CN102768194A - 一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,包括:取虫草菌粉样本,测定腺苷含量;采集虫草菌粉样本的近红外光谱并进行预处理,采用偏最小二乘法建立虫草菌粉样本中腺苷含量与预处理后的近红外光谱之间的校正模型;采集待测样本的近红外光谱并进行预处理,通过校正模型计算得到待测样本的腺苷含量;其中,采集近红外光谱的光谱扫描波段为4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1。本发明方法通过特征波段进行建模,运算量小,建模速度快;所建立的PLS回归模型可靠性高、预测效果好,可以实现对虫草菌粉中腺苷含量的快速、准确、无损检测。
Description
技术领域
本发明涉及虫草菌粉成分检测领域,尤其涉及一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法。
背景技术
由于天然虫草产区具有局限性,产量稀少,加上长期以来乱采滥挖造成生态破坏严重,野生虫草远远不能满足日益增长的市场需求。发酵虫草菌粉是分离自虫草寄生真菌经过生物技术发酵生产的中药保护品种,同时也是一种重要的功能保健食品,富含腺苷、D-甘露醇、多种氨基酸等活性物质,具有抗肿瘤、抗疲劳和提高免疫力等重要生物学功能(Pan B S,LinC Y,Huang B M.Evid Based Complement Alternat Med,2011,2011:750468.;Wang Z-M,Peng X,Lee K-L D,et al.Food Chemistry,2011,125(2):637-643.)。冬虫夏草属于子囊菌纲、麦角科、虫草属,为虫草中的一种,是我国特有的名贵强壮滋补中药材。发酵冬虫夏草菌粉为从新鲜冬虫夏草中分离得到的真菌无性世代菌种经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末,是国家一类新药和中药保护品种。
目前,主要采用高效液相色谱仪等现代分析技术对发酵虫草菌粉(包括发酵冬虫夏草菌粉)中反映质量的指标腺苷含量进行检测(Li SP,Li P,Dong TT,et al.Electrophoresis,2001,22(1):144-150.;Yang F Q,Li D Q,Feng K,et al.J Chromatogr A,2010,1217(34):5501-5510.)。公告号CN100483131C的发明专利公开了一种表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,其中公开了采用HPLC分析法检测天然冬虫夏草提取液中腺苷成分的含量与比例。公告号CN101822765B的发明专利公开了一种益肾壮骨、补血益精中药复方制剂的含量检测方法,中药复方制剂由熟地黄、炒杜仲、枸杞子、女贞子、炒菟丝子、炒山药、茯苓、发酵虫草菌粉、莲子、芡实、煅牡蛎等十一味原料药组成,该专利文献中公开了采用高效液相色谱法检测中药复方制剂中的腺苷含量。这些传统的化学检测方法需要破坏样本,预处理和测定过程很费时,仅能进行抽样检测,无法实现企业要求对产品质量信息进行大规模的获取的要求。
进入21世纪以来,利用近红外光谱(Near Infrared Spectroscopy,NIRS)分析技术对食品、农副产品、石油等中各种成分的检测以及产品质量影响因素的研究日益增多。国内研究者王迪等利用近红外快速测定蛹虫草中有效成分的含量(WANG Di,ZHANG Yuan-li,MENG Qin-fan.Acta OpticaSinica,2009(10):2795-2799.)。程翼宇研究组还使用人工神经网络方法对发酵虫草菌粉进行氨基酸及甘露醇的定量检测分析(YANG Nan-lin,CHENYi-yu.analytical chemistry(analytical chemistry),2003(06):664-668.;ZHAOChen,QU Hai-bin,CHEN Yi-yu.Spectro scopy and Spectral Analysis,2004(01):50-53.)。但是这些研究都仅仅使用NIRS对活性成分进行简单定量,而关于发酵虫草菌粉中腺苷的NIRS定量检测尚未有人涉及,且还没有人进一步进行波长选择等分析。
