CN102719500A

CN102719500A - 一种固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法

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Publication number: CN102719500A
Application number: CN2012102337491A
Authority: CN
Inventors: 高智慧; 任丽梅; 余琼林; 刘磊; 王文芳; 丁国钰
Original assignee: Tianjin Qiren Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Qiren Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-10-10

Abstract

一种采用固定化酶连续转化生产γ-氨基丁酸的方法。采用构建的谷氨酸脱羧酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，将其诱导表达后破碎细胞，收集上清液，对融合表达纤维素结合域（CBD）的谷氨酸脱羧酶的最适反应条件和固定化条件进行了研究。利用CBD标签对纤维素的特异性吸附性能，将纤维素载体加入到细胞裂解液中，实现谷氨酸脱羧酶的特异性吸附，并采用交联剂交联固定化谷氨酸脱羧酶。优化转化条件，最佳的催化反应条件为，pH5.5；反应时间2h；底物L-谷氨酸钠的浓度40g/L；固定化酶浓度8mL/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度0.1mM。在最适反应条件下，重复连续转化10次，底物L-谷氨酸钠的转化率均达到93%以上。

Description

一种固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过固定化酶法生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸是一种具有很高生理活性的天然氨基酸，广泛分布于动植物中。是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动。根据目前的研究，发现γ-氨基丁酸的生理活性主要表现在以下几方面：（1）镇静神经、抗焦虑；（2）降低血压；（3）治疗帕金森病、癫痫、老年痴呆等疾病；（4）降低血氨，以解决氨毒，从而增进肝机能；（5）提高脑活力；（6）促进乙醇代谢；（7）其他如防止皮肤老化、消除体臭、改善脂质代谢、防止动脉硬化高效减肥等功能。γ-氨基丁酸目前在医药中已有广泛的应用，同时作为一种具有显著药理作用的功能性因子，其在食品工业中的应用也越来越受关注。

由于γ-氨基丁酸在动植物原料中含量很低，很难直接从天然组织中大量提取得到，目前γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。但是，化学合成法得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂，因此化学合成法制备的γ-氨基丁酸不宜用于食品添加剂使用。

生物合成法主要是利用酶催化转化，在γ-氨基丁酸支路中合成。该方法生产成本低、无毒、安全环保，属于低碳、绿色生产方式。就酶源而言，可分为两种途径：植物组织代谢和微生物发酵。其中，植物组织代谢主要利用内源酶转化制备γ-氨基丁酸，分为植物组织生长代谢和立体植物组织应激代谢两种方式。微生物发酵法主要是利用谷氨酸脱羧酶（GAD）生物催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸。至今为止，被发现具有GAD活性并用来制备γ-氨基丁酸的微生物主要包括大肠杆菌E.coli、乳酸菌、酵母菌、红曲霉菌等，表1是目前微生物生产γ-氨基丁酸的情况。

表1微生物生产γ-氨基丁酸的研究概况

目前，生物合成法是γ-氨基丁酸的主流生产技术，综合比较国内外生物合成法生产γ-氨基丁酸,不同菌株及不同的生产方式,γ-氨基丁酸的产量差别较大，且发酵周期均较长，发酵结束后如何将产物从成分复杂的发酵液分离、纯化，也成为生产流程中复杂、耗时、增加成本的一环。近年来，随着酶固定化技术在医药工业的发展应用，有关固定化GAD转化γ-氨基丁酸的研究也已有报道，吴国琪等（分析化学，1999，27（7）：759-763采用羧甲基化的烯丙基葡聚糖生化树脂，林少琴等（药物生物技术，2005，12（2）：101-105）采用壳聚糖材料固定GAD，陈蔚青等人（中国生化药物杂志，2007，28（4）：224-227）采用海藻酸钠与明胶协同作用固定化，以海藻酸钠和明胶为载体，通过氯化钙硬化、戊二醛交联，对大肠杆菌GAD进行包埋法固定化，并尝试采用填充床反应器连续反应制备γ-氨基丁酸，但反应效率还有待改进提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的绿色合成方法。

