CN102770561A - 用于诊断不同亚型肺癌的基于组织的微-rna方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于鉴定展现出肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，其中所述核酸分子在靶细胞中和在对照细胞中差异表达。本发明还提供了通过使用所述核酸分子来鉴定展现出肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的方法，以及同于预防或治疗肺癌的方法和药物组合物。
Description
发明领域
本发明涉及已经过证实的miRNA生物标记和相应的方法，以用于可靠地在外科手术和活组织检查肺组织中组织中不同亚型的肺癌，特别是用于区别不同亚型的肺癌。所述肺癌亚型包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌。
发明背景
肺癌依然是世界上男性和女性癌相关死亡中最常见的原因。据估计在2009年有约1400000新增病例，伴随平均2.51%的年增长率(Frost&Sullivan估计)，这些在2009年诊断为肺癌15的患者绝大多数将会死于该疾病(Higgins,M.J.et al.(2009)Expert Rev Anticancer Ther 9,1365-1378)。尽管在过去的几十年中外科技术和联合治疗有了一定的改进，但在美国和欧洲不同分期肺癌患者的总5年存活率仅约15%。
肺癌分类为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)或非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。主要的(80%)肺癌组织学类型为NSCLC包括腺癌和鳞状细胞状细胞癌。吸烟是发生肺癌的最重要风险因子，占世界范围内男性肺癌病例中的80%和女性肺癌患者中的50%。
肺癌治疗依不同的癌亚型而异。对早期NSCLC的治疗选择是外科手术，有40%的总5年存活率。但是，多数患者在诊断时已处于晚期，使得一线治疗仅局限于多药联合化疗而且预期存活率少于8个月。在靶向治疗方面的近期进展要求对非小细胞肺癌(NSCLC)30更准确地亚型分类。癌血管生成抑制剂可使鳞状细胞状细胞癌患者更易于发生异常反应(Lebanoy,D.(2009)J Clin Oncol 27,2030-2037)。小细胞肺癌(SCLC)患者是肺癌中致死性最高的亚型，患者死亡率高于90%。尽管在早中期患者中常观察到高初始反应率，中位存活率也有约20个月。但外科手术对SCLC的治疗几乎是无效的，化疗或化疗放疗联合才是治疗选择。
除了对不同亚型和不同病因肺癌的不同治疗，监测者间的差异和缺乏特异、标准化的检测也限制了当下对患者实施充分策略化合适治疗的能力。对肺癌患者个体的治疗决策很快将基于详细的癌和宿主特征。用于区分肺癌亚型的特异性分子生物标记是绝对需要的。
许多诊断性检测也受限于一般是基于对单一分子指标的分析，而这种分析可能影响检测的可信度和/或准确性。此外，单一指标通常并不能对潜伏阶段、癌进展等进行详细预测的。因此，仍然需要发掘可供选择的分子指标和检测方式来克服这些局限。
解决这一问题的方法之一可以基于调控性RNA分子，特别是基于由20-25个核酸大小的进化保守的内源性表达的非编码RNA，该类RNA可介导靶mRNA表达并以此自从其在10年前发现以来被证实参与细胞发育、分化、增殖和凋亡的微RNA(miRNA)(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature 431,350-355;He,L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。而且，由于其在体外非常稳定和在体内的长期存在，miRNA有作为癌生物标记的其他mRNA所没有的优势(Lu,J.et al.,(2005)Nature 435,834-838;Lim,L.P.et al.,(2005)Nature 433,769-773)。
miRNA产生于原发转录并被RNase III Drosha加工成茎-环状结构的前体(pre-miRNA)。转运到细胞质后，另一名为Dicer的RNase III剪切pre-miRNA发夹的环形成短双链RNA，其中一条链以成熟miRNA整合成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。其中的miRNA引导miRNP到靶mRNA发挥功能(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292;He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。
根据miRNA与其目标间的互补程度，miRNA可引导不同的调控过程。与miRNA高互补的mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异性剪切。因此，在这种情况下，miRNA作为短干扰RNA(siRNA)发挥功能。靶向与miRNA互补性较弱的mRNA要么被导向细胞降解途径或在不影响mRNA水平的状态下被翻译抑制。但，miRNA如何抑制靶mRNA的翻译机制仍有争议。
高通路miRNA定量技术，如miRNA芯片、以实时RT-PCR为基础的TaqMan miRNA检测，已被证实为研究全癌基因组整体miRNA谱的有力工具。越来越多的数据显示miRNA表达的异常调节与特定类型癌的发生和/或进展相关。例如：两个miRNA,miR-15和miR-16-1被证实位于在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中缺失的遗传位点，并且在70%的CLL患者中有miRNA基因的缺失或下调。而且，miR-15和miR-16-1的下调在结直肠瘤变中也有发现，而miRNA let-7的表达常在肺癌中减少(Michael,M.Z.et al.(2003)Mol Cancer Res 1,882-891;Mayr,C.et al.(2007)Science 315,1576-1579)。事实上，根据miRNA表达的癌相关性改变和miRNA常位于与癌相关的遗传区推测miRNA可是癌抑制基因和癌基因(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)Nat Rev Cancer 6,259-269;Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)J Clin Invest 117,2059-2066;Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)Hum Mol Genet 16,R106-R113)。已有描述的人癌中miRNA表达模式凸显了其可被用于诊断和预后生物标记的潜能。
一些研究报道miRNA在肺癌中的表达谱(Johnson,S.M.et al.(2005)Cell 120,635-647;Liang,Y.et al.(2008)BMC Med Genomics 1,61;Kumar,M.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105,3903-3908;Miko,E.et al.(2009)Exp Lung Res 35,646-664;Xie,Y et al.(2009)Lung Cancer May 13;Lebanony,D.et al.(2009)J Clin Oncol 27,2030-2037;Kauppinen,S.et al.(2009)Clin Cancer Res 15,1177-1183;Mascaux,C.et al.(2009)Eur RespirJ33,352-359)。相同地，这些研究都表明特定miRNA与非恶性肺组织相比在恶性组织中有异常表达。而且，研究表明一些miRNA可能与预后相关(Yu,S.L.et al.(2008)Cancer Cell 13,48-57;Raponi,M.et al(2009)Cancer Res69,5776-5783)。因此，这些miRNA可对与恶性转化和进展相关的细胞过程提供线索。
由此，仍然需要(一系列)的诊断指标，尤其是以“表达特征(signature)”或“分子印迹”形式能进行快速、可靠和节省花费性鉴定和/或治疗表现为或有可能发展为不同类型肺癌的细胞。此外，仍需相应的能同时鉴定和治疗有癌表型的靶细胞的方法
发明目的和发明概述
本发明的目的是提供已经过证实的miRNA生物标记和相应的方法，以用于可靠地在外科手术和活组织检查肺组织中不同亚型的肺癌，特别是用于区别不同亚型的肺癌。具体来说，通过确定多种核酸分子，肺癌表现为腺癌肺癌、鳞状细胞癌和小细胞肺癌，每种核酸分子编码miRNA序列，而所述多种核酸分子中的一种或多种在被分析的靶细胞中与在对照细胞中相比差异表达，而一种或多种差异表达的核酸分子一起可作为一种指征肺癌存在的核酸表达生物标记。
更具体地，本发明的目标是提供有效的miRNA生物标记，以用于鉴定一或多种展现出肺癌的哺乳动物靶细胞、和/或区别腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌。
另外，本发明的目的还在于提供相应的方法，以用于鉴定一或多种展现出肺癌的哺乳动物靶细胞、区别不同亚型的肺癌、以及预防或治疗此类疾病。
这些及其它目的从以下描述将变得清楚，其通过独立权利要求的主题来达成。本发明的一些优选实施方案则通过从属权利要求的主题来限定。
在第一方面，本发明涉及用于鉴定展现出腺癌肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是腺癌肺癌存在的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少四种核酸分子。
在具体的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-34a和hsa-miR-375.的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一种或多种正常对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-34a和hsa-miR-375表达上调以及编码hsa-miR-27a和hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在更优选实施方案中，核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-34a/hsa-miR-27a和hsa-miR-34a/hsa-miR-29a中任一或多个核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-29a、hsa-miR-27a和hsa-miR-34a的一种核酸组合。
第二方面，本发明涉及用于鉴定一个或多个展现出鳞状细胞肺癌的哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是鳞状细胞肺癌存在的指征。
本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少四种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-29a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
