CN102766604B

CN102766604B - 一种猪流感病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN102766604B
Application number: CN 201210202821
Authority: CN
Inventors: 张龙现; 张云; 胡慧; 菅复春; 岳耀辉; 宁长申
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2032-06-19
Also published as: CN102766604A

Abstract

发明公开了一种猪流感病毒毒株，猪流感病毒（swineinfluenzavirus），CCTCC NO：V201223。本发明的猪流感病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的的保护，可应用在制备疫苗的生产毒种。

Description

一种猪流感病毒毒株及其应用

技术领域

本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及一种猪流感病毒毒株及其生物学特性。

背景技术

2010年10月，漯河市某猪场猪群7头1月龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽。采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到一株有血凝性的疑似流感病毒，经分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。

发明内容

本发明本发明的目的是提供一种猪流感病毒毒株，分类命名：猪流感病毒，拉丁文学名：swine influenza virus，简称SIV，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：武汉市武汉大学，保藏日期：2012年5月15日，保藏编号CCTCC NO：V201223。

本发明的技术方案是：一种猪流感病毒毒株，猪流感病毒（swine influenza virus），CCTCC NO：V201223。

所述的猪流感病毒毒株具有下述特点：

（1）所述毒株的核酸类型是单股负链RNA病毒，由大小不等的8个独立节段组成，分别是：PB2基因片段长度为2341 bp，PB1为2341 bp，PA为2233 bp，HA为1777 bp，NP为1565 bp，NA为1466 bp，M为1027 bp，NS为890 bp。

（2）所述毒株对脂溶剂***、氯仿和酸敏感；属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。

（3）对鸡胚的致病力较弱，其中EID₅₀为10^-5.86，ELD₅₀为10^-2.43；能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠感染试验中未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。

（4）利用通用引物对所述毒株进行PCR鉴定后，再进行全基因组PCR扩增并克隆测序，用philip3.64分析软件结果显示该毒株为新型四源重组病毒，其中HA、NP和NS片段来源于经典猪流感；NA和PB1片段来源于类人H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感。

所述的猪流感病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的H1N2猪流感病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的的保护，可应用在制备疫苗的生产毒种。

附图说明

图1为SIV通用引物电泳图；

图2为亚型引物PCR产物电泳图；M：DNA质量分子标准；1-3：SIV通用引物RT-PCR阳性样品；P：阳性对照；N：阴性对照

图3为SIV全基因组PCR产物电泳图；Mark：DNA质量分子标准；1-8：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。

具体实施方式

2010年10月，漯河市某猪场7头1月龄猪只发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽，其发病表现与国内报道的其他地区发病的猪流感症状大致相似，初步判断为猪流感。

采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到一株有血凝性的疑似流感病毒，血凝试验排除鸡新城疫和禽减蛋综合征病毒。第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价7log2；用特异性引物进行分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。

理化特性试验表明所述毒株经过氯仿、***和酸处理后，不能再感染鸡胚，判断其对脂溶剂敏感。病毒属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。

该病毒对鸡胚的致病力较弱，其中EID₅₀为10^-5.86，ELD₅₀为10^-2.43；能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。

对所述毒株进行全基因组PCR扩增并克隆测序，用philip3.64分析软件结果显示该毒株为新型四源重组病毒，其中HA、NP和NS片段来源于经典猪流感；NA和PB1片段来源于类人H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感。

本发明中，毒株定名为A/swine/Henan/YIL/2010(H1N2)株，简称SWHN/YIL/10株。

1、流行病学调查：2010年10月，漯河市某猪场7头1月龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为高烧，流鼻涕，咳嗽，呼吸困难，并且具有传染性，其发病表现与国内外报道的其他地区发病的猪流感症状大致相似，初步判断为猪流感。采集患病猪的鼻拭子和病死猪的肺脏样品，将样品立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。

2、病毒分离：将鼻拭子样品涡旋震荡处理15秒，挤出液体，4 ℃ 5000 r/min离心4 min，取上清，4℃作用过夜。采集病死猪的肺组织在无菌条件下剪碎并研磨，用PBS液(含链霉素和青霉素终浓度为3000 μg /mL，3000 IU/ mL)制成10%的匀浆，4 ℃作用5 h，反复冻融3次，按上述条件离心，取上清。将上清经尿囊腔接种9~10日龄非免疫鸡胚，0.2 mL/枚，每个样品接种2枚，35 ℃条件下孵育96 h，并保持一定的湿度，每隔8 h照胚，弃去24 h内死亡鸡胚。收集24 ~96 h死亡和未死亡鸡胚置4 ℃冷却过夜，次日无菌收集尿囊液。

