CN102719407B - 猪细小病毒bq-c株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪细小病毒BQ-C株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用，属于生物疫苗领域。本发明的猪细小病毒BQ-C株具有免疫原性好、培养特性好等优点，将本发明的猪细小病毒（BQ-C株）接种ST细胞，收获培养物，用二乙烯亚胺（BEI）灭活后，与法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂混合乳化制成猪细小病毒灭活疫苗。实验证明，使用本发明制备得到的猪细小病毒灭活疫苗免疫初产健康阴性母猪能够预防由猪细小病毒引起的疾病，而且此疫苗具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。

Description

猪细小病毒BQ-C株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用，特别涉及一株自行分离得到的猪细小病毒BQ-C株以及由该病毒株制备得到的灭活疫苗。属于生物疫苗领域。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染的主要是孕猪，特别是初产母猪在怀孕前容易受到感染，引起怀孕母猪流产、产死胎、胎儿木乃伊化等，而母体通常缺乏临诊症状；当然也会引起其他症状。自1966年Mayr和Mahnel发现和证实PPV存在及其致病性以来，国内外学者对其进行了广泛深入的研究。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到了PPV。此后，在各地陆续分离到了数株PPV，目前，人们发现猪细小病毒经常与其他一些病毒，例如猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸***综合征病毒等混合感染，导致断奶仔猪多***综合征、皮炎、呼吸道综合征等，给世界的养猪业造成很大的损失。虽然不同分离株均属于同一血清型，但可以引起多种临床症状，但都以造成繁殖障碍为主。目前，我国经产母猪及种公猪PPV阳性率高达80%以上。

本发明的发明人在2005年从黑龙江省某猪场分离到一株猪细小病毒，经实验室鉴定为强毒株，驯化克隆后的毒株命名为PPV BQ-C株。利用PPV BQ-C株，开展了猪细小病毒病灭活疫苗的研制开发工作，筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的猪细小病毒强毒BQ-C株，选择了最适合该病毒增殖的ST细胞和符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验数据，证明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍，在实验室试验、中间试制的基础上，本发明研制出了猪细小病毒（BQ-C株）灭活疫苗，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍性，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种免疫原性良好、效价稳定的猪细小病毒株；

本发明的目的之二是提供所述的猪细小病毒株在制备疫苗中的应用；

本发明的目的之三是提供一种由所述的猪细小病毒株制备得到的疫苗；

本发明的目的之四是提供所述的疫苗在制备预防猪细小病药物中应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的发明人在2005年从黑龙江省某猪场分离到一株猪细小病毒，经实验室鉴定为强毒株，驯化后的毒株命名为PPV BQ-C株。本发明的PPV BQ-C株是从发生典型猪细小病毒感染的妊娠母猪所产弱仔中分离获得的，因此与分离到的其它毒株相比在细胞上的增殖滴度高，对猪的免疫原性好。经猪睾丸传代细胞系（ST）传代后作为疫苗毒种，效检用强毒为BQ-C株第7～10代。该毒株可以引起ST细胞90%以上感染。

本发明的一种猪细小病毒，为在ST细胞上传代后的第7代病毒株，命名为猪细小病毒BQ-C株，分类命名为猪细小病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6091，保藏日期为2012年5月8日。

本发明还提供了所述的猪细小病毒在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。

本发明的一种猪细小病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的本发明所述的猪细小病毒BQ-C株。

在本发明所述的猪细小病毒灭活疫苗中，优选的，所述的猪细小病毒BQ-C株采用以下方法进行灭活：0.3%的二乙烯亚胺（BEI）在32℃条件下灭活96小时后，加入0.02%硫代硫酸钠终止灭活。

在本发明中，优选的，所述的猪细小病毒灭活疫苗是由15%（v/v）的法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂和85%（v/v）的用二乙烯亚胺（BEI）灭活的猪细小病毒（BQ-C株）乳化后得到。

