CN102766643A - 编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001及其应用,该基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示;该基因可用于提高农作物的草甘膦抗性,具体的是将基因aroAS001、含有基因aroAS001的表达载体或克隆载体,或含有上述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本发明的基因是一种优良的草甘膦抗性基因,转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长,与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比,表现出优良的草甘膦抗性,取得了意料不到的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因aroA及其应用,该基因是从高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌菌株中克隆得到的,对草甘膦表现出增强的抗性。
背景技术
草甘膦(Glyphosate)因理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解和不破坏土壤环境等优点,自1971年孟山都公司成功开发以来,备受市场青睐,现已成为全球销量最大的植物保护产品。由此,草甘膦也成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象,抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦作用靶标酶EPSP合成酶(EPSPS)基因的克隆、表达及其功能验证等也因此成为现代分子生物育种研究的重点。
在自然界中,植物和微生物都含有编码EPSP合成酶(EPSPS)的基因。植物中编码该合酶的基因为epsps,而在微生物中编码该合酶的基因为aroA。
1983年孟山都公司和华盛顿大学的科学家分离得到了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4,该株系的EPSPS对草甘膦不敏感,具有很高的抗性。1986年孟山都公司将CP4EPSPS基因导入到大豆基因组中,成功培育出抗草甘膦大豆新品种。此后科学家们分别从细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、可变盐单胞菌、假单胞菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结合分支杆菌中克隆得到编码EPSP合成酶的aroA基因,从拟南芥、烟草、牛筋草、小蓬草等植物中克隆得到了epsps基因(He etal.,2001;Borges etal.,2007;Melanie etal.,2005;Brotherton etal.,2007;Dinelli etal.,2006;Zhao etal.,2011;Baerson etal.,2002;刘柱等,2004)。其中牛筋草、胡萝卜及烟草epsps基因可耐受100uM以下的草甘膦(Baerson etal.,2002;Shyr etal.,1992;Dyer etal.,1988),水稻epsps基因突变体可耐受100mM以下的草甘膦(Zhou etal.,2006);可变盐假单胞菌的EPSP合酶基因可耐受50mM以下的草甘膦(刘光全等,2004);人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)中的EPSP合酶基因可耐受300mM以下的草甘膦(金 芜军等,2010)。
目前关于杂草对草甘膦抗性机制有多方面的说法。Lorraine-Colwill等认为瑞士黑麦草抗性生物型和敏感生物型EPSPS酶的活性以及epsps基因序列都没有差异,主要是由植物体内的吸收输导差异而产生了对草甘膦的抗性。而Gaines等认为,EPSPS酶的表达量增加也可以使植物对草甘膦产生抗性。而草甘膦靶标酶EPSP合成酶基因epsps的核酸序列位点发生突变,致使生物体对草甘膦产生抗性,有很多研究报道。
发明内容
为了克服现有转基因作物草甘膦抗性偏低的缺陷,本发明的首要目的在于提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因aroAS001。
本发明的另一目的在于提供上述基因(aroAS001)在提高农作物草甘膦抗性中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001,其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
上述基因(aroAS001)是利用同源克隆的方法从一株高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)kpS001菌株中克隆得到的,该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.6189。
上述基因(aroAS001)可用于提高农作物的草甘膦抗性,包括将aroAS001、含有aroAS001的表达载体或克隆载体、含有上述表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
肺炎克雷伯氏菌aroAS001基因是一种优良的草甘膦抗性基因,转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长,与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比,表现出优良的草甘膦抗性,取得了意料不到的有益效果。
