CN102732462A - 一株鲑鱼肾杆菌及其生产的酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株高产胞外壳聚糖降解酶的海洋细菌Renibacterium Sp.QD1及其产胞外壳聚糖降解酶CSN-A的分离纯化条件、酶学性质。本发明通过对菌株QD1进行发酵培养，发酵上清液活性达300-400U/ml，粗酶液经硫酸铵沉淀、疏水层析，得到约28kDa的壳聚糖降解酶CSN-A，该酶降解壳聚糖的最适温度为50℃，最适pH为5.6-5.8，Fe3+,Al3+,Cu2+和SDS对CSN-A酶活有强烈的抑制作用，而Mn2+能明显激活CSN-A，CSN-A降解壳聚糖终产物以壳2糖、3糖为主。菌株QD1在适合于工业化生产条件下的酶活力可达300-400U/ml发酵液。本发明在解决目前市场上壳聚糖酶产生菌株产量低、价格昂贵方面将具有极大的应用前景，并将极大促进壳寡糖等相关产品的利用。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选及应用技术领域。具体涉及一株鲑鱼肾杆菌及其生产的酶，即一株高产胞外壳聚糖酶的海洋细菌Renibacterium Salmoninarum QD1及其所产的壳聚糖降解酶CSN-A。
背景技术：
甲壳素（chitin）又称几丁质，是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物，年生物合成约十亿吨。它广泛存在于虾、蟹和昆虫类等节肢动物的外壳及部分高等植物和真菌的细胞壁中。壳聚糖（chitosan）是甲壳素脱去部分或全部乙酰基的产物，是一类由2-氨基-2-脱氧-葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖（＜40%）单体通过β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖。与甲壳素相比，壳聚糖含有性质较活泼的伯氨基，它是天然多糖中唯一含有阳离子的高分子聚合物，具有多种生理功能，如抗菌性、成胶性和成膜性等，因而在多个领域具有重要的应用价值。壳聚糖酶是一类催化氨基葡萄糖的β-1,4-糖苷键断裂，从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶。壳聚糖酶用途广泛，一方面，壳聚糖酶可以用于制备具有独特生理活性的壳寡糖；另一方面，壳聚糖酶本身还可以作为生物防腐剂，能提高植物的抗病能力；最后，壳聚糖酶在生物体的自溶、细胞壁的形态发生、土壤微生物的营养代谢等基础研究方面也具有重要的用途。
自1973年首次在真菌和细菌培养液中发现壳聚糖酶以来，人们已经在许多细菌、放线菌和真菌等类群的微生物中发现了壳聚糖酶的存在，但这些壳聚糖酶的活性大多低于10U/ml。根据文献报道，2007年孙玉英等报道了一株来自海洋Microbacterium sp.OU01的壳聚糖酶，其活力达到118U/ml，2004年陈小娥等报道的曲霉经优化后的活力达197U/ml。目前已有多个壳聚糖酶实行了商品化，其价格均比较昂贵，如郑州骏涛化工有限公司生产的食品级壳聚糖酶售价为460元/升。综上所述，目前壳聚糖酶的研究存在如下缺点，菌株产酶能力低下、酶活力不高、适合于工业化生产的菌株少、发酵成本高。因此，高活力、低成本的壳聚糖酶及其微生物产生菌株具有重要的市场应用前景。
发明内容：
本发明的目的是提供一株鲑鱼肾杆菌及其生产的壳聚糖酶，即一株高产胞外壳聚糖酶的菌株，及其生产的壳聚糖酶，从而弥补现有的技术不足。
本发明提供的壳聚糖酶产生菌株为鲑鱼肾杆菌属海洋细菌Renibacterium Sp.QD1，已于2011年6月30日保藏在位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M 2011226。
本发明的菌株用来生产壳2糖（壳寡2糖）和/或壳3糖（壳寡3糖）。
本发明的菌株能大量分泌高活性的壳聚糖降解酶CSN-A，适合工业化生产，产壳聚糖酶最适发酵时间为40-42hr。
本发明的菌株产壳聚糖酶最适温度为25-28℃。
上述的壳聚糖酶CSN-A是从QD1菌株发酵上清液中分离纯化到的，具有如下性质：
壳聚糖降解酶CSN-A，其SDS-PAGE电泳分子量大小为28kD。
上述的壳聚糖酶，其作用底物为壳聚糖。
上述的壳聚糖酶，降解壳聚糖的最适温度是50℃。
上述的壳聚糖酶，温度稳定范围为0-25℃。
上述的壳聚糖酶，降解壳聚糖的最适pH是5.6。
