的清晰度；丙酮浸泡铜网能够去除铜网表面的污染物，并且丙酮与包埋剂的相容性好，有利于切片在通网上附着。

其中，所述染色处理采用的染色剂为质量体积百分比浓度为1-1.5%的高锰酸钾-柠檬酸钠溶液，即所述染色剂中高锰酸钾与柠檬酸钠溶液的质量体积之比为1-1.5：100，也就是说每100ml的柠檬酸钠溶液中加入1-1.5g的高锰酸钾，或每1L柠檬酸钠溶液中加入0.01-0.015kg的高锰酸钾。

特别是，所述染色剂按照如下操作步骤制备而成：首先将柠檬酸钠溶于超纯水中，制得柠檬酸钠溶液；然后将高锰酸钾溶于柠檬酸钠溶液，搅拌均匀即得。

其中，所述柠檬酸钠溶液的质量体积百分比浓度为1-2%，即每100ml超纯水中加入1-2g柠檬酸钠。

特别是，还包括将染色剂首先进行离心处理，然后对离心处理后的上清液进行过滤处理。

其中，所述的离心处理过程中离心速度为2000-3000rpm，离心时间为5-6min。

特别是，采用过滤精度为0.22μm的水系滤头进行所述的过滤处理。

特别是，还包括将染色处理后的植物纤维样品用超纯水冲洗2-3次之后，用光纤照明灯下照射20～30s，除去样品表面多余水分。

特别是，在进行所述的软化处理之前包括：在体视显微镜下利用双面刀片将植物样品切成0.1cm×0.1cm×0.5cm大小的细长条。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明利用环氧丙烷置换出脱水剂乙醇，增强了Spurr树脂与环氧丙烷的相容性，提高了Spurr树脂渗透到植物组织细胞壁和细胞腔内的效率，而传统方法仅使用了脱水剂乙醇，不利于Spurr树脂的渗透。

2、本发明在抽真空条件下进行Spurr树脂渗透处理，增强了树脂在组织中的渗透深度，避免了切片过程中出现的样品形变，切片皱褶，搓板样震颤以及无法切下厚度适中的连续切片等问题，使绝大部分组织的细胞微细结构不被破坏；而传统方法是在常压下进行的，通常Spurr树脂渗透不够充分。

3、本发明使用没有支持膜的铜网避免了支持膜上污染物对样品的干扰，同时减少了电子束穿过样品的距离，增加了切片在透射电镜下的清晰度；而传统方法使用带有支持膜的铜网，通常会产生污染物，切片清晰度差。

4、本发明使用1-1.5%高锰酸钾-柠檬酸钠溶液染色，保证植物组织中的木质素在中性条件下发生氧化还原反应，高锰酸钾被还原成二氧化锰后沉积在组织表面，产生了透射电子显微图像上的明暗对比区域，增强观察效果，本发明中植物组织细胞壁和细胞腔内均无污染物，本发明使用1-1.5%高锰酸钾-柠檬酸钠溶液染色防止了高锰酸钾溶液在碱性或酸性条件下被还原成二价锰或锰酸根离子等污染物，影响切片的染色效果，降低切片的清晰度，对样品的电镜观察产生干扰，对比度减弱，降低了电镜观察效果。

说明书附图

图1是红瑞木（Cornus alba）纤维细胞透射电子显微图像，其中

1A是本发明方法获得的红瑞木纤维细胞透射电子显微镜图像（2μm）；

1B是传统包埋法获得的红瑞木纤维细胞透射电子显微镜图像（2μm）。

图2是黑杨（Populus nigra）纤维细胞透射电子显微图像，其中

2A是本发明方法获得的黑杨纤维细胞透射电子显微镜图像（5μm）；

2B是传统包埋法获得的黑杨纤维细胞透射电子显微镜图像（5μm）。

图3是乌拉草（Carex meyeriana）薄壁细胞透射电子显微图像，其中

3A是本发明方法获得的乌拉草纤维细胞透射电子显微镜图像（500nm）；

3B是传统包埋法获得的乌拉草纤维细胞透射电子显微镜图像（1μm）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

