CN102732537A - 分离的荧光素酶及其用途 - Google Patents
分离的荧光素酶及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102732537A CN102732537A CN2012102094057A CN201210209405A CN102732537A CN 102732537 A CN102732537 A CN 102732537A CN 2012102094057 A CN2012102094057 A CN 2012102094057A CN 201210209405 A CN201210209405 A CN 201210209405A CN 102732537 A CN102732537 A CN 102732537A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- luciferase
- lual
- pcdna3
- dna
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
- C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22的核苷酸和氨基酸序列,以及它们的活性和用途。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日为2001年11月22日,申请号为01819433.8,发明名称为“分离的荧光素酶及其用途”。
技术领域
本发明涉及荧光素酶LuAL、Lu164、Lu16、Lu39、Lu45、Lu52和Lu22的核苷酸和氨基酸序列以及它们的活性和用途。
技术背景
荧光素酶
发光表示发射可见光谱范围内的光子,这种发射是通过激发发光分子产生的。与荧光不同,这种光的能量不是以较短波长的辐射形式从外部提供的。
在化学发光和生物发光之间存在差别。化学发光表示一种化学反应,这种反应导致分子受到激发,当被激发的电子回到基态时,该分子自身发出光线。如果该反应是由酶催化时就叫做生物发光。参与所述反应的酶通常被称为荧光素酶。
有关发光生物的综述可以参见Hastings等1995。
荧光素酶是过氧化物酶或单加氧酶和双加氧酶。形成所述发光产物的原始物质的酶底物被称为荧光素。不同物种之间的荧光素有所不同。所述***的量子产率为0.1-0.9个光子/转化底物分子(Idelgaufts,1993)。
可以根据其来源或酶促特性对荧光素酶进行分类。下面提供了某些类型荧光素酶的概述:
细菌荧光素酶
表1:细茵荧光素酶
Coelenterazine-依赖型真核荧光素酶
表2:Coelenterazine-依赖型真核荧光素酶
Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶
表3:Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶
还可以根据某些荧光素酶的底物专一性区分各种荧光素酶。最重要的底物包括Coelenterazine(Jones等1999)和荧光素,以及这两种物质的衍生物。下面示出了这两种底物及其通过荧光素酶进行的转化的示意图:
荧光素酶底物
下面通过举例形式示出了某些荧光素酶底物及其转化。本文所示出的所有底物是通过酶促转化的,同时释放出光和二氧化碳(CO2)并且消耗氧气(O2)。所述反应对辅因子或能量载体(例如,对于萤火虫荧光素酶来说是ATP)的依赖性是酶专一性的。
水母蛋白在将Coelenterazine转化成Coelenteramide时,会发出波长为470纳米的光线。
荧光素
萤火虫荧光素在将荧光素转化成羟基荧光素时,会发出波长为560纳米的光线。
Vargula-荧光素
Vargula荧光素酶在将Vargula荧光素转化成Vargula-羟基荧光素时会发出波长为460纳米的光线。
报导***
报导基因或指示基因通常是一种基因,其基因产物可以通过简单的生物化学或组织化学方法方便地检测到。至少有两种类型的报导基因是可以区别的。
1.抗性基因。抗性基因是一种基因,其表达会使细胞产生对抗生素或其他物质的抗性。在缺乏该抗性基因时,所述抗生素或其他物质在生长培养基中的存在会导致细胞死亡。
2.报导基因。在基因工程技术中,报导基因的产物是作为融合的或未融合的指示剂使用的。最常见的报导基因包括β-半乳糖苷酶(Alam等1990),碱性磷酸酶(Yang等1997;Cullen等1992),荧光素酶和其他发光蛋白(Shinomura,1985;Phi1lips GN,1997;Snowdowne等,1984)。
Metridia longa物种的分类
节肢动物门→甲壳纲→挠足亚纲
Metridia longa种属于甲壳纲,特别是挠足亚纲或浮游动物。
发明内容
分离cDNA
为了研究Metridia longa种的生物发光活性,从白海(Biologische Station Kartesh,俄罗斯)获得样品,并且保存在液氮中。为了制备Metridia longa的cDNA库,通过Krieg(Krieg等1996)的方法使用异硫氰酸盐分离RNA。
进行RT-PCR便制备cDNA。为此,按照以下方案将10微克RNA与逆转录酶(Superscribt Gold II)一起培养:
PCR 1. 30秒钟 95℃
2. 6分钟 68℃
3. 10秒钟 95℃
4. 6分钟 68℃
在步骤3之后进行步骤4,进行17个循环
为了使聚合酶失活,在37℃下用蛋白酶K培养反应产物30分钟,并且用乙醇使cDNA沉淀。将cDNA溶解在水中,并且在37℃用SfiI培养1小时。对反应产物进行凝胶过滤,以便分离出小片段。然后将分离的cDNA连接到SfiI裂解过的并且脱磷酸化的λTriplEx2载体上。然后为了制备λ噬菌体表达库,使用体外包装***中的SMARTcDNA库构建试剂盒(Clontech)将克隆的cDNA片段包封到λ噬菌体中。
通过实施库筛选鉴定含有具有表达Colenterazin依赖型荧光素酶的潜力的cDNA***片段的重组噬菌体。