上述的壳聚糖酶，pH稳定范围为pH5-10。
上述的壳聚糖酶，其抑制剂为Fe3+,Al3+,Cu2+和SDS，促进剂为Mn2+。
上述的聚糖酶降解壳聚糖的终产物为壳2糖和壳3糖。
本发明所涉及的产酶菌株经过对其发酵条件优化其活力可以达到300-400U/ml，是迄今报道产酶量较高的菌株，此外该菌株还具有发酵周期短、发酵成本低的优点，而且本发明所涉及的壳聚糖酶具有较高的pH稳定性，预示了其在工业应用中的潜在价值。
附图说明：
图1：本发明中所用菌株产胞外壳聚糖酶的温度曲线图谱；
图2：本发明中所用菌株产胞外壳聚糖酶的时间梯度曲线；
图3：本发明中所用菌株产胞外壳聚糖酶CSN-A的SDS-PAGE电泳图；
图4：本发明所用菌株产胞外壳聚糖酶CSN-A最适温度和温度稳定性图谱；
图5：本发明中所用菌株产胞外壳聚糖酶CSN-A最适pH和pH稳定性图谱；
图6：各种离子对本发明中所用菌株产壳聚糖酶CSN-A的活力影响图谱；
图7：本分明中所用菌株产壳聚糖酶CSN-A降解壳聚糖的终产物薄层分析。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对发明菌株的筛选、酶的性质进行详细的描述。
实施例1菌株的分离和鉴定
从胶州湾采集海水，4℃保存，如下方法处理:将海水经5000rpm/min离心10min后，用少量的海水重悬，将溶液进行梯度稀释后直接涂布在含有0.5%的壳聚糖固体培养基平板上，于28℃培养2-3天，选择带有明显透明水解圈的菌落，挑取单克隆接种到含3ml液体培养基的试管中，28℃200rpm/min培养12hr，将培养液按1%的比例接入含50ml液体培养基的250毫升三角瓶中，于28℃200rpm/min培养1-2天。培养液经离心后进行酶活力测定，筛选高稳定性、高活力的菌株。对其中活力最高的一株菌经形态分析和16SrDNA序列测定，表明该菌株属于鲑鱼肾杆菌属，革兰氏染色呈阳性，命名为RenibacteriumSalmoninarum QD1。
实施例2菌株发酵条件的优化
1）菌株QD1最适发酵温度的优化
过夜培养的菌株接种于100ml发酵液，分别于18、25、30、37℃进行发酵培养，定时取样测定壳聚糖酶活，如图1所示，QD1菌株最适发酵温度确定为25~28℃。
2）菌株QD1最适发酵时间的优化
过夜培养的菌株接种于100ml发酵液，于28℃进行培养，定时取样测定壳聚糖酶活力，如图2所示，菌株QD1产壳聚糖酶在40-42hr达到高峰。
按照上述优化条件，菌株QD1产壳聚糖酶活力可提高到300-400U/ml发酵液。
使用的液体培养基配方为（g/L）：壳聚糖胶体5g，氯化钠1g，酵母粉1g。酶活力测定方法为光吸收法，0.9ml 1%壳聚糖胶体溶液加入1ml 0.2M醋酸缓冲液（PH5.8），于50℃温浴，加入100ul发酵上清粗酶液，于50℃反应10min，反应完毕后加入DNS试剂1.5ml，于沸水浴煮沸10min，加水稀释至25ml体积，取5ml于10000rpm/min离心5min，上清液于520nm测定吸光值，根据氨基葡萄糖标准曲线，求得还原糖量。一个酶活力单位（U）定义为50℃下每分钟催化生成相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。壳聚糖胶体溶液的配制，称取1g壳聚糖，加入10ml1M盐酸，玻璃棒搅拌至成胶，加入70ml去离子水，75℃水浴保温搅拌至全部溶解，用1M氢氧化钠调PH至6.0，75℃保温至白色沉淀全部溶解，加水定容到100ml，121℃灭菌后备用。
实施例3菌株产壳聚糖酶CSN-A的分离纯化
1：CSN-A酶的分离纯化
过夜培养的菌株QD1接种于100ml发酵液，于28℃发酵培养36hr，收集发酵液以12000g、4℃离心20min，上清液用60%硫酸铵沉淀过夜，4℃12000rpm/min离心30min，沉淀用20mM磷酸缓冲液pH6.8溶解，经0.22μm滤膜过滤后备用，过滤后的酶液上样疏水层析柱，用去离子水进行梯度洗脱，收集各个洗脱峰，以壳聚糖酶活作为跟踪，分别测定每个洗脱峰，所得的活性峰经PAGE电泳显示为单一条带，命名为CSN-A。比活性从199U/mg蛋白提高到1574U/mg，提高了7.89倍，回收率为67%，见表1。
表1壳聚糖酶CSN-A的分离纯化步骤及结果
实施例4壳聚糖酶CSN-A的酶学性质
1）壳聚糖酶CSN-A的分子量确定
因为蛋白质的相对迁移率与分子量的对数成正比，因此可以通过SDS-PAGE测定目标蛋白的分子量。根据SDS-PAGE中标准分子量蛋白和目标蛋白的相对迁移率，计算出CSN-A酶的分子量大小为28kD，如图3所示，该大小与其在凝胶色谱中的大小一致。
