CN102827794A - 一株地中海假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株地中海假单胞菌及其应用，它涉及一株地中海假单胞菌及其应用。它为一株地中海假单胞菌(Pseudomonds mediterranea）MJM-3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CGMCC NO.6292。一株地中海假单胞菌作为菌肥用于作物栽培上。用于作物栽培上。该菌株具有ACC脱氨酶活性，同时还能分泌植物生长素IAA及嗜铁素。因此能降低逆境条件下植物体内乙烯浓度，促进植物根系的生长发育，促进植物铁吸收，改善植物生长状况。该菌株应用于农业生产可以促进植物生长，提高作物的产量，增强抗逆能力。

Description

一株地中海假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株地中海假单胞菌及其应用。

背景技术

世界上存在着大面积盐碱土地和次生盐渍化土壤。随着人口、粮食、土地及能源矛盾的加剧，尤其随着一些大型水利工程的修建，次生盐渍化问题越来越严重，因此对盐渍化土地的开发和防治次生盐渍化问题十分迫切。

土壤盐碱化是人类面临的生态危机之一。盐胁迫不仅会影响植物生长发育和产量，并且高浓度盐胁迫会造成植物生物量降低甚至死亡。盐碱胁迫几乎会影响植物每个重要生理过程，盐胁迫条件下，植物生长受抑制，新陈代谢受到影响，光合作用中光合链被破坏，导致大量积累电子，致使植物细胞内的线粒体、叶绿体和过氧化物体上产生大量内源活性氧，活性氧使线粒体和叶绿体受到伤害，破坏体内蛋白、核酸等生物大分子，诱发细胞膜脂过氧化，破坏细胞离子平衡，致使新陈代谢紊乱。其中碱胁迫在盐胁迫的基础上还增加了高pH，所以对植物的影响比盐更严重，甚至导致植物死亡。

目前土壤修复的方法主要有物理、化学和生物学的方法，采取物理、化学法去除法往往耗资巨大，而且会伴有二次污染的产生，不适于处理大面积的污染。微生物治理法需要特定的培养和技术条件，实施起来往往达不到预期实验效果。目前研究人员基本是通过品种间杂交等常规手段选育抗逆性品种，对现有植物物种进行抗逆性筛选，利用现代生物技术创造新的抗逆性品种的途径开展抗逆性育种工作。通过对种子和幼苗进行抗逆性锻炼，合理施肥，化学调控及其他措施来改进栽培措施提高植物抗逆性。而近些年来，通过接种有益微生物提高植物抗逆性的研究，越来越引起人们的关注。接种菌根真菌(mycorrhizal fungi)。菌根(mycorrhiza)是土壤中的一类真菌与高等植物的根系所建立的互惠共生体，参与菌根形成的真菌称为菌根真菌。而某些真菌无法纯培养，菌剂的生产周期长，耗费大，接种技术实施困难，不能播种，只能大量移栽它的宿主植物，且有自然条件下接种效果不稳定等因素，一定程度上制约了其大面积的实际推广应用。

发明内容

本发明的目的是为了提供一株地中海假单胞菌及其应用。

本发明的一株地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CGMCCNO.6292。

本发明的一株地中海假单胞菌作为菌肥用于作物栽培上。

本发明地中海假单胞菌（Pseudomonnas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，该菌株在ADF培养基上形成圆形、不透明、淡黄色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落（如图1所示）。

根据《常见细菌***鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株MJM-9进行革兰氏染色、接触酶、甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、柠檬酸盐作用生理生化实验的检测和鉴定。结果表明地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，表现出接触酶阳性，淀粉水解阴性，吲哚实验表现为阳性，甲基红、乙酰甲基甲醇、柠檬酸盐作用实验表现为阴性。

本发明包含以下有益效果：

本发明的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3具有ACC脱氨酶活性，产生植物生长激素IAA，合成嗜铁素；可在盐碱胁迫环境中有效地促进植物营养吸收、调节植物生长以及提高植物在逆境条件下抗逆能力。其在作物栽培上的应用，能够增进肥效，提高产量。