为此,将由大肠杆菌XL1-Blue得到的茵苔铺平铺到90毫米的培养皿上,并且在37℃下培养10小时。然后每个培养皿用2500个噬菌体感染,然后在37℃下培养8小时,以便形成噬茵斑。然后将培养皿在4℃下保存1小时,以便使软的琼脂糖***。
为了进行复制铺板,用大肠杆菌XL1-Blue悬浮液饱和硝酸纤维素膜并且干燥。将干燥的膜在噬菌斑上放置60秒,然后铺放在新的琼脂糖平板上。然后在37℃下培养所述琼脂糖平板2小时,并且添加4毫升SOB培养基(+10mM MgSO4,0.2%麦芽糖)。分离茵苔,重新悬浮在LB培养基中(+20mM IPTG),并且在37℃下培养1小时。通过离心收获细菌,并且通过超声波破碎,在添加Coelenterazin之后,在发光计中测定生物发光活性。
将能产生阳性生物发光信号的培养皿划分成多个扇区,并进行新的复制铺板。连续进行复制铺板,直到鉴定了活性个体噬菌斑。为了亚克隆阳性噬菌斑的噬菌体cDNA***片段,按照SMART cDNA库构建试剂盒的生产商的方法在大肠杆菌BM25.8中的pTriplEx2载体中进行。在含有浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下培养pTriplEx2-cDNA转染过的大肠杆菌过夜。为了获得超量表达,用LB培养基将过夜培养物按1∶150倍稀释,并且在37℃下培养1小时。然后通过添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至20mM的浓度进行培养。将诱导的培养基在37℃下培养1小时,并且通过离心收获细菌。通过在0.5毫升SM缓冲液中超声处理破碎所述细胞。在添加10微升Coelenterazin(10-4M,溶解在甲醇中)之后在发光计中测定化学发光。
鉴定了具有Coelenterazine依赖性荧光素酶活性的三种荧光素酶。所述荧光素酶被命名为Lu164、LuAL和Lu22。下面将详细披露所述荧光素酶。
本发明还涉及这三种荧光素酶的功能性等同物。功能性等同物是具有可比较的底物范围的荧光素酶,这种荧光素酶是分泌的并且具有至少70%的同源性。优选80%或90%的同源性。特别优选95%的同源性。
荧光素酶适合用作细胞***的报导基因,特别是用作受体、离子通道、转载体、转录因子或诱导***的报导基因。
可以将荧光素酶用于细菌***中,例如,用于效价测定或用作生物化学***,特别是蛋白酶的底物。
荧光素酶还可以用作与抗体或其他蛋白连接的报导酶,例如,用于ELISA,用于免疫组织化学或用于Western印迹。
可以将荧光素酶用于BRET(生物发光共振能量转移)***。
荧光素酶还适合用作融合蛋白,用于进行共聚焦显微分析,或用于分析蛋白-蛋白相互作用。
荧光素酶还可用作与生物素、NHS,CN-Br或其他结合介体连接的报导酶,例如,用于ELISA或用于固定化。
另外,可以将荧光素酶用作与DNA或RNA寡核苷酸连接的报导酶,例如,用于Northern和Southern印迹或用于实时PCR。
本发明还涉及作为野生型或标记蛋白纯化荧光素酶,并且涉及荧光素酶在体外翻译***中的应用。
本发明涉及一种DNA或RNA分子,它们具有Seq.ID NO.:1;Seq.ID NO.:3;Seq.ID NO.:5;Seq.ID NO.:7;Seq.ID NO.:8;Seq.ID NO.:9;或Seq.ID NO.:10的序列,其中所述序列包括位于该序列5,端的功能性启动子。
本发明还涉及重组DNA或RNA载体,其中上述分子作为重组DNA或RNA载体的一部分。
本发明还涉及包含所述载体的生物。
本发明还涉及一种寡核苷酸,它包括与上述DNA或RNA序列相同或互补的10个以上的连续核苷酸。
核苷酸和氨基酸序列
LuAL
荧光素酶LuAL是分子量为23.7kDa,等电点为8.32的蛋白。
其编码核苷酸序列为:
5`atggatatgagggttatctttgctcttgttttctcatcattggttcaggccaaatcaactgaattcgatcctaacattaacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggagacaatggatgtcatcaaatcagatattacagatactgatagagtcagcaactttgttgcaactgaaaccgatgctaaccgtgggaaaa tgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaagctggctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccaggaagatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccgaaatctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgatctttgcgctacctgcactactggatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctggcagatgtgcaagttttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列:
MDMRVIFALVFSSLVQAKSTEFDPNINIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMDVIKSDITDTDRVSNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDLCATCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPGRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
和以下氨基酸组成:
