CN102766643A

CN102766643A - 编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA及其应用

Info

Publication number: CN102766643A
Application number: CN2012102623084A
Authority: CN
Inventors: 田兴山; 张纯; 冯莉; 吴丹丹; 张妤; 杨彩宏; 岳茂峰; 崔烨
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2012-11-07

Abstract

本发明公开了一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA_S001及其应用，该基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；该基因可用于提高农作物的草甘膦抗性，具体的是将基因aroA_S001、含有基因aroA_S001的表达载体或克隆载体，或含有上述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本发明的基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。

Description

编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的基因aroA及其应用，该基因是从高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌菌株中克隆得到的，对草甘膦表现出增强的抗性。

背景技术

草甘膦（Glyphosate）因理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解和不破坏土壤环境等优点，自1971年孟山都公司成功开发以来，备受市场青睐，现已成为全球销量最大的植物保护产品。由此，草甘膦也成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦作用靶标酶EPSP合成酶（EPSPS）基因的克隆、表达及其功能验证等也因此成为现代分子生物育种研究的重点。

在自然界中，植物和微生物都含有编码EPSP合成酶（EPSPS）的基因。植物中编码该合酶的基因为epsps，而在微生物中编码该合酶的基因为aroA。

1983年孟山都公司和华盛顿大学的科学家分离得到了根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）CP4，该株系的EPSPS对草甘膦不敏感，具有很高的抗性。1986年孟山都公司将CP4EPSPS基因导入到大豆基因组中，成功培育出抗草甘膦大豆新品种。此后科学家们分别从细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、可变盐单胞菌、假单胞菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结合分支杆菌中克隆得到编码EPSP合成酶的aroA基因，从拟南芥、烟草、牛筋草、小蓬草等植物中克隆得到了epsps基因（He etal.,2001；Borges etal.,2007；Melanie etal.,2005;Brotherton etal.,2007;Dinelli etal.,2006;Zhao etal.,2011;Baerson etal.,2002;刘柱等，2004）。其中牛筋草、胡萝卜及烟草epsps基因可耐受100uM以下的草甘膦(Baerson etal.,2002；Shyr etal.,1992;Dyer etal.,1988)，水稻epsps基因突变体可耐受100mM以下的草甘膦（Zhou etal.,2006）；可变盐假单胞菌的EPSP合酶基因可耐受50mM以下的草甘膦（刘光全等，2004）；人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi）中的EPSP合酶基因可耐受300mM以下的草甘膦（金芜军等，2010）。

目前关于杂草对草甘膦抗性机制有多方面的说法。Lorraine-Colwill等认为瑞士黑麦草抗性生物型和敏感生物型EPSPS酶的活性以及epsps基因序列都没有差异，主要是由植物体内的吸收输导差异而产生了对草甘膦的抗性。而Gaines等认为，EPSPS酶的表达量增加也可以使植物对草甘膦产生抗性。而草甘膦靶标酶EPSP合成酶基因epsps的核酸序列位点发生突变，致使生物体对草甘膦产生抗性，有很多研究报道。

发明内容

为了克服现有转基因作物草甘膦抗性偏低的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的基因aroA_S001。

本发明的另一目的在于提供上述基因（aroA_S001）在提高农作物草甘膦抗性中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA_S001，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

上述基因（aroA_S001）是利用同源克隆的方法从一株高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)kpS001菌株中克隆得到的，该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6189。

上述基因（aroA_S001）可用于提高农作物的草甘膦抗性，包括将aroA_S001、含有aroA_S001的表达载体或克隆载体、含有上述表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

肺炎克雷伯氏菌aroA_S001基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。

附图说明

图1为实施例2中aroA_S001基因PCR扩增产物电泳图；其中M-DL2000Marker，1-aroA_S001基因PCR扩增产物（1284bp）。

图2为实施例3中重组质粒pProA-aroA_S001的菌落PCR检测结果图；其中， M-DL2000Marker，1-9-第1-9号克隆的扩增结果。

图3为实施例4中，kpS001EPSPS蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测结果图；M-低分子量标准蛋白，1-含空载体pProA菌株DH5αIPTG诱导表达6小时，2-含pProA-aroA_S001重组质粒菌株DH5αIPTG诱导表达6小时。

