CN102827222A - 一种泰乐菌素的半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泰乐菌素的半抗原、人工抗原和单克隆抗体及其制备方法与应用。该半抗原含有泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的共有结构部分，并且在所述泰乐菌素人工抗原的制备过程中，利用了引入的羧基与载体蛋白连接，也就是使该共有结构部分远离载体蛋白，充分暴露给动物的免疫识别***。因此，以该人工抗原作为免疫原免疫动物，可获得能同时识别泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的广谱特异性抗体，用于快速免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种泰乐菌素的半抗原、人工抗原和单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
大环内酯类药物是一类具有14～16元环内酯结构的抗生素。自1952年发现代表品种红霉素以来，已有多个品种问世。兽医临床应用的主要有红霉素、泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、吉他霉素、螺旋霉素、竹桃霉素等，其中泰乐菌素、替米考星和泰万菌素为动物专用药物。泰乐菌素对支原体和多种G+菌具有很强的抗菌作用。替米考星具有同泰乐菌素相似的广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌、支原体、螺旋体等有抑制作用。泰万菌素具有比泰乐菌素更强的抗菌作用。因此，这些药物在畜禽养殖中应用非常广泛。
随着这些药物的广泛应用，其在动物性食品中的残留问题也日益突出。例如，为了控制泰乐菌素的残留，欧盟于1999年首先禁止泰乐菌素作为饲料添加剂使用。随后各国相继制定了一系列关于泰乐菌素在各种禽畜产品和蜂蜜中的最高残留限量。中国农业部规定泰乐菌素在牛、猪、鸡的肉中最大残留限量为200μg/kg，牛奶中最大残留限量为50μg/kg。泰乐菌素用于防治蜜蜂幼虫腐臭病时很容易在蜂蜜中残留，且在蜂蜜中残留的泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的半衰期为75天。另外，中国农业部规定替米考星在牛、猪、鸡的肉中最大残留限量为200μg/kg，牛奶中最大残留限量为50μg/kg。因此，非常有必要对动物性食品中这几种动物专用大环内酯类药物的残留进行鉴控。
目前，针对泰乐菌素、替米考星和泰万菌素的残留检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、免疫分析测定法等。其中免疫分析法逐渐脱离昂贵的仪器和繁琐的操作，有很高的精确度、灵敏性和特异性，且对技术要求不高，检测时间短，适用于大批量样品快速检测。因此，免疫分析检测技术已逐渐成为世界各国对有毒有害残留物快速筛选监测的主要方法之一，这为大环内酯类药物的快速检测提供了一种新的途径。免疫分析法的核心试剂是抗体。目前，国内外针对这几种动物专用大环内酯类药物的免疫检测技术，均是利用泰乐菌素或替米考星分子中的羟基直接与载体蛋白连接作为免疫原去制备抗体，所得抗体不能识别其他同类药物。泰乐菌素分子中含有泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的共有结构部分。将此共有结构部分与大分子载体蛋白偶联，突出于载体蛋白的表面，也就是将这一共有结构部分作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫***，能获得同时识别这几种药物及代谢物的广谱性抗体，为建立和研发多残留免疫检测方法或检测产品奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种泰乐菌素的半抗原。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种泰乐菌素的半抗原，其分子结构式如式1所示：
式1。
本发明的目的之二是提供泰乐菌素半抗原的制备方法。
所述的泰乐菌素半抗原的制备方法，包括如下步骤，
(a)将等物质的量的泰乐菌素和6-氨基己酸在水和乙酸的混和液中加热回流反应，得到含半抗原的黄色液体；
(b)将所得黄色液体浓缩蒸发后得固体，重结晶，得到固体的泰乐菌素半抗原。
本发明的目的之三是提供一种泰乐菌素的人工抗原。
一种泰乐菌素的人工抗原，由泰乐菌素半抗原与载体蛋白结合而成，其分子结构式如式2所示：
式2。
所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
本发明的目的之四是提供一种泰乐菌素人工抗原的制备方法。
所述泰乐菌素人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将式1结构的化合物、氯甲酸异丁酯和三正丁胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，在1～15℃下搅拌反应得溶液A；将载体蛋白溶解于磷酸缓冲液中，得溶液B；
(b)将溶液A加入到溶液B中，在1～15℃下搅拌反应过夜，得泰乐菌素的人工抗原。
本发明的目的之五是提供一种泰乐菌素的单克隆抗体。
为了实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案：
一种泰乐菌素的单克隆抗体，是能与泰乐菌素的人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
本发明的最后一个目的是提供上述泰乐菌素单克隆抗体的应用。
所述泰乐菌素的单克隆抗体的应用，是用于泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及脱红霉糖泰乐菌素的免疫检测。
上述式1结构的化合物含有泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的共有结构部分，并且在所述泰乐菌素人工抗原的制备过程中，利用了引入的羧基与载体蛋白连接，也就是使该共有结构部分远离载体蛋白，充分暴露给动物的免疫识别***。因此，以该人工抗原作为免疫原免疫动物，可以获得能同时识别泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素的广谱特异性抗体，用于快速免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。
具体实施方式
下面对本发明做进一步说明：
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得。
实施例1
实验1：式1结构的泰乐菌素半抗原的合成例
(a)向一个三口烧瓶中加入20mL蒸馏水和0.5mL冰醋酸，然后再加入1mmol酒石酸泰乐菌素和1mmol 6-氨基己酸，搅拌溶解，然后加热回流，直至反应液变为黄色。
(b)然后，将黄色溶液在40℃浓缩蒸发，得黄色固体。将黄色固体用10mL乙醇溶解，向该乙醇溶液中加入20mL乙酸乙酯，即析出固体产品，将该沉淀60℃干燥，即得泰乐菌素半抗原。其结构式如式1所示：