发酵虫草菌粉中腺苷指标的差异是评价其品质并定价不同的主要依据。如能解决快速准确定量检测的问题,对大批量生产过程中的质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,用于虫草菌粉中腺苷含量的快速、无损、准确检测,解决了现有检测方法操作繁琐、耗时、耗力、成本高、污染环境等问题。
一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,包括:
(1)取虫草菌粉样本,测定腺苷含量;
(2)采集虫草菌粉样本的近红外光谱并进行预处理,采用偏最小二乘法建立虫草菌粉样本中腺苷含量与预处理后的近红外光谱之间的校正模型;
(3)采集待测样本的近红外光谱并进行预处理,通过校正模型计算得到待测样本的腺苷含量;
其中,采集近红外光谱的光谱扫描波段为4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1。
电磁波波长800-2500nm范围内为物质分子振动光谱的倍频和组合频谱带,因而包含了物质组分和分子结构的丰富信息,可用于成分含量的定量测定。含氢基团对光波有很强的吸收,通过扫描样品的近红外光谱,可以得到样品中腺苷基团的特征信息,用于腺苷的定量。
步骤(1)中,所述的虫草菌粉可以为人工发酵虫草菌丝体(包括不同来源菌种如cordyceps sinensis(Berk)sacc,Paecilomyces hepiali Chen &Dai,Cephalosporiun sinensis.Chen.Sp.nov,Mortierella SP,蛹虫草种[Cordyceps militaris(L.Fr)Link])经干燥、粉碎后得到的粉末;也可以为天然虫草经干燥、粉碎后得到的粉末。天然虫草是不同虫草菌属真菌通过各种方式感染蝙蝠蛾(鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫)的幼虫,以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活,最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳,形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。天然虫草比发酵虫草多了虫体的成分,但腺苷的含量在不同产地虫体的含量差异较大,如青海产0.3g/100g;西藏产0.1g/100g;四川产0.2g/100g(李绍平,李萍,季晖等.药学学报,2001,36(6):436-439),形成含量的浓度梯度更易于定量建模。
采用人工发酵方法时,所述的虫草菌粉为发酵虫草菌粉,可以通过如下方法制备:将经活化的虫草菌株接种到液体培养基中进行发酵培养,发酵培养后分离得到菌丝体,菌丝体经干燥、粉碎后得到发酵虫草菌粉;也可以为市售产品,包括发酵虫草菌丝体粉原料、胶囊制剂内容物、蛹虫草菌丝体粉等。
冬虫夏草为虫草中的一种,所述的发酵虫草菌粉优选为发酵冬虫夏草菌粉;更优选为杭州中美华东制药有限公司生产的发酵冬虫夏草菌粉,该产品为从新鲜冬虫夏草中分离得到的真菌无性世代菌种经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末,是通过特殊的发酵、干燥工艺制备获得的,菌丝体与发酵液分离地较彻底,活性成分含量较高且质量稳定,腺苷含量差异较小。
所述的虫草菌粉的粒径优选为80-100目,构建的校正模型预测效果较好。
样本量越大,所构建模型的可靠性越高;但样本量过大会增加工作强度。所述的虫草菌粉样本的数量优选为162个以上。
为了构建校正模型并进行预测,可以均匀抽取总样本的2/3作为校正集,其余剩下的1/3作为预测集,并确保预测集浓度分布均匀,且范围不超过校正集。
杭州中美华东制药有限公司生产的发酵冬虫夏草菌粉质量稳定,样本间腺苷含量差异较小,即样本梯度较窄,不利于模型构建。但采用本发明的方法,能获得预测效果较好的模型。所述的虫草菌粉样本腺苷含量的最大值与最小值之间的差值可以在0.08%以上。
测定腺苷含量的方法可以为高效液相色谱法,依照《中华人民共和国药典》2000年版(二部)“附录V D高效液相色谱法”中的记载进行。
步骤(2)中,采集近红外光谱时采用傅立叶变换近红外光谱仪;优选地,采用MPA型多功能傅立叶变换近红外光谱仪,光谱范围:液体透射、光纤探头、积分球(12800-4000cm-1),固体透漫射(12800-5700cm-1),分辨率:2cm-1(0.3nm在1,250nm处),波数准确度:优于0.05cm-1,波数精度:优于0.1cm-1,透光率精度:优于0.1%T。采用该近红外光谱仪,可以采集2203个波长信息,利于建模。