尤其优选的是，与所述一种或多种正常对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-205和hsa-miR-25被上调，而编码hsa-miR-29a和hsa-miR-375的核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-205/hsa-miR-29a,hsa-miR-25/hsa-miR-29a,hsa-miR-205/hsa-miR-375和hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-29a的一种核酸组合。
在第三方面，本发明涉及用于鉴定一个或多个展现出小细胞肺癌的哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是小细胞肺癌存在的指征。
本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少五种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种正常对照细胞相比被下调。
在更优选实施方案中，核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-25、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
尤其优选的是，与所述一种或多种正常对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-25和hsa-miR-375被上调，而编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a和hsa-miR-29b的核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25/hsa-miR-27a、hsa-miR-375/hsa-miR-27a、hsa-miR-25/hsa-miR-29a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29a和hsa-miR-375的一种核酸组合。
第四方面，本发明涉及用于将鳞状细胞肺癌与腺癌肺癌区别开的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是鳞状细胞肺癌或腺癌肺癌存在的指征。
本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少四种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-27a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
尤其优选的是，与所述一种或多种对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-27a被上调，而编码hsa-miR-375的核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205/hsa-miR-375和hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-375的一种核酸分子组合。
第五方面，本发明涉及用于将小细胞肺癌与腺癌肺癌区别开的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是小细胞肺癌或腺癌肺癌存在的指征。
本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少六种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
尤其优选的是，与所述一种或多种对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-25和hsa-miR-375被上调，而编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b和hsa-miR-34a的核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25/hsa-miR-27a、hsa-miR-375/hsa-miR-27a、hsa-miR-25/hsa-miR-29a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25、hsa-miR-34a和hsa-miR-375的一种核酸组合。
第六方面，本发明涉及用于将小细胞肺癌与鳞状细胞肺癌区别开的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是小细胞肺癌或鳞状细胞肺癌存在的指征。
本文所定义的核酸表达生物标记可包括至少六种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被上调；以及包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与一种或多种对照细胞相比被下调。
在更优选的所述方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
尤其优选的是，与所述一种或多种对照细胞相比，在所述一种或多种靶细胞中hsa-miR-375被上调，而编码hsa-miR-205、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b和hsa-miR-34a的核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-375/hsa-miR-27a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29b和hsa-miR-375核酸组合。
第七方面，本发明涉及用于鉴定展现出腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)收集患者的活组织检查或外科手术组织；
(b)在载玻片上制备组织切片；
(c)将至少一种编码微RNA序列的核酸分子生物标记物杂交到载玻片上的切片上；
(d)在显微镜下或者通过数字病理学方案对miRNA的表达进行定量；
(e)在所述的一种或多种靶细胞中确定多种核酸分子表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列；
(f)在一种或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(g)通过对比在步骤(e)和(f)中所获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表如本文所定义的核酸表达生物标记，其是腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或者小细胞肺癌存在的指征。
尤其优选的是，该方法以原位杂交来实现。
为了进行定量的确定，使用7个经验证的miRNA生物标记：hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a和hsa-miR-375。
为了将所获得的编码微RNA序列的核酸分子生物标记的表达水平标准化，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24核酸表达分子。作为所获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122核酸表达分子。
第八方面，本发明涉及预防或治疗肺癌的方法，该方法包括：(a)通过使用本文所述的方法在一种或多种靶细胞中鉴定核酸表达生物标记；及(b)在所述一种或多种细胞中改变所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一种或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在所述一种或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一种或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
第九方面，本发明涉及用于预防和/或治疗肺癌的药物组合物，所述组合物包含一种或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与本文所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于本文所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。
最后，第十方面，本发明涉及上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
在随后的详细描述中本发明的其他实施方案将会阐明。
附图简述
图1：描绘了发明概要第七方面中根据检测表现为腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌的单一或多靶细胞的本发明用于确定某一表达生物标记的基本方法步骤的流程图。尤其是运用原位杂交方法区分不同肺癌亚型。
图2A：说明根据用于检测表现为腺癌肺癌的单一或多靶细胞的本发明在第一方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。同时也显示与正常肺组织相比腺癌肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的腺癌肺癌可与正常肺组织可靠地区分。
图2B：逐步描述了本发明第一方面中用于检测FFPE外科手术组织中展现出腺癌肺癌的一或多个靶细胞对组一(hsa-miR-27a、hsa-miR-29a和hsa-miR-34a)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中的腺癌肺癌可与正常肺组织(AUC=0.925)可靠地区分。
图3A：说明根据用于检测表现为鳞状细胞肺癌的单一或多靶细胞的本发明在第二方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。也显示与正常肺组织相比腺癌肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的鳞状细胞肺癌可与正常肺组织可靠地区分。
图3B：逐步描述了第二方面中根据用于检测FFPE外科手术组织中表现为鳞状细胞肺癌的单一或多靶细胞的本发明对一组合的(hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-29a)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中的腺癌肺癌可与正常肺组织(AUC=0.961)可靠地区分。
图4A：说明根据用于检测表现为小细胞肺癌的单一或多靶细胞的本发明在第三方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。也显示与正常肺组织相比小细胞肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的小细胞肺癌可与正常肺组织可靠地区分。