超纯水，北京同泰联科技发展有限公司；乙醇（分析纯），购自北京试剂厂；环氧丙烷（分析纯），购自北京试剂厂；Spurr树脂购自中兴百瑞科技有限公司。

本发明实施例中Spurr树脂的组成成分二氧化乙烯基环己烯（ERL4221）、聚丙二醇二缩水甘油醚（DER736）、壬烯基丁二酸（NSA）、二甲基胺基乙醇（DMAE）的重量配比为10：8：26：0.5。

本发明中的Spurr树脂除了上述组成配比之外，其他二氧化乙烯基环己烯（ERL4221）、聚丙二醇二缩水甘油醚（DER736）、壬烯基丁二酸（NSA）、二甲基胺基乙醇（DMAE）的重量配比为10：8-9：24-26：0.4-0.6均适用于本发明。

实施例1  红瑞木（Cornus alba）纤维细胞透射电子显微镜样品制备

1、软化处理

1A）将植物红瑞木（Cornus alba)在体视显微镜下用双面刀片将样品分割成尺寸为0.1cm×0.1cm×0.5cm（长×宽×高）的细长条，制成红瑞木条；

1B）将红瑞木条置于超纯水中，加热煮沸，在保持超纯水沸腾的条件下，对红瑞木条煮20min；

1C）将煮制后的红瑞木置于温度为（20℃）的超纯水中浸泡1小时；

1D）重复步骤1B）、1C）直至红瑞木条沉入超纯水中，制得植物组织中气体排尽的软化样品，即软化红瑞木条。

2、脱水处理

将软化红瑞木条依次置于体积百分比浓度为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液中，浸泡、逐步脱除红瑞木中的水分，制得乙醇红瑞木条，其中采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水时间为15min；采用体积百分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水时间为10min；采用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水时间为5min；采用体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水时间为3min,；采用体积百分比浓度为100%的乙醇（即无水乙醇）浸泡脱水2次，每次脱水时间为1min，即将软化红瑞木条首先置于体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水15min，接着将经过30%乙醇浸泡的红瑞木条取出后直接置于体积百分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水10min；然后将经过50%乙醇浸泡的红瑞木条取出后直接置于体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水5min；紧接着将经过70%乙醇浸泡的红瑞木条取出后直接置于体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水3min；最后将经过90%乙醇浸泡的红瑞木条取出后直接置于无水乙醇溶液浸泡脱水2次，每次脱水1min。

3、置换处理

将脱水后的乙醇红瑞木条依次置于环氧丙烷与乙醇体积比为1:1、2：1、3:1的环氧丙烷-乙醇混合溶液、纯环氧丙烷中，分别浸泡2min，即将乙醇红瑞木条首先置于体积比为1:1的环氧丙烷-乙醇混合溶液中浸泡2min，接着将红瑞木条取出后直接置于体积比为2:1的环氧丙烷-乙醇混合溶液中浸泡2min，然后将红瑞木条取出后直接置于体积比为3:1的环氧丙烷-乙醇混合溶液中浸泡2min，最后将红瑞木条取出后直接置于环氧丙烷中浸泡2min，用环氧丙烷将脱水后的乙醇红瑞木条中的乙醇置换脱除，制得环氧丙烷红瑞木条。

4、渗透处理

4A）将经置换处理的环氧丙烷红瑞木条用镊子取出后放入50ml水解瓶中，加入Spurr树脂与环氧丙烷体积比为1:1的混合溶液，接着将水解瓶置于真空干燥器中，抽真空使真空干燥器中的绝对压力达到并保持为0.08MPa的状态12小时，Spurr树脂渗透到红瑞木条中，进行第一阶段的渗透处理，制得第一渗透红瑞木条；

4B）将第一渗透红瑞木条用镊子取出后置于新的50ml水解瓶中，加入Spurr树脂与环氧丙烷体积比为2:1的混合溶液，接着将水解瓶置于真空干燥器中，抽真空使真空干燥器中的绝对压力达到并保持为0.06MPa的状态12小时，Spurr树脂继续渗透到红瑞木条中，进行第二阶段的渗透处理，制得第二渗透红瑞木条；

