CN102818894A

CN102818894A - 一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡及其制备方法

Info

Publication number: CN102818894A
Application number: CN2012102363570A
Authority: CN
Inventors: 贾东芬; 韩琰旭; 崔德鹏; 陈发荣
Original assignee: Beijing Liujiaoti Science & Technology Development Co Ltd
Current assignee: Beijing Liujiaoti Science & Technology Development Co Ltd
Priority date: 2012-07-09
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡及其制备方法，所述方法包括：测制胶体金；制备胶体金标记抗体；将金标抗体离心纯化处理；将样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理；将金标抗体点样在金标抗体结合垫上；将包被抗体金黄色葡萄球菌稀释，点样在NC膜上；将NC膜、吸水纸、金标抗体结合垫及样品垫依次粘贴在PVC胶板上。本发明大大简化了检验程序，缩短了检测时间，可为食品企业质量控制，工商、卫生、质监等食品***部门现场执法、日常监管及应对细菌性食物中毒突发公共卫生事件提供有力技术支撑，对促进我国食品行业健康发展，保障人民健康方面具有重要意义。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及金黄色葡萄球菌检测领域，尤其涉及一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡。

背景技术

金黄色葡萄球菌是食品卫生微生物常规检测项目之一。由于致病金黄色葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦细菌污染食品，并在合适的温度环境下，细菌可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒。

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的***物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球所引起的中毒事件已成为世界性的公共卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，由此造成的经济损失也相当惨重，所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。

常规方法检测食品中金黄色葡萄球菌首先要根据样品进行富集培养，使被检测金黄色葡萄球菌的数量在样品中达到可检测的水平，然后才能根据食品微生物研究法进行金黄色葡萄球菌的分离，形态特征观察及一系列生理生化特性鉴定，通常这种检测时间需要5天-7天，操作繁琐、检测时间长，不能满足食品卫生监管部门对食物中毒病原菌的快速检测、预警及应对突发公共卫生事件的需要。因此，研究开发金黄色葡萄球菌快速检测技术成为近年来的重点研究方向。

发明内容

为解决上述中存在的问题与缺陷，本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡，所述技术方案如下：

样品垫、金标抗体结合垫、NC膜及吸水纸，所述样品垫、金标抗体结合垫、NC膜及吸水纸设置在PVC胶板上。

用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，所述方法包括：

A 测制胶体金；

B 制备胶体金标记抗体；

C 将金标抗体离心纯化处理；

D 将样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理；

E 将金标抗体点样在金标抗体结合垫上；

F 将包被抗体金黄色葡萄球菌稀释，点样在NC膜上；

G 将NC膜、吸水纸、金标抗体结合垫及样品垫依次粘贴在PVC胶板上。

本发明提供的技术方案的有益效果是：

本发明提供的金黄色葡萄球菌免疫胶体金检测卡，大大简化了检验程序，缩短了检测时间，可为食品企业质量控制，工商、卫生、质监等食品***部门现场执法、日常监管及应对细菌性食物中毒突发公共卫生事件提供有力技术支撑，对促进我国食品行业健康发展，保障人民健康方面具有重要意义。

附图说明

图1是用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法流程图；

图2是检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡结构图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述：

参见图2，一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡，包括样品垫、金标抗体结合垫、NC膜及吸水纸，所述样品垫1、金标抗体结合垫3、NC膜9及吸水纸5设置在PVC胶板6上。所述NC膜上设置有控制线（C线）4和检测线（T线）8。

上述胶体金检测卡在使用过程中，将样品滴加在样品垫上，样品滴加方向2如图1中所示，通过层析，层析方向7如图1所示，层析后通过检测线控制线（C线）和检测线（T线）显示检测结果。

本实施例还提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，（如图2所示）该方法包括：

步骤10 测制胶体金；

步骤20 制备胶体金标记抗体；

步骤30 将金标抗体离心纯化处理；

步骤40 将样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理；

步骤50 将金标抗体点样在金标抗体结合垫上；

步骤60 将包被抗体金黄色葡萄球菌稀释，点样在NC膜上；

步骤70 将NC膜、吸水纸、金标抗体结合垫及样品垫依次粘贴在PVC胶板上。

上述步骤可以通过下述具体实施例实现：

实施例1

测制胶体金：在冷凝回流装置中的圆底烧瓶中加入100ml超纯水和1ml1%的氯金酸溶液，加热至沸腾后加入1ml1%浓度的柠檬酸三钠溶液，观察颜色变化，待颜色稳定时继续反应10min，冷却静置一天，利用粒度仪检测制得粒径为40nm胶体金，其最大吸收峰在526nm。

制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH8.2，取最佳用量金黄色葡萄球菌PBP2a单克隆抗体16μg/ml、终质量浓度为1%的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

将金标抗体离心纯化处理：首先将金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于4℃再8000 r/min离心30min。

溶液分为三层:透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为0.1%吐温20、1%海藻糖、0.5% BSA、0.01mol/L PBS pH7.4溶液。

重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0.1%的叠氮钠4℃保存备用。

将样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后37℃、2小时烘干，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3%%吐温20、2%海藻糖、10%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