为了减少光谱数据受采集时装样差异、样本不均匀等因素带来的影响,所述的预处理可以采用Savitzky-Golay卷积平滑(S-G平滑)处理、归一化(normalization)处理、多元散射校正(MSC)、基线校正(baseline)和标准正态变量变换(SNV)中的一种或多种。通过预处理可以简化、强化模型,其中,S-G平滑处理实质上是一种加权平均法,是消除噪声最常用的一种方法;归一化常被用来校正由微小光程差异引起的光谱变化。MSC主要用于消除颗粒分布不均匀及颗粒大小产生的散射影响;基线校正主要用于扣除仪器背景或漂移对信号的影响;SNV与MSC的目的基本相同,主要是用来消除固体颗粒大小、表面散射及光程变化对光谱的影响。
优选地,所述的预处理采用Savitzky-Golay卷积平滑处理。试验证明,采用该预处理方法,校正模型对样本中腺苷含量的预测效果最好。
建立校正模型时可以采用偏最小二乘法(PLS)、主成分分析法(PCR)和人工神经网络法(ANN)中的一种。本发明采用所述的偏最小二乘法可以使用全谱或部分谱数据,且数据矩阵分解和回归交互结合为一步,得到的特征值向量与被测组分或性质相关,而不是与数据矩阵中变化最大的变量相关,比较适用于小样本多元数据分析,可以使用于复杂的分析体系。
建立PLS校正模型过程中,通过留一法进行交互验证,当验证集均方根误差(RMSEV)达到最小而r2最大值时所使用的主因子数目被认为是最优。将它们作为输入变量,建立PLS校正模型,进行预测。校正模型的建立可以采用Unscramber软件进行。
采集近红外光谱数据时可以采用全波段扫描,光谱扫描波段可以为12493.45-3999.91cm-1(仪器参数为4000-12500cm-1,是MPA仪器能采集到全谱范围参数)。为了有效选出包含有特征信息的波段,提高运算速度,可以采用相关系数和回归系数结合法进行特征波段的选取,特征波长的选取会较大程度地影响待测成分的检测效果。
相关系数法是在多元校正中,通过将光谱阵中每个波长对应的反射率向量与待测浓度向量进行相关性计算,对应相关系数越大其信息相应越多。本发明中,根据全波段下的PLS回归系数图,对腺苷含量设定相关系数绝对值大于0.2的波长为所需要的特征波长,选定的波段为8088.54-7286.24cm-1,4902.49-4817.64cm-1和4740.49-3999.91cm-1。
回归系数法是在回归分析中度量因变量对自变量的相依程度的指标,它是在通过多项式或其它带参数的函数对自变量和因变量达到最佳拟合程度时的多项式系数或函数的参数,可据此选出相依程度较高的波长。本发明中,根据全波段下的PLS回归系数图,对腺苷含量设定阈值为6×10-5,选定的波段为5126.21-4104.05cm-1波段。
选取这几个光谱区间相交的部分作为建模时的特征波段,即采集近红外光谱的光谱扫描波段为4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1。采用该特征波段,不仅能有效提高预测效果,而且能大大减少建模中的运算量,提高建模速度,并为检测仪器的开发提供依据。
模型性能的优劣以对预测集样本的准确判别率为标准,可以采用预测相关系数(r)、预测均方根误差(RMSEP)、剩余预测偏差(RPD)评价模型性能。r值越高,RMSEP值越小,说明模型性能越好;RPD值是化学值标准偏差与RMSEP的比值,其值在1.5~2.0之间被认为是模型可以区分变量的高值和低值,在2.0~2.5表明可以进行定量预测,超过2.5则表明有良好的预测精度。
所述的校正模型的因子数采用留一法交叉验证,即建模的过程中每次取其中一个变量来作为验证,剩下的建模。
步骤(3)中,所述的近红外光谱采集和预处理方法可以参照步骤(2)中的相关操作。
本发明采用近红外光谱分析结合化学计量学技术对虫草菌粉中腺苷含量进行了定量分析,以Savitzky-Golay平滑处理对近红外光谱进行预处理,并选取4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1两个特征波段,建立了偏最小二乘法回归模型。
本发明方法适用于浓度梯度窄的样本,通过所选取的特征波段进行建模,建模过程中运算量小,建模速度快;且所建立的偏最小二乘法回归模型有效性好、可靠性高,对待测样本中腺苷含量的预测效果好,可以实现对虫草菌粉中腺苷含量的快速、准确、无损检测。本发明方法通过与过程控制***整合,可实现对分析数据的集成管理和生产过程的实时监控;将光谱仪器通过光纤连接检测探头,结合本方法可用于发酵虫草菌粉生产过程中样品的实时检测,为生产实践中的近红外在线检测打下了基础。