Ala:18(8.3%)Cys:10(4.6%)Asp:14(6.4%)Glu:12(5.5%)Phe:10(4.6%)Gly:19(8.7%)His:2(0.9%)Ile:18(8.3%)Lys:21(9.6%)Leu:15(6.9%)Met:10(4.6%)Asn:8(3.7%)Pro:7(3.2%)Gln:5(2.3%)Arg:7(3.2%)Ser:9(4.1%)Thr:15(6.9%)Val:14(6.4%)Trp:2(0.9%)Tyr:2(0.9%)
Lu164
荧光素酶Lu164是分子量为23.8kDa,等电点为7.81的蛋白。其编码核苷酸序列为:
5`atggatataaaggttgtctttactcttgttttctcagcattggttcaggcaaaatcaactgaattcgatcctaacattgacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggagacaatggaggtcatgatcaaagcagatattgcagatactgatagagccagcaactttgttgcaactgaaaccgatgctaaccgtggaaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaagctggctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccaggaagatgtcatgattatg9tggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccgaaatctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgaacgttgcgcttcctgcactactggatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctgacagatgtgcaagttttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列:
MDIKVVFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKADIADTDRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
并且具有以下氨基酸组成:
Ala:21(9.6%)Cys:10(4.6%)Asp:15(6.8%)Glu:13(5.9%)Phe:10(4.6%)Gly:18(8.2%)His:2(0.9%)Ile:18(8.2%)Lys:22(10.0%)Leu:14(6.4%)Met:10(4.6%)Asn:7(3.2%)Pro:7(3.2%)Gln:5(2.3%)Arg:7(3.2%)Ser:8(3.7%)Thr:14(6.4%)Val:14(6.4%)Trp:2(0.9%)Tyr:2(0.9%)
Lu22
荧光素酶Lu22是分子量为20.2kDa,等电点为7.89的蛋白。其编码核苷酸序列为:
5`atgggagtcaaacttatttttgctgttgtttgtgtcgcagttgcccaggctgccacaattcaggaaaattttgaagacattgatcttgtagccataggtggcagctttgcatcagatgttgatgctaacagaggtggacatggtggacatcctggcaaaaagatgccaaaagaagtacttatggaaatggaagccaatgctaaacgagctggctgccacaggggttgtctggtttgtctgtcacacatcaagtgcacagcacaaatgcagaagtttatcccaggaagatgccatagttatgcaggagacaaggattctgctcagggaggaattgccggtggtgccattgttgatatacctgaaattgccggatttaaagaaatgaagcccatggaacagttcattgctcaagttgatctctgtgaagattgcacaactggatgcctcaaaggtcttgccaatgttcattgctctgatctcctgaagaagtggctgccatcaagatgtaagacatttgcttccaaaattcaatctcaagtggataccatcaaaggtttggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列:
MGVKLIFAVVCVAVAQAATIQENFEDIDLVAIGGSFASDVDANRGGHGGHPGKKMPKEVLMEMEANAKRAGCHRGCLVCLSHIKCTAQMQKFIPGRCHSYAGDKDSAQGGIAGGAIVDIPEIAGFKEMKPMEQFIAQVDLCEDCTTGCLKGLANVHCSDLLKKWLPSRCKTFASKIQSQVDTIKGLAGDR
并且具有以下氨基酸组成:
Ala:21(11.1%)Cys:11(5.8%)Asp:12(6.3%)Glu:9(4.7%)Phe:7(3.7%)Gly:21(11.1%)His:6(3.2%)Iie:13(6.8%)Lys:16(8.4%)Leu:12(6.3%)Met:7(3.7%)Asn:4(2.1%)Pro:6(3.2%)Gln:9(4.7%)Arg:6(3.2%)Ser:9(4.7%)Thr:6(3.2%)Val:13(6.8%)Trp:1(0.5%)Tyr:1(0.5%)
在序列表中也示出了上述序列。
荧光素酶的酶促活性和生物化学表征
蛋白LuAL、Lu164和Lu22是在转化Coelenterazin时能发出光线的酶。因此,它们属于荧光素酶。荧光素酶可以在细菌和真核细胞中有效表达。在真核细胞中表达的荧光素酶LuAl、Lu164和Lu22是分泌型的,不会发生与细菌表达相关的分泌。
荧光素酶的活性是温度依赖型的。测定荧光素酶LuAL和Lu164的最佳温度分别为22℃(LuAL)和27℃(Lu164)。荧光素酶Lu22活性的最佳温度为4℃或更低。
具体实施方式
实施例
质粒/结构