在本发明中，乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MontanideTMISA15AVG佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂8.5∶1.5的体积配比；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800r/min连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30分钟后分装。

进一步的，本发明还提供了所述的灭活疫苗在制备预防由猪细小病毒引起的疾病的生物制品中的用途。

特别地，所述的疾病为初产健康阴性母猪发生的母猪繁殖障碍。

附图说明

图1为猪细小病毒BQ-C株在ST细胞上培养不同时间后的荧光检测结果；

图1A为接种0小时的荧光检测结果；图1B为接种8小时的荧光检测结果；图1C为接种16小时的荧光检测结果；图1D为接种24小时的荧光检测结果；图1E为接种32小时的荧光检测结果；图1F为接种40小时的荧光检测结果；图1G为接种48小时的荧光检测结果；图1H为接种56小时的荧光检测结果；图1I为正常对照细胞的荧光检测结果。

图2为猪细小病毒BQ-C株感染ST细胞后的一步生长曲线。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1猪细小病毒BQ-C株的分离及培养鉴定

1毒种来源及标准

根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》（2005年版），对制苗用毒种进行了鉴定，现将试行规程（草案）中毒种标准进行以下说明。

1.1毒种来源

制造本品用的毒种为猪细小病毒BQ-C株，是本发明人在2005年从发病猪只自行分离驯化后获得，由于这一毒株是从发生典型猪细小病毒感染的妊娠母猪所产弱仔中分离获得的，并且与分离到的其它毒株相比在细胞上的增殖滴度高，对猪的免疫原性好，所以选择其用于疫苗的生产。经猪睾丸传代细胞系（ST）传代后作为疫苗毒种，效检用强毒为BQ-C株第7～10代。该毒种为在ST细胞上传代后的第7代病毒株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.6091，保藏日期为2012年5月8日。

1.2毒种（CGMCC No.6091）标准

1.2.1红细胞凝集价

取96孔U型微量反应板，每孔加入25μl PBS（0.01mol/L,pH值7.0～7.4），第一列各孔中加入25μl抗原，然后将抗原进行2倍系列稀释，直至第11孔弃去25μl。每孔加入25μl PBS，再加入0.6%豚鼠红细胞悬液25μl，用微量振荡器混合均匀，置室温下作用1小时。判定结果时，以50%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。结果：毒种对豚鼠红细胞凝集价应不低于1:512。

1.2.2病毒含量

以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，随后加入消化分散的ST细胞悬浮，每孔100μl（细胞含量以3×10⁵/mL），并设正常细胞培养对照，置37℃、含5%的CO₂培养箱中培养，逐日观察细胞病变（CPE），细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为CPE。观察7日，记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。结果：每毫升病毒液不低于10^6.0TCID₅₀。

1.2.3毒力

病毒代次为猪细小病毒BQ-C株第7～10代细胞毒；攻毒剂量为每毫升病毒含量应不低于10^6.0TCID₅₀；程序是健康阴性初产母猪4头，妊娠35天后分别肌肉注射猪细小病毒BQ-C株第7～10代细胞毒2ml、滴鼻2ml，病毒含量分别为3×10^6.0TCID₅₀；判定标准是攻毒后40天剖杀，损失胎猪25%以上，或者有3/5母猪发生繁殖障碍（死胎、木乃伊胎和溶胎）。

1.2.4免疫原性

将毒种同步接种ST细胞进行增殖，收获病毒液，用BEI灭活后，加Montanide^TMISA 15AVG佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，用健康易感初产母猪（PPV HI抗体效价不高于1:8）5头，配种前肌肉注射按本规程制苗2ml，在妊娠后35～40日，连同条件相同的对照猪5头，滴鼻并经肌肉注射猪细小病毒BQ-C株各2ml（10^6.0TCID₅₀），攻毒后40日剖杀所有猪。对照组应至少4头出现死胎、木乃伊胎或胎儿重吸收等繁殖障碍症状，免疫组应至少4头保护。