图4B：逐步描述了第三方面中根据用于检测FFPE外科手术组织中表现为小细胞肺癌的单一或多靶细胞的本发明对一组合的(hsa-miR-29a和hsa-miR-375)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中的小细胞肺癌可与正常肺组织(AUC=0.998)可靠地区分。
图5A：说明根据用于鉴别鳞状细胞肺癌和腺癌肺癌的本发明在第四方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。也显示与腺癌肺癌患者相比鳞状细胞肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的鳞状细胞肺癌可与腺癌肺癌可靠地区分。
图5B：逐步描述了第四方面中根据用于鉴别FFPE外科手术组织中鳞状细胞肺癌可与腺癌肺癌的本发明对一组合的(hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-375)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中鳞状细胞肺癌可与腺癌肺癌(AUC=0.922)可靠地区分。
图6A：说明根据用于鉴别小细胞肺癌和腺癌肺癌的本发明在第五方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。也显示与腺癌肺癌患者相比小细胞肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的小细胞肺癌可与腺癌肺癌可靠地区分。
图6B：逐步描述了第五方面中根据用于鉴别FFPE外科手术组织中小细胞肺癌可与腺癌肺癌的本发明对一组合的(hsa-miR-25、hsa-miR-34a和hsa-miR-375)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中小细胞肺癌可与腺癌肺癌(AUC=0.991)可靠地区分。
图7A：说明根据用于鉴别小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌的本发明在第六方面中属于尤其优选表达生物标记的人miRNA。也显示与鳞状细胞肺癌患者相比小细胞肺癌患者中这些miRNA的表达水平和准确性(即：上调或下调)。数据表明FFPE外科手术组织中的小细胞肺癌可与鳞状细胞肺癌可靠地区分。
图7B：逐步描述了第六方面中根据用于鉴别FFPE外科手术组织中小细胞肺癌可与鳞状细胞肺癌的本发明对一组合的(hsa-miR-29b和hsa-miR-375)的逻辑回归分析。数据表明FFPE外科手术组织中小细胞肺癌可与鳞状细胞肺癌(AUC=0.982)可靠地区分。
发明详述
本发明是基于肺癌能根据高敏感性和特异性的特定miRNA表达谱进行可靠地诊断和亚型区分，而且在此确定的这些表达生物标记通常包括上和下调两方面这一预期之外的发现。更具体来说，通过分析整体miRNA表达模式和/或单独miRNA表达水平可以实现对肺癌的早期诊断和亚型区分。以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一种或多种限制的条件下实施。
本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。
术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的精确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10%，优选±5%。
另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。
术语的进一步定义在以下使用术语时给出。
以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
本发明的目的是提供已经过证实的miRNA生物标记和相应的方法，以用于可靠地在外科手术和活组织检查肺组织中不同亚型的肺癌，特别是用于区别不同亚型的肺癌。具体来说，通过确定多种核酸分子，肺癌表现为腺癌肺癌、鳞状细胞癌和小细胞肺癌，每种核酸分子编码miRNA序列，而所述多种核酸分子中的一种或多种在被分析的靶细胞中与在对照细胞中相比差异表达，而一种或多种差异表达的核酸分子一起可作为一种指征肺癌存在的核酸表达生物标记。
更具体地，本发明的目标是提供有效的miRNA生物标记，以用于鉴定一或多种展现出肺癌的哺乳动物靶细胞、和/或区别腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌。
本文所用术语“癌症”(也称为“癌(carcinoma)”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌症倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(geneticre-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文所用术语“肺癌”指肺组织中失控性细胞生长，或肺组织的癌性生长。
在此使用术语“肺癌的不同亚型”包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌。
“腺癌肺癌”或“腺性肺癌”为一类非小细胞肺癌。80%的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)，其中50%是腺癌。腺癌肺癌发生于肺的周围区，可在诊断前存在很长时间。是女性中最常见的肺癌类型，在非吸烟者中也常见。
“鳞状细胞肺癌”是一类非小细胞肺癌。约30%NSCLC为鳞状细胞肺癌。鳞状细胞肺癌常发生于肺中央部的支气管(大气道)。很多人早期即有症状，常为咯血(咯出血液)。
“小细胞肺癌”(SCLC)被认为是起源于构成部分支气管(气道)上皮(衬附)的神经内分泌细胞。SCLC占所有肺癌病例的18%。SCLC很具侵袭性。生长很快并通过血流扩散到肝脏、肺、骨和脑。在诊断时很容易在这些器官中发现肿瘤转移灶。
在此所用术语“患者”指至少被怀疑患有肺癌，或某种类型肺癌的人；术语“健康个体”或“正常对照”常指无这种癌表型的健康人。但是，在某些应用中，例如在比较不同类型肺癌时，有其他类型肺癌的个体常被认为是“对照”。
在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品典型地是组织。另外，血液及其它类型样品也可以使用。
本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(综述参见例如Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相应于所编码的miRNA(5'→3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5'→3')序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3'→5')的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。
因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一种或多种“有义核酸分子”和/或一种或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一种或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肺癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一种或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一种或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。
在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。
本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在靶细胞中的表达水平相比于健康对照细胞或其他疾病类型样品是改变的，其可以是上调(即在靶细胞中miRNA浓度增加)或下调(即在靶细胞中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在靶细胞中被激活至比在对照细胞中更高或更低的水平。
在本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。
本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一种或多种被分析细胞中的浓度。
如上所述，术语“对照细胞”典型地是指采集于不具有肺癌表型特征的(健康)个体细胞样品。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同类型肺癌时，来源于其他类型肺癌的细胞细胞典型地被认为是“对照细胞”。
表达水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley&Sons,Hoboken,NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述miRNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半寿期短，典型地仅测量成熟miRNA的浓度。
在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群靶细胞或对照细胞内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。
所获得的一种或多种靶细胞和一种或多种对照细胞的表达水平之间的差异可以标准化(或归一化，normalize)至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在细胞的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。
但是，代替在任何实验中确定一种或多种对照细胞的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定细胞表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，一种或多种靶细胞的相应表达水平可以用用于标准化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“标准化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“标准化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。
在本发明中，术语“诊断肺癌和/或区分不同肺癌亚型”也指预测和可能性分析(意为“诊断”)。在此描述的生物标记和方法意欲用于与包括治疗性干预、诊断标准如疾病分期已经疾病监测和监视在内的治疗模式方面的临床决策。根据本发明，可提供对一对象状况检测的中段结果。这种中段结果可连同其他信息辅助医生、护士、或其他行医者对患该疾病的个体进行诊断。另外，该发明可被用作对细胞样品进行癌性改变检测，并给医生提供用以诊断的有利信息。再次，本发明可用于不同肺癌亚型的鉴别诊断。