附图说明
图1为实施例1中全光谱样本平均光谱曲线图;
图2为实施例1中腺苷回归系数和相关系数图,其中,图(a)为腺苷PLS回归系数图,图(b)为腺苷的相关系数图;
图3为实施例2中全光谱样本平均光谱曲线图。
具体实施方式
实施例1发酵冬虫夏草菌粉中腺苷含量检测
1、样品制备
随机收集162个发酵冬虫夏草菌粉样品用于建立整个数据集。为使采集的样品更具代表性和多样性,样品分别来自杭州中美华东制药有限公司提供的不同批次(20批次)发酵冬虫夏草菌粉,使所建模型具有更好的适应性和鲁棒性。样本以(4±1℃)的温度保存;每个样品放在统一的塑料封装袋中,整个实验在室温18-20℃下进行。
2、采用化学方法测定腺苷含量
依照《中华人民共和国药典》2000年版(二部)“附录V D高效液相色谱法”进行;测得值为100克样品中的含量值(g)。测定结果见表1。
按照腺苷测量值进行排序后均匀抽取总样品的2/3(总计108个)作为校正集,其余剩下的1/3作为预测集,确保预测集浓度分布均匀,且范围不超过校正集。
表1建模集和预测集的腺苷含量(g/100g)
3、基于全波段的偏最小二乘法(PLS)建模
MPA型多功能傅立叶变换近红外光谱仪(BRUKER,德国),光谱范围:液体透射、光纤探头、积分球(12800-4000cm-1),固体透漫射(12800-5700cm-1),分辨率:2cm-1(0.3nm在1,250nm处),波数准确度:优于0.05cm-1,波数精度:优于0.1cm-1,透光率精度:优于0.1%T。所有的化学计量分析法由Unscrambler version 9.6(CAMO PROCESS AS,挪威)和MATLAB 7.1(The Math Works,Natick,美国)执行。OPUS 5.5软件(BRUKER,德国)。
(1)光谱测量与化学计量学分析
每个样本的光谱是连续32次扫描的平均值。将所有样本的光谱吸收值取平均值,得到如图1所示的光谱曲线。N-H键伸缩振动的一级倍频一般出现在6666cm-1附近,伸缩振动与弯曲振动的组合频率在4650cm-1附近。C-H键振动的一级倍频出现在6250-5555cm-1之间,二级倍频在9090-8333cm-1之间,第一组合频出现在5000-4160cm-1之间,谱带较强(褚小立.化学计量学方法与分子光谱分析技术[M].化学工业出版社.2011.7:1259-307)。应用以下5种光谱预处理方法,包括Savitzky-Golay平滑处理(S-G平滑处理)、归一化处理(normalization)、多元散射校正(MSC)、基线校准(baseline)和变量标准化(SNV)。
(2)全波段建模
经预处理后,建立光谱数据与发酵冬虫夏草菌粉腺苷含量的PLS模型。
表2发酵冬虫夏草菌粉中腺苷含量全光谱PLS模型结果
腺苷不经过任何处理就能够达到较为理想的预测结果,这与王迪等(WANG Di,ZHANG Yuan-li,MENG Qin-fan.Acta Optica Sinica,2009(10):2795-2799.)快速测定蛹虫草中有效成分的含量所观察的结果相一致。光谱预处理对腺苷含量预测效果不仅没有提高反而有所降低,出现这样的结果原因很可能是因为发酵虫草菌粉中腺苷的含量较少,其官能团对光谱的响应不是很强,预处理之后反而削弱了有用的信息。
4、基于特征波段的偏最小二乘法(PLS)建模
MPA光谱仪一共采集有2203个波长信息,为了有效选出包含有特征信息的波段,提高运算速度,采用回归系数和相关系数结合法,进行特征波段的选取。
从全波段建模可以得到腺苷的PLS回归系数图(见图2中的图a,v为波数,Reg为相关系数),在波数4107.91-3999.91cm-1和9025.83-12493.45cm-1这两个波段内噪声较大,不选取这两个波段内的波长。根据回归系数图,对腺苷设定阈值为6×10-5,选定的波段为5126.21-4104.05cm-1波段。
在Matlab中对腺苷含量进行相关性分析,得到相关系数图(见图2中的图b,v为波数,Rel为相关系数)。根据计算结果,对腺苷含量设定相关系数绝对值大于0.2的波长为所需要的特征波长,由图知,有3个光谱区间符合这一设定阈值,它们分别是8088.54-7286.24cm-1,4902.49-4817.64cm-1和4740.49-3999.91cm-1。