本发明的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3可以通过间接分泌铁载体等方式抑制或减轻植物病害对植物产生不良影响，并通过产生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和调节植物生长。本发明的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3含有的1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶的PGPR能水解植物体内生物合成乙烯的直接前体ACC，产生羟基丁酸和氨，阻止乙烯的释放。当这种菌附着在种子表皮时，它能水解ACC，降低种子在逆境条件下大量产生的植物生长抑制剂和植物衰老剂-乙烯浓度，促进根的伸长和植物生长。

附图说明

图1为地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3在ADF培养基上生长的菌落形态照片；

图2表示地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3在不同浓度色氨酸条件下IAA合成含量变化柱状图；

图3表示地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3嗜铁素检测平板效果照片；

图4表示地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3在盐碱胁迫条件下对苜蓿促生效果照片；其中，CK为对照组苜蓿促生效果照片，MJM-3为地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3苜蓿促生效果照片；

图5表示地中海假单胞菌（Pseudomonas meditrranea）MJM-3在盐碱胁迫条件下对小麦促生效果照片；其中，CK为对照组小麦促生效果照片；MJM-3为地中海假单胞菌

（Pseudomonas mediterranea）MJM-3小麦促生效果照片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CGMCC NO.6292。

本实施方式地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，该菌株在ADF培养基上形成圆形、不透明、淡黄色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落（如图1所示）。

根据《常见细菌***鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株MJM-9进行革兰氏染色、接触酶、甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、柠檬酸盐作用生理生化实验的检测和鉴定。结果表明地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，表现出接触酶阳性，淀粉水解阴性，吲哚实验表现为阳性，甲基红、乙酰甲基甲醇、柠檬酸盐作用实验表现为阴性。

本实施方式的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3具有ACC脱氨酶活性，产生植物生长激素IAA，合成嗜铁素；可在盐碱胁迫环境中有效地促进植物营养吸收、调节植物生长以及提高植物在逆境条件下抗逆能力。其在作物栽培上的应用，能够增进肥效，提高产量。

本实施方式的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3可以通过间接分泌铁载体等方式抑制或减轻植物病害对植物产生不良影响，并通过产生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和调节植物生长。本发明的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3含有的1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶的PGPR能水解植物体内生物合成乙烯的直接前体ACC，产生羟基丁酸和氨，阻止乙烯的释放。当这种菌附着在种子表皮时，它能水解ACC，降低种子在逆境条件下大量产生的植物生长抑制剂和植物衰老剂-乙烯浓度，促进根的伸长和植物生长。

具体实施方式二：本实施方式的一株地中海假单胞菌作为菌肥用于作物栽培上。

本实施方式的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3具有ACC脱氨酶活性，产生植物生长激素IAA，合成嗜铁素；可在盐碱胁迫环境中有效地促进植物营养吸收、调节植物生长以及提高植物在逆境条件下抗逆能力。其在作物栽培上的应用，能够增进肥效，提高产量。

本实施方式的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea MJM-3可以通过间接分泌铁载体等方式抑制或减轻植物病害对植物产生不良影响，并通过产生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和调节植物生长。本发明的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3含有的1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶的PGPR能水解植物体内生物合成乙烯的直接前体ACC，产生羟基丁酸和氨，阻止乙烯的释放。当这种菌附着在种子表皮时，它能水解ACC，降低种子在逆境条件下大量产生的植物生长抑制剂和植物衰老剂-乙烯浓度，促进根的伸长和植物生长。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

