CN102824385A - 一种楤白皮总皂苷及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种楤白皮总皂苷及其制备方法和应用。楤白皮总皂苷是从楤木的根皮当中提取得到的，其提取为：楤木的根皮经乙醇-水溶液浸渍后加热回流提取，提取液上样于大孔吸附树脂柱，用水洗脱至流出液无色后再用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液干燥后得到楤白皮总皂苷。楤白皮总皂苷对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，能够应用于抗肿瘤药物的制备。

Description

一种楤白皮总皂苷及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物药用活性成分技术领域，涉及一种楤白皮总皂苷及其制备方法和应用。

背景技术

从天然动、植物中寻找低毒、高效的抗癌活性成分是新药研究的重要途径。秦巴山区是我国天然药物资源最为丰富的区域之一，其中一些从秦巴地区太白山某些中草药提取的有效成分已被《美国药典》录入或用于临床肿瘤的治疗之中，因此近年来太白山传统中草药成为新药研究的重点领域。

发明内容

本发明解决的问题在于从太白山中草药中的一种自五加科植物楤木的根皮（亦称飞天蜈蚣七）中提取药用活性成分，提供一种楤白皮总皂苷及其制备方法，所提取的总皂苷具有抗肿瘤活性。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种楤白皮总皂苷，是从楤木的根皮当中提取得到的，其提取为：

楤木的根皮经乙醇-水溶液浸渍后加热回流提取，提取液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液干燥后得到楤白皮总皂苷。

一种楤白皮总皂苷的制剂，以楤白皮总皂苷为药用成分，将其制备成的固体或液体形式的制剂。

所述的固体形式为片剂、颗粒剂、胶囊剂，液体形式为溶液、糖浆剂，

所述的楤白皮总皂苷对肿瘤细胞抑制的应用。

所述的楤白皮总皂苷用于抗肿瘤药物的制备的应用。

一种楤白皮总皂苷的制备方法，包括以下步骤：

1）将楤木的根皮经冲洗、干燥后粉碎，然后加入乙醇-水溶液浸渍8～12h，浸渍后加热回流提取1～5h，回流提取完成后收集提取液，减压回收乙醇，浓缩得到浓缩液；

2）浓缩液加水后搅拌均匀，静止12～24h后抽滤；将滤液上大孔吸附树脂，先用水洗脱至流出液无色，然后再用乙醇-水溶液按照体积浓度30～80%进行梯度洗脱；收集乙醇梯度大于50%洗脱的洗脱液，并回收洗脱液中的乙醇，浓缩得到二次浓缩液；

3）将二次浓缩液喷雾干燥或真空干燥后得到药物干燥粉；

4）将药物干燥粉加水溶解均匀后加入乙酸乙酯萃取，萃取多次后合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到三次浓缩液，三次浓缩液真空干燥后得到楤白皮总皂苷。

所述的乙醇-水溶液中乙醇的体积浓度为30～85%，其余为水。

所述的浓缩液或二次浓缩液的相对密度为1.06～1.10，三次浓缩液的相对密度为0.90～0.95。

所述的大孔吸附树脂为D-101、HPD722、AB-8或DS401树脂柱。

所述的梯度洗脱的流速为0.5～2ml/min，时间为2～24h。

所述的喷雾干燥时采用热风干燥，进风温度为160～180℃，出风温度为70～100℃，雾化器转速为80转/秒至200转/秒；

真空干燥时，真空度为0.09～0.15Mpa，温度为50～80℃干燥20～40小h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的楤白皮总皂苷，是以楤木的根皮（飞天蜈蚣七）作为原料，通过回流提取、树脂分离纯化、乙酸乙酯萃取得到的具有药用活性的总皂苷。该总皂苷能够作为药用成分通过制剂得到中成药，方便使用，提高药用的安全性。

本发明提供的楤白皮总皂苷对肿瘤细胞具有明显的抑制作用：楤白皮总皂苷进行了抗肿瘤提取物对体外培养的H22肝癌细胞、FBL3白血病细胞和B16黑色素瘤细胞均具有明显的抑制作用，楤白皮总皂苷体外对FBL₃和B₁₆细胞的作用IC₅₀分别为0.199g·L^-1和0.0774g·L^-1；在上述浓度下，对H₂₂细胞的抑制率均超过80%，能够应用于抗肿瘤药物的制备。

本发明提供的楤白皮总皂苷具有较高的安全性：楤木皂苷一次性灌胃给药的LD50为3265mg/kg，LD50的95％可信限为2931～3639mg/kg。

附图说明

图1为分光光度法的检测楤白皮总皂苷浓度和吸光度关系曲线；

图2为楤白皮总皂苷不同时间点对FBL3细胞的抑制作用；

图3为楤白皮总皂苷对H22、B16和FBL3肿瘤细胞的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供一种楤白皮总皂苷及其制备方法和应用，从传统太白山中草药飞天蜈蚣七中提取具有药用效果的总皂苷。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