图4为实施例5中，分别转入pProA和pProA-aroA_S001质粒的ER2799菌株分别在含0mM和50mM草甘膦培养基中的生长曲线图；其中，aroA_S001-0是转入ProA-aroA_S001质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，aroA_S001-50是转入ProA-aroA_S001质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-0是转入pProA质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-50是转入pProA质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图。

图5为实施例5中，分别转入pProA和pProA-aroA_S001质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图；其中，aroA_S001是转入pProA-aroA_S001质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图，pProA是转入pProA质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

高抗草甘膦菌株的筛选分离，是从广东蔬菜田间取土样，以草甘膦为筛选标记，分离获得肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株；具体包括以下步骤：

1、高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌的分离：

（1）取广东蔬菜田间土样10g，加入到90mL 150mmol/L草甘膦（原粉）的基础盐培养基（液体）中，置于37℃、120r/min培养72h。

（2）取步骤（1）10mL培养液加入到含200mmol/L草甘膦（原粉）的基础盐培养基（液体）培养，37℃、120r/min培养72h；依此类推，将前一轮培养液逐级加入300、350、400mmol/L草甘膦（原粉）的基础盐培养基（液体）培养，37℃、120r/min培养72h。

（3）取适量培养液分别在含350mmol/L草甘膦的营养琼脂、马丁、高氏一号平板培养基上，划线分离。

（4）挑取步骤（3）中的单菌落接种于含400mmol/L草甘膦（原粉）的基础盐培养基（液体）培养，37℃、120r/min培养72h。

（5）取适量培养液在含400mmol/L草甘膦的营养琼脂马丁高氏平板培养基上，划线分离。获得耐受400mmol/L草甘膦的菌株。

2、利用革兰氏染色法，在显微镜下观察步骤1分离得到的菌株，为短杆状、单个、成双或短链状排列，革兰氏阴性杆菌。

3、利用通用引物27F、1492R PCR扩增该菌株的16S DNA序列。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃ 5min

72℃ 10min

16℃ Forever

PCR产物送上海英俊公司测序。测序结果经NCBI网站Blast比对，该菌株16sDNA序列与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)16sDNA序列相似度为99%。确定本实施例分离得到的菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)，命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)kpS001菌株，该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6189。

实施例2

克隆编码肺炎克雷伯氏菌EPSP合成酶的基因aroA，本实施例利用同源克隆的方法从菌株kpS001中克隆编码EPSP合成酶的基因aroA；具体包括以下步骤：

1、肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株基因组提取方法：基因组提取用天根细菌基因组提试剂盒提取，操作步骤与说明书基本一致，稍作修改如下：

（1）取细菌培养液2mL，12000rpm离心1min，尽量吸净上清。

（2）向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

（3）向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

（4）加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮后，简短离心去除管内壁水珠。

（5）加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15s,出现絮状沉淀，简短离心去除管内壁水珠。

（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个CB3中（吸附柱放入收集管），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管。

（7）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管。

（8）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管。漂洗两次。

（9）将吸附柱CB3放回收集管，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管，将无菌的双蒸水加热至65℃后，取50ul向吸附膜中间部位悬空滴加，静置30s,12000rpm离心1min,收集滤出液，即为基因组DNA。

2PCR扩增方法

以NCBI中Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae NTUH-K2044全长aroA基因序列（Gene ID:7948607）设计正反向PCR引物，用来扩增kpS001菌株aroA基因序列(aroA_S001)。

引物如下：

KpF：5-ATGGAATCCCTGACGTTACAAC-3

KpR：5-TCAGGCGAGGGTACTGATCCG-3

PCR反应体系如下：

10*Taq buffer

3μL

[0058]

dNTP（10mmol）	1μL
		kpF（10pmol）	1μL
kpR（10pmol）	1μL
		gDNA	2μL
rTaq	0.3μL
		ddH₂O	21.7μL
Total	30μL