用于制备下文所披露的结构的载体是购自Clontech公司的载体pcDNA3.1(+)和pTriplEx2,以及载体pASMplr(具有cAMP-敏感型启动子元件的固有结构;cre)。所述载体的衍生物被命名为pcDNA3-x、pTriplEx2-x和pASM-x。
LuAL
图1表示载体pTriplEX2-LuAL、pcDNA3-LuAL和pASM-LuAL的质粒图谱。
图2表示载体pTriplEX2-Lu164、pcDNA3-Lu164和pASM-Lu164的质粒图谱。
图3表示载体pTriplEX2-Lu22、pcDNA3-Lu22和pASM-Lu22的质粒图谱。
作为Lu164底物的Coelenterazin衍生物
为了鉴定Lu164的底物,在每一种情况下将10微升不同的Coelenterazin衍生物(10-4M)的溶液与来自CHO-pcDNA3-Lu164细胞系的10微升上清液一起培养,并且测定发光。Coelenterazine获自Molecular Probes(USA)。
荧光素酶LuAL和Lu22与荧光素酶Lu164相比没有差别。确定未修饰过的Colenterazin(图B,Coelenterazin a)是Lu164、LuAl和Lu22的最佳底物。
图4表示作为Lu164的潜在底物的Coelenterazin衍生物和在发光计(RLU,相对光学单位)中以8.7kV的电压测定发光30秒所获得的曲线;以及Coelenterazin衍生物的分子结构示意图。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22依赖于Coelenterazin的酶促活性
细菌表达
细菌表达是通过用表达质粒pTriplEX2-Lu164、pTriplEX2-LuAL和pTriplEX2-Lu22转化细菌在大肠杆茵菌株BL21(DE3)中进行的。在37℃下,在LB培养基中培养转化过的细菌3小时,通过添加IPTG至1mM的最终浓度诱导表达4小时。通过离心收获诱导过的细菌,重新悬浮在PBS中,并且通过超声波破碎。将Coelenterazin(10-4M,溶解在甲醇中)或荧光素(萤火虫荧光素)添加到5微升裂解物(5mg/ml)中,并且测定化学发光。
所述测定,用RLU(相对发光单位)表示,是在9.5kV的电压下进行30秒。所测定的Lu164、LuAL和Lu22的值分别为230000、320000和260000RLU。所述表达是使用载体pTriplEx2-Lu164、pTriplEx2-LuAL和pTriplEx2-Lu22在大肠杆菌BL21(DE3)中进行的。
真核表达
在瞬时实验中,通过用表达质粒pcDNA3-Lu164、pcDNA3-LuAL和pcDNA3-Lu22转染细胞影响在CHO细胞中的组成型真核表达。为此,在96孔微量滴定板的每个孔中接种10000个悬浮在DMEM-F12培养基中的细胞,并且在37℃下培养过夜。转染是用Fugene 6试剂盒(Roche)按照生产商的说明进行的。转染过的细胞在37℃下,在DMEM-F12培养基中培养过夜。在添加Coelenterazin(10-4M,溶解在甲醇中)之后,在室温下,用发光计以9.5kV的电压测定培养基(5微升)和细胞裂解物(5微升)中的化学发光30秒。
所测定的Lu164、LuAL和Lu22的值分别为680000、670000和510000 RLU(相对发光单位)。所述表达是使用载体pcDNA3-Lu164、pcDNA3-LuAL和pcDNA3-Lu22在CHO细胞中进行的。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22的发光光谱
为了测定发光光谱,用质粒pTriplEx2-Lu164、pTriplEx2-LuAL和pTriplEx2-Lu22转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,并且按照下面的3.1部分所披露的方法进行超量表达。将50微升Coelenterazin(10-4M)添加到100微升体积的细菌裂解物中,并且测定发光光谱。荧光素酶的发光光谱曲线如下文所示。
对于荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22来说,通过所述的底物转化所产生的最大发光发生在大约490纳米的波长下。
图5表示在细菌表达之后荧光素酶Lu164(A)、LuAL(B)和Lu22(C)的发光光谱(RLU,相对发光单位)。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22从CHO细胞中的分泌,以Lu164和LuAL为例
为了表征荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22在真核细胞中的表达,用质粒pcDNA3-LuAl、pcDNA3-Lu164、pcDNA3-Fireluc和pcDNA3.1(+)稳定转染CHO细胞。所得到的克隆在DMEM-F12培养基中培养。将萤火虫荧光素酶用作非分泌型荧光素酶的阳性对照。将质粒pcDNA3.1(+)用作对照质粒,检测CHO亲本细胞中的潜在内源活性。
为了检测荧光素酶的分泌,将2000个细胞平铺到384孔微量滴定板上。在24小时之后,取出培养基,并且用Tyrode溶液洗涤细胞,并且添加30微升新的培养基。对于萤火虫荧光素酶来说,在添加5微升Coelenterazin(10-4M)或荧光素之后,用发光计以9.5kV的电压首次测定(0小时)30秒。在经过1-5小时之后进行1-5小时的测定。
图6表示培养基中荧光素酶活性随着时间的提高。没有分泌萤火虫荧光素酶。荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22是分泌型荧光素酶。
图6表示在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly、pcDNA3-Lu164和pcDNA3作为对照载体的无cDNA***片段的转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的荧光素酶活性(RLU,相对发光单位;h是小时;Firefly:萤火虫荧光素酶)。