传统太白山中草药飞天蜈蚣七是采用采挖的根皮切成厚片或小节，干燥而成，具有活血止痛、祛瘀除痹等作用。

利用飞天蜈蚣七提取楤白皮总皂苷的制备方法如下：

楤木的根皮经乙醇-水溶液浸渍后加热回流提取，提取液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液干燥后得到楤白皮总皂苷。

下面通过具体的实施例对楤白皮总皂苷的制备方法进行说明。

实施例1

楤白皮总皂苷的制备方法，包括以下步骤：

取选好的飞天蜈蚣七1000克分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到乙醇-水体系中先浸渍，浸渍后回流；其中乙醇-水体系中乙醇浓度为30%，其余为水，浸渍时间8小时，回流提取温度为80℃，共提取两次（第一次提取完成后收取提取液，然后再加入与第一次提取相同的乙醇-水溶液在相同条件下提取），每次2小时，乙醇-水体系用量为8000ml，即乙醇-水体系：飞天蜈蚣七=1g/8ml；提取完成后，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.06至1.10（60℃测），得到浓缩液2000ml；

加浓缩液量一半量水1000ml，搅拌均匀，静止24小时，抽滤；滤液上D-101树脂柱，先用水洗脱至无色，洗脱液弃去，再用乙醇溶液梯度洗脱，洗脱梯度为50%～80%（体积浓度计），洗脱的流速为0.5ml/min，时间为4小时，50%乙醇洗脱液弃去，合并60%、70%、80%梯度洗脱液；合并洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度1.06-1.10（60℃测）；

喷雾干燥或真空干燥采用喷雾干燥则进风温度为160-180℃，出风温度为70-100℃，雾化器转速为80转/秒至200转/秒；若采用真空干燥，则真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥20-40小时；得药物干燥粉170克；

取药物干燥粉，加水适量溶解均匀后加乙酸乙酯一半量900ml萃取，萃取三次（每次加入量为900ml），合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至溶液相对密度0.90-0.95（50℃测），浓缩液进行真空干燥真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥10-20小时；即得中草药提取物楤白皮总皂苷80克。

楤白皮总皂苷抗肿瘤疾病方面有效成分为皂苷类，含齐墩果酸和糖生成的皂甙。用紫外分光光度法以齐墩果酸-3-O-β-Ｄ-吡喃葡萄糖醛酸苷为对照，分光光度检测结果如图1所示，可以根据图中所示曲线进行计算，或者重新测定标准曲线（检测波长为238nm）；提取物中测定楤白皮总皂苷以齐墩果酸-3-O-β-Ｄ-吡喃葡萄糖醛酸苷计不得少于30%。

实施例2

楤白皮总皂苷的制备方法，包括以下步骤：

取选好的飞天蜈蚣七1000克分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到乙醇-水体系中先浸渍，浸渍后回流；其中乙醇-水体系中乙醇浓度为50%，其余为水，浸渍时间10小时，回流提取温度为85℃，共提取两次，每次1.5小时，乙醇-水体系用量为6000ml，即乙醇-水体系：飞天蜈蚣七=1g/6ml；提取完成后，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.06至1.10（60℃测），得到浓缩液2000ml；

加浓缩液量一半量水1000ml，搅拌均匀，静止24小时，抽滤；滤液上HPD722树脂柱，先用水洗脱至无色，洗脱液弃去，再用乙醇溶液梯度洗脱，洗脱梯度为30%～70%（体积浓度计），洗脱的流速为1ml/min，时间为8小时），50%乙醇洗脱液弃去，合并60%、70%梯度洗脱液；合并洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度1.06-1.10（60℃测）；

喷雾干燥或真空干燥采用喷雾干燥则进风温度为170-175℃，出风温度为80-90℃，雾化器转速为100转/秒至120转/秒；若采用真空干燥，则真空度为0.09Mpa，温度为80℃干燥24小时；得药物干燥粉170克；

取药物干燥粉，加水适量溶解均匀后加乙酸乙酯一半量900ml萃取，萃取三次（每次加入量为900ml），合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至溶液相对密度0.90-0.95（50℃测），浓缩液进行真空干燥真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥10-20小时；即得中草药提取物楤白皮总皂苷80克。

实施例3

楤白皮总皂苷的制备方法，包括以下步骤：

取选好的飞天蜈蚣七1000克分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到乙醇-水体系中先浸渍，浸渍后回流；其中乙醇-水体系中乙醇浓度为85%，其余为水，浸渍时间12小时，回流提取温度为90℃，共提取两次，每次1小时，乙醇-水体系用量为5000ml，即乙醇-水体系：飞天蜈蚣七=1g/5ml；提取完成后，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.06至1.10（60℃测），得到浓缩液；