1.2.5纯净检验

对建立的猪细小病毒BQ-C株的原始种子批第10～11代、基础种子批第12～21代和生产种子批第22～25代进行了细菌、霉菌、支原体检验，并对第11、12和24代次毒种进行了外源病毒的检验，结果表明，本发明建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，均纯净。

1.2.6特异性

用DMEM液将毒种稀释至200TCID₅₀/0.1ml，与灭活的抗猪细小病毒特异性血清等量混匀，置37℃中和1小时，同步接种生长良好的ST细胞3瓶（细胞含量以3×10⁵/ml），同时设病毒对照、正常细胞对照和阴性血清对照，置37℃、含5%的CO₂培养箱中，培养5～7日。中和病毒组和正常细胞对照组均应不出现细胞病变（CPE）；病毒对照组和阴性血清对照组均应出现CPE。

1.2.7毒种使用代次

将原始分离得到的猪细小病毒BQ-C株，在ST细胞上连续传40代（即在菌种保藏编号为CGMCC No.6091的菌株基础上连续传代33代），测定了每一代病毒的TCID₅₀，选择第15、20、25、30、35、40代病毒分别灭活后制成疫苗，接种5月龄后备猪，妊娠35天时进行攻毒。结果表明，病毒在ST细胞上传代，第7代以后（包括第7代病毒，即菌种保藏编号为CGMCC No.6091的病毒株）各代次病毒含量稳定，均不低于10^6.0TCID₅₀，且HA效价均在2⁹以上，已经达到了做疫苗的标准。攻毒试验表明，第15、20、25、30代病毒制备的疫苗免疫猪在对BQ-C株攻击的保护性无显著差异，胎儿均健康存活；第35和40代病毒制备的疫苗免疫后攻毒各有2头和1头死胎，而对照组4头猪均有不同程度的死胎和弱胎。根据以上结果，为保证生产毒种良好的免疫原性和安全性，本发明确定了病毒的传代最高次数在27代，原始毒种为7～11代，基础毒种为第12～21代，生产用毒种最高传代次数限制在3代（第22～25代）以内。

1.2.8毒种保存期的确定

将猪细小病毒BQ-C株湿毒保存在-20℃和-70℃下，于保存后不同时间取样进行HA效价和TCID₅₀测定，结果显示湿毒于-20℃冻存18个月、于-70℃保存30个月时毒价开始明显下降；冻干毒保存在-20℃和-70℃下，于保存后每年取样进行HA效价和TCID₅₀测定。结果在-20℃下保存36个月的病毒的效价略有下降，保存48个月病毒的HA效价和TCID₅₀值明显下降，而在-70℃下保存48个月病毒的HA效价和TCID₅₀没有明显的变化，保存60个月下降明显。考虑到在病毒保存时存在的其他不利因素，保证病毒保存期可靠性，所以将猪细小病毒BQ-C株湿毒在-20℃的保存期定为12个月，在-70℃的保存期定为24个月；将猪细小病毒冻干毒在-20℃的保存时间定为36个月；冻干毒在-70℃的保存时间为48个月。

2生产用细胞

2.1细胞来源

ST细胞，购自中国（武汉）典型培养物保藏中心，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。

2.2细胞的选择

在病毒的培养过程中本发明选用了传代细胞系PK-15及ST进行病毒的增殖，结果病毒在ST细胞上的病变时间早，增殖滴度最高，猪细小病毒BQ-C株（CGMCC No.6091）在ST细胞上的增值规律如图1所示，猪细小病毒BQ-C株（CGMCC No.6091）感染ST细胞后的一步生长曲线如图2所示。国外学者也有报告选择ST细胞进行PPV的增殖比较好，所以选择了ST细胞进行病毒的增殖。

2.3细胞系的建立

制苗用细胞系选用ST细胞。传代范围控制在40～55代，本发明建立了原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库。其中原始细胞库共分装55瓶；基础细胞库分装370瓶；工作细胞库共分装了350瓶。对各个代次的细胞都按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒的污染。

