CN102743371A - 一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物，即用甲磺酸萘莫司他来制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物。且在药物中还选择性的添加有补体***内毒素分子C3a和/或C5a的抗体。本发明使用甲磺酸萘莫司他，作用于补体途径，来制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物，同时添加有C3a、C5a多肽的抗体，产生中和作用，更加有效的控制视网膜新生血管的生长，制备的药物将成为视网膜新生血管治疗的新型药物，为临床多种视网膜新生血管性疾病的治疗提供新思路。

Description

一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物

技术领域

本发明属于眼底疾病的生物防治技术领域，具体涉及一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物，即甲磺酸萘莫司他（Nafamostat mesylate,FUT-175）的新的用途，以及以甲磺酸萘莫司他为主要原料制备的，用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物。

背景技术

视网膜新生血管性疾病是我国乃至世界范围最严重致盲性眼病之一，主要是指由于新生血管生长伴随出血、渗出、增生等病理性改变造成的致盲性玻璃体视网膜疾病。包括糖尿病性视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病、视网膜静脉周围炎、早产儿视网膜病变等，对我国人群视力健康的威胁日益凸显。一直以来，关于视网膜新生血管发生的机制众说纷纭，例如血管活性因子及内源性血管生成抑制剂在视网膜新生血管（retinal neovascularization,RNV）中的作用，它们在眼内不是单一、独立地起作用,而是多种因子相互协调,共同调控血管生成。此外，免疫学途径近年来逐渐引起科学家重视。其中，炎症及补体途径的参与已在部分视网膜新生血管性疾病中得到证实，但至于具体过程及涉及的补体成分均尚无定论。为此，开展视网膜新生血管性疾病相关免疫学机理的研究，以期寻找可以更早、更有效阻断RNV进程的作用靶点，具有重要的临床意义。

甲磺酸萘莫司他（Nafamostat mesylate,FUT-175）是由日本Torii公司原研，1986年上市的合成蛋白酶抑制剂，此药物主要用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎急性恶化，胰管造影后的急性胰腺炎、外伤性胰腺炎、手术后急性胰腺炎等症状的改善。但申请人在长期的研究中发现，甲磺酸萘莫司他可以有效的抑制视网膜新生血管的生长，从而促成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物，即可以更早、更有效阻断RNV生长的作用靶点，为视网膜新生血管性疾病的临床治疗提供新的思路，以弥补现有治疗方式的不足。

本发明一个方面涉及甲磺酸萘莫司他的新用途，即甲磺酸萘莫司他在制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

本发明另一方面提供一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物，包括有甲磺酸萘莫司他和补体***内毒素分子C3a和/或C5a的抗体。

上述的药品中，甲磺酸萘莫司的含量约为1～3%，而抗体的添加量为0.002～0.005%。

本发明的药剂中还添加0.5～1.5%苯乙醇作为防腐剂。

本发明使用甲磺酸萘莫司他，作用于补体途径，来制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物，同时添加有C3a和C5a多肽的抗体，产生中和作用，更加有效的控制视网膜新生血管的生长，此合成剂将成为视网膜新生血管治疗的新型药物，为临床多种视网膜新生血管性疾病的治疗提供新思路。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

一、甲磺酸萘莫司他治疗视网膜新生血管性疾病的新用途

甲磺酸萘莫司他药物购买于Sigma-Aldrich公司，小鼠腹腔注射用量为50mg/kg，利用C57BL/6J小鼠（购于Jackson Laboratory）建立氧诱导视网膜病变模型OIR，将7日（P7）龄清洁级小鼠置于体积分数为75%的高氧环境中饲养5d后回到空气中继续饲养，自12天（P12）开始，每天小鼠腹腔注射甲磺酸萘莫司他药物，在视网膜新生血管生长最为旺盛的17天(P17)，通过颈静脉灌5μlFITC-conjugated isolectin-B4（20mg/ml）。实验结束后取材，随后进行视网膜铺片，观察视网膜新生血管生长情况。通过荧光显微镜观察表明，甲磺酸萘莫司他能够明显抑制RNV的生长，实验小鼠眼底血管生长趋于正常。

然而，利用补体***内毒素分子C3a和C5a的受体C3aR和C5aR敲除鼠（C3aR^-/-和C5aR^-/-小鼠）进行同样处理，注射甲磺酸萘莫司他后视网膜新生血管的生长变化并不明显。此外，通过视网膜铺片，荧光造影观察，血管内皮核数的统计，比较C57BL/6J小鼠及C3aR^-/-和C5aR^-/-小鼠，具体操作如下：

（1）视网膜铺片：利用C57BL/6J小鼠及C3aR^-/-和C5aR^-/-小鼠建立氧诱导视网膜病变模型OIR，具体方法同上所述。根据荧光显微镜观察结果，C3a及C5aR的敲除抑制了RNV的生长。根据RNV的评分标准，敲除鼠的RNV生长、血管簇的形成、血管迂曲程度较C57BL/6J小鼠明显降低，而其中央无灌注区显著大于正常组小鼠。