反应程序如下：

94℃ 5min

72℃ 10min

16℃ Forever

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后（见图1），用天根DNA产物快速纯化回收试剂盒回收目的片段，长度约1300bp。连接到pMD18-T载体上。热击法将重组载体转入DH5α大肠杆菌中，通过氨苄青霉素（Amp⁺）抗性筛选阳性克隆，菌落PCR检测阳性克隆后，提取阳性克隆质粒。

连接反应按以下所示体积进行：

3热击法转化：

（1）将连接产物无菌操作转入100μL解冻的感受态中，轻轻混匀内容物，冰上放置30min

（2）将混合物置于42℃水浴中热激90s。

（3）迅速置于冰上，冷却2min。

（4）加800μL LB液体培养基37℃温育45min。

（5）取200μL培养液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h。

4阳性克隆筛选：

用无菌牙签挑取单克隆置于10μL无菌水中，取2μL用于PCR做检测，余下8μL接种于300μL含氨苄青霉素的LB培养基中37℃振荡培养。

PCR反应体系：

10*Taq buffer	1μL
		dNTP(10mmol)	0.2μL
M13F(10pmol)	0.2μL
		M13R(10pmol)	0.2μL
菌液	2μL
		rTaq	0.1μL
ddH₂O	6.3μL
		Total	10μL

反应程序：

94℃ 5min

72℃ 10min

16℃ Forever

5质粒提取

取15μL阳性克隆的菌液接种至5mL的含有Amp⁺LB扩大培养12h。用天根质粒小提取试剂盒提取质粒。步骤详见其说明书。

将所提取质粒送上海英俊公司测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，该基因序列命名为aroA_S001，推导出对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3

构建aroA_S001与原核表达载体pProA的重组载体，包括以下步骤：

1PCR扩增

根据实施例2测序结果(SEQ ID NO.3)重新设计引物如下：

KpF1：5-GAATTCATGGAATCCCTGACGTTACAAC-3

KpR1：5-CTCGAGTCAGGCGAGGGTACTGATCCG-3

PCR反应体系：

10*Taq buffer	3μL
		dNTP（10mmol）	1μL
kpF（10pmol）	1μL
		kpR（10pmol）	1μL
DNA	2μL
		rTaq	0.3μL
ddH₂O	21.7μL
		Total	30μL

PCR反应程序如下：

94℃ 5min

72℃ 10min

16℃ Forever

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，用天根DNA产物快速纯化回收试剂盒回收目的片段，长度约1300bp。连接到pMD18-T载体上。利用热击法将重组载体转入大肠杆菌DH5α大肠杆菌中，通过氨苄霉素（Amp⁺）抗性筛选阳性克隆，菌落PCR检测阳性克隆后，提取阳性克隆质粒（步骤如实施例2所述）。之后用EcoRI和XhoI对pMD18-aroA_S001质粒及pProA载体质粒双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收酶切片段aroA_S001与酶切后的pProA载体，16℃连接过夜。

酶切体系如下：

37℃，温育3小时。

连接体系如下：

酶切后目的片段	5μL
		酶切后表达载体proA	3μL
Buffer	1μL
		T4连接酶	1μL
total	10μL

16℃连接过夜。利用热击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用氨苄霉素筛选阳性克隆，菌落PCR检测（方法如实施例2所述），结果见如2，图中的第1-4、6-7、9号克隆为阳性克隆，即重组质粒pProA-aroA_S001。

实施例4

实施例3重组质粒的蛋白诱导表达，包括以下步骤：

1IPTG诱导蛋白表达

（1）挑取实施例3中的阳性克隆菌落，接入1mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃过夜培养。