在本发明中，所鉴定的一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该核酸表达特征是在靶细胞中存在肺癌的指征。本文所用术语“表达生物标记”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在肺癌患者来源的细胞和正常对照细胞之间不同。本文中，核酸表达生物标记也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定一个体的表型状态的miRNA序列。
在第一方面，本发明涉及用于鉴定展现出腺癌肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是腺癌肺癌存在的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少四种核酸分子。
在更优选的实施方案中，核酸表达特征(signature)包括一个或多个编码hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-34a(SEQID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)被上调，而编码(SEQ ID NO:3)和hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含任意一种或多种编码hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)和hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)和hsa-miR-34a (SEQ ID NO:6)的一种核酸分子组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表1。
表1
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记 | |
| hsa-miR-27a | uucacaguggcuaaguuccgc |
| hsa-miR-29a | uagcaccaucugaaaucgguua |
| hsa-miR-34a | uggcagugucuuagcugguugu |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
在此公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
在此使用的术语“至少一种核酸”可为核酸分子多形性的任何亚群，即：任一、任二、任三、任四、任五、任六、任七、任八、任九、任十以此类推的核酸分子，每一核酸分子编码一包含于在此确定的核酸表达生物标记的miRNA序列。
在第二方面，本发明涉及用于鉴定展现出鳞状细胞肺癌的一或多个哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该生物标记是存在鳞状细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少四种核酸分子。
在更优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含一个或多个编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-29a(SEQID NO:4)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)被上调而编码hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在更进一步优选方案中，核酸表达生物标记包含任意一或多种编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-25(SEQID NO:2)/hsa-miR-29a (SEQ ID NO:4)、hsa-miR-205(SEQ IDNO:1)/hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的一种核酸组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表2。
表2
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记 | |
| hsa-miR-205 | uccuucauuccaccggagucug |
| hsa-miR-25 | cauugcacuugucucggucuga |
| hsa-miR-29a | uagcaccaucugaaaucgguua |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
在此揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
在第三方面，本发明涉及用于鉴定展现出小细胞肺癌的一或多个哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是存在小细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少五种核酸分子。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括一个或多个编码hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQID NO:4)、hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中，hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)被上调，而编码hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-29b(SEQID NO:5)的任意一或多种核酸分子的表达被下调。
在更进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含任意一或多个编码hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-25(SEQ IDNO:2)/hsa-miR-29a (SEQ ID NO:4)和hsa-miR-375(SEQ IDNO:7)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的一种核酸组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表3。
表3
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记 | |
| hsa-miR-25 | cauugcacuugucucggucuga |
| hsa-miR-27a | uucacaguggcuaaguuccgc |
| hsa-miR-29a | uagcaccaucugaaaucgguua |
| hsa-miR-29b | uagcaccauuugaaaucaguguu |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
在此揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
在第四方面，本发明涉及用于鉴别诊断鳞状细胞肺癌和腺癌肺癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该生物标记是存在鳞状细胞肺癌或腺癌肺癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少四种核酸分子。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包括一个或多个编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中，hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-27a(SEQID NO:3)被上调，而编码hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的任意一或多种核酸分子的表达被下调。
在更进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含任意一或多个编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)和hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的一种核酸分子组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表4。
表4
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记物 | |
| hsa-miR-205 | uccuucauuccaccggagucug |
| hsa-miR-25 | cauugcacuugucucggucuga |
| hsa-miR-27a | uucacaguggcuaaguuccgc |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
在此揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
在第五方面，本发明涉及用于鉴别诊断小细胞肺癌和腺癌肺癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该生物标记是存在小细胞肺癌或腺癌肺癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少六种核酸分子。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达特征包括一个或多个编码hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQID NO:4)、hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)、hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中，hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)被上调，而编码hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3),hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4),hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)和hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)的任意一或多种核酸分子的表达被下调。
在更进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含任意一或多个编码hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的核酸组合。尤其是核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)、hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的一种核酸组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表5。