本发明方法涉及基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD和BL21(DE3)-pET21(+)-GAD，以底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸出发，经表达的谷氨酸脱羧酶或者固定化的基因工程菌表达的谷氨酸脱羧酶直接转化L-谷氨酸钠或L-谷氨酸，制备γ-氨基丁酸。

本发明所述的固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的具体方法是：

以固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶（简称“固定化酶”）融合蛋白为酶源，浓度为0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的条件下，进行酶促反应，反应过程中，向反应体系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸为20g/L至50g/L，温度25至50℃，pH值为4至6，经酶法转化反应1h至4h生产γ-氨基丁酸，并进一步分离获得γ-氨基丁酸粉末或晶体。

酶促反应优选转化温度为37℃；优选转化pH值为5.5；优选转化时间为2h；底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸的用量优选分别为40g/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.1mM；固定化酶优选用量为8mL/L。

固定化酶源可重复使用15次以上，且在最佳的反应条件和体系下，连续转化10次，其催化底物转化率均能够达93%以上。

所述的固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白的制备方法是：

首先，本发明自行构建了高效融合表达纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，即以大肠杆菌BL21的基因组为模板进行PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因，构建pET21(+)-GAD表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，随后将确认的GAD基因转入pET35b，构建基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，其中大肠杆菌BL21(DE3)以及对应的表达载体pET21a(+)、pET35b均为文献报道和商业化可利用的表达体系；

以上述重组基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的细胞裂解液为起始酶源，经过纤维素载体吸附，完成固定化，得到固定化酶。

所述的谷氨酸脱羧酶基因来源于构建的重组菌株BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD，该菌株具备可表达谷氨酸脱羧酶融合蛋白，并能够将L-谷氨酸或其钠盐转化为γ-氨基丁酸。

所述的纤维素载体包括纤维素微球、纤维素凝胶、脱脂棉和滤纸。

固定化酶采用纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白特异性吸附固定的方式，或采用交联剂进一步交联固定的方式，其中交联剂为戊二醛，浓度为0.1%。

在本发明实施例中，采用柱前衍生化HPLC法来测定L-谷氨酸及γ-氨基丁酸的含量，衍生化试剂为邻苯二甲醛试剂。柱前衍生化方法如下：精密量取100μL样品溶液，加入50μL衍生化试剂（称取0.1g邻苯二甲醛用1mL乙腈溶解，加入130μLβ-巯基乙醇，用0.4mol/L硼酸缓冲液定容至10mL，pH10.2），混合反应2min，取20μL进样分析。色谱柱：C₁₈色谱柱(Inertsil ODS-SP5μ,4.6×250mm)；流动相：0-11min，B相8%-100%；其中A相（称取3.2g结晶乙酸钠，用水溶解定容至400mL；然后加入88μL三乙胺，搅拌下滴加5%醋酸约700μL调节pH至7.20；再加入2mL四氢呋喃，混合后过滤备用），B相（称取2.4g结晶乙酸钠，用水溶解定容至300mL；然后滴加2%的醋酸将pH调至7.20混合后过滤备用）；室温；流速为1mL/min；检测波长340nm。

本发明的优点和有益效果：

本发明自行构建了融合表达谷氨酸脱羧酶的重组表达载体pET35b-GAD并转化至E.coli BL21(DE3)，对融合的谷氨酸脱羧酶进行高效表达，获得高活力的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶（CBD-GAD）。并巧妙地通过CBD生物特异性识别纤维素的特性，对谷氨酸脱羧酶进行了固定化。利用固定化的高效融合表达的CBD-GAD为酶源，以L-谷氨酸钠或L-谷氨酸为底物，能够酶法连续转化制备γ-氨基丁酸。本发明发酵成本低，固定化过程简便快捷，酶促反应催化效率高，酶和产物分离操作简单，因此为固定化酶法制备γ-氨基丁酸的绿色生产工艺提供了一条新的途径，在γ-氨基丁酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。

附图说明

图1是L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的柱前衍生化HPLC检测；

A：底物L-谷氨酸；B：标准品γ-氨基丁酸；C：反应液中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸检测。

图2是交联剂的浓度考察。

图3是催化条件的优化；

A：反应温度与转化率的关系；B：pH与转化率的关系；C：反应时间与转化率的关系；D：底物L-谷氨酸钠对转化率的关系；E：固定化酶与转化率的关系；F：磷酸吡哆醛与转化率的关系。