4C）将第二渗透红瑞木条用镊子取出置于新的50ml水解瓶中，加入Spurr树脂与环氧丙烷体积比为3:1的混合溶液，接着将水解瓶置于真空干燥器中，抽真空使真空干燥器中的绝对压力达到并保持为0.04MPa的状态12小时，Spurr树脂再次渗透到红瑞木条中，进行第三阶段的渗透处理，制得第三渗透红瑞木条；

4D）将第三渗透红瑞木条用镊子取出置于新的50ml水解瓶中，加入纯Spurr树脂，然后将水解瓶置于真空干燥器中，抽真空使真空干燥器中的绝对压力达到并保持为0.02MPa的状态24小时，进行第四阶段的渗透处理，红瑞木条中的环氧丙烷被Spurr树脂完全脱出，即Spurr树脂完全渗透到红瑞木条中，制得树脂渗透红瑞木条。

5、切片处理

5A）将树脂渗透红瑞木条置于包埋板（北京中兴百瑞技术有限公司）中，加入纯的Spurr树脂使之浸满包埋板的凹槽，在70℃条件下，使树脂渗透红瑞木条内部和外部的Spurr树脂进行聚合处理，聚合反应12小时后制得树脂-红瑞木条包埋块；

5B）利用超薄切片机沿着红瑞木条的轴向将树脂-红瑞木条包埋块切成厚度为90nm的红瑞木透射电镜切片，切片置于含有蒸馏水的样品池中，备用。

6、染色处理

6A）在室温下将没有支持膜的铜网（孔径为200目）置于丙酮中浸泡1-2分钟。重复2次，浸泡后的铜网置于密封的样品盒中待用；

用镊子夹住铜网边缘，将铜网深入到悬浮有红瑞木透射电镜切片的样品池的底部，然后将切片捞于铜网中部；

6B）首先将柠檬酸钠加入到超纯水中搅拌，溶解均匀，制得柠檬酸钠溶液，其中每100ml超纯水中加入1g柠檬酸钠；

接着将高锰酸钾加入到柠檬酸钠溶液，搅拌，溶解均匀，制得高锰酸钾-柠檬酸钠溶液，其中每100ml的柠檬酸钠溶液中加入1g的高锰酸钾；

然后将高锰酸钾-柠檬酸钠溶液置于离心机中进行离心处理（转速：2000rpm，离心时间：5min），离心后的上清液经过过滤精度为0.22μm水系过滤头过滤，制得染色剂，备用；

6C）用毛细吸管吸取制备好的染色剂5-10μl，滴于附着有石蜡封口膜（Parafilm）的载玻片上，使之形成液珠。用镊子轻轻夹住附着有样品的铜网边缘，然后将附着有样品的一面反扣于染色剂形成的液珠表面，染色处理30s后用超纯水冲洗2次，去除红瑞木切片表面的染色剂，然后将样品在光纤照明灯下照射30秒，除去铜网表面多余水分，制得红瑞木植物细胞透射电镜染色样品。

将制得红瑞木植物细胞透射电镜染色样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，红瑞木透射电镜观察结构如图1A所示。

电镜观察结果表明：

1、本发明方法获得的红瑞木切片透射电镜图中红瑞木组织细胞的微细结构信息清楚、完整，细胞微细结构清晰，各层间的界限清晰，对比度高。

2、本发明的红瑞木透射电镜超薄切片透射电子显微图像中污染物少，红端木组织细胞壁和细胞腔内均无污染物，图像清晰度优于传统的制样方法（图1B）。

3、本发明的红瑞木透射电镜切片表面平整光滑，组织细胞饱满、结构完整、无形变和破坏，而且透射电镜切片厚度均匀适中，切片没有皱褶和搓板样震颤，红瑞木植物组织切片完整，保证了植物细胞中的结构信息的完整保留，而按照传统方法制备的红瑞木电镜切片厚度差异大，切片褶皱多，表面粗糙，植物组织细胞结构部分被破坏。