表5
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记 | |
| hsa-miR-25 | cauugcacuugucucggucuga |
| hsa-miR-27a | uucacaguggcuaaguuccgc |
| hsa-miR-29a | uagcaccaucugaaaucgguua |
| hsa-miR-29b | uagcaccauuugaaaucaguguu |
| hsa-miR-34a | uggcagugucuuagcugguugu |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
在此揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
在第六方面，本发明涉及用于鉴别诊断小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一种或多种在靶细胞和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该生物标记是存在小细胞肺癌或鳞状细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少六种核酸分子。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达特征包括一个或多个编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQID NO:4)、hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)、hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的核酸分子。
尤其优选的是，与一种或多种对照细胞相比，在一种或多种靶细胞中，hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)被上调，而编码hsa-miR-205(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-29b(SEQID NO:5)和hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)的任意一或多种核酸分子的表达被下调。
在更进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含任意一或多个编码hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的核酸组合。尤其是，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)和hsa-miR-375(SEQ IDNO:7)的一种核酸组合。
为了标准化获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记，可优选使用在肺组织中稳定表达的编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)核酸表达分子。作为获得的编码miRNA序列的核酸分子生物标记表达水平的阴性对照，可优选使用在肺组织中不表达的编码hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表达分子。
上述涉及的miRNA核酸序列列于表6。
表6
| miRNA | 序列(5'→3') |
| 生物标记 | |
| hsa-miR-205 | uccuucauuccaccggagucug |
| hsa-miR-27a | uucacaguggcuaaguuccgc |
| hsa-miR-29a | uagcaccaucugaaaucgguua |
| hsa-miR-29b | uagcaccauuugaaaucaguguu |
| hsa-miR-34a | uggcagugucuuagcugguugu |
| hsa-miR-375 | uuuguucguucggcucgcguga |
| 对照 | |
| hsa-miR-24 | uggcucaguucagcaggaacag |
| hsa-miR-122 | uggagugugacaaugguguuug |
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;see also Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。
第七方面，本发明涉及用于鉴定展现出腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)收集患者的活组织检查或外科手术组织；
(b)在载玻片上制备组织切片；
(c)将至少一种编码微RNA序列的核酸分子生物标记物杂交到载玻片上的切片上；
(d)在显微镜下或者通过数字病理学方案对miRNA的表达进行定量；
(e)在所述的一种或多种靶细胞中确定多种核酸分子表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列；
(f)在一种或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(g)通过对比在步骤(e)和(f)中所获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表如本文所定义的核酸表达生物标记，其是腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或者小细胞肺癌存在的指征。
尤其优选的是，该方法以原位杂交来实现。
为了定量测定，使用7个经验证的miRNA生物标记：hsa-miR-205(SEQID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3),hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4),hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5),hsa-miR-34a(SEQID NO:6)及hsa-miR-375(SEQ ID NO:7).
为了标准化编码miRNA序列的所述核酸分子标记物得到的表达水平，可优选使用所述编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)的核酸表达分子，其在肺组织中稳定表达。而对于编码miRNA序列的所述核酸分子标记物得到的表达水平的阴性对照，可优选使用所述的编码hsa-122(SEQ ID NO:9)的核酸表达分子，其在肺组织中不表达。
原位杂交技术允许特定的核酸分子在形态上被保存的染色体、细胞或者组织切片中被检测。结合免疫细胞化学，原位杂交能在DNA，mRNA和蛋白水平把微观拓扑学信息同基因活性联系起来。有两种类型的非放射性杂交方法：直接法和间接法。直接法是使用荧光素或其他荧光染剂与核苷酸直接耦合(Baumann,J.G.J.et al.((1980)Exp.Cell Res.138,485–490)。间接法是使用地高辛配基(通过特异性抗体检测)和生物素(抗生蛋白链菌素检测)(Leary,J.L et al(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,4045–4049)。
第八方面，本发明涉及预防或治疗肺癌的方法，该方法包括：(a)通过使用本文所述的方法在一种或多种靶细胞中鉴定核酸表达生物标记；及(b)在所述一种或多种细胞中改变所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一种或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在所述一种或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一种或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
如本文所用，术语“改变编码miRNA序列的核酸分子表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未修饰的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未修饰的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。
在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一种或多种核酸分子的表达以这样的方式被修饰，由此其表达在所述一种或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一种或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一种或多种癌靶细胞中的调节作用的反方式模式(anti-cyclical)的发生，以在所述一种或多种靶细胞中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。
在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入一种或多种靶细胞中。
如本文所用术语“互补序列”是指导入一种或多种细胞中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。
两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。
“互补”核酸分子(即编码与下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一种或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。
例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2'-O-甲基基团或者2'-O-甲氧基基团(也称作2'-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2'-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(参见例如Orom,U.A.et al.(2006)Gene 372,137-141)。
最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt,J.et al.(2005)Nature 438,685–689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4,721-726)。
为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)如前文;Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)如前文;Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)如前文)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。