试验1、菌株筛选

本发明的一株地中海假单胞菌是通过以下步骤筛选得到的：

（1）取1g种植苜蓿的黑龙江地域根际农田土，放入50mL的PAF培养基中，在28℃温度下振荡培养24h；

（2）取1mL步骤（1）培养后的PAF培养液，放入50mL新的PAF培养基中，在28℃温度下继续振荡培养24h；

（3）取1mL步骤（2）培养后的PAF培养液，放入50mL DF盐培养液A中，在28℃温度下振荡培养24h；

（4）取1mL步骤（3）培养后的DF盐培养液，放入50mLADF培养液中，在28℃温度下振荡培养48h；

（5）取1mL步骤（4）培养后的的培养液，涂布于ADF琼脂培养基上，在28℃温度下振荡培养72h，取培养基上生长的单菌落进行纯化；

（6）对步骤（5）纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到ADF培养基上保存备用；

其中，步骤（1）和（2）中所述的PAF培养基为：由10g的蛋白胨、10g的酪蛋白水解物、1.5g的MgSO₄、1.5g的K₂HPO₄和10mL的甘油组成；

步骤（3）中所述的DF盐培养液为：称取4.0g的KH₂PO₄、6.0g的Na₂HPO₄、0.2g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的FeSO₄·7H₂O、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、2.0g的(NH₄)₂SO₄、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；将上述DF盐培养液成份加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL；

步骤（4）和（6）中所述的ADF培养液为：称取4.0g的KH₂PO₄、6.0g的Na₂HPO₄、0.2g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的FeSO₄·7H₂O、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；向上述组分中加入蒸馏水溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL，高温灭菌后加入1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），使其终浓度为3.0mmol/L。

步骤（5）中的ADF琼脂培养基为：向1L的步骤（4）和（6）的ADF培养液加入15g琼脂。

试验2、菌株鉴定：

对筛选得到的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3进行生理生化鉴定，和分子鉴定。

2.1生理生化鉴定

本发明地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，该菌株在ADF培养基上形成圆形、不透明、淡黄色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落（如图1所示）。

根据《常见细菌***鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株MJM-9进行革兰氏染色、接触酶、甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、柠檬酸盐作用生理生化实验的检测和鉴定。结果表明地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3为革兰氏阴性菌，表现出接触酶阳性，淀粉水解阴性，吲哚实验表现为阳性，甲基红、乙酰甲基甲醇、柠檬酸盐作用实验表现为阴性。

2.2分子鉴定

对上述试验筛选得到的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3进行分子鉴定是按照以下步骤进行的：对上述得到的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3纯化菌株采用碱裂解法进行ACC脱氨酶的苜蓿根际促生菌株的DNA提取，利用引物F8和R1541，以提取的DNA为模版，进行PCR扩增，然后委托北京Invitrogen生命科技有限公司测序；其中，PCR扩增引物序列如下：

F8：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

F1541：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。

地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的16S rDNA长度为830bp（如序列表Seq ID No：1所示），其序列提交至GenBank，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的16S rDNA与荧光假单胞菌属（Pseudomonas mediterranea）的16S rDNA基因序列的保守区相似性达99％。综合生理生化特征和菌落形态特征，确定地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3属于荧光假单胞菌属（Pseudomonas mediterranea），已于2012年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.6292。

上述PCR引物购买自生工生物工程上海有限公司。

试验3、地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的ACC脱氨酶活性测定

3.1培养基配制：

TSB培养基为：17g的胰蛋白胨、3g的大豆胨、5g的NaCl、2.5g的葡萄糖、2.5g的K₂HPO₄溶解到1000mL蒸馏水中，调整pH值至7.5；

ADF培养基：KH₂PO₄ 4.0g、Na₂HPO₄ 6.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·7H₂O 0.1g、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；向上述组分中加入蒸馏水溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL，高温灭菌后加入1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），使其终浓度为3.0mmol/L；

DF培养基为：4.0g的KH₂PO₄、6.0g的Na₂HPO₄、0.2g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的FeSO₄·7H₂O、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；向上述组分中加入蒸馏水溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL。

3.2酶活测定：

酶活测定的具体步骤如下：

（1）挑取经纯培养后的地中海假单胞菌（Pseudomonas meaditerranea）MJM-3单菌落于50mL TSB培养基中，在温度为28℃、转速为180rpm的条件下培养12h；

（2）将步骤（1）培养后的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3在温度为4℃、转速为8000g的条件下离心10min，收集菌体，用50mL不含(NH₄)₂SO₄的DF培养基洗涤菌体3次，然后将全部菌体按接种于ADF培养基中，在温度为28℃、转速为180rpm的条件下培养48h诱导其产生ACC脱氨酶；

（3）将步骤（2）培养后的菌液在温度为4℃、转速为8000g的条件下离心10min，收集菌体，将菌体细胞悬浮于1mL浓度为0.1mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液中，然后转移至1.5mL的离心管中，待用；