2.4细胞系的鉴定

根据现行《中国兽药典》附页中有关“生产、检验用细胞标准”规定进行检验，均符合标准。具体见“ST细胞系的鉴定试验报告”。

实施例2灭活疫苗的制备

猪细小病毒灭活疫苗（BQ-C株）的制备工艺流程是按照目前已经成熟的商品化疫苗制备工艺制备。从实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看，用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定，效检结果完全符合所制定的质量标准。

1病毒液的制备

在病毒繁殖过程中，很多因素会影响细胞及病毒的增殖。PPV的复制需要宿主细胞的DNA聚合酶，最适宜在具有旺盛增殖能力并处于有丝***时期的细胞内增殖，因此在进行PPV繁殖时采用与细胞同时接种培养；培养液中血清浓度显著影响着病毒的复制，经过一系列比较试验，选用细胞培养液血清浓度为10%，维持液血清浓度为2％，能够繁殖稳定的，高滴度的病毒液；另外对培养液的pH值、细胞浓度、病毒接种剂量、收毒时间等进行了比较试验，结果显示病毒繁殖时细胞维持液pH值控制在7.2～7.4之间、接毒时细胞浓度选择1×10⁵个/ml～5×10⁵个/ml、细胞接毒剂量为1%（v/v）病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml以上的种毒、病毒最佳收获时间为72～96小时，均能获得高病毒含量的病毒液。

在本实施例中选用细胞培养液（商品名是1640，购自Gibco公司）中血清浓度为10%，pH值控制在7.3，维持液（商品名是MEM，购自上海沪峰生物科技有限公司）中血清浓度为2％，接毒时ST细胞浓度为3×10⁵个/ml，按照1%（v/v）的细胞接毒剂量接入病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml的猪细小病毒BQ-C株第7代病毒株（菌种保藏编号为CGMCC No.6091）、病毒收获时间为72小时。

2灭活工艺

选择终浓度为0.1％、0.2％、0.3%、0.4%的甲醛溶液和终浓度为0.1％、0.2％、0.3%、0.4%的二乙烯亚胺（BEI）对猪细小病毒进行灭活比较试验，试验结果表明，0.3%的BEI在32℃条件下96小时后可将猪细小病毒完全灭活，而且，试验结果表明BEI对细胞的损伤较小；PPV抗原加入0.3%的甲醛溶液，经37℃灭活48小时亦可达到完全灭活病毒的目的；但甲醛具有强刺激性，如果疫苗中残留游离的甲醛进入动物机体，会产生不良反应。因而最终确定用0.3%的BEI在32℃条件下灭活猪细小病毒96小时后，加入0.02%硫代硫酸钠终止灭活。

3乳化工艺

采用法国赛比克公司的商品化Montanide^TM ISA15AVG佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂8.5∶1.5的体积配比；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800r/min连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30分钟后分装。

4半成品检验质量标准

4.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.2病毒含量测定

以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，随后加入消化分散的ST细胞悬浮，每孔100μl（细胞含量以3×10⁵/ml左右为宜），并设正常细胞培养对照，置37℃、含5%的CO₂培养箱中培养，逐日观察细胞病变（CPE），细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为感染。记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。结果每毫升病毒液不低于10^6.0TCID₅₀。

4.3灭活检验

取灭活后的病毒液，按病毒液与生长液1∶10的比例接种于ST细胞3瓶（细胞含量以3×10⁵/ml），37℃培养观察5日，对无病变者再盲传2代，同时设病毒对照。结果无细胞病变。实验室生产的3批半成品均合格。