如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。
为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5'非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5'-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3'非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。
此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(Naguibneva,I.et al.(2006)Biomed.Pharmacother.60,633–638)。
因此，被导入提供的一种或多种细胞中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR
第九方面，本发明涉及用于预防和/或治疗肺癌的药物组合物，所述组合物包含一种或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与本文所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于本文所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。
最后，第十方面，本发明涉及上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
在本发明范围内，合适的药物组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经含服和舌下)、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物，或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。可以局部或全身性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。所述制剂可以包装为独立剂量单位。
本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。
使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.and Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA;Crowder,T.M.et al.(2003)A Guide toPharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC,Boca Raton,FL;Niazi,S.K.(2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRCPress,Boca Raton,FL)。
为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
所述药物组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送***中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。
为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。
一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.et al.(2004)Nature 432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen,J.et al.(2008)Nature 452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(参见例如Zimmermann,T.S.et al.(2006)Nature 441,111-114))。近年来，描述了一类称作类脂质(lipidoid)的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc,A.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。
进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使***中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles,A.et al.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6,443-453;Kim,D.H.and Rossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184中。
本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。
实施例
实施例1：患者资料
在发现研究中，收集了中山医院2007-2009年期间存档的肺癌患者冰冻组织标本125例。所有患者对参与科学研究都有知情同意。组织标本的汇集依照协议由上海中山医院协会评论委员会批准。以上组织在手术离体后，立即用OCT包埋，用液氮快速冰冻，并被存放在-80°C以待用。毗邻形态学上的正常组织(距离癌组织至少10cm)来自相同的肺癌患者。这些样本包括36例腺癌肺癌，30例鳞状细胞肺癌和16例小细胞肺癌及44例相应的正常组织。
在验证研究中，收集了来自上海中山医院2004-2008年期间存档的215例经***固定石蜡包埋(FFPE)的肺癌组织。这些FFPE组织中包括54例腺癌肺癌，50例鳞状细胞肺癌和56例小细胞肺癌及55例相应的正常组织。在发现和验证研究中的肿瘤标本的基础特征详见表-7。
表7：在发现研究和验证研究中组织标本的特性
| 组织标本 | 发现组 | 验证组 |
| 正常肺组织 | 44 | 55 |
| 肺癌 | ||
| 腺癌 | 36 | 54 |
| 鳞癌 | 30 | 50 |
| 小细胞肺癌 | 16 | 56 |
| 总数 | 126 | 215 |
患者数据(年龄，性别，影像资料，治疗方法，其他医疗状况，家族史等等)来自医院数据库用于匹配所收集的不同样品。病理学追踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(例如正常对照组、腺癌肺癌，鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌)以及保证样本的一致分级。
实施例2：样品制备
在发现研究中，对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活近红外激光二极管集成显微镜光学器件。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck,M.R.et al.(1996).Science 274,998-1001;Espina,V.et al.(2007)Expert Rev.Mol.Diagn.7,647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显微镜(ArcturusVeritasTM Laser Capture Microdissection Instrument(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)进行捕获步骤。
为了帮助从试探性研究到临床实施的转变，FFPE外科组织用于验证研究。一旦FFPE组织被选用于研究分析，HE切片就要被准备用来检验每一个样本中肿瘤部分所占的比例。如果一个肿瘤组织有超过75%的赘生性细胞，它将被认为适合用于分析而不用再做进一步的肿瘤细胞纯化。如果，组织学显示肿瘤有低于75%的赘生性细胞，那么它将被选择并标记用来做显微切割。除肿瘤损害外，对照组织应距离癌组织至少10cm。
使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)根据厂商指导分离总RNA。NanoDrop 1000 Spectrophotometer (NanoDropTechnologies,Waltham,MA)测定总RNA浓度。对RNA的质量监控则通过RNA 6000Pico LabChip kit由2100Bioanalyzer来完成。
实施例3：微阵列数据
在发现研究中，使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。该芯片阵列取自Sanger v.10.1数据库，包含723个人类miRNA的探针。126个LCM切取的肺组织样本中获得的总RNA(100ng)，用Cy3标记后，并经XDR Scan(PMT100,PMT5)扫描得到信号。标记和杂交的操作方法均参照Agilent芯片说明书。通过应用Quantile方法及使用本领域已知的GeneSpring GX10软件(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。
对于每个测量进行独立实验，确定的miRNA表达水平代表获得的各自的各个数据的平均值。
未配对t检验在费歇尔检验(F-test)之后用于鉴定在腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌中最优的候选miRNA标记物。MedCalc软件被用于执行受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC)分析以确定作为诊断价值的生物标记物的候选miRNA的特异性和敏感性。95%可信区间被用来确定显著性。
关于在第一方面的冰冻的手术切除组织中能区分腺癌肺癌与正常肺组织的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-8。
表8：手术切除冰冻组织中可以区分腺癌肺癌和正常肺组织的候选miRNA生物标记物
关于在第二方面的冰冻的手术切除组织中能区分鳞状细胞肺癌与正常肺组织的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-9。
表9：手术切除冰冻组织中可以区分肺鳞癌和正常肺组织的候选miRNA生物标记物
关于在第三方面的冰冻的手术切除组织中能区分小细胞肺癌与正常肺组织的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-10。
表10：手术切除冰冻组织中可以区分小细胞肺癌和正常肺组织的候选miRNA生物标记物
关于在第四方面的冰冻手术切除组织中能区分鳞状细胞肺癌与腺癌肺癌的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-11。
表11：手术切除冰冻组织中可以区分肺鳞癌和腺癌肺癌的候选miRNA生物标记物
关于在第五方面的冰冻手术切除组织中能区分小细胞肺癌与腺癌肺癌的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-12。