实施例2  黑杨（Populus nigra）纤维细胞透射电子显微镜样品制备

1、软化处理

除了植物选用黑杨（Populus nigra），对黑杨木条煮30min，在温度为25℃的超纯水中浸泡2h之外，其余与实施例1相同；

2、脱水处理

除了采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水25min；采用体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水15min；采用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水10min；采用体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水5min,；采用体积百分比浓度为100%的乙醇浸泡脱水2次，每次脱水时间3min之外，其余与实施例1相同；

3、置换处理

除了环氧丙烷-乙醇混合溶液、纯环氧丙烷分别浸泡1min之外，其余与实施例1相同；

4、渗透处理

除了第一阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.09MPa，渗透时间为13h；第二阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.05MPa，渗透时间为15h；第三阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.03MPa，渗透时间为15h；第四阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.01MPa，渗透时间为24h之外，其余与实施例1相同；

5、切片处理

与实施例1相同；

6、染色处理

除了每100ml超纯水中加入2g柠檬酸钠之外，其余与实施例1相同.

将制得黑杨植物细胞透射电镜样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，黑杨细胞透射电镜观察结构如图2A所示。

电镜观察结果表明：

1、本发明方法获得的黑杨切片透射电镜图中黑杨组织细胞的微细结构信息清楚、完整，细胞微细结构清晰，各层间的界限清晰，对比度高。

2、本发明的黑杨透射电镜超薄切片透射电子显微图像中污染物少，黑杨组织细胞壁和细胞腔内均无污染物，图像清晰度优于传统的制样方法（图2B）。

3、本发明的黑杨透射电镜切片表面平整光滑，组织细胞饱满、结构完整、无形变和破坏，而且透射电镜切片厚度均匀适中，切片没有皱褶和搓板样震颤，黑杨植物组织切片完整，保证了植物细胞中的结构信息的完整保留，而按照传统方法制备的黑杨电镜切片厚度差异大，切片褶皱多，表面粗糙，植物组织细胞结构部分被破坏。

实施例3  乌拉草（Carex meyeriana）薄壁细胞透射电子显微镜样品制备

1、软化处理

除了植物选用乌拉草茎，对乌拉草茎煮25min，在温度为15℃的超纯水中浸泡1h之外，其余与实施例1相同；

2、脱水处理

除了采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水20min；采用体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水10min；采用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水7min；采用体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水5min；采用体积百分比浓度为100%的乙醇浸泡脱水2次，每次脱水时间2min之外，其余与实施例1相同；

3、置换处理

除了环氧丙烷-乙醇混合溶液、纯环氧丙烷分别浸泡3min之外，其余与实施例1相同；

4、渗透处理

除了第一阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.07MPa，渗透时间为10h；第二阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.06MPa，渗透时间为10h；第三阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.04MPa，渗透时间为10h；第四阶段的渗透处理阶段的绝对压力为0.01MPa，渗透时间为24h之外，其余与实施例1相同；

5、切片处理

与实施例1相同；

6、染色处理

除了每100ml超纯水中加入1.5g柠檬酸钠，每100ml的柠檬酸钠溶液中加入1.5g的高锰酸钾之外，其余与实施例1相同.

将制得乌拉草薄壁细胞透射电镜样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，乌拉草薄壁细胞透射电镜观察结构如图3A所示。

电镜观察结果表明：

1、本发明方法获得的乌拉草切片透射电镜图中乌拉草组织细胞的微细结构信息清楚、完整，细胞微细结构清晰，各层间的界限清晰，对比度高。

2、本发明的乌拉草透射电镜超薄切片透射电子显微图像中污染物少，除了乌拉草的细胞腔中原生质被高锰酸钾染色形成黑色沉淀物之外，乌拉草组织的细胞壁表面没有任何的污染物，图像清晰度，能够清楚的区分出乌拉草细胞壁的各个形态区域，并且可以看出木质素形成的颗粒状沉积，优于传统的制样方法（图3B）。