（4）将步骤（3）中的离心管在转速为1600g的条件下离心5min，去上清，收集菌体，将菌体重悬于600μL浓度为0.1mol/L、pH为8.5的Tris-HCl溶液中，再加入30μL甲苯，漩涡震荡30s，得菌液；然后取200μL菌液做酶活测定（剩余菌液做蛋白测定）；

同时，设置空白对照：在600μL浓度为0.1mol/L、pH为8.5的Tris-HCl中加入30μL甲苯；

（5）取步骤（4）得到的200μL的菌液，加入20μL浓度为0.5mol/L的ACC溶液震荡30s后，在温度为30℃的条件下培养15min，然后加入1mL浓度为0.56mol/L的HCl溶液混合均匀，在室温（25℃）离心5min，收集上清液，待用；在室温震荡离心5min，收集上清，待用；

（6）取1mL步骤（5）收集的上清与800μL浓度为0.56mol/L的HCl溶液混合均匀，再加入300μL 2,4-二硝基苯肼混合，得混合溶液；将混合溶液在30℃温度下培养30min后，向其中加入2mL浓度为2mol/L的NaOH溶液终止反应，然后以1mL浓度为0、0.1、0.3、0.7、1和2μmol·L^-1的α-丁酮酸为标准液，在吸光值为540nm处进行酶活测定，测得ACC标准曲线，以y=3.7396x-0.0385为方程式，进行ACC合成量的计算；

（7）蛋白含量采用考马斯亮蓝法进行测定；

其中，ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每小时形成α-丁酮酸的量表示，单位为μmolα-KA·(mgPr·h)^-1。酶活性测定均扣除样品对照空白后计算，重复3次。

结果显示地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3具有较高的ACC脱氨酶活性，高达29.78μmolα-KA·(mgPr·h)^-1。

试验4、地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的IAA合成含量测定：

（1）取地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3于DF培养基中，在温度为28℃、转速为180rpm的条件下培养2d；

（2）取步骤（1）中地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3培养液100μL分别转入到含有不同浓度（0、50、100、200和500μgL-Trp·mL^-1）色氨酸（L-Trp）的DF培养基中，然后在温度为28℃、转速为180rpm的条件下培养2d；

（3）取步骤（2）中地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3培养液进行OD₆₀₀值测定，然后将其余培养液在室温、转速为8000rpm的条件下离心10min，取500μL上清液加入2mL的Salkowsk试剂，室温培养20min后，在535nm处测吸光值；

同时，用对不含地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的DF培养基采用步骤（3）的方法进行相同处理作为对照组；

（4）以不同浓度（0.01、0.05、0.25和0.5mg·mL^-1）的IAA溶液为标准液，以对照组进行调零，在535nm处测吸光值，测得标准曲线，以y=0.1729x-0.0098方程，进行ACC合成量的计算；

其中，DF培养基为：称取4.0g的KH₂PO₄、6.0g的Na₂HPO₄、0.2g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的FeSO₄·7H₂O、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、2.0g的(NH₄)₂SO₄、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；向上述组分中加入蒸馏水溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL。

结果如图2所示，由图2可知，地中海假单胞菌（Pseudomonds mediterranea）MJM-3能产生吲哚乙酸，且合成吲哚乙酸量随着L-Trp浓度的增加而增加，具体在浓度为0、50、100、200、500μg L-Trp·mL^-1中的吲哚乙酸量分别为0.55、7.49、12.07、26.65、36.24μg(mL·OD₆₀₀)^-1。

试验5、地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3菌株的嗜铁素合成含量测定

5.1嗜铁素合成含量定性检测：参照Schwyn和Neilands的方法，将地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3接于铬奥醇CAS (chrome azurol S)平板培养基上，在温度28℃的条件下培养48~72h，观察菌落周围的颜色变化，有橘黄色圈产生，则证明有嗜铁素产生；

其中，铬奥醇CAS平板培养基制备方法如下：

CAS蓝色染液：

溶液A：将0.06g的CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL浓度为1mmol·L^-1的FeCl₃溶液(含10mmol·L^-1的HCl)；