附图说明
图1为实施例2中aroAS001基因PCR扩增产物电泳图;其中M-DL2000Marker,1-aroAS001基因PCR扩增产物(1284bp)。
图2为实施例3中重组质粒pProA-aroAS001的菌落PCR检测结果图;其中, M-DL2000Marker,1-9-第1-9号克隆的扩增结果。
图3为实施例4中,kpS001EPSPS蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测结果图;M-低分子量标准蛋白,1-含空载体pProA菌株DH5αIPTG诱导表达6小时,2-含pProA-aroAS001重组质粒菌株DH5αIPTG诱导表达6小时。
图4为实施例5中,分别转入pProA和pProA-aroAS001质粒的ER2799菌株分别在含0mM和50mM草甘膦培养基中的生长曲线图;其中,aroAS001-0是转入ProA-aroAS001质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图,aroAS001-50是转入ProA-aroAS001质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图,pProA-0是转入pProA质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图,pProA-50是转入pProA质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图。
图5为实施例5中,分别转入pProA和pProA-aroAS001质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图;其中,aroAS001是转入pProA-aroAS001质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图,pProA是转入pProA质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
高抗草甘膦菌株的筛选分离,是从广东蔬菜田间取土样,以草甘膦为筛选标记,分离获得肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株;具体包括以下步骤:
1、高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌的分离:
(1)取广东蔬菜田间土样10g,加入到90mL 150mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)中,置于37℃、120r/min培养72h。
(2)取步骤(1)10mL培养液加入到含200mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养,37℃、120r/min培养72h;依此类推,将前一轮培养液逐级加入300、350、400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养,37℃、120r/min培养72h。
(3)取适量培养液分别在含350mmol/L草甘膦的营养琼脂、马丁、高氏一号平板培养基上,划线分离。
(4)挑取步骤(3)中的单菌落接种于含400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养,37℃、120r/min培养72h。
(5)取适量培养液在含400mmol/L草甘膦的营养琼脂马丁高氏平板培养基上,划线分离。获得耐受400mmol/L草甘膦的菌株。
2、利用革兰氏染色法,在显微镜下观察步骤1分离得到的菌株,为短杆状、单个、成双或短链状排列,革兰氏阴性杆菌。
3、利用通用引物27F、1492R PCR扩增该菌株的16S DNA序列。
PCR反应体系如下:
PCR反应条件如下:
94℃ 5min
72℃ 10min
16℃ Forever
PCR产物送上海英俊公司测序。测序结果经NCBI网站Blast比对,该菌株16sDNA序列与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)16sDNA序列相似度为99%。确定本实施例分离得到的菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae),命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)kpS001菌株,该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号 为CGMCC NO.6189。
实施例2
克隆编码肺炎克雷伯氏菌EPSP合成酶的基因aroA,本实施例利用同源克隆的方法从菌株kpS001中克隆编码EPSP合成酶的基因aroA;具体包括以下步骤:
1、肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株基因组提取方法:基因组提取用天根细菌基因组提试剂盒提取,操作步骤与说明书基本一致,稍作修改如下:
(1)取细菌培养液2mL,12000rpm离心1min,尽量吸净上清。
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA,振荡至菌体彻底悬浮。
(3)向管中加入20μL蛋白酶K溶液,混匀。