图4是固定化酶稳定性考察。

具体实施方式

实施例1谷氨酸脱羧酶基因的克隆及表达

根据NCBI数据库收录的大肠杆菌BL21的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计上游引物GAD1：5’-CGC GGA TCC ATG GAT AAG AAG CAA G-3’和下游引物GAD2：5’CCG CTCGAG CGG TCA GGT ATG TTT AAA G-3’。

以大肠杆菌BL21的基因组为模板进行PCR扩增获得谷氨酸脱羧酶基因，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带后，连接pET21a(+)载体，构建pET21a(+)-GAD，并转入BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD。

取一个谷氨酸脱羧酶工程菌单菌落接种于LB培养基，37℃培养过夜以获得饱和培养物,将饱和培养物以1%接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养OD₆₀₀达到0.5时，添加IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃诱导3h诱导表达谷氨酸脱羧酶。

确认表达产物具备催化L-谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸活性后，将GAD连接至pET35b，构建pET35b-GAD载体，并转入BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，诱导表达后确认表达产物具备催化L-谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸的活性。

实施例2γ-氨基丁酸的高效液相色谱法检测

采用柱前衍生化HPLC法来测定L-谷氨酸及γ-氨基丁酸的含量，衍生化试剂为邻苯二甲醛试剂。柱前衍生化方法如下：精密量取100μL样品溶液，加入50μL衍生化试剂，混合反应2min，取20μL进样分析。色谱柱：C₁₈色谱柱(Inertsil ODS-SP5μ,4.6×250mm)；流动相：0-11min，B相8%-100%；室温；流速为1mL/min；检测波长340nm。

反应液离心取上清液，按上述方法衍生后进行HPLC分析，结果见图1，与γ-氨基丁酸标准曲线比对，计算底物溶液中L-谷氨酸钠的摩尔转化率。

实施例3谷氨酸脱羧酶的固定化

分别取10mL纤维素微球（参见中国专利，申请号200710057042.9），加入到50mL实施例1获得的基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的菌体裂解液中，4℃振荡过夜。磷酸钠缓冲液洗涤后，加入0.01%至1%不同浓度的戊二醛交联，随后以1M Gly封闭10h，磷酸钠缓冲液洗涤，得到固定化的谷氨酸脱羧酶，即固定化酶，4℃保存备用。分别取1mL不同固定化条件固定化的纤维素微球，加入同样剂量的L-谷氨酸钠，考察固定化效率，结果如图2所示，交联剂戊二醛的最佳浓度为0.1%。

实施例4固定化谷氨酸脱羧酶反应条件优化

以上述实施例3中固定化酶为酶源，分别在每升反应体系中加入底物L-谷氨酸为20~50g；磷酸吡哆醛为0.05mM~0.15mM；转化温度为25~50℃；转化pH值为4~6；转化时间为1~4h，固定化酶为4~20mL/L。考察不同的转化条件对L-谷氨酸钠转化率的影响，并采用实施例2中的方法检测γ-氨基丁酸的含量，计算L-谷氨酸钠的转化率。

图3A：考察反应温度与L-谷氨酸钠转化率的关系；固定化酶4mL；底物L-谷氨酸钠为20g；磷酸吡哆醛为0.1mM；转化pH值为5；转化时间为1h。

图3B：考察pH与L-谷氨酸钠转化率的关系；固定化酶4mL；底物L-谷氨酸钠用量为20g；磷酸吡哆醛为0.1mM；转化时间为1h；转化温度为37℃。

图3C：考察反应时间与L-谷氨酸钠转化率的关系；固定化酶4mL；底物L-谷氨酸钠用量为20g；磷酸吡哆醛为0.1mM；转化pH值为5.5；转化温度为37℃。

图3D：考察底物与L-谷氨酸钠转化率的关系；固定化酶4mL；磷酸吡哆醛为0.1mM；转化温度为37℃；转化pH值为5.5；转化时间为2h。

图3E：考察固定化酶与L-谷氨酸钠转化率的关系；底物L-谷氨酸钠用量为40g；磷酸吡哆醛为0.1mM；转化pH值为5.5；转化时间为2h；转化温度为37℃。

图3F：考察磷酸吡哆醛与L-谷氨酸钠转化率的关系；固定化酶8mL；底物L-谷氨酸钠用量为40g；转化温度为37℃；转化pH值为5.5；转化时间为2h。

确认最佳转化条件：反应温度为37℃；反应体系pH为5.5；反应时间为2h；底物L-谷氨酸钠浓度为40g/L；固定化酶用量为8mL/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.1mM。