溶液B：将0.073g的十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HDTMA)溶于40mL去离子水中；

将溶液A沿着烧杯壁缓缓加入到溶液B中，轻轻晃动混匀溶液A和溶液B，得到CAS蓝色染液，备用；

溶液a：将15g的KH₂PO₄、25g的NaCl和50g的NH₄Cl溶于500mL去离子水；

溶液b：质量百分含量为20%的葡萄糖溶液：将20g葡萄糖溶于100mL去离子水；

溶液c：将25g的NaOH溶于150mL去离子水；

酸性酪蛋白水解物溶液：将3g酸性酪蛋白水解物溶于27mL去离子水，然后采用0.22μm的滤膜过滤灭菌；

铬奥醇CAS平板培养基的配制如下：量取100mL溶液a与750mL去离子水混合，向其中加入32.24g的PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸）；加入细菌培养专用琼脂（购买自百特生物公司）15g，然后在120℃温度下，灭菌15min；待溶液冷却至50℃加入30mL酸性酪蛋白水解物溶液，10mL的溶液b，再缓慢加入100mL的CAS蓝色染液，充分混匀，倒平板，即得CAS平板培养基；其中，在加入PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸）时，由于PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸）在pH小于5以下不溶，应调节溶液酸碱度在缓慢加入PIPES，并不断搅拌，最终用溶液c将溶液调到pH=6.8。

5.2嗜铁素合成含量定量分析：将上述“嗜铁素合成含量定性检测”中可产生橘黄色圈的单菌落接种于MKB培养基中，然后放入摇床中，在温度为28℃、转速为180r·min^-1的条件下培养48h，然后将培养后的菌液在温度为28℃、转速为1000rpm的条件下离心10min，取上清液，以1:1的体积比向上清液中加入CAS检测液，充分混匀，静止1h后，在630nm处测吸光值(A)，以去离子水与CAS检测液等体积混合后，在630nm处测吸光值(Ar)为对照，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量；该值越低，表明嗜铁素含量越高；

其中，MKB培养基为：称取5g的酸解酪蛋白，15mL的甘油，2.5g的K₂HPO₄，2.5g的MgSO₄·7H₂O；将上述组分加入到蒸馏水中溶解，调节pH至7.2，定容至1000mL，然后在121℃温度下，灭菌20min；

CAS检测液的制备如下：

1、将0.182g CTAB溶于50mL去离子水；

2、将0.0054g FeCl·6H₂O溶于2mL浓度为10mM的HCl水溶液；

3、将0.0605g铬天青S溶于50mL去离子水；

4、将1.5mL步骤2得到的溶液与7.5mL步骤3得到的溶液混合，再与6mL步骤1得到的溶液混合，得到混合液；

5、将4.307g的PIPES用20~30mL去离子水溶解，加入6.25mL浓HCl，调pH为5.6；

6、将全部步骤4得到的溶液和全部步骤5得到的溶液混合，并用去离子水定容至溶100mL，即得CAS检测液。

结果如图3所示，菌落周围有橘黄色圈产生，证明假单胞菌（Pseudomona sp.）MJM-9能够合成嗜铁素。

样品中嗜铁素的相对含量A/Ar为1.15，表明地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3具有一定的合成嗜铁素的能力。

试验6、地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3盆栽苜蓿促生试验

6.1土样采集

本发明所用土样均取自黑龙江省大庆市采油厂附近盐碱土。采集样品时在每个区域内设置5个样方，每个样方面积为1×1m²，收集表层土壤（0~20cm），土壤混合后，装入事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回试验室，土壤经碾碎，混匀，风干后过筛保存。供试土壤的理化性质见表1。

表1供试土壤理化性质

6.2盆栽苜蓿促生试验方法

（1）将保存的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-9在ADF固体培养基上活化；

（2）挑取步骤（1）中活化后的单菌落于LB培养基中，在温度为28℃、转速为180rpm的条件下振荡培养24h，用无菌水调节菌液浓度至1×10¹⁰cfu/mL，即为悬液A，备用；