荧光素酶活性对温度的依赖性
为了测定荧光素酶Lu22、Lu164和LuAL对温度的依赖性,用载体pcDNA3-Lu22、pcDNA3-Lu164和pcDNA3-LuAL瞬时转染CHO细胞,并且在0-47℃下测定上清液中的荧光素酶活性。为此,让细胞上清液和Coelenterazin溶液适应测定温度5分钟。测定是在发光计中以9.5kV的电压进行30秒。
图7表示所测定的荧光素酶LuAl、Lu164和Lu22依赖于温度的发光情况。LuAL的荧光素酶活性的最佳温度为27℃。对于Lu164最佳温度为22℃和对于Lu22所测定的最佳温度为4℃或更低。
图7表示在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly和pcDNA3-Lu164转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的温度依赖型荧光素酶活性(RLU:相对发光单位;培养基:DMEM-F12+10%FCS)
在CHO细胞中诱导荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22表达,LuAL为例
在瞬时实验中,通过用表达质粒pASM-LuAL转染细胞在CHO细胞中诱导真核表达。为此,在96孔微量滴定板的每个孔中接种10000个悬浮在DMEM-F12培养基中的细胞,并且在37℃下培养过夜。用Fugene6试剂盒(Roche)按照生产商的说明进行转染。转染过的细胞在37℃下,在DMEM-F12培养基中培养过夜。然后用毛喉萜(Forskolin)(10-5M)诱导所述细胞5小时。在添加Coelenterazin(10-4M,溶解在甲醇中)之后,用发光计以9.5kV的电压测定培养基和细胞裂解物的化学发光30秒。
图8表示LuAL在CHO细胞中的诱导表达。在37℃下用毛喉萜(10-5M)诱导表达5小时。测定10微升细胞上清液中的活性(RLU:相对发光单位;诱导因子:诱导过的RLU与未诱导过的RLU的比例)在细胞***中用荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22作为报导基因,以报导体NPY2和A2A为例,并且使用LuAL作为报导基因
为了能够分析受体专一性配体在基于细胞的***中对G蛋白结合受体的激活作用,将荧光素酶LuAL的cDNA序列克隆到表达载体pASMplr中。表达载体pASMplr含有cAMP-敏感型启动子元件(CRE),它能够间接测定cAMP的细胞内浓度。在该***中,荧光素酶被用作报导基因。
以G蛋白结合受体NPY2(神经肽受体2)和A2A(腺苷受体2a)为例说明了在细胞***中将荧光素酶Lu22、Lu164和Lu22用作报导基因的用途。为此,用载体pcDNA3-NPY2或pcDNA3-A2A对稳定克隆CHO-pASM-LuAL进行瞬时转染。受体NPY2是Gi结合受体,A2A受体是Gs结合受体。
通过添加1μM NECA活化A2A受体4小时。在存在10-5M毛喉萜的条件下,通过添加10μM NPY2肽活化NPY2受体。在添加Coelenterazin(10-4M)之后用发光计以9.5kV的电压测定培养基(30微升)中的荧光素酶活性30秒。
图9表示将荧光素酶用作细胞***的报导基因的用途,以G蛋白结合受体A2A和NPY2为例(RLU:相对发光单位)。
附图说明
图1:载体pTriplEX2-LuAL、pcDNA3-LuAL和pASM-LuAL的质粒图谱。
图2:载体pTriplEX2-Lu164、pcDNA3-Lu164和pASM-Lu164的质粒图谱。
图3:载体pTriplEX2-Lu22、pcDNA3-Lu22和pASM-Lu22的质粒图谱。
图4:作为Lu164的潜在底物的Coelenterazin衍生物。
A.在发光计(RLU,相对光学单位)中8.7kV的电压测定发光30秒所获得的曲线;
B.Coelenterazin衍生物的分子结构示意图。
图5:在细菌表达之后荧光素酶Lu164(A)、LuAL(B)和Lu22(C)的发光光谱(RLU,相对发光单位)。
图6:在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly、pcDNA3-Lu164和pcDNA3作为对照载体的无cDNA***片段的转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的荧光素酶活性(RLU,相对发光单位;h是小时;Firefly:萤火虫荧光素酶)。
图7:在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly和pcDNA3-Lu164转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的温度依赖型荧光素酶活性(RLU:相对发光单位;培养基:DMEM-F12+10% FCS)。
图8:LuAL在CHO细胞中的诱导表达。在37℃下用毛喉萜(10-5M)诱导表达5小时。测定10微升细胞上清液中的活性(RLU:相对发光单位;诱导因子:诱导过的RLU与未诱导过的RLU的比例)。
图9:将荧光素酶用作细胞***的报导基因的用途,以G蛋白结合受体A2A和NPY2为例(RLU:相对发光单位)。
参考文献/专利文献
Apley EC,Wagner R,Engelbrecht S.,以36 kDa的分子纯化形式快速制备铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的方法,,Anal Biochem.1985 Oct;150(1):145-54.
Berestovskaya NG,Shaloiko LA,Gorokhovatsky AY,Bondar VS,Vysotski Es,Maximov JE,von Doehren H,Alakhov YB.活性发光蛋白obelin在无细胞翻译***中的共翻译形成:翻译过程的直接超高灵敏测定。Anal Biochem.1999Mar 1;268(1):72-8.