加浓缩液量一半量水，搅拌均匀，静止24小时，抽滤；滤液上AB-8树脂柱，先用水洗脱至无色，洗脱液弃去，再用乙醇溶液梯度洗脱，洗脱梯度为40%～80%（体积浓度计），洗脱的流速为2ml/min，时间为15小时，50%乙醇洗脱液弃去，合并60%、70%、80%梯度洗脱液；合并洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度1.06-1.10（60℃测）；

喷雾干燥或真空干燥采用喷雾干燥则进风温度为170-175℃，出风温度为80-90℃，雾化器转速为100转/秒至120转/秒；若采用真空干燥，则真空度为0.09Mpa，温度为80℃干燥24小时；得药物干燥粉170克；

取药物干燥粉，加水适量溶解均匀后加乙酸乙酯一半量萃取，萃取三次（每次加入量相同），合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至溶液相对密度0.90-0.95（50℃测），浓缩液进行真空干燥真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥10-20小时；即得中草药提取物楤白皮总皂苷80克。

实施例4

楤白皮总皂苷的制备方法，包括以下步骤：

取选好的飞天蜈蚣七1000克分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到乙醇-水体系中先浸渍，浸渍后回流；其中乙醇-水体系中乙醇浓度为55%，其余为水，浸渍时间9小时，回流提取温度为86℃，共提取两次，每次1.2小时，乙醇-水体系用量为10000ml，即乙醇-水体系：飞天蜈蚣七=1g/10ml；提取完成后，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.06至1.10（60℃测），得到浓缩液；

加浓缩液量一半量水，搅拌均匀，静止24小时，抽滤；滤液上DS401树脂柱，先用水洗脱至无色，洗脱液弃去，再用乙醇溶液梯度洗脱，洗脱梯度为30%～80%（体积浓度计），洗脱的流速为1.6ml/min，时间为24小时，50%乙醇洗脱液弃去，合并60%、70%、80%梯度洗脱液；合并洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度1.06-1.10（60℃测）；

喷雾干燥或真空干燥采用喷雾干燥则进风温度为160-170℃，出风温度为70-90℃，雾化器转速为150转/秒至180转/秒；若采用真空干燥，则真空度为0.15Mpa，温度为50℃干燥40小时；得药物干燥粉；

取药物干燥粉，加水适量溶解均匀后加乙酸乙酯一半量萃取，萃取三次（每次加入量相同），合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至溶液相对密度0.90-0.95（50℃测），浓缩液进行真空干燥真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥10-20小时；即得中草药提取物楤白皮总皂苷80克。

所制备的楤白皮总皂苷的楤木皂苷急性毒性试验：观察楤木皂苷单次灌胃给药的急性毒性作用，探索其致小鼠死亡的剂量范围及LD50值。

其具体的方法为：

昆明小鼠96只，18～22g，雌雄各半。购自西安交通大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（陕）2007-001；在动物房(24℃±3℃)内饲养并观察一周后用于试验。试验前将小鼠随机分成8组，其中7个试验组和1个对照组，每组12只，雌雄各半，组内小鼠体重相差不超过2g。设计7个试验组，其剂量分别为2000mg/kg、2600mg/kg、3380mg/kg、4394mg/kg、5712mg/kg、7426mg/kg、9654mg/kg。小鼠于试验给药前禁食12小时，不限制饮水。试验时给小鼠一次性灌胃给药0.5ml/只，对照组灌胃相同体积蒸馏水，然后连续观察14日。

高剂量（9654mg/kg、7426mg/kg）组小鼠给药3h后开始出现死亡；给药后第一日，小鼠平均体重下降；中等剂量（4394mg/kg、5712mg/kg）下小鼠活动量下降，24h后精神和饮食恢复；在较小剂量（2000mg/kg、2600mg/kg）下，小鼠的饮食，活动及排便等均未见异常。

通过实验我们得出的结论是楤木皂苷一次性灌胃给药的LD50为3265mg/kg，LD50的95%可信限为2931～3639mg/kg。

MTT法检测楤白皮总皂苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用：

分别取对数生长期、CO₂孵箱37℃培养的H22，FBL3和B16细胞，制成单个细胞悬液，使细胞浓度为5000个/孔，接种于96孔板，每孔加100ul的细胞悬液。H22为悬浮细胞，而FBL3和B16则需贴壁生长。因此H22在接种后立即每孔加药（楤白皮总皂苷或阳性对照药DDP）20ul，然后使总体积为200ul，FBL3和B16培养24h待贴壁细胞后加药（楤白皮总皂苷或阳性对照药DDP）。

每个浓度设6个复孔，楤白皮总皂苷的终浓度分别为：0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L。同时设置对照组（不加药）、调零组（加培养基和溶媒）和阳性药顺铂（DDP）组。加药后CO₂孵箱37℃继续培养。