(4)加入220μL缓冲液GB,振荡15s,70℃放置10min,溶液变清亮后,简短离心去除管内壁水珠。
(5)加入220μL无水乙醇,充分振荡混匀15s,出现絮状沉淀,简短离心去除管内壁水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个CB3中(吸附柱放入收集管),12000rpm离心1min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心1min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管。
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW,12000离心1min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管。漂洗两次。
(9)将吸附柱CB3放回收集管,12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管,将无菌的双蒸水加热至65℃后,取50ul向吸附膜中间部位悬空滴加,静置30s,12000rpm离心1min,收集滤出液,即为基因组DNA。
2PCR扩增方法
以NCBI中Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae NTUH-K2044全长aroA基因序列(Gene ID:7948607)设计正反向PCR引物,用来扩增kpS001菌株aroA基因序列(aroAS001)。
引物如下:
KpF:5-ATGGAATCCCTGACGTTACAAC-3
KpR:5-TCAGGCGAGGGTACTGATCCG-3
PCR反应体系如下:
10*Taq buffer | 3μL |
[0058]
dNTP(10mmol) | 1μL |
kpF(10pmol) | 1μL |
kpR(10pmol) | 1μL |
gDNA | 2μL |
rTaq | 0.3μL |
ddH2O | 21.7μL |
Total | 30μL |
反应程序如下:
94℃ 5min
72℃ 10min
16℃ Forever
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后(见图1),用天根DNA产物快速纯化回收试剂盒回收目的片段,长度约1300bp。连接到pMD18-T载体上。热击法将重组载体转入DH5α大肠杆菌中,通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选阳性克隆,菌落PCR检测阳性克隆后,提取阳性克隆质粒。
连接反应按以下所示体积进行:
3热击法转化:
(1)将连接产物无菌操作转入100μL解冻的感受态中,轻轻混匀内容物,冰上放置30min
(2)将混合物置于42℃水浴中热激90s。
(3)迅速置于冰上,冷却2min。
(4)加800μL LB液体培养基37℃温育45min。
(5)取200μL培养液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12-16h。
4阳性克隆筛选:
用无菌牙签挑取单克隆置于10μL无菌水中,取2μL用于PCR做检测,余下8μL接种于300μL含氨苄青霉素的LB培养基中37℃振荡培养。
PCR反应体系:
10*Taq buffer | 1μL |
dNTP(10mmol) | 0.2μL |
M13F(10pmol) | 0.2μL |
M13R(10pmol) | 0.2μL |
菌液 | 2μL |
rTaq | 0.1μL |
ddH2O | 6.3μL |
Total | 10μL |
反应程序:
94℃ 5min
72℃ 10min
16℃ Forever
5质粒提取
取15μL阳性克隆的菌液接种至5mL的含有Amp+LB扩大培养12h。用天根质粒小提取试剂盒提取质粒。步骤详见其说明书。
将所提取质粒送上海英俊公司测序,测序结果如SEQ ID NO.3所示,该基因序列命名为aroAS001,推导出对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3
构建aroAS001与原核表达载体pProA的重组载体,包括以下步骤:
1PCR扩增
根据实施例2测序结果(SEQ ID NO.3)重新设计引物如下:
KpF1:5-GAATTCATGGAATCCCTGACGTTACAAC-3
KpR1:5-CTCGAGTCAGGCGAGGGTACTGATCCG-3
PCR反应体系:
10*Taq buffer | 3μL |
dNTP(10mmol) | 1μL |
kpF(10pmol) | 1μL |
kpR(10pmol) | 1μL |
DNA | 2μL |
rTaq | 0.3μL |
ddH2O | 21.7μL |
Total | 30μL |
PCR反应程序如下:
94℃ 5min
72℃ 10min
16℃ Forever
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后,用天根DNA产物快速纯化回收试剂盒回收目的片段,长度约1300bp。连接到pMD18-T载体上。利用热击法将重组载体转入大肠杆菌DH5α大肠杆菌中,通过氨苄霉素(Amp+)抗性筛选阳性克隆,菌落PCR检测阳性克隆后,提取阳性克隆质粒(步骤如实施例2所述)。之后用EcoRI和XhoI对pMD18-aroAS001质粒及pProA载体质粒双酶切,0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收酶切片段aroAS001与酶切后的pProA载体,16℃连接过夜。