表12：手术切除冰冻组织中可以区分小细胞肺癌和腺癌肺癌的候选miRNA生物标记物
关于在第六方面的冰冻手术切除组织中能区分小细胞肺癌与鳞状细胞肺癌的7个主要候选miRNA的列阵分析实验数据详见表-13。
表13：手术切除冰冻组织中可以区分小细胞肺癌和肺鳞癌的候选miRNA生物标记物
实施例4：在石蜡包埋的手术组织中微阵列数据的验证
为验证获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的实时定量RT-PCR，其采用TaqMan微RNA测定法(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。对215例石蜡包埋的手术切除组织中依次验证了hsa-miR-205(SEQID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3),hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4),hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)及hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)的表达(表1)。同时进行的对小RNA U47表达的检测用来作为标准化的质量监控。每个实验重复三次。
简要的说，根据Applied Biosystem指导，采用Taqman微RNA RT试剂盒进行反转录测定。将100ng的总RNA在包含1X逆转录缓冲液,1X RT引物,1nM dNTP，4U RNase抑制剂和50U MultiScribe逆转录酶的15微升RT混合液中进行反转录。然后将这些RT混合液放在PCR仪(Thermal cycleralpha engine,Bio-rad)上反应，执行程序如下：16°C,30分钟;42°C,30分钟;85°C,5分钟。并根据Applied Biosystem的指导采用TaqMan Universal PCRMaster Mix试剂盒和Taqman微RNA测定试剂盒进行定量PCR的测定。
2微升的RT产物在1X TaqMan Universal PCR Master Mix,NoAmpErase UNG，1X TaqMan MicroRNA Assay mix中扩增。在Roch LightCycling 480仪上进行实时荧光定量PCR，执行程序如下：96°C,5分钟初热;然后95°C下40或50个循环,15秒;60°C,60秒。Cp值由LC480软件经过二次衍生法计算而得。最后根据标准样品的Cp值对miRNA进行绝对定量。
未配对t检验在费歇尔检验(F-test)之后用于鉴定miRNA的差异表达。MedCalc软件被用于执行受试者工作特征曲线(receive operatingcharacteristic curve,ROC)分析以确定作为诊断价值的生物标记物的候选miRNA的特异性和敏感性。95%可信区间被用于确定显著性。
关于在第一方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分腺癌肺癌与肺正常组织的4个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-14。其中优选的hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3),hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)和hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)用粗体标记。
表14：手术切除石蜡组织中可以区分肺鳞癌和正常肺组织的验证miRNA生物标记物
关于在第二方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分鳞状细胞肺癌与肺正常组织的4个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-15。优选的hsa-miR-205(SEQ ID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-29a(SEQ ID NO:3)用粗体标记。
表15：手术切除石蜡组织中可以区分小细胞肺癌和正常肺组织的验证miRNA生物标记物
关于在第三方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分小细胞肺癌与肺正常组织的5个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-16。优选的hsa-miR-29a(SEQ ID NO:3)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)用粗体标记。
表16：手术切除石蜡组织中可以区分小细胞肺癌和正常肺组织的验证miRNA生物标记物
关于在第四方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分鳞状细胞肺癌与腺癌肺癌的4个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-17。优选的hsa-miR-205(SEQ ID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)用粗体标记。
表17：手术切除石蜡组织中可以区分肺鳞癌和腺癌肺癌的验证miRNA生物标记物
关于在第五方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分小细胞肺癌与腺癌肺癌的5个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-18。优选的hsa-miR-205(SEQ ID NO:1),hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)用粗体标记。
表18：手术切除石蜡组织中可以区分小细胞肺癌和腺癌肺癌的验证miRNA生物标记物
关于在第六方面的石蜡包埋的手术切除组织中能区分小细胞肺癌与鳞状细胞肺癌的5个经验证的候选miRNA的实验数据详见表-19。优选的hsa-miR-205(SEQ ID NO:1),hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375(SEQ ID NO:7)用粗体标记。
表19：手术切除石蜡组织中可以区分小细胞肺癌和肺鳞癌的验证miRNA生物标记物
所获得的结果证实在肺癌中miRNA表达的高特异性调节。因此，本文所述的miRNA的相应亚集代表独特的miRNA表达特征，用于肺癌的表达谱分析，其不仅使得可以鉴别癌发生状态(cancerogenous state)本身，而且使得可以区别不同类型的肺肿瘤。
实施例5：量化miRNA生物标记的方法
通过使用TaqMan微RNA测定(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的实时定量RT-PCR,根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA标记物进行定量分析。
特别优选地，所述miRNA生物标记物的定量可通过原位杂交实现(图1)。所述方法如下：
(a)收集患者的活组织检查或外科手术组织；
(b)在载玻片上制备组织切片；
(c)将至少一种编码微RNA序列的核酸分子生物标记物杂交到载玻片上的切片上；
(d)在显微镜下或者借助数字式病理学解答法对miRNA的表达进行定量；
(e)在所述的一种或多种靶细胞中确定多种核酸分子表达水平，每种核酸分子均编码miRNA序列；
(f)在一种或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(g)通过对比在步骤(e)和(f)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定在靶细胞和对照细胞中差异表达的一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表如本文定义的核酸表达特征，其是存在腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或者小细胞肺癌的指征。
对于标准化编码miRNA序列的所述核酸分子标记物得到的表达水平，所述编码hsa-miR-24(SEQ ID NO:8)的核酸表达分子可能优选，其在结直肠组织中稳定表达。而对于编码miRNA序列的所述核酸分子标记物得到的表达水平的阴性对照，所述的编码hsa-122(SEQ ID NO:9)的核酸表达分子可能优选，其在结直肠组织中不表达。
用于杂交的探针是杂交在包含30个残基的靶miRNA的一个被综合的非限定的序列(GGGGGTCCTATATGGCTCCACTTCTCCCCC)。所述残基序列用粗体标记。探针在5’端被标记在一个萤光基团上。单个或多个探针与单独的荧光染料可以平行杂交。本发明中用于原位杂交的探针序列在表-20中给出。
所述的残基5’发夹结构(GGGGG-CCCCC对)用以稳定在探针和靶miRNA之间的杂交并提高杂交特异性。在原位杂交中，同样的原理可以用来设计其他miRNA标记物的探针。
表20：原位杂交探针
在本文中举例描述的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。
本文广泛及概括地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。
其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。
Claims (42)
1.用于鉴定展现出肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，
其中所述多种核酸分子的一种或多种在所述靶细胞中和在一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述特征是肺癌，和/或不同亚型肺癌存在的指征，
其中不同的肺癌由腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或者小细胞肺癌所组成。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述肺癌是腺癌肺癌。
3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少四种核酸分子。
4.权利要求1-3的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被下调。
5.权利要求1-4任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-34a及hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
6.权利要求5的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在所述一种或多种正常对照细胞中相比，hsa-miR-34a和hsa-miR-375的表达被上调，而编码hsa-miR-27a和hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