结果表明：无菌检验合格的病料接种鸡胚后，96 h内无鸡胚死亡发生，对照组鸡胚也全部健活。经过3代鸡胚盲传以后，发现所收获尿囊液具有血凝性，并且均与抗ND和EDS-76阳性血清HI试验为阴性，第3代尿囊液进行具有血凝活性的尿囊液接种的鸡胚均表现出不同程度的全身出血变化，死亡胚与存活胚病变显著，胚胎发育阻滞，胚体头颈部、背部、大腿、翅膀及腹部出血明显，严重者呈弥漫性出血。第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价7log2。

3、病毒PCR鉴定：通用引物是根据GenBank数据库中已有的猪流感病毒的NP基因核苷酸序列用Clustal、DNAstar等生物软件进行同源性分析后，选出较为保守的核苷酸区域，应用Primer 5.0设计特异性引物根据NP基因设计合成，亚型引物参照Choi等设计的亚型引物合成。

参照Invitrogen Trizol LS Reagent 的说明进行，具体操作步骤如下：取新鲜的病毒样品250 μL加入装有750 μL Trizol的1.5 mL RNase-free离心管中混合均匀，室温静置5min；加入200 μL氯仿，涡旋混匀15 s，室温静置5 min；4℃ 12,000 g/min离心15 min，转移上相至新管中，加入等体积异丙醇（约500 μL），轻缓混匀，室温放置15 min，4 ℃ 12,000g/min离心10 min，弃上清，RNA在管侧和管底形成胶状沉淀；加入1 mL RNase-free 75％乙醇，温和颠倒混匀，4 ℃ 7,500g/min离心5 min，弃上清，将离心管置于超净台风干，加入20 μL DEPC处理过的双蒸水溶解，最后分装成小管，可置-70 ℃保存备用。

RT反应体系按Takara公司反转录试剂盒说明书进行。各成分加入后混匀离心，42 ℃保温1 h，70 ℃保温15 min后冰上冷却备用。

PCR反应体系：

cDNA	5	μL
			Premix EX Taq	25	μL
上游引物P1	1	μL
			上游引物P2	1	μL
ddH2O	18	μL
			Total Volume	50	μL

PCR反应条件：依次加入表中各成分，混匀离心，PCR扩增程序为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50~55 ℃退火30 s，延伸72 ℃2 min，运行30个循环后于72 ℃延伸10 min。反结束后取PCR产物5 μL，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。通用结果及亚型引物的结果如图1-2所示。

图3为目的基因PCR 扩增，其中， DNA ladder marker 2000 (2000, 1000, 750, 500, 250,100)；目的基因PCR 扩增结果：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段，大约分别为：2.3 kb、2.3 kb、2.2 kb、1.7 kb、1.5 kb、1.4 kb、1.0 kb、0.9 kb，与预期大小相符。

4、SIV分离株的有限稀释克隆

将SIV***无菌鸡胚尿囊液做10^-2～10^-8稀释，每个稀释度接种SPF鸡胚后病毒血凝价达到8log2或8log2以上的最高稀释度的鸡胚尿囊液即为该SIV分离株的稀释克隆毒株，经过无菌检验后小管分装．置-70℃保存备用。以下实验所需流感病毒株均为已纯化的SIV的稀释克隆毒株。结果显示所述毒株第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价7log2。

5、生物学特性研究

5.1 SIV红细胞凝集谱的测定用新鲜制备的鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊、牛等动物的1％红细胞悬液与新鲜收获的病毒尿囊液做HA试验，测定红细胞凝集谱。结果显示所述毒株血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。

5.2 S1V血凝素热稳定试验

将新鲜收获的无菌鸡胚尿囊液分装于11个带盖的灭菌小管，0.5 mL/管，置于56 ℃水浴处理0 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min及过夜，处理后迅速放到4 ℃冰箱5～10 min，分别测其HA价。依据血凝效价将血凝素热稳定性分为3 个类型：即热不稳定型(56 ℃5 min，下降2个滴度)、热稳定型(56 ℃30 min下降2 个血凝滴度)和中等热稳定型(介于两者之间)。结果显示所述毒株属于热稳定型毒株。

5.3 脂溶剂敏感性试验

5.3.1对***的敏感试验

将病毒尿囊液加入两个灭菌小管中，1 mL/管，于其中1管内加入***0.2 mL至终浓度为200 mL/L，另一管加灭菌生理盐水作阴性对照，斡旋振荡10 min，4 ℃作用24 h。加入***的小管，可分为清晰的两层。吸取下层病毒液，移入另一小管内，使残余***全部挥发。然后分别取上述两份病毒液各接种3枚鸡胚，0.2 mL/L枚，35 ℃孵育96 h，定时照胚，收集24～96h内死亡或未死鸡胚尿囊液，测定HA效价。如经过***处理的病毒液和对照组的病毒液血凝价相差2个滴度以上，则判为病毒对***敏感。