5关于成品检验质量标准

5.1安全检验标准

为了保证疫苗的安全性，本发明对实验室制备的5批疫苗先后进行了“对小白鼠的安全性试验”、“对仔猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量（2倍剂量）接种的安全性试验”、“对后备母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量（2倍剂量）接种的安全性试验”、对妊娠母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量（2倍剂量）接种的安全性试验”。试验结果表明：各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次性大剂量接种后，猪只状态均良好，采食饮水正常，无异常反应；疫苗接种后对妊娠母猪的繁殖功能也无明显影响。以上试验均证明疫苗是安全的。通过试验观察本发明总结出只要接种疫苗后21日内不出现局部红肿、溃疡、糜烂以及神经萎缩、采食减少等现象，以后就不会出现因为疫苗接种而引起的不良反应，就可以证明疫苗的安全性。因此，在试行规程（草案）中规定：用10～20kg健康易感仔猪（HI抗体效价不高1:8）2头，各深部肌肉注射疫苗4ml，另取条件相同的2头猪不接种作为对照，连续观察21日。在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。

5.2效力检验标准的制定

5.2.1抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验

将安全性试验合格的1批猪细小病毒灭活疫苗0701，按照不同剂量0.5ml/头份、1ml/头份、2ml/头份、4ml/头份分别免疫3～5月龄的健康后备母猪（PPV HI抗体不高于8），并以10^6.0TCID₅₀/ml PPV BQ-C株第10代强毒4ml攻击，以确定HI抗体滴度与免疫攻毒保护的相关性。试验结果表明，当血清HI抗体效价在不低于1:64时，母猪产仔成活率达97.5%，其中一组中有一头猪仔流产，但PCR检测仔猪病毒分离率为0，也无其他引起母猪流产的病原感染。以上结果表明在试验条件下，当血清HI抗体效价在不低于1:64时，能有效阻止病毒经母体垂直传给胎儿。因而确定疫苗效力检验时，检验标准为免疫28日后，其血清HI抗体效价不低于1:64。

5.2.2最小免疫剂量和最小使用剂量试验

将安全性试验合格的3批猪细小病毒灭活疫苗0701、0702和0703，按照不同剂量0.5ml/头份、1ml/头份、1.5ml/头份、2ml/头份分别免疫3～5月龄的健康后备母猪（PPV HI抗体不高于8），于免疫后28日采血进行HI抗体检测。结果显示，以1ml/头份剂量免疫猪28日后HI抗体效价平均值不低于1:64，而1.5ml/头份以上剂量免疫猪28日后HI抗体效价均不低于1:64。根据HI抗体效价与攻毒保护相关性试验结果，确定在免疫后28天猪细小病毒HI抗体效价达到1:64以上时，可以完全保护怀孕母猪抵抗猪细小病毒强毒的攻击。考虑到疫苗的保存、运输和使用过程中可能存在的效价降低因素。本发明将猪细小病毒灭活疫苗（BQ-C株）的最小免疫剂量确定为1.5ml/头份，使用剂量确定为2.0ml/头份。

5.2.3免疫豚鼠与免疫猪HI抗体相关性试验

将实验室生产的3批猪细小病毒灭活疫苗0701、0702和0703分别免疫豚鼠和猪，进行HI抗体效价检测，分析豚鼠与猪的HI抗体相关性。结果表明，当豚鼠免疫0.5ml/只、猪免疫2ml/只，28日后其血清HI抗体效价均不低于1:64，二者有明显的平行关系。试验结果证明可以用实验动物豚鼠代替靶动物（猪）进行效力检验。

因此，根据以上结果，本发明将本产品的效力检验标准定为：

用体重350g～400g成年豚鼠（PPV HI抗体效价不高于1:8）5只，各肌肉注射疫苗0.5ml，28日后，连同对照豚鼠4只，一并采血，测定PPV HI抗体效价。对照豚鼠HI抗体效价应不高于1:8，免疫豚鼠至少应有4只出现抗体反应，且HI抗体效价应不低于1:64。

用3月龄健康易感猪（PPV HI抗体效价不高于1:8）5头，各深部肌肉注射疫苗2ml，28日后，连同对照猪4头，一并采血，测定PPV HI抗体效价。对照猪HI抗体效价应不高于8，注苗猪应全部出现抗体反应，且HI抗体效价应不低于1:64。