酶切体系如下:
37℃,温育3小时。
连接体系如下:
酶切后目的片段 | 5μL |
酶切后表达载体proA | 3μL |
Buffer | 1μL |
T4连接酶 | 1μL |
total | 10μL |
16℃连接过夜。利用热击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,利用氨苄霉素筛选阳性克隆,菌落PCR检测(方法如实施例2所述),结果见如2,图中的第1-4、6-7、9号克隆为阳性克隆,即重组质粒pProA-aroAS001。
实施例4
实施例3重组质粒的蛋白诱导表达,包括以下步骤:
1IPTG诱导蛋白表达
(1)挑取实施例3中的阳性克隆菌落,接入1mL含氨苄的LB液体培养基中,37℃过夜培养。
(2)取步骤(1)中50μL菌液接种到含氨苄的5mL的培养液LB中,培养2h以上,至OD600为0.5-1.0。
(3)取1mL未诱导的培养物于离心管中,用于比较。4℃保存。
(4)加IPTG到剩下的培养物中至终浓度为1mmol/L,继续培养。隔3h、6h各取1mL的样,室温高速离心1min,倒掉培养液。
(5)用1mL PBS洗涤沉淀,再次离心得到沉淀。用PBS稀释沉淀,使稀释浓度一致。
(6)取20μL稀释的菌液100℃加热5min,立刻冰浴5min,加1×SDS上样缓冲液,简短离心。
(7)10%SDS-PAGE电泳检测。
2实验结果
本实验以转入pProA空载体的大肠杆菌DH5α为对照组。电泳结果显示,与对照菌株相比,在IPTG诱导下,目的菌株中目的蛋白有大量表达,大小约48KDa(见图3)。目的蛋白的成功表达表明该重组质粒可用于后期功能验证。
实施例5
实施例2重组质粒的功能验证,包括以下步骤:
1试验方法:
为了验证基因aroAS001对草甘膦的抗性水平,将实施例2构建的重组载体pProA-aroAS001转入aroA缺陷型大肠杆菌ER2799菌株中,观察该重组缺陷型菌株在分别含0、50、100、200、300、400mM草甘膦的M9培养基中,37℃,180rpm/min生长情况,以转入空载体pProA的缺陷型大肠杆菌菌株ER2799为对照。实验步骤如下:
(1)将重组载体pProA-aroAS001和对照空载体pProA分别转入缺陷型菌株ER2799中,挑选阳性克隆,获得重组菌和对照菌。
(2)将阳性克隆分别接种到等量的LB液体培养基中(含50ug/ml Amp+;1.0mM IPTG;100ug/ml的苯丙氨酸Phe,酪氨酸Tyr,色氨酸Trp),37℃,培养过夜
(3)测定过夜培养的菌液OD595值,如两者OD595值不同,将OD595较小的菌液适当延长时间培养至两者OD595值一致。
(4)分别取OD595值一致的重组菌和对照菌菌液100ul,接种至3ml M9培养基中,重组菌和对照菌各接种5管,培养基中加入50ug/ml氨苄(Amp+)、1.0mM IPTG,然后,在5管接种菌液的M9培养基中分别加入0mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM的草甘膦,37℃、180rpm振荡培养。
(5)分别于0、12、24、36、48小时取100ul菌液测定OD595值。
(6)菌液OD595值数据分析。
2实验结果
为了验证肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株aroAS001基因对草甘膦的抗性功能,将目的基因aroAS001连接到pProA载体上并转入aroA基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799中,并接入到含不同浓度草甘膦的M9基础盐培养基中培养,进行功能互补实验。
以转入pProA空载体的ER2799菌株为实验对照。实验结果显示,在没加草甘膦时,重组菌和对照菌的生长状态无显著差异,而加入草甘膦50mM以后,对照菌的生长明显受到抑制,而重组菌依然能够生长(图4)。
随着草甘膦浓度的增加,重组菌生长逐渐受到抑制,直到草甘膦浓度达到400mM时,重组菌的生长基本受到抑制,但仍略高于对照菌株(图5)。由此可见,肺炎克雷伯氏菌kpS001aroAS001基因对草甘膦表现出良好的抗性。转入pProA-aroAS001重组质粒的ER2799菌株获得了较强的草甘膦耐受能力。
由以上实施例可见,从高抗草甘膦菌株肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株中克隆的编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因aroAS001,提供了 一种来源于细菌的EPSPS基因全序列,及其相应的氨基酸序列,具有优良的草甘膦抗性。该基因可用于转化农作物,以提高转基因作物的草甘膦抗性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001,其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的基因aroAS001在提高农作物草甘膦抗性中的应用。
3.根据权利要求2所述的基因aroAS001在提高农作物草甘膦抗性中的应用,其特征在于:将基因aroAS001转化入农作物中。
4.根据权利要求2所述的基因aroAS001在提高农作物草甘膦抗性中的应用,其特征在于:将含有基因aroAS001的表达载体或克隆载体转化入农作物中。
5.根据权利要求4所述的基因aroAS001在提高农作物草甘膦抗性中的应用,其特征在于:将含有权利要求4所述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121107 |