Bonin等Photinus pyralis荧光素酶。Gene.1994 141:75-77
Alam J,Cook JL.报导基因:用于研究哺乳动物基因转录。AnalBiochem.1990 Aug1;188(2):245-54
Cullen Bryan R.,Malim Michael H.,作为真核报导基因的分泌型胎盘碱性磷酸酶。Methods in Enzymology.216:362ff
Hastings,Cell Physiology:Source book,Sperelakis N.(ed.),Academic press,pp 665-681,1995
Head JF,Inouye S.Teranishi K,Shimomura O.,在2.3埃分辨率下发光蛋白水母蛋白的晶体结构。Nature.2000 May 18;405(6784):372-6.
Gould S.,Suresh S.,作为分子和细胞生物学工具的萤火虫荧光素酶。Ana1.Biochem.1988,161:501-507
Idelgaufts H.,来自A-Z的重组DNA技术。VCH Verlag,Weinheim,1993
Inouye S.Noguchi M,Sakaki Y,Takagi Y,Miyata T,IwanagaS.Miyata T,Tsuji FI.发光蛋白水母蛋白的克隆和cDNA序列分析。Proc Natl Acad Sci USA 1985 May;82(10):3154-8
Inouye,S.,Kakoi,H.,Goto,T.,Tetrahedron Lett.,34,2971-2974(1976)
Inouye,S.,Watanebe,H.,Nakamura,H.and Shimomura,O.,FEBS letters 481(2000)19-25
Jones Keith,Hibbert Frank,Keenan Martine.Glowingjellyfish,发光和被称为coelenterazine的分子。Tibtech.1999.17:477ff
Kenda1l Jonathan M.,Badminton Michael N.进入激动人心的新纪元的Aequoria victoria生物发光。Tibtech.1998 16:216
Krieg,S.,Castles,C.,Allred,D.,Benedix,M.,Fuqua S.,分子空气干燥冷冻切片的RNA用于RT-PCR和示差展示。Biotechniques.1996 Sep;21(3):425-8.
Lorenz WW,McCann RO,Longiaru M,Cormier MJ.,编码Renillareniformis荧光素酶的cDNA的分离和表达。Proc Natl Acad Sci USA.1991 May 15;88(10):4438-42.
Lorenz WW,Cormier MJ,O′Kane DJ,Hua D,Escher AA,SzalayAA.,在哺乳动物细胞中表达Renilla reniformis荧光素酶基因。JBiolumin Chemilumin.1996 Jan-Feb;11(1):31-7.
Mathews J.C.等,rernilla reniformis荧光素酶的纯化和特性。Biochemistry.1977,16(1):85-91
Matveev SV,Lewis JC,Daunert S.,在肽测定中将遗传工程obelin用作生物发光标记。Anal Biochem.1999 May 15;270(1):69-74.
Phillips GN.绿色荧光蛋白的结构和动力学。Curr Opin StructBiol.1997 Dec;7(6):821-7
Sala-Newby等,重组萤火虫荧光素酶的表达。Biochem Soc.Transact.1992,20:143S
Shimomura O,Johnson FH.,生物发光蛋白水母蛋白的特性。Biochemistry.1969 Oct;8(10):3991-7.
Shimomura O.,海洋中的生物发光:发光蛋白***。Symp Soc ExpBiol.1985;39:351-72.
Shimomura O,Teranishi K.,与coelenterazine的发光相关的发光。Luminescence.2000 Jan-Feb;15(1):51-8.
Snowdowne KW,Borle AB.在哺乳动物细胞中用水母蛋白测定无细胞质的钙。Am J Physiol.1984 Nov;247(5 Pt 1):C396-408.
Thompson EM,Nagata S.Tsuji FI.,来自海洋贝类Vargulahilgendorfii的荧光素酶cDNA的克隆和表达。Proc Natl Acad SciUSA.1989 Sep;86(17):6567-71.
Thompson EM,Nagata S.Tsuji FL,Vargula hilgendorfii荧光素酶:用于监测哺乳动物细胞中基因表达的分泌型报导酶。Gene.1990 Dec 15;96(2):257-62.
Ungrin MD,Singh LM,Stocco R,Sas DE,Abramovitz M.,用于G-蛋白结合受体的基于水母蛋白的自动化钙功能测定。AnalBiochem.1999 Jul 15;272(1):34-42.
Webster JJ,Chang JC,Manley ER,Spivey HO,Leach FR.,影响通过萤火虫荧光素酶进行ATP分析的缓冲液。Anal Biochem.1980Jul 15;106(1):7-11.