2）壳聚糖酶CSN-A的最适温度和热稳定性测定
纯化后的CSN-A在不同的温度(20、30、40、50、60、70℃)下进行酶活性测定，结果如图4A所示。CSN-A的最适温度为50℃，当低于30℃或高于70℃时，酶活性大幅降低，仅为最适温度下的15%左右。
酶的温度稳定性分析是指将酶在一定的温度(0、10、20、30、40、50)下保温1h后，按标准方法测定残余酶活，结果如图4B所示。CSN-A在30℃以下有较好的稳定性，当温度达到50℃时，纯酶在1h内几乎全部失活。
3）壳聚糖酶CSN-A的最适pH和pH稳定性测定
纯化后的CSN-A在不同的pH下的方法进行酶活性测定，结果如图5A所示。CSN-A的酶活性对pH比较敏感，最适pH为5.6。当pH低于5或高于7时，酶活性显著下降，要低于最适pH的50%。
pH稳定性的测定是将等量的酶液与不同pH的缓冲液4℃放置24h，测定时按标准方法测定残余酶活，结果如图5B所示。结果表明，CSN-A在pH5-10之间均能保持较好的稳定性。
4）金属离子对CSN-A酶活性的影响
分别考察1mmol/L的各种离子(Li+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Al3+、Fe3+)对酶活的影响，对照组的酶活定为100%。如图6所示，Cu2+、Fe3+和Al3+对CSN-A的酶活具有强烈的抑制作用，此外表面活性剂SDS对酶活也有显著的抑制作用，而Mn2+对酶活有显著的激活作用。
5）壳聚糖酶CSN-A降解壳聚糖的终产物薄层层析分析
底物的配制（1%）：按照1克壳聚糖粉:10ml 1M HCl的比例加入盐酸，75℃加热搅拌过夜，用1M NaOH回调PH至6.0，回调过程中要边加热边搅拌，用去离子水补充体积至底物浓度为1%。
水解：调整酶液浓度为100U/ml，按照酶液：底物=1：9的体积比，于55℃条件下水解1h，产物经喷雾干燥后密封保存。
产物鉴定：取适量产物干粉，用去离子水配制成溶液，利用薄层层析（TLC）鉴定产物的组成，展开剂为：正丁醇：冰乙酸：水：氨水=2:1:1:0.3，展层后用吹风机吹干，将薄层板浸入显色剂（2g二苯胺、2mL苯胺、1ml浓HCl与10mL85％磷酸共溶于200mL丙酮中），迅速取出后用吹风机烘干，然后用电炉烘烤硅胶板，至显色为止。
结果如图7所示，其中M为壳2糖和壳3糖标准品，A为未降解的壳聚糖，结果B说明CSN-A降解壳聚糖的终产物为壳2糖和壳3糖。
本发明获得的菌株和从该菌株获得的壳聚糖酶CSN-A具有很好的工业应用前景，能够用来工业化生产壳2糖和壳3糖。
Claims (10)
1.一种鲑鱼肾杆菌属海洋细菌Renibacterium Sp.，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011226。
2.权利要求1所述的鲑鱼肾杆菌属海洋细菌Renibacterium Sp.的应用，其特征在于，是用来生产壳2糖和/或壳3糖。
3.一种壳聚糖降解酶，其特征在于，是用权利要求1所述的鲑鱼肾杆菌属海洋细菌Renibacterium Sp.所分泌的，其分子量大小为28kD。
4.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的作用底物为壳聚糖。
5.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶降解壳聚糖的最适温度是50℃。
6.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的温度稳定范围为0-25℃。
7.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的最适pH为5.6。
8.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的pH稳定范围为pH5-10。
9.如权利要求3所述的壳聚糖降解酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的抑制剂为Fe3+、Al3+、Cu2+和SDS，促进剂为Mn2+。
10.权利要求3所述的壳聚糖降解酶的用途，是用于生产壳2糖和壳3糖。
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