式1。
该产物熔点156℃；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)Vmax3350，3399，3200，2973，2929，2830，1619，1530，1500，1390，1110，1066，921，611cm-1。与泰乐菌素的红外数据相比，多出了羧基和直链烷烃。
实验2：式2结构的泰乐菌素人工抗原的合成例1
(a)将0.1mmol的泰乐菌素半抗原溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺中。然后加入约20μL三乙胺和10μL氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应1小时，得A液；将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液。
(b)将溶液A滴加到溶液B中，4℃搅拌反应12小时，得到含泰乐菌素人工抗原的反应液。
(c)将所得反应液转入透析袋，4℃生理盐水透析三天。期间更换透析液9次。
(d)将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用滤径为0.2um的滤膜过滤，得到泰乐菌素的人工抗原，分装于安瓿瓶中，-20℃保存。泰乐菌素的人工抗原结构式如式2所示。
式2。
实验3：式2结构的泰乐菌素人工抗原的合成例2
(a)将0.1mmol的泰乐菌素半抗原溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺中。然后加入约20μL三乙胺和10μL氯甲酸异丁酯，1℃搅拌反应1小时，得A液；将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液。
(b)将溶液A滴加到溶液B中，1℃搅拌反应12小时，得到含泰乐菌素人工抗原的反应液。
(c)将所得反应液转入透析袋，4℃生理盐水透析三天。期间更换透析液9次
(d)将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用滤径为0.2um的滤膜过滤，得到泰乐菌素的人工抗原，分装于安瓿瓶中，-20℃保存。泰乐菌素的人工抗原结构式如式2所示。
式2。
实验4：式2结构的泰乐菌素的人工抗原的合成例3
(a)将0.1mmol的泰乐菌素半抗原溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺中。然后加入约20μL三乙胺和10μL氯甲酸异丁酯，15℃搅拌反应1小时，得A液；将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液。
(b)将溶液A滴加到溶液B中，15℃搅拌反应12小时，得到含泰乐菌素的人工抗原的反应液。
(c)将所得反应液转入透析袋，4℃生理盐水透析三天。期间更换透析液9次
(d)将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用滤径为0.2um的滤膜过滤，得到泰乐菌素的人工抗原，分装于安瓿瓶中，-20℃保存。泰乐菌素的人工抗原结构式如式2所示。
式2。
实施例2、
实验1：抗体的制备
(1)以上述实施例1中制备的泰乐菌素人工抗原作为免疫原，免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射。间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次。
(2)最后一次免疫后7天，选取上述步骤1)中血清效价最高的小鼠脱颈椎处死。无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10∶1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。用泰乐菌素为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞。然后采用有限稀释法获得分泌抗泰乐菌素单克隆抗体的单株杂交瘤细胞。
(3)将上述步骤2)中获得的单株杂交瘤细胞扩大培养，注射到空白小鼠的腹腔中，每只小鼠1×106-2×106个杂交瘤细胞。两周后，采集小鼠的腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行提纯，获得针对泰乐菌素的单克隆抗体。
实验2：抗体性能测定
1、抗体最低检测限(LOD)和半数抑制量(IC50)的测定
用方阵滴定法确定上述实施例2制备的泰乐菌素单克隆抗体和上述实施例1制备的泰乐菌素人工抗原的工作浓度。用系列浓度的泰乐菌素标准品溶液进行间接竞争ELISA试验。标准品溶液的浓度为5.0，10.0，20.0，50.0，100，200，500，1000ng/mL。
间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)：用工作浓度的上述实施例1制备的人工抗原包被酶标板，将系列浓度的泰乐菌素标准品溶液与抗体同时加到酶标板小孔中。同时设置零标准对照孔(将实验溶液换为稀释液，其他一致)和空白对照孔(将抗体溶液换为稀释液，其它一致)。37℃孵育1小时。倒出孔内液体，用10倍稀释的磷酸缓冲液洗涤2-5次。加酶标二抗溶液到酶标板小孔中，37℃孵育1小时。洗涤2-5次后，加入底物显色液到酶标板小孔中，37℃孵育15分钟。用酶标仪在450nm处测定吸光度值(OD)。以吸光度为纵坐标，以标准品溶液浓度的Log值为横坐标，绘制半对数曲线图。
根据标准曲线得出10％抑制量(LOD)和半数抑制量(IC50)，检测灵敏度。抑制率按下式计算：
式中：ODmax为不加标准品实验溶液时的吸光度(即零标准对照孔)，ODx为标准品浓度为x时的吸光度，ODmin为空白对照孔的吸光度。
结果表明，泰乐菌素单克隆抗体对泰乐菌素的半数抑制率量(IC50)为36ng/mL，最低检测限(LOD)为5.5ng/mL。
2、抗体特异性检测
抗体的特异性是指该抗体同半抗原结合的能力与同该半抗原相似物结合能力的比较，常以交叉反应率作为评价的指标。交叉反应率大，说明抗体的特异性广。如果它能与多种半抗原相似物有交叉反应，则为广谱特异性抗体。
将替米考星、泰万菌素及泰乐菌素代谢物脱红霉糖泰乐菌素标准品进行系列稀释，分别与上述实施例2制备的泰乐菌素单克隆抗体进行反应，制作标准曲线。在曲线上分别找到这3种类似物产生50％抑制时的半数抑制量(IC50)，计算泰乐菌素单克隆抗体对这几种类似物的交叉反应率。
交叉反应率(％)＝(泰乐菌素的半数抑制量/其他类似物的半数抑制量)×100％。
实验设三次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明上述实施例2制备的泰乐菌素单克隆抗体能同时识别泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及泰乐菌素分解产物脱红霉糖泰乐菌素，交叉反应率分别为100％，76％，91％，49％。因此，上述实施例2制备的泰乐菌素单克隆抗体是能同时识别这4种目标物的广谱特异性抗体，可以满足对这几种动物专用大环内酯类药物及泰乐菌素代谢物的广谱、高效筛测。