5.3.2 对氯仿的敏感试验

将新鲜病毒尿囊液加入两个灭菌小管中，1 mL/管，加入终浓度为48 mL/0.2 分析纯氯仿混合振荡，置于4 ℃ 作用10 min。另一组用灭菌生理盐水代替氯仿作阴性对照，每个处理样品接种3枚鸡胚，35 ℃孵育96 h，收集24～96 h内死亡或未死鸡胚尿囊液，测定HA效价。氯仿处理过的病毒液滴度比对照管病毒液滴度下降2个滴度以上，则判为病毒对氯仿敏感。

5.3.3 病毒的耐酸性试验

将新鲜病毒尿囊液加入两个灭菌小管中，1 mL/管，一管用0.1 mol/L的盐酸将pH调至3.0，室温下作用2 h，再用5.6%的NaHCO₃溶液调至pH=7.2左右；另一份加入和上述盐酸用量相同的灭菌生理盐水，同样在室温下放置2 h作为阴性对照，将上述2份病毒悬液经10倍稀释后，每份处理过的病毒液接种3枚10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，35 ℃孵育96 h，收集24～96 h内死亡或未死鸡胚尿囊液，测定HA效价。试验组与对照组HA价相差2个滴度以上者判为病毒对该pH值敏感。

理化特性试验表明所述毒株经过氯仿、***和酸处理后，不能再感染鸡胚，判断其对脂溶剂敏感。

5.3.4 鸡胚半数感染量(EID₅₀)和鸡胚半数致死量（ELD₅₀）试验

将新收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水液l0倍倍比稀释后，接种l0 日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，0.2 mL/枚，并设生理盐水对照组，35 ℃孵育96 h。每隔8 h照胚一次，弃去24 h死亡的鸡胚，并统计鸡胚死亡数目和时间。收获鸡胚尿囊液，测定HA价。按Reed- Muench法计算EID₅₀/0.2 mL和。具体计算如下：EID₅₀ /ELD₅₀的对数=高于50％病毒稀释对数-相应距离比×稀释系数的对数（10倍递进稀释时为1）。

距离比例=

结果显示所述毒株对鸡胚的致病力较弱，EID₅₀为10^-5.86，ELD₅₀为10^-2.43。

6、细胞感染试验

用HANKS洗液洗涤培养了 42h-72h的单层MDCK细胞3次。将1-2 mL新鲜病毒尿囊液接种细胞。接种过的细胞在37 ℃条件下孵育1-2h。孵育后弃去细胞瓶中接种物，加入适量含有终浓度为1 μg/ml TPCK处理的胰酶培养维持液，37℃孵育5-7天，定期检查细胞病变。如果最后孵育阶段观察不到细胞病变，那么将细胞培养物冻在-70℃冰箱中，然后再融化，按照上述步骤进行盲传。如果观察到细胞病变，就可以对部分细胞培养液进行病毒的血凝检测或者RT-PCR检测。结果显示所述毒株能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变。

7、SIV病毒株对小鼠的感染试验

新鲜病毒液用生理盐水按1:10稀释，每一病毒液点眼滴鼻途径接种1月龄 BALB/c小鼠4 只，0.1 mL/只，并设生理盐水对照组。每日观察其临床症状并记录小鼠病死情况，观察至感染后第14 d。死亡的小鼠进行解剖采集内脏进行病毒分离，未死小鼠采集血清，进行HI试验。结果显示试验组小鼠无死亡，对照组小鼠正常。第14 d采集感染组小鼠的血液，测其HI价在1:32-1:128之间。

8、全基因组PCR产物的扩增、克隆及序列测定

参照Hoffman等关于A型流感病毒全基因组扩增的引物序列，设计反转录通用引物 Uni12和8个基因组片段的引物，引物由上海英潍捷基公司合成，PAGE级纯化，工作浓度10μM，贮存浓度100 μΜ，与-20℃保存备用。

上述PCR产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切割目的片段，然后用胶回收试剂盒进行DNA回收和纯化，操作按说明进行，回收产物置－20oC保存备用。胶回收纯化后的PCR产物按照Takara公司说明书与PMD18-T载体16℃水浴连接过夜。连接反应体系按照说明书进行，构建成重组质粒将10 μL连接产物加入含50 μL感受态细胞DH5α的1.5 mL离心管中，轻缓混匀，冰浴30 min；42 ℃热激90 s，取出后立即冰浴2 min使之冷却。加入1 mL LB液体培养基轻缓混匀，37 ℃摇床200 r/min培养50 min。取出后5000g/min离心5min，吸弃300 μL上清，重悬菌体后吸取200 μL培养液，涂布于含有Amp抗性的LB琼脂平扳上。37℃培养10h-16h至出现单菌落。