加药培养48h后，每孔加MTT 20ul继续培养4h，悬浮细胞2000r离心10min，弃去上清，每空加入150ulDMSO，在摇床上震荡10min，在酶标仪450nm波长下检测各孔的OD值，按下列公式计算抑制率。

细胞增值抑制率%=[1-（OD_给药组-OD_调零组）/(OD_对照组-OD_调零组)]×100%

在培养48h后，阳性对照药顺铂则对H₂₂、B₁₆和FBL₃细胞的抑制作用均呈现剂量依赖关系；在25～100umol/L范围内，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞生长抑制越明显。

当楤白皮总皂苷在0.025g/L～3.2g/L浓度范围内，作用于FBL₃细胞24h后，如图2所示，药物对肿瘤细胞的抑制作用随浓度的升高有升高的趋势，但量效关系并不十分明显；当药物作用48h后，药物作用表现出了明显的量效关系，药物抑制肿瘤细胞生长的作用呈现明显的S型曲线，也表明药物作用48h后作用明显。因此在后续检测时选择培养48h作为观察时间点。

在0.025g/L～3.2g/L浓度范围内，加入楤白皮总皂苷与H₂₂细胞共同培养48h后，其表现出明显的肿瘤抑制作用，抑制率均在80%以上；与此同时，在0.05g/L～0.4g/L浓度范围内，楤白皮总皂苷对B16细胞的抑制作用则呈现出浓度依赖关系，随着浓度的增加，肿瘤抑制率明显上升，从0上升至80%以上，计算IC₅₀为0.199g/L；在0.025g/L～0.2g/L浓度范围内，对B₁₆细胞抑制率有明显上升，从0上升至80%以上，IC₅₀为0.0774g/L，见图3。

楤白皮总皂苷的制剂

用现有的成熟技术制备成的固体或液体形式的制剂，其中楤白皮总皂苷的含量为0.1%～99%。固体形式为片剂、颗粒剂、胶囊剂，液体形式溶液、糖浆剂。

采用取得的楤白皮总皂苷加入重量为1～1.5%淀粉后，制粒，制成的片剂、颗粒剂、胶囊剂。

采用取得的楤白皮总皂苷加入适量的药用辅料，制成的液体、糖浆剂。所述的药物辅料包括：甜味剂、芳香剂、胶浆剂、防腐剂、稳定剂。

Claims (10)

1.一种楤白皮总皂苷，其特征在于，是从楤木的根皮当中提取得到的，其提取为：

楤木的根皮经乙醇-水溶液浸渍后加热回流提取，提取液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液干燥后得到楤白皮总皂苷。

2.一种楤白皮总皂苷的制剂，其特征在于，以权利要求1所述的楤白皮总皂苷为药用成分，将其制备成的固体或液体形式的制剂。

3.如权利要求2所述的楤白皮总皂苷的制剂，其特征在于，所述的固体形式为片剂、颗粒剂或胶囊剂，液体形式为溶液或糖浆剂。

4.权利要求1所述的楤白皮总皂苷在抗肿瘤药物的制备的应用。

5.一种楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将楤木的根皮经冲洗、干燥后粉碎，然后加入乙醇-水溶液浸渍8～12h，浸渍后加热回流提取1～5h，回流提取完成后收集提取液，减压回收乙醇，浓缩得到浓缩液；

2）浓缩液加水后搅拌均匀，静止12～24h后抽滤；将滤液上大孔吸附树脂，先用水洗脱至流出液无色，然后再用乙醇-水溶液按照体积浓度30～80%进行梯度洗脱；收集乙醇梯度大于50%洗脱的洗脱液，并回收洗脱液中的乙醇，浓缩得到二次浓缩液；

3）将二次浓缩液喷雾干燥或真空干燥后得到药物干燥粉；

4）将药物干燥粉加水溶解均匀后加入乙酸乙酯萃取，萃取多次后合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到三次浓缩液，三次浓缩液真空干燥后得到楤白皮总皂苷。

6.如权利要求5所述的楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，所述的乙醇-水溶液中乙醇的体积浓度为30～85%，其余为水。

7.如权利要求5所述的楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，所述的浓缩液或二次浓缩液的相对密度为1.06～1.10，三次浓缩液的相对密度为0.90～0.95。

8.如权利要求5所述的楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为D-101、HPD722、AB-8或DS401树脂柱。

9.如权利要求5所述的楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，所述的梯度洗脱的流速为0.5～2ml/min，时间为2～24h。

10.如权利要求5所述的楤白皮总皂苷的制备方法，其特征在于，所述的喷雾干燥时采用热风干燥，进风温度为160～180℃，出风温度为70～100℃，雾化器转速为80转/秒至200转/秒；

真空干燥时，真空度为0.09～0.15Mpa，温度为50～80℃干燥20～40小h。

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