Claims (7)
1.一种泰乐菌素的半抗原，其分子结构式如式1所示：
式1。
2.一种如权利要求1所述的泰乐菌素半抗原的制备方法，包括如下步骤，
(a)将等物质的量的泰乐菌素和6-氨基己酸在水和乙酸的混和液中加热回流反应，得到含半抗原的黄色液体；
(b)将所得黄色液体浓缩蒸发后得固体，重结晶，得到固体的泰乐菌素半抗原。
3.一种泰乐菌素的人工抗原，由权利要求1所述的泰乐菌素半抗原与载体蛋白结合而成，其分子结构式如式2所示：
式2。
4.如权利要求3所述的泰乐菌素的人工抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
5.如权利要求3或4所述泰乐菌素的人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将式1结构的化合物、氯甲酸异丁酯和三正丁胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，在1～15℃下搅拌反应得溶液A；将载体蛋白溶解于磷酸缓冲液中，得溶液B；
(b)将溶液A加入到溶液B中，在1～15℃下搅拌反应过夜，得泰乐菌素的人工抗原。
6.一种泰乐菌素的单克隆抗体，是能与权利要求3或4所述的泰乐菌素的人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
7.如权利要求6所述的泰乐菌素的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体用于泰乐菌素、替米考星、泰万菌素及脱红霉糖泰乐菌素的免疫检测。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103159778A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-19 | 中国农业大学 | 一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用 |
| CN108178777A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-06-19 | 华南农业大学 | 一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用 |
| CN109021094A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-18 | 陕西医药控股医药研究院有限公司 | 一种利用唾液酸人工抗原快速检测流感易感人群的方法以及试纸条 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6506885B1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-01-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to the drug tilmicosin and a method for detecting the same |
| CN1569835A (zh) * | 2004-05-10 | 2005-01-26 | 浙江大学 | 二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 |
| CN1811442A (zh) * | 2006-02-17 | 2006-08-02 | 中国农业大学 | 一种检测泰乐菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
-
2012
- 2012-08-25 CN CN2012103156154A patent/CN102827222A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6506885B1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-01-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to the drug tilmicosin and a method for detecting the same |
| CN1569835A (zh) * | 2004-05-10 | 2005-01-26 | 浙江大学 | 二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 |
| CN1811442A (zh) * | 2006-02-17 | 2006-08-02 | 中国农业大学 | 一种检测泰乐菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIAN K. ZHANG，等: "Production of the monoclonal antibody against tylosin for immunoassay of macrolide antibiotics in milk", 《JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE AND HEALTH, PART B》 * |
| 徐加发，等: "半抗原设计合成研究进展", 《江苏农业学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103159778A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-19 | 中国农业大学 | 一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用 |
| CN103159778B (zh) * | 2013-03-27 | 2015-07-22 | 中国农业大学 | 一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用 |
| CN108178777A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-06-19 | 华南农业大学 | 一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用 |
| CN108178777B (zh) * | 2017-12-28 | 2020-12-11 | 华南农业大学 | 一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用 |
| CN109021094A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-18 | 陕西医药控股医药研究院有限公司 | 一种利用唾液酸人工抗原快速检测流感易感人群的方法以及试纸条 |
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