（3）将苜蓿种子（龙牧803苜蓿，购买自黑龙江省农科院）预先用10%(V/V)次氯酸钠进行表面消毒10min，再用无菌水洗涤3次以上，然后放入步骤（2）得到的悬液A中浸泡1h；

同时将苜蓿种子经无菌水浸泡处理1h，作为对照（CK）；

（4）将步骤（3）处理后的种子均匀播种于同一规格的花盆中，每盆20株，重复5次，室温培养；

（5）一周内测定发芽势，40天后测定株高、根长、地上植株干重、地下根系干重。

统计结果如表2所示，盆栽效果如图4所示。

表2地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3对苜蓿促生作用的生物量测定

由表2可知，在地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的作用下，苜蓿种子的发芽率提高了近30%，小麦植株的株高增高了近25%，根长增长了近22%，地上部分植株鲜重分别增加了31%、干重增加了近52%，而地下部分根系鲜重增加了近32%、干重增加了近1.4倍，促生效果显著。

由图4可知，接菌盆栽的植株较未接菌的盆栽长势要好，植株更为健壮，促生效果明显。

试验8、地中海假单胞菌（Pseudomonas meaditerranea）MJM-3盆栽小麦促生试验

本试验所用土样试验7。

本试验的盆栽小麦促生试验方法如下：

（1）将保存的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3在ADF固体培养基上活化；

（2）挑取地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3单菌落于LB培养基中，在温度为28℃，转速为180rpm条件下振荡培养24h，用无菌水调节使菌液浓度为1×10¹⁰cfu/mL，即为悬液A，备用；

（3）将小麦种子（中国春，黑龙江省农业科学院）预先用10%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤3次以上，浸泡于悬液A中处理1h；

同时将小麦种子经无菌水浸泡处理1h，作为对照（CK）；

（4）将步骤（3）中处理后的种子均匀播种于同一规格的花盆中，每盆10株，重复5次，室温（25℃）培养；定期将制备好的悬液A用无菌水调节使菌液浓度至1×10⁹cfu/mL，即得悬液B，取50mL悬液B均匀浇灌于小麦苗根部周围；

对照组（CK）处理为：将步骤（3）中处理后的种子均匀播种于同一规格的花盆中，每盆10株，重复5次，室温（25℃）培养；用与悬液B等量水浇灌；

（5）一周内测定发芽势，一个月后测定株高、根长、地上植株干重、地下根系干重；

本试验中的ADF培养基为：称取4.0g的KH₂PO₄、6.0g的Na₂HPO₄、0.2g的MgSO₄·7H₂O、0.1g的FeSO₄·7H₂O、2.0g的葡萄糖、2.0g的葡萄糖酸、2.0g的柠檬酸、0.01mg的H₃BO₃、0.0112mg的MnSO₄、0.1246mg的ZnSO₄、0.0782mg的CuSO₄和0.01mg的MoO₃；向上述组分加入蒸馏水溶解后，调整pH值至7.5，定容至1000mL，高温灭菌后加入1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），使1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）终浓度为3.0mmol/L；

LB培养基为：称取5g的酵母粉，10g的蛋白胨，10g的NaCl，定容至1L，调节pH值至7.2。

统计结果如表3所示，盆栽效果如图5所示。

表3地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3对小麦促生作用的生物量测定

由表3可知，在地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3的作用下，小麦种子的发芽率提高了近23%，小麦植株的株高增高了近11%，根长增长了近28%，地上部分植株鲜重分别增加了近21%、干重增加了近29%，而地下部分根系鲜重增加了近4倍、干重增加了近81%，促生效果显著。

由图5可知，接菌盆栽的植株较未接菌的盆栽长势要好，植株更为健壮，促生效果明显。

由此可知，地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3对小麦具有显著的促生作用。测定经地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）MJM-3处理的小麦与对照相比，发芽率、株高、根长、鲜重、干重均有显著提高。

Claims (2)

1.一株地中海假单胞菌，其特征在于它为地中海假单胞菌(Pseudomonas meditrranea）MJM-3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CGMCC NO.6292。

2.如权利要求1所述的一株地中海假单胞菌的应用，其特征在于地中海假单胞菌作为菌肥用于作物栽培上。

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