Yang Te-Tuan,Sinai Parisa,Kitts Paul A.Kain Seven R.,用分泌型碱性磷酸酶报导***进行的基因表达的定量。Biotechnique.1997 23(6)1110ff
JP 05064583,Tora,(TORAY IND Inc.),用抗原、抗体、半抗原或激素等修饰过的荧光素酶-它是从Vargula hilgendorfii中分离的,可用于生物发光分析。
JP 08027200,Tora,(TORAY IND Inc.),包括与IgG结合结构域融合的荧光素酶的蛋白-可以用作化学发光免疫测定的诊断试剂
JP 09187281,Kikk,(KIKKOMAN Corp.),抗体-萤火虫荧光素酶融合蛋白-和相关的产物,即萤火虫荧光素酶融合基因,重组DNA及其制备
US 5196524,Gustafson G.;Ingolia T.;Kirchner G.;RobertsJ.,(Lilly&Co),编码具有细菌荧光素酶活性的融合蛋白的重组DNA-包括从特殊的天然生物发光细菌中分离的lux A和B基因的编码区,以及特定限制酶识别位点的DNA接头
US 5418155,Milton J.,Cornier;William W.Lorenz,分离的Renilla荧光素酶及其使用方法
US 5422266,Cormier MJ.;Prasher D.,(UNIV GEORGIA RESFOUND INC),编码apo:水母蛋白的DNA-可用于重组生产apo:水母蛋白,在化学和生物化学测定中它是生物发光标记。
US 5670356,Sherf B.;Wood K.(Promega Corp),修饰过的萤火虫荧光素酶基因-编码细胞质形式的荧光素酶
US 5798441 Cormier M.J.;Prasher D.,(UNIV GEORGIA RESFOUND INC),新分离的apo水母多肽-可以用作生物/化学测定的发光标记
WO 0020619,Alan P.;Liu Jingxue,分泌型renilla荧光素酶
WO 9520653,Renard JP;Thompson E.M.;Thompson E.,(INRAINST NAT RECH AGRONOMIQUE),用Vargula荧光素酶基因作为标记检测转基因胚胎-可以在胚泡阶段鉴定这种胚胎,以及含有该基因的转基因动物,胚胎和细胞系
WO 9938999,Roelant C.(Packard Instr.Co.Inc.),通过检测样品发光检测renilla荧光素酶的存在。
Claims (6)
1.一种编码荧光素酶的DNA分子或其对应的RNA分子,其中所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:7-10中的任一种。
2.一种重组DNA或RNA载体,其包含权利要求1的DNA或RNA分子。
3.权利要求2的重组DNA或RNA载体,包括位于所述DNA或RNA分子5,方向的功能性启动子。
4.一种包含权利要求2所述载体的微生物。
5.一种肽,它是由权利要求1的DNA或RNA分子编码的。
6.权利要求1的DNA或RNA分子作为细胞***报导基因的用途。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10058091.2 | 2000-11-23 | ||
DE10058091A DE10058091A1 (de) | 2000-11-23 | 2000-11-23 | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB018194338A Division CN1303214C (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102732537A true CN102732537A (zh) | 2012-10-17 |
Family
ID=7664340
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200510118849XA Expired - Lifetime CN1847399B (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
CN2012102094057A Pending CN102732537A (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
CNB018194338A Expired - Lifetime CN1303214C (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
CN2010105056541A Expired - Lifetime CN101979586B (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200510118849XA Expired - Lifetime CN1847399B (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB018194338A Expired - Lifetime CN1303214C (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
CN2010105056541A Expired - Lifetime CN101979586B (zh) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | 分离的荧光素酶及其用途 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7297483B2 (zh) |
EP (1) | EP1339853B1 (zh) |
JP (2) | JP4179877B2 (zh) |
KR (1) | KR100841808B1 (zh) |
CN (4) | CN1847399B (zh) |
AT (1) | ATE335824T1 (zh) |
AU (3) | AU2002220697A1 (zh) |
BR (2) | BR0115534A (zh) |
CA (1) | CA2429451C (zh) |
DE (2) | DE10058091A1 (zh) |
DK (1) | DK1339853T3 (zh) |
ES (1) | ES2271111T3 (zh) |
HK (3) | HK1096423A1 (zh) |
IL (2) | IL155878A0 (zh) |
MX (1) | MXPA03004539A (zh) |
PL (1) | PL206385B1 (zh) |
PT (1) | PT1339853E (zh) |
WO (2) | WO2002042469A1 (zh) |
ZA (1) | ZA200303928B (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10058091A1 (de) * | 2000-11-23 | 2002-06-06 | Bayer Ag | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
DE102007005803A1 (de) * | 2007-02-06 | 2008-08-07 | Bayer Healthcare Ag | Sekretierte Luziferase MLuc7 und deren Verwendung |
DE102007005804A1 (de) | 2007-02-06 | 2008-08-07 | Bayer Healthcare Ag | Sekretierte Luziferase Lu164M3 und deren Verwendung |
JP5605727B2 (ja) | 2010-04-06 | 2014-10-15 | Jnc株式会社 | セレンテラジン類縁体及びセレンテラミド類縁体 |
WO2012071631A1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Gene Stream Pty Ltd | Improved light-emitting molecules |
US8435777B1 (en) | 2012-01-20 | 2013-05-07 | Cayla | CPG-free gene for a new secreted reporter protein |
JP6132350B2 (ja) * | 2012-10-26 | 2017-05-24 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 人工生物発光酵素 |
CN104781401B (zh) * | 2012-10-26 | 2018-06-05 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 人工生物发光酶 |
WO2014093677A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Promega Corporation | Recognition of cellular target binding by a bioactive agent using intracellular bioluminescence resonance energy transfer |
JP6153140B2 (ja) * | 2013-10-18 | 2017-06-28 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 人工生物発光酵素に用いるための発光基質 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5604123A (en) * | 1988-08-09 | 1997-02-18 | Toray Industries, Inc. | Luciferase, gene encoding the same and production process of the same |
WO1999049019A2 (en) * | 1998-03-27 | 1999-09-30 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5838313A (en) * | 1995-11-20 | 1998-11-17 | Siemens Corporate Research, Inc. | Multimedia-based reporting system with recording and playback of dynamic annotation |
US6995768B2 (en) * | 2000-05-10 | 2006-02-07 | Cognos Incorporated | Interactive business data visualization system |