3、本发明的乌拉草透射电镜切片表面平整光滑，组织细胞饱满、结构完整、无形变和破坏，而且透射电镜切片厚度均匀适中，切片没有皱褶和搓板样震颤，乌拉草植物组织切片完整，保证了植物细胞中的结构信息的完整保留，而按照传统方法制备的乌拉草电镜切片厚度差异大，切片褶皱多，表面粗糙，植物组织细胞结构部分被破坏。

对照例1  传统方法制备红瑞木纤维细胞透射电子显微镜样品

1、软化处理

1A）将植物红瑞木（Cornus alba)在体视显微镜下用双面刀片将样品分割成尺寸为0.1cm×0.1cm×0.5cm（长×宽×高）的细长条，制成红瑞木条；

1B）将红瑞木条置于超纯水中，加热煮沸，在保持超纯水沸腾的条件下，对红瑞木条煮20min；

1C）将煮制后的红瑞木置于温度为（20℃）的超纯水中浸泡1小时；

1D）重复步骤1B）、1C）直至红瑞木条沉入超纯水中，制得植物组织中气体排尽的软化样品，即软化红瑞木条。

2、脱水处理

将软化红瑞木条依次置于体积百分比浓度为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液中，浸泡、逐步脱除红瑞木中的水分，制得乙醇红瑞木条，其中采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水时间为15min；采用体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水时间为10min；采用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水时间为5min；采用体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水时间为3min,；采用体积百分比浓度为100%的乙醇（即无水乙醇）浸泡脱水2次，每次脱水时间为1min。

3、渗透处理

将脱水后的乙醇红瑞木条依次置于Spurr树脂与乙醇体积比为1:1、2：1、3:1的Spurr树脂-乙醇混合溶液、纯Spurr树脂中，依次分别浸泡12h、24h、24h、36h，Spurr树脂逐渐渗透到红瑞木条中，逐级取代乙醇红瑞木条中的乙醇，制得Spurr树脂渗透红瑞木条。

4、切片处理

4A）将树脂渗透红瑞木条置于包埋板（北京新兴百瑞技术有限公司）中，加入纯的Spurr树脂使之浸满包埋板的凹槽，在70℃条件下，使Spurr树脂进行聚合处理，聚合处理12小时后制得含有红瑞木条的包埋块；

4B）利用超薄切片机沿着红瑞木条的轴向将含有红瑞木条的包埋块切成厚度为90nm的红瑞木透射电镜切片，切片置于含有蒸馏水的样品池中，备用。

5、染色处理

5A）在室温下将具有支持膜的铜网（孔径为200目）置于丙酮中浸泡1-2分钟。重复2次，浸泡后的铜网置于密封的样品盒中待用；

用镊子夹住铜网边缘，将铜网深入到悬浮有红瑞木透射电镜切片的样品池的底部，然后将切片捞于铜网中部；

5B）将高锰酸钾加入到超纯水中，搅拌，溶解均匀，制得高锰酸钾溶液，其中每100ml的超纯水中加入1g的高锰酸钾；

然后将高锰酸钾溶液置于离心机中进行离心处理（转速：2000rpm，离心时间：5min），离心后的上清液经过过滤精度为0.22μm水系过滤头过滤，制得染色剂，备用；

5C）用毛细吸管吸取制备好的染色剂5-10μl，滴于附着有石蜡封口膜（Parafilm）的载玻片上，使之形成液珠。用镊子轻轻夹住附着有样品的铜网边缘，然后将附着有样品的一面反扣于染色剂形成的液珠表面，染色处理30s后用超纯水冲洗2次，去除红瑞木切片表面的染色剂，然后将样品在光纤照明灯下照射30秒，除去铜网表面多余水分，制得红瑞木植物细胞透射电镜染色样品。

将制得红瑞木植物细胞透射电镜染色样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，红瑞木透射电镜观察结构如图1B所示，电镜观察结构图中污染物多，切片破损，图片模糊，分层结构信息被部分掩盖；透射电镜切片表面粗糙，有明显的皱褶和搓板样震颤。