（2）荧光造影术：荧光素眼底血管制影是20世纪60年代兴起的眼科检查手艺。利用荧光素钠做为制影剂畴前臂静脉快速注入，当荧光素钠随血流进入眼底血管时，通过拆无一组滤色片的眼底摄影机，持续拍摄眼底血管外染料轮回时接收激发光线发射出的荧光形态，以察看视网膜动态轮回的过程，从而得以体会眼底血管的微细结构和微轮回的变化，为良多眼底病的发病机理、诊断、医乱和预后评估供给按照。利用此手段，对小鼠腹腔灌注0.1ml10%荧光素钠，随后用眼底造影机进行实时观察，并进行记录。结果说明C3aR^-/-和C5aR^-/-小鼠的中央无灌注区明显大于C57BL/6J小鼠。

（3）血管内皮核数计数：建立OIR模型，分别取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠眼睛，并进行病理组织学分析，方法如下：

·固定（10％***，Bouin氏固定液等）：使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。随后进行

·脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

·浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块***，才能在切片机上切成很薄的切片。

·切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为4微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

·脱蜡染色（HE染色）：染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。具体过程如下：

①将已入蒸馏水后的切片放入苏木***溶液中染色数分钟。

②酸水及氨水中分色，各数秒钟。

③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。

④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。

⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。

·脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

·封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

通过连续切片，染色观察，统计血管内皮核数，结果表明C3aR^-/-和C5aR^-/-小鼠的突破内界膜的血管内皮核数明显低于C57BL/6J小鼠表明补体***中的内毒素分子C3a和C5a可明显促进视网膜新生血管的生长。

建立OIR模型，分别取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠（PBS对照组及FUT-175处理组）视网膜，提取总蛋白进行western blot分析，具体操作步骤如下：

·总蛋白的提取：加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂，充分剪碎研匀，冰上放置，充分提取，离心，取上清。

·SDS-PAGE凝胶电泳：清洗玻璃板组装电泳槽，灌胶与上样，电泳（一般为恒压120V电泳，当样品进入下层胶后恒压160V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止）。

·转膜：切胶，备膜，装膜，转膜

·免疫反应，具体操作过程如下：

①封闭：将膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入加有BSA封闭液的平皿中，室温下摇床2h，或者4℃冰箱过夜。

②加一抗：将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有TBST的洗缸中摇床上漂洗3次，每次5min。洗完后将TBST尽可能沥干(但膜一定要保持湿润)，放入加有一抗的平皿中侧摆摇床室温低速孵育2h。

③加二抗：回收一抗，将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3次，每次5min，然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中，避光室温孵育1h。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中洗3次每次5min。

·化学发光，显影，定影

·凝胶图像分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理***分析目标带的分子量和净光密度值。

通过分析凝胶图像，显示FUT-175可调节VEGF-A的蛋白表达，在敲除鼠中并无检测到VEGF-A的表达变化，初步说明FUT-175通过补体***（C3a和C5a）对VEGF-A表达进行调控，进而调节RNV的生长，并可更早、更有效的治疗视网膜新生血管性疾病。因此，甲磺酸萘莫司他可以用来制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物。

实施例1：甲磺酸萘莫司他添加C3a抗体

C3a抗体购买于Abcam公司（ab48581）。制备的药品中中包含有质量体积比g/ml为2%的甲磺酸萘莫司，同时添加质量体积比g/ml为0.002%的C3a抗体，防腐剂苯乙醇的添加量质量体积比g/ml为1.1%，最后用磷酸盐缓冲液补充至最终体积。

对于甲磺酸萘莫司和抗体、防腐剂的用量以符合药理剂量为准，本领域的技术人员可以通过常规的方法来确定添加量，而不仅仅限于本发明说明书中记载的范围。

具体制备方法是将甲磺酸萘莫司他固体粉末溶于磷酸盐缓冲液（氯化钠9克，磷酸氢二钠6克，磷酸二氢钠0.4克添加双蒸水至1000ml，PH7.2至7.4）中，加入浓度为200μg/ml的抗体，然后加入苯乙醇完成制备。

实施例2：甲磺酸萘莫司他添加C3a和C5a抗体

C5a抗体购买于Santa Cruz公司（sc-21941）。在90ml磷酸盐缓冲液中加入1g甲磺酸萘莫司，再加入0.003g的C3a和C5a抗体的混合物，其中C3a和C5a抗体的添加比例为1：1，再加入1g防腐剂苯乙醇作为防腐剂，最后用磷酸盐缓冲液补齐到100ml。

其中C3a和C5a抗体可以等比例添加，也可以选用任一药理允许的比例。

根据甲磺酸萘莫司他的腹腔给药剂量50mg/kg，自氧诱导模型的P12天开始，每天注射此实施例2制备的药物，在视网膜新生血管生长最为旺盛的P17可以观察到，注射此实施例药剂的小鼠视网膜新生血管的生长较单纯注射甲磺酸萘莫司他更加有效得得以控制，血管生长更加正常。

Claims (7)

1.甲磺酸萘莫司他的应用，其特征在于，所述的应用是甲磺酸萘莫司他在制备治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

2.一种治疗视网膜新生血管性疾病的药物，其特征在于，所述的药物为包含有药理有效剂量的甲磺酸萘莫司他的溶液。

3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的甲磺酸萘莫司他在溶液中的浓度为1～3%。

4.权利要求2所述的药物，其特征在于所述的药物还包括有补体***内毒素分子C3a和/或C5a的抗体。

5.如权利要求4所述的药物，其特征在于所述的抗体的添加量为0.002～0.01%。

6.如权利要求2或4所述的药物，其特征在于所述的药物还添加防腐剂。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于所述的防腐剂为苯乙醇。