将金标抗体点样在金标抗体结合垫上：金标抗体调浓度至OD₅₂₆为5，点样机将金标抗体在结合垫上均匀点样，点样量在30μl/cm²，37℃真空干燥。

检测线抗体和控制线二抗的包被：将包被抗体金黄色葡萄球菌PBP2a检测单抗稀释到0.7mg/ml，二抗稀释度为商品化稀释0.7 mg/ml倍，点样在NC膜上分别划T线和C线，间距为5mm，37℃干燥。

试纸条的组装：将2cm×0.3cmNC膜、1.8cm×0.3cm吸水纸、1cm×0.3cm金标垫、1.5cm×0.3cm样品垫按图1方式依次粘贴在PVC胶板上，即成金黄色葡萄球菌胶体金试纸条。

将金黄色葡萄球菌竞标准品按1倍稀释5倍稀释10倍稀释50倍稀释的浓度依次滴加在金黄色葡萄球菌胶体金试纸条上，用缓冲液作为对照组，观察实验结果。

实施例2

测制胶体金与上述第一实施例雷同，这里不再详细描述。

制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH9.2，取最佳用量金黄色葡萄球菌单克隆抗体16μg/ml、终质量浓度为0.5%的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

金标抗体离心纯化处理：金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于4℃再10000r/min离心30min。

溶液分为三层：透明上清液，管底可流通的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液终质量浓度为0.2%吐温20、2%海藻糖、1%BSA及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

重复离心3次，最后重悬液至原体积的1/20，加入0.1%的叠氮钠4℃保存备用。

样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后37℃、2小时烘干，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.2%吐温20、1%海藻糖、8%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

金标抗体点样在金标抗体结合垫上、检测线抗体和控制线二抗的包被及试纸条的组装与上述第一实施例雷同，这里不再详细描述。

实施例3

测制胶体金与上述第一实施例雷同，这里不再详细描述。

制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH9.2，取最佳用量金黄色葡萄球菌单克隆抗体16μg/ml、终质量浓度为2%的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

金标抗体离心纯化处理：首先将金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于4℃在12000 r/min离心30min。

溶液分为三层:透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为0.5%吐温20、3%海藻糖、2% BSA及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后37℃、2小时烘干，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.5%吐温20、3%海藻糖、6%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

实施例4

测制胶体金与上述第一实施例雷同，这里不再详细描述。

制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH9.2，取最佳用量金黄色葡萄球菌单克隆抗体16μg/ml、终质量浓度为1.5%的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

金标抗体离心纯化处理：金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于4℃再12000r/min离心30min。

溶液分为三层：透明上清液，管底可流通的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液终质量浓度为0.3%吐温20、2.5%海藻糖、1.5%BSA及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后37℃、2小时烘干，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3%吐温20、2.5%海藻糖、5%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡，其特征在于，所述胶体金检测卡包括：样品垫、金标抗体结合垫、NC膜及吸水纸，所述样品垫、金标抗体结合垫、NC膜及吸水纸设置在PVC胶板上。

2.根据权利要求1所述的检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡，其特征在于，所述NC膜上设置有控制线和检测线。

3.检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

A 测制胶体金；

B 制备胶体金标记抗体；

C 将金标抗体离心纯化处理；

E 将金标抗体点样在金标抗体结合垫上；

F 将包被抗体金黄色葡萄球菌稀释，点样在NC膜上；

4.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：将纯水和氯金酸溶液加热至沸后加入柠檬酸三钠溶液进行反应并冷却，检测制取粒径为40nm胶体金。

5.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：取金黄色葡萄球菌单克隆抗体16ug/ml、终质量浓度为0.5～3%的海藻糖及100mL胶体金溶液进行混合，在混合后的溶液中加入终质量浓度为0.5%的BSA，获得金标抗体溶液，并进行冷冻离心纯化处理。

6.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤C具体包括将金标抗体溶液在常温低速离心20min,取溶液中的上清液并离心30min；所述溶液包括三层：透明上清液、管底暗红色沉淀液及管底壁上黑色金颗粒层；

取管底暗红色沉淀液，并在暗红色沉淀液中加入重悬液重悬；所述重悬液为：终质量浓度为0.1%～0.5%吐温20、1%～3%海藻糖、0.5%～2%BSA及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液；

对重悬液进行离心处理，并在离心处理后的重悬液中加入0.1%的叠氮钠，且温度为4℃条件下保存。

7.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤D中对样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理包括：将处理液在温度为37℃环境下浸泡2小时并烘干；所述处理液为：含有终质量浓度为0.2%～0.5%吐温20、1%～3%海藻糖、5%～10%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

8.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤E具体包括：将浓度至OD₅₂₆为5的金标抗体均匀点样在结合垫上，并在温度为37℃下真空干燥；所述点样量为30μl/cm²。

9.根据权利要求3所述的用于检测金黄色葡萄球菌的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤F中包被抗体金黄色葡萄球菌稀释包括单抗稀释和二抗稀释，其中，单抗稀释到0.7 mg/ml，二抗稀释到0.7mg/ml，并将单抗稀释和二抗稀释后的金黄色葡萄球菌点样在NC膜上，分别划T线和C线，在温度为37℃下干燥。