对照例2  传统方法制备黑杨纤维细胞透射电子显微镜样品

除了植物选择黑杨条，软化处理过程中对黑杨条煮30min，25℃超纯水中浸泡2h；脱水处理过程中采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水25min；体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水15min；体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水10min；体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水5min；体积百分比浓度为100%的乙醇浸泡脱水2次，每次脱水时间为3min；渗透处理过程中依次分别渗透浸泡12h、24h、24h、36h之外，其余与对照例1相同。

将制得黑杨植物细胞透射电镜染色样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，黑杨透射电镜观察结构如图2B所示，电镜观察结构图中污染物多，切片破损，图片模糊，分层结构信息被部分掩盖；透射电镜切片表面粗糙，有明显的皱褶和搓板样震颤。

对照例3  传统方法制备乌拉草纤维细胞透射电子显微镜样品

除了植物选择乌拉草，软化处理过程中对黑杨条煮25min，15℃超纯水中浸泡1h；脱水处理过程中采用体积百分比浓度为30%的乙醇溶液浸泡脱水20min；体积分比浓度为50%的乙醇溶液浸泡脱水10min；体积百分比浓度为70%的乙醇溶液浸泡脱水7min；体积百分比浓度为90%的乙醇溶液浸泡脱水5min；体积百分比浓度为100%的乙醇浸泡脱水2次，每次脱水时间为2min；渗透处理过程中依次分别渗透浸泡12h、24h、24h、36h，染色处理过程中每100ml的超纯水中加入1.5g的高锰酸钾之外，其余与对照例1相同。

将制得乌拉草植物细胞透射电镜染色样品置于透射电子显微镜下，进行透射电镜观察，乌拉草透射电镜观察结构如图3B所示，电镜观察结构图中污染物多，切片破损，图片模糊，木质素的颗粒状沉积不能清楚的观察到，分层结构信息被部分掩盖；透射电镜切片表面粗糙，有明显的皱褶和搓板样震颤。

Claims (10)

1.一种植物组织透射电镜样品的制备方法，其特征是包括在真空状态下对植物组织样品进行Spurr树脂的渗透处理。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述真空状态的绝对压力低于0.09MPa。

3.一种植物组织透射电镜样品的制备方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1）软化处理

将植物样品于沸水中煮制处理后置于超纯水中进行浸泡，重复煮制和浸泡直至植物样品沉入水底，制得软化植物组织

2）脱水处理

将软化植物组织置于体积百分比浓度为30-100%的乙醇溶液中浸泡，脱除植物组织中的水分，制得乙醇植物组织；

3）置换处理

将乙醇植物组织依次置于环氧丙烷与乙醇的混合溶液、环氧丙烷换剂中，浸泡，脱出乙醇直至环氧丙烷完全置换出乙醇，制得环氧丙烷植物组织；

4）渗透处理

将环氧丙烷植物组织依次置于Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂中浸泡，进行渗透处理，Spurr树脂渗透到植物组织细胞中，制得树脂渗透植物组织。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是在进行所述的软化处理之前包括：在体视显微镜下利用双面刀片将植物样品切成0.1cm×0.1cm×0.5cm大小的细长条。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征是步骤2）中所述乙醇溶液的体积百分比浓度依次为：30%、50%、70%、90%、100%。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征是步骤3）中进行所述置换处理过程中环氧丙烷和乙醇混合溶液中环氧丙烷与乙醇的体积之比为1-3:1。 

7.如权利要求3或4所述的方法，其特征是在所述步骤4）中在真空度状态下进行所述的渗透处理。

8.如权利要求3或4所述的方法，其特征是步骤4）中所述Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液中Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比为：1-3:1。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征是还包括对树脂渗透植物组织进行切片处理后将样品薄片平铺于铜网上，然后进行染色处理。

10.如权利要求9所述的方法，其特征是所述染色处理所使用的染色剂是质量体积百分比浓度为1-1.5%的高锰酸钾-柠檬酸钠溶液。 

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