7.权利要求5的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-34a/hsa-miR-27a及hsa-miR-34a/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29a、hsa-miR-27a及hsa-miR-34a的一种核酸组合。
8.权利要求1的试剂盒，其中所述肺癌是鳞状细胞肺癌。
9.权利要求1或8的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少四种核酸分子。
10.权利要求1或8-9的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被下调。
11.权利要求1或8-10任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码sa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-29a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
12.权利要求11的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在所述一种或多种正常对照细胞中相比，hsa-miR-205和hsa-miR-25的表达被上调，而编码hsa-miR-29a和hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205/hsa-miR-29a、hsa-miR-25/hsa-miR-29a、hsa-miR-205/hsa-miR-375、hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-25及hsa-miR-29a的一种核酸组合。
14.权利1的试剂盒，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
15.权利要求1或14的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少五种核酸分子。
16.权利要求1或14-15的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种正常对照细胞中相比被下调。
17.权利要求1或14-16任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b及hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
18.权利要求17的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在所述一种或多种正常对照细胞中相比，hsa-miR-25和hsa-miR-375的表达被上调，而编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a和hsa-miR-29b的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
19.权利要求17的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25/hsa-miR-27a、hsa-miR-375/hsa-miR-27a、hsa-miR-25/hsa-miR-29a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29a和hsa-miR-375的一种核酸组合。
20.权利要求1-19的试剂盒，进一步用于将鳞状细胞肺癌与腺癌肺癌区别开。
21.权利要求1或20的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少四种核酸分子。
22.权利要求1或20-21的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被下调。
23.权利要求1或20-22任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-27a及hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
24.权利要求23的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在所述一种或多种对照细胞中相比，hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-27a的表达被上调，而编码hsa-miR-375的一种核酸分子的表达被下调。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205/hsa-miR-375和hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-375的一种核酸组合。
26.权利要求1-19的试剂盒，进一步用于将小细胞肺癌与腺癌肺癌区别开。
27.权利要求1或26的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少六种核酸分子。
28.权利要求1或26-27的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被下调。
29.权利要求1或26-28任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a及hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
30.权利要求29的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在所述一种或多种对照细胞中相比，hsa-miR-25和hsa-miR-375的表达被上调，而编码hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b和hsa-miR-34a的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
31.权利要求1或26-30的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25/hsa-miR-27a、hsa-miR-375/hsa-miR-27a、hsa-miR-25/hsa-miR-29a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-25、hsa-miR-34a和hsa-miR-375的一种核酸组合。
32.权利要求1-19的试剂盒，进一步用于将小细胞肺癌与鳞状细胞肺癌区别开。
33.权利要求32的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记可包含至少六种核酸分子。
34.权利要求1或32-33的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比被下调。
35.权利要求1或32-34任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-205、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a及hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子。
36.权利要求35的试剂盒，其中在所述一种或多种靶细胞中与在一种或多种对照细胞中相比，hsa-miR-375的表达被上调，而编码hsa-miR-205、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b和hsa-miR-34a的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
37.权利要求35的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-375/hsa-miR-27a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一种或多种核酸组合。特别是，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-29b和hsa-miR-375的一种核酸组合。
38.用于鉴定展现出腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌的一种或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)收集患者的活组织检查或外科手术组织；
(b)在载玻片上制备组织切片；
(c)将至少一种编码微RNA序列的核酸分子生物标记物杂交到载玻片上的切片上；
(d)在显微镜下或者通过数字病理学方案对miRNA的表达进行定量；
(e)在所述的一种或多种靶细胞中确定多种核酸分子表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列；
(f)在一种或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(g)通过对比在步骤(e)和(f)中所获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表如本文所定义的核酸表达生物标记，其是腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或者小细胞肺癌存在的指征。
39.权利要求38的方法，进一步用于区别选自腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌及小细胞肺癌的肺癌。
40.在一种或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肺癌的方法，所述方法包括：
(a)通过使用权利要求53-54的方法在一种或多种靶细胞中鉴定核酸表达特征；及
(b)在所述一种或多种细胞中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一种或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在所述一种或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一种或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
41.用于在一种或多种哺乳动物靶细胞中预防和/或治疗肺癌的药物组合物，所述组合物包含一种或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，
所述序列与如1-55任一项所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于如权利要求1-40任一项所定义的在所述一种或多种靶细胞中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。
42.权利要求41的药物组合物在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
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