挑选LB平板上单个菌落，接种于5 mL含Amp的LB液体培养液中，37 ℃ 200 r/min振荡培养12 h -16 h。取1 μL菌液进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性克隆的菌株送宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析。随后利用GenBank中的BLAST对测序结果进行序列比对分析。结果表明，通过序列测定，测得的8条目的基因序列与预期结果相符。

9、病毒基因遗传进化树的绘制

从GenBank下载大量序列，包含了各个进化谱系的SIV毒株序列，与本研究分离到的SIV共同绘制进化谱系，采用CLUSTAL、philip3.64、BioXM、treeView、MEGA4等软件进行同源性和遗传进化分析。应用philip3.64分析软件，选择NJ(Neighbor-Joining)方法绘制遗传进化树。

对测定结果进行Blast比对分析后，从GenBank下载大量序列，包含了各个进化谱系的SIV毒株序列，与本研究分离到的SIV共同绘制进化谱系，采用CLUSTAL、phylip3.64和MEGA4等软件进行同源性和遗传进化分析。采用NJ方法建树，将SWHN/ YIL /10与Genbank中下载的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因核苷酸序列进行比对，根据p-distance计算并绘制***进化树。

SWHN/ YIL /10聚合酶蛋白PB2基因全长2341bp，编码760个氨基酸。其与2009年的甲型流感毒株A/Hamburg/NY1580/09(H1N1) 同源性最高，为99.3%。进化树分析显示，与美洲禽流感毒株duck/New York/13152/94(H1N1)组成一个大的分支。

聚合酶蛋白PB1基因全长2341bp，编码758个氨基酸。其与参考毒株中A/Wisconsin/10/98(H1N1)的核苷酸同源性最高，为96.7%。NCBI Blast分析显示，PB1基因与从1992-1998年在内地、香港及纽约流行的人流感同源性很高，在97%-95%之间。进化树上分析显示PB1基因与以A/New York/613/96(H3N2)为代表的人流感毒株组成一个大的分支。

聚合酶蛋白PA基因全长2233bp，编码717个氨基酸。其与参考毒株中A/mallard/South Dakota/00125/07(H3N2)的同源性最高，为97%。进化树分析显示，PA基因与美洲禽流感毒株群处在一个大的分支上。

血凝素蛋白基因HA全长1776 bp，编码567个氨基酸。其与参考毒株中A/swine/Hong Kong/8631/2001(H1N1)同源性最高，为95.7%。进化树分析显示，HA与以A/swine/ Tennessee/25/77（H1N1）为代表的经典猪流感处在一个大的分支上。

神经氨酸苷酶NA基因全长1469 bp，编码470个氨基酸。其与参考毒株中A/Buenos Aires/4459/96(H3N2)同源性最高，为95.6%。进化树分析显示，NA与1997-1998年间，在包括我国在内的多个国家流行的H3N2人流感病毒组成一个大的分支。

核蛋白NP基因全长1565 bp，编码505个氨基酸。其与参考毒株中A/swine/Guangdong/ 1/2010(H1N1)同源性最高，为96.4%。进化树分析显示，NP与A/swine/Tennessee/25/77（H1N1）为代表的经典猪流感处在一个大的分支上。

基质蛋白M基因全长1027 bp，分为两个编码区，M1编码253个氨基酸，M2编码98个氨基酸。其与2009年的甲型流感毒株A/Singapore/527/2009(H1N1)同源性最高，为99.3%。进化树分析显示，M基因与欧洲禽流感turk/ Germany/3/91(H1N1)处在一个大的分支上。

非结构蛋白NS的基因全长890bp，编码区分为两部分，SWHN/01/10 NSI编码218个氨基酸，NS2编码122个氨基酸；所述毒株SWHN/ YIL /10 NS1基因编码220个氨基酸，NS2编码122个氨基酸，在参考毒株中与A/swine/Hong Kong/172/1993(H1N1)碱基同源率最高，为95.7%。进化树分析发现该毒株的NS基因与经典猪流感谱系处在一个分支上。

综上所述，***进化分析显示，毒株A/swine/Henan/YIL/2010(H1N2)为四源重组病毒，基因片段很可能为北美三源重排病毒和欧亚类禽SIV的重组毒株，这是继2009年甲型流感病毒之后在猪群中首次发现四源重组病毒。其中HA、NP和NS基因推测来源于猪古典H1N1病毒；NA和PB1基因推测起源于20世纪90年代在我国和纽约流行的季节性H3N2亚型人流感病毒；PB2、PA基因起源于美洲禽流感，M基因起源于欧亚禽流感。

10、毒株的免疫原性

将所述毒株灭活后接种1月龄SIV抗体阴性猪，试验猪只攻毒1周后其抗体水平有轻微的上升，3周后的抗体水平可达1:160。

Claims

1.一种猪流感病毒毒株，其特征在于：猪流感病毒（swine influenza virus），CCTCC NO：V201223。

2.权利要求1所述的猪流感病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。