在最适酶促反应条件下，L-谷氨酸钠的转化率约为99.5%。

实施例5酶的稳定性考察

以实施例4确定的最佳条件，单次催化反应结束后，过滤分离固定化酶和产物γ-氨基丁酸，回收的固定化酶重复用于下一次催化反应。反复使用20次，固定化酶的重复实验结果表明，L-谷氨酸钠转化率可达70%以上，且前15次底物L-谷氨酸钠的转化率均在80%以上，前10次底物L-谷氨酸钠的转化率均在93％以上（图4）。

实施例6以L-谷氨酸钠为底物制备及分离γ-氨基丁酸

以实施例4确定的最佳条件，以固定化酶为酶源，以L-谷氨酸钠为底物，酶法制备γ-氨基丁酸，1L体系中加入8mL固定化酶，加入谷氨酸钠40g，以及辅酶磷酸吡哆醛0.1mM，控制温度37°C、以3N盐酸调节pH5.5,进行水解反应2h，同样进行10次连续反应。转化液过滤去除微球，经001x7阳离子交换树脂吸附脱盐，0.5M氨水洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至稀稠状，加入3倍体积的95%乙醇，4°C静置过夜，过滤收集晶体，并用少量预冷的95%乙醇洗涤，60°C的真空干燥，得γ-氨基丁酸白色粉末195g，采用HPLC检测，产物纯度达到98.5%。

实施例7以L-谷氨酸为底物制备及分离γ-氨基丁酸

以实施例4确定的最佳条件，以固定化酶为酶源,以L-谷氨酸为底物，酶法制备γ-氨基丁酸，1L体系中加入8mL固定化酶，加入谷氨酸40g，以及辅酶磷酸吡哆醛0.1mM，控制温度37°C、pH5.5,进行水解反应2h，同样进行10次连续反应。转化液过滤去除微球，真空浓缩至稀稠状，加入3倍体积的95%乙醇，4°C静置过夜，过滤收集晶体，并用少量预冷的95%的乙醇洗涤后，于60°C的真空干燥箱内干燥，得γ-氨基丁酸白色粉末224g，采用HPLC检测，产物纯度达到95.0%。

Claims

1.一种采用固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于该方法包括：

以固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白、简称“固定化酶”为酶源，浓度为0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的条件下，进行酶促反应，反应过程中，向反应体系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸为20g/L至50g/L，温度25至50℃，pH值为4至6，经酶法转化反应1h至4h生产γ-氨基丁酸，并进一步分离获得γ-氨基丁酸粉末或晶体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白的制备方法是：

首先，构建高效融合表达纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，即以大肠杆菌BL21的基因组为模板进行PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因，构建pET21(+)-GAD表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，随后将确认的GAD基因转入pET35b，获得重组表达载体pET35b-GAD，再构建基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸脱羧酶基因来源于构建的重组菌株BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD，该菌株具备可表达谷氨酸脱羧酶融合蛋白，并能够将L-谷氨酸或其钠盐转化为γ-氨基丁酸。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的纤维素载体包括纤维素微球、纤维素凝胶、脱脂棉和滤纸。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：固定化酶采用纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白特异性吸附固定的方式，或采用交联剂进一步交联固定的方式，其中交联剂为戊二醛，浓度为0.1%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酶促反应优选转化温度为37℃；优选转化pH值为5.5；优选转化时间为2h；底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸的用量优选分别为40g/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.1mM；固定化酶优选用量为8mL/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：固定化酶源可重复使用15次以上，且在最佳的反应条件和体系下，连续转化10次，其催化底物转化率均能够达93%以上。