只选取这几个光谱区间相交的部分为建模时的特征波段,为4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1两个波段,建立PLS模型,预测结果如表3所列。
表3选择波长进行不同预处理后腺苷PLS模型预测结果
对腺苷原始光谱来说,使用特征波长建模效果比全波段建模效果好。和全波段建模一样的是,不经过任何预处理就能够达到较为理想的预测结果,且经过Savitzky-Golay卷积平滑预处理与不经任何预处理的预测效果相近。
利用腺苷选取特征波长建立PLS模型后,无论是否采用预处理,其预测效果较全波段PLS模型均有不同程度的提高:由全波段时的最优(r=0.7882,RMSEP=0.000134,RPD=1.6407)提高到(r=0.8290,RMSEP=0.001250,RPD=1.8476)。
实施例2发酵虫草菌粉中腺苷含量检测
1、样品制备
随机收集162个发酵虫草菌粉样品用于建立整个数据集。样品分别来自江西国药有限责任公司及长兴制药有限公司不同批次(20批次)发酵虫草菌粉。样品实验条件及保存均参照实施例1。
2、采用化学方法测定腺苷含量
校正集和预测集设置、腺苷的测定均参照实施例1,测定结果见表4。
表4建模集和预测集的腺苷含量(g/100g)
3、利用选择出的特征波段进行偏最小二乘法(PLS)建模
近红外光谱仪器及使用软件均参照实施例1。
(1)光谱测量与化学计量学分析
每个样本的光谱是连续32次扫描的平均值。将所有样本的光谱吸收值取平均值,得到如图3所示的光谱曲线。
(2)特征波段建模
利用特征波段对光谱分别不进行预处理和预处理建立PLS模型,利用实施例1中相同特征波段4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1两个波段建立光谱数据与发酵虫草菌粉腺苷含量的PLS模型。
表5选择波长进行不同预处理后腺苷PLS模型预测结果
利用腺苷所选取特征波长建立PLS模型后,无论是否采用预处理,其预测效果都很好:最优为(r=0.9743,RMSEP=0.01234,RPD=6.2391)。说明该特征波段适用于发酵虫草菌粉中腺苷含量的预测。
Claims (9)
1.一种虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,包括:
(1)取虫草菌粉样本,测定腺苷含量;
(2)采集虫草菌粉样本的近红外光谱并进行预处理,采用偏最小二乘法建立虫草菌粉样本中腺苷含量与预处理后的近红外光谱之间的校正模型;
(3)采集待测样本的近红外光谱并进行预处理,通过校正模型计算得到待测样本的腺苷含量;
其中,采集近红外光谱的光谱扫描波段为4902.49-4817.64cm-1和4740.49-4107.91cm-1。
2.根据权利要求1所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的虫草菌粉为发酵虫草菌粉。
3.根据权利要求2所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的虫草菌粉为发酵冬虫夏草菌粉。
4.根据权利要求1所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的虫草菌粉的粒径为80-100目。
5.根据权利要求1所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的虫草菌粉样本的数量为162个以上。
6.根据权利要求5所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的虫草菌粉样本腺苷含量的最大值与最小值之间的差值在0.08%以上。
7.根据权利要求1所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,步骤(1)中,测定腺苷含量的方法为高效液相色谱法。
8.根据权利要求1所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,步骤(2)或(3)中,所述的预处理采用Savitzky-Golay卷积平滑处理、归一化处理、多元散射校正、基线校正和标准正态变量变换中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的虫草菌粉腺苷含量快速检测方法,其特征在于,所述的预处理采用Savitzky-Golay卷积平滑处理。
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