（2）取步骤（1）中50μL菌液接种到含氨苄的5mL的培养液LB中，培养2h以上，至OD600为0.5-1.0。

（3）取1mL未诱导的培养物于离心管中，用于比较。4℃保存。

（4）加IPTG到剩下的培养物中至终浓度为1mmol/L，继续培养。隔3h、6h各取1mL的样，室温高速离心1min，倒掉培养液。

（5）用1mL PBS洗涤沉淀，再次离心得到沉淀。用PBS稀释沉淀，使稀释浓度一致。

（6）取20μL稀释的菌液100℃加热5min，立刻冰浴5min，加1×SDS上样缓冲液，简短离心。

（7）10%SDS-PAGE电泳检测。

2实验结果

本实验以转入pProA空载体的大肠杆菌DH5α为对照组。电泳结果显示，与对照菌株相比，在IPTG诱导下，目的菌株中目的蛋白有大量表达，大小约48KDa（见图3）。目的蛋白的成功表达表明该重组质粒可用于后期功能验证。

实施例5

实施例2重组质粒的功能验证，包括以下步骤：

1试验方法：

为了验证基因aroA_S001对草甘膦的抗性水平，将实施例2构建的重组载体pProA-aroA_S001转入aroA缺陷型大肠杆菌ER2799菌株中，观察该重组缺陷型菌株在分别含0、50、100、200、300、400mM草甘膦的M9培养基中，37℃，180rpm/min生长情况，以转入空载体pProA的缺陷型大肠杆菌菌株ER2799为对照。实验步骤如下：

（1）将重组载体pProA-aroA_S001和对照空载体pProA分别转入缺陷型菌株ER2799中，挑选阳性克隆，获得重组菌和对照菌。

（2）将阳性克隆分别接种到等量的LB液体培养基中（含50ug/ml Amp⁺；1.0mM IPTG;100ug/ml的苯丙氨酸Phe,酪氨酸Tyr,色氨酸Trp），37℃，培养过夜

（3）测定过夜培养的菌液OD595值，如两者OD595值不同，将OD595较小的菌液适当延长时间培养至两者OD595值一致。

（4）分别取OD595值一致的重组菌和对照菌菌液100ul，接种至3ml M9培养基中，重组菌和对照菌各接种5管，培养基中加入50ug/ml氨苄（Amp⁺）、1.0mM IPTG，然后，在5管接种菌液的M9培养基中分别加入0mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM的草甘膦，37℃、180rpm振荡培养。

（5）分别于0、12、24、36、48小时取100ul菌液测定OD595值。

（6）菌液OD595值数据分析。

2实验结果

为了验证肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株aroA_S001基因对草甘膦的抗性功能，将目的基因aroA_S001连接到pProA载体上并转入aroA基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799中，并接入到含不同浓度草甘膦的M9基础盐培养基中培养，进行功能互补实验。

以转入pProA空载体的ER2799菌株为实验对照。实验结果显示，在没加草甘膦时，重组菌和对照菌的生长状态无显著差异，而加入草甘膦50mM以后，对照菌的生长明显受到抑制，而重组菌依然能够生长（图4）。

随着草甘膦浓度的增加，重组菌生长逐渐受到抑制，直到草甘膦浓度达到400mM时，重组菌的生长基本受到抑制，但仍略高于对照菌株（图5）。由此可见，肺炎克雷伯氏菌kpS001aroA_S001基因对草甘膦表现出良好的抗性。转入pProA-aroA_S001重组质粒的ER2799菌株获得了较强的草甘膦耐受能力。

由以上实施例可见，从高抗草甘膦菌株肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株中克隆的编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的基因aroA_S001，提供了一种来源于细菌的EPSPS基因全序列，及其相应的氨基酸序列，具有优良的草甘膦抗性。该基因可用于转化农作物，以提高转基因作物的草甘膦抗性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA_S001，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的基因aroA_S001在提高农作物草甘膦抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的基因aroA_S001在提高农作物草甘膦抗性中的应用，其特征在于：将基因aroA_S001转化入农作物中。

4.根据权利要求2所述的基因aroA_S001在提高农作物草甘膦抗性中的应用，其特征在于：将含有基因aroA_S001的表达载体或克隆载体转化入农作物中。

5.根据权利要求4所述的基因aroA_S001在提高农作物草甘膦抗性中的应用，其特征在于：将含有权利要求4所述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。