CN102766667B - 甜菊苷转化为莱鲍迪苷e的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法，其是采用黑曲酶II在外加糖源下将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E。本发明以甜菊苷为原料得到莱鲍迪苷E的转化率≥70%，固形物中莱鲍迪苷E含量至少可达60%，进一步分离纯化后可达80%，甚至可＞90%，莱鲍迪苷E的口感无异味，与蔗糖相似，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产RE成本低，易放大，适用于工业生产。
Description
技术领域
本发明属于食品化工领域，具体涉及甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法。
背景技术
甜菊糖苷(Steviol glycosides)是对甜叶菊提取物的一个总称，其甜味成分包括甜菊苷（Stevioside），莱鲍迪苷A、B、C、D、E（Rebaudi oside A/B/C/D/E），甜菊双糖苷（Steviolbioside），杜克苷A（Dulcoside A）等。传统甜菊糖苷中甜菊苷约占总苷量的66%，莱鲍迪苷A约占总苷量的22%，莱鲍迪苷C约占总苷量的9%，杜尔可苷A约占总苷量的2%，其它成分含量极微。甜菊糖苷主要成分的结构式见下：
甜菊苷 莱鲍迪苷A 莱鲍迪苷C
莱鲍迪苷E 莱鲍迪苷B 甜菊双糖苷
甜菊苷（Stevioside，以下简称ST）是传统甜菊糖苷中含量最多的甜味成份，甜度为蔗糖的200倍，但甜菊苷有一定的甘草余味，这也制约了传统甜菊糖苷的广泛应用。
莱鲍迪苷E（Rebaudioside E，以下简称RE）和ST有相同的母核结构（甜菊醇），但RE较ST在19位侧链上多连接了一个葡萄糖分子。RE分子结构式见式2。实验中发现，RE在口感上没有后苦味。但是RE在甜菊糖苷中的含量远远小于1%，如果通过纯化甜菊糖苷来生产RE，其成本很高，难以大量生产和推广使用。
为了改善甜菊糖苷的口感，目前研究多集中在已有分子上加入长糖链。
专利申请CN 201110379733.7公开了一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)提高甜菊糖苷味质的方法，其采用水配制成含2-5％重量的甜菊糖苷和2-5％重量的淀粉的反应液，将酶活为60-70U/ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均匀，转移酶的加入量为300-500U/甜菊糖苷重量g，在温度为37-50℃进行转化反应48-72小时。
专利申请201010131126.4公开了种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法。该方法以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料，在微波反应装置中经由微波辐射与CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本发明提供的工艺条件内，不仅可以显著加快酶催化反应的进行，而且不会产生通常条件下水体系中微波使酶失活的现象。
以上这些方法都是用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷，但CGTase不能将单一的一个葡萄糖残基加到甜菊糖苷分子上，并且其催化糖链转移到甜菊糖苷上的位置不专一。因此，CGTase的催化产物是复杂的混合 物，难以符合美国FDA和欧盟JECFA的标准；且环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)不能催化在甜菊苷（Stevioside）结构上特异加一个葡萄糖残基转化成莱鲍迪苷A（Rebaudioside A）的反应。
文献Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana（The Plant Journal，41，56-67）从甜叶菊中发现了可以将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A的酶UGT76G1。该酶需要额外的尿嘧啶二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）作为糖供体，目前为止UDP-Glc并没有相应的工业产品，要得到UDP-Glc成本高昂且难以大量获得。此外该反应操作步骤繁琐，酶稳定性差、催化活性低，因此这一方法不适用于大规模工业生产。
迄今为止，还没有以甜菊糖苷中单一成分甜菊苷（Stevioside）为原料，通过微生物发酵，以蔗糖为糖基供体进行生物转化生产莱鲍迪苷E（Rebaudioside E）的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种以甜菊苷为原料，以蔗糖为糖源，通过酶法转化生产莱鲍迪苷E，从而改善其口感的方法。
本发明的技术方案为：甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法，其采用黑曲酶II在外加糖源下将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E。
进一步地，所述糖源为蔗糖。
进一步地，具体步骤为：将甜菊苷、水、蔗糖按照重量比1︰10～20︰1～8配制成水溶液；然后按甜菊苷︰黑曲酶II=800～1200︰1的重量比向所述水溶液中加入黑曲酶II，在温度为30～50℃、pH 6～8的条件下反应3～7h；过滤反应液，浓缩、干燥即得含有莱鲍迪苷E的固形物。
之所以选择蔗糖为糖源，是因为蔗糖的其物理化学性质与莱鲍迪苷E差异 较大，反应后便于采用柱层析或结晶等方式去除未反应的蔗糖以及反应后的果糖。
本发明中所述的黑曲酶II由黑曲霉菌CICC 40430（中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏编号：40430）发酵诱导得到的一种特异性糖基转移酶。
黑曲酶II的制备方法如下：
将黑曲霉菌CICC 40430单克隆在BMGY培养液中经初培、扩配、离心收集、再次扩配、甲醇诱导、离心收集上清酶液，获取上清酶液中分子量在70～75kD的酶即为黑曲酶II。
具体地，其包括如下步骤：