DE10058091A1 (de) * | 2000-11-23 | 2002-06-06 | Bayer Ag | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
US6643635B2 (en) * | 2001-03-15 | 2003-11-04 | Sagemetrics Corporation | Methods for dynamically accessing, processing, and presenting data acquired from disparate data sources |
US8036939B2 (en) * | 2001-06-08 | 2011-10-11 | Servigistics, Inc. | Reporting in a supply chain |
US7587755B2 (en) * | 2004-07-02 | 2009-09-08 | Citrix Systems, Inc. | System and method for executing interactive applications with minimal privileges |
US20060230234A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Sap Ag. | Browser cache management |
US7779347B2 (en) * | 2005-09-02 | 2010-08-17 | Fourteen40, Inc. | Systems and methods for collaboratively annotating electronic documents |
US7831464B1 (en) * | 2006-04-06 | 2010-11-09 | ClearPoint Metrics, Inc. | Method and system for dynamically representing distributed information |
-
2000
- 2000-11-23 DE DE10058091A patent/DE10058091A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-11-12 WO PCT/EP2001/013057 patent/WO2002042469A1/de unknown
- 2001-11-12 AU AU2002220697A patent/AU2002220697A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 BR BR0115534-2A patent/BR0115534A/pt active IP Right Grant
- 2001-11-22 CA CA2429451A patent/CA2429451C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 CN CN200510118849XA patent/CN1847399B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 JP JP2002545175A patent/JP4179877B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 MX MXPA03004539A patent/MXPA03004539A/es active IP Right Grant
- 2001-11-22 CN CN2012102094057A patent/CN102732537A/zh active Pending
- 2001-11-22 KR KR1020037006911A patent/KR100841808B1/ko active IP Right Grant
- 2001-11-22 AU AU2002224876A patent/AU2002224876B2/en not_active Expired
- 2001-11-22 IL IL15587801A patent/IL155878A0/xx active IP Right Grant
- 2001-11-22 EP EP01994705A patent/EP1339853B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 ES ES01994705T patent/ES2271111T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 AU AU2487602A patent/AU2487602A/xx active Pending
- 2001-11-22 US US10/416,752 patent/US7297483B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 AT AT01994705T patent/ATE335824T1/de active
- 2001-11-22 DK DK01994705T patent/DK1339853T3/da active
- 2001-11-22 PT PT01994705T patent/PT1339853E/pt unknown
- 2001-11-22 CN CNB018194338A patent/CN1303214C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 CN CN2010105056541A patent/CN101979586B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 DE DE50110723T patent/DE50110723D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 PL PL362774A patent/PL206385B1/pl unknown
- 2001-11-22 BR BRPI0115534-2A patent/BRPI0115534B1/pt unknown
- 2001-11-22 WO PCT/EP2001/013597 patent/WO2002042470A1/de active IP Right Grant
-
2003
- 2003-05-13 IL IL155878A patent/IL155878A/en unknown
- 2003-05-21 ZA ZA200303928A patent/ZA200303928B/en unknown
-
2004
- 2004-06-08 HK HK07103527.9A patent/HK1096423A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-06-08 HK HK04104076A patent/HK1061044A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-10 JP JP2007264492A patent/JP4519163B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-10-22 US US11/975,752 patent/US8236540B2/en active Active
-
2011
- 2011-08-18 HK HK11108724.3A patent/HK1154623A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-07-18 US US13/552,486 patent/US20130115641A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-05-15 US US14/714,166 patent/US9745557B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5604123A (en) * | 1988-08-09 | 1997-02-18 | Toray Industries, Inc. | Luciferase, gene encoding the same and production process of the same |
WO1999049019A2 (en) * | 1998-03-27 | 1999-09-30 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9745557B2 (en) | Isolated luciferases and the use thereof | |
EP0973874B1 (en) | Enzyme assay for mutant firefly luciferase | |
AU2006281994B2 (en) | Arachnocampa luciferases | |
IL168158A (en) | Photoprotein with improved bioluminescence | |
KR20090116733A (ko) | 분비형 루시페라아제 MLuc7 및 그의 용도 | |
US8383797B2 (en) | Luciferase gene optimized for use in imaging of intracellular luminescence | |
US7544484B2 (en) | Nucleic acids encoding membrane-binding proteins and methods of using same | |
Su et al. | Protein kinase C phosphorylates nonmuscle myosin-II heavy chain from Drosophila but regulation of myosin function by this enzyme is not required for viability in flies | |
WO2003080000A2 (en) | Modulation of angiogenesis through targeting of cysteine oxygenase activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1177476 Country of ref document: HK |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121017 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1177476 Country of ref document: HK |