6抗体消长规律与免疫持续期试验

将安全性试验合格的3批猪细小病毒灭活疫苗0701、0702和0703分别免疫健康后备母猪、经产猪和公猪。为进一步掌握免疫效力及免疫持续期，制定合理的免疫程序，保证免疫猪群保持高而持久的抗体水平，对免疫猪不同时间进行抗体检测，以掌握其抗体消长规律。

试验结果表明，3～5月龄初产母猪免疫2ml/头份，2～3周后加强免疫一次，经产母猪于配种前一个月免疫2ml/头份，28日后其血清HI抗体不低于1:64，免疫后抗体高峰在2～6个月内，其后抗体水平逐渐下降，至9个月仍达1:64，为保证疫苗的免疫保护效果，确定其免疫持续期为7个月。

7免疫程序的确定

根据仔猪母源抗体的持续时间，初次免疫应在5～6月龄，因为这时母源抗体已下降到较低水平（HI抗体效价低于1:64）。而且后备母猪配种时间一般为6月龄，这样在5～6月龄时免疫也正好可以避免母猪在妊娠时遭受强毒攻击。对于经产母猪由于其体内抗体的持续存在，猪细小病毒对其往往不构成威胁，所以在以前一般不进行免疫，但近几年由于临床发病的复杂性，如猪细小病毒往往会加重猪圆环病毒的感染等，所以本发明主张对经产母猪在妊娠前进行免疫，这样可以保护妊娠母猪在整个妊娠期避免猪细小病毒强毒的攻击。

根据后备母猪的配种时间、后备母猪免疫后的抗体消长规律、免疫期，同时结合临床上猪细小病毒感染的实际情况，本发明确定了猪细小病毒灭活疫苗（BQ-C株）的免疫程序为：初产母猪5～6月龄免疫1次，2～4周后加强免疫1次；经产母猪于配种前3～4周免疫1次；公猪每年免疫两次。每次免疫均为2ml/头。

8疫苗的保存期

本发明对实验室制备的3批灭活疫苗（0701、0702、0703）保存期进行了试验研究，将3批疫苗在2～8℃条件下保存9、12、15、18个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。结果显示，3批疫苗在2～8℃条件下保存18个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。效力检验中0701批疫苗保存18个月样品免疫豚鼠后有一只豚鼠HI抗体效价为1:32；0701和0702批疫苗保存18个月样品免疫猪后均有一头猪HI抗体效价为1:32，但免疫猪平均HI抗体水平为1:64，考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的保存期定为2～8℃条件下保存15个月。

9与国内同类商品苗的免疫效力比较

将实验室试制的3批疫苗0701、0702和0703与市售疫苗A（批号：20071228）和B（批号：20071205），分别免疫350g～400g健康豚鼠及5～6月龄健康后备猪，28日后其血清HI抗体效价均不小于1:64，达到攻毒保护要求，实验室制备的疫苗HI抗体平均值略高于市售A疫苗，明显高于市售B疫苗。

分别在免疫前、免疫后3、6、9、12个月静脉采血分离血清，检测抗体产生情况。结果表明：在免疫后6个月内，实验室试制的疫苗和市售A和B疫苗免疫猪，HI抗体效价均在1:64以上，均能达到攻毒保护要求。而6个月后市售B疫苗免疫猪HI抗体下降明显。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.猪细小病毒（Porcine parvovirus），命名为猪细小病毒BQ-C株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6091。

2.权利要求1所述的猪细小病毒在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。

3.一种猪细小病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的猪细小病毒。

4.如权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于所述的灭活是指将权利要求1所述的猪细小病毒采用0.3%的二乙烯亚胺在32℃条件下灭活96小时后，加入0.02%硫代硫酸钠终止灭活。

5.权利要求3或4所述的灭活疫苗在制备预防由猪细小病毒引起的疾病的生物制品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的疾病为初产健康阴性母猪发生的母猪繁殖障碍。

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