（1）挑取黑曲霉菌CICC 40430单克隆，接种至含25ml BMGY培养液的250ml摇瓶中，在温度为26～30度，转数为200～300rpm的条件下培养至对数生长期；将上述培养液接种至含1L BMGY培养液的2～4L摇瓶中，在温度26～30度，转数为200-300rpm的条件下培养至对数生长期。
（2）将步骤（1）的得到的培养液在2000～3000g条件下离心，收集细胞，去除上清，用BMMY培养液重悬细胞至OD600=1.0，分装至几个3-4L隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床26-30度继续培养。
（3）每24小时，加甲醇至0.4-0.6%浓度，直至到达最佳诱导时间。室温条件下，2000-3000g离心5min收集细胞。保留上清酶液，置于4度预冷浓缩。使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在70-75kD的酶即为黑曲酶II。
进一步地，其包括如下步骤：
（1）挑取黑曲霉菌CICC 40430单克隆，接种至含25ml BMGY培养液的250ml摇瓶中，在温度为28度，转数为250rpm的条件下培养至OD600=4；将上述培养后的培养液接种至含1L BMGY培养液的3L摇瓶中，在温度为28度，转数为250rpm的条件下培养至对OD600=4。
（2）用灭菌离心管，室温下2500g离心5min收集细胞，去除上清，用BMMY 溶液重悬细胞至OD600=1.0，分装培养基至几个3-4L隔板摇瓶，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床28度继续培养。
（3）每24小时，加甲醇至0.5%浓度，直至到达最佳诱导时间；室温条件下，2500g离心5min收集细胞。保留上清酶液，置于4℃浓缩。使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在70-75kD的酶即为黑曲酶II。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的方法以甜菊苷为原料得到莱鲍迪苷E的转化率≥70%，固形物中莱鲍迪苷E含量至少可达60%，进一步分离纯化后可达80%，甚至可＞90%，莱鲍迪苷E的口感无异味，与蔗糖相似，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产RE成本低，易放大，适用于工业生产。
具体实施方式
在具体实施方式中，甜菊苷(Stevioside)简称为ST，莱鲍迪苷E(Rebaudioside E)简称为RE，蔗糖(Sucrose)简称为SU。
实验1反应底物条件对RE转化的影响
为考察反应底物条件对RE生物转化的影响，以正交试验方法进行实验，分别将9份50g ST（95%）按表1条件（1︰10～1︰20m/v、10～40℃、搅拌时间30～60min）进行反应底物准备。准备后，再按照ST干粉与SU的比例1︰5，800︰1～1200︰1(m/m,ST干粉：黑曲酶II）的重量比量加入黑曲酶II，在pH值7、40℃条件下保温5h的进行酶催化的生物转化。
表1反应底物条件试验方案及结果分析
本发明不限于实施例中RE的特定转化率、纯度及溶解ST干粉的特定条件。
实验2生物转化条件对RE转化的影响
为考察生物转化条件对RE转化率的影响，以生物转化条件因素进行正交实验。首先，分别将9份50g ST（90%）按表2条件，将ST干粉与水的比例1︰15，搅拌时间45min，溶解温度25℃，搅拌速度90rpm进行反应底物准备。然后按ST︰黑曲酶II=1000︰1(m/m)加入黑曲酶II，再按照表2条件（ST：SU=1︰2～1︰8m/m、温度30～50℃、酸碱度pH 6～8、反应时间3～7h）进行生物转化的正交试验。生物转化反应后，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法，检测RE的生成量，并计算RE转化率，结果见表2。
表2生物转化条件对RE转化率的影响
本发明不限于实施例中RE的特定转化率、纯度及酶处理ST的特定条件。
实验3考察过滤、浓缩法对固形物RE含量的影响
按照实施例1-18的转化方法得到反应液后，若采用滤纸过滤，干燥，得到固形物A；若采用结晶可得到固形物B；若将固形物B再结晶后干燥得到固形物C，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法检测RE，结果见表3。
表3
从表3可见，采用固形物中莱鲍迪苷E含量至少可达60%，进一步精制后可达80%，甚至可＞95%。
Claims (1)
1.甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法，其特征在于：其采用黑曲酶II在外加糖源下将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E，所述糖源为蔗糖，具体步骤为：将甜菊苷、水、蔗糖按照重量比1︰10～20︰1～8配制成水溶液；然后按甜菊苷︰黑曲酶II=800～1200︰1的重量比向所述水溶液中加入黑曲酶II，在温度为30～50℃、pH 6～8的条件下反应3～7h；过滤反应液，浓缩、干燥即得含有莱鲍迪苷E的固形物，所述的黑曲酶II由黑曲霉菌（Aspergillus niger） CICC 40430（中国工业微生物菌种保藏管理中心 保藏编号：40430）发酵诱导得到的一种特异性糖基转移酶，它是由下述方法得到的：
（1）挑取黑曲霉菌CICC 40430单克隆，接种至含 25ml BMGY培养液的 250ml 摇瓶中，在温度为26～30 度，转数为200～300rpm 的条件下培养至对数生长期；将上述培养液接种至含 1L BMGY培养液的 2～4L 摇瓶中，在温度26～30 度，转数为200-300rpm的条件下培养至对数生长期；
（2）将步骤（1）的得到的培养液在2000～3000g条件下离心，收集细胞，去除上清，用BMMY培养液重悬细胞至OD600=1.0，分装至几个3-4L 隔板摇瓶中，用 2 层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床 26-30度继续培养；
（3）每 24 小时，加甲醇至 0.4-0.6%浓度，直至到达最佳诱导时间，室温条件下，2000-3000g 离心 5min 收集细胞，保留上清酶液，置于 4 度预冷浓缩，使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在70-75kD的酶即为黑曲酶II。
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