CN102716487A - 人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂及其应用。具体地，本发明公开了可有效促进人参皂苷-Rd透皮吸收的渗透促进剂及其组合，该渗透促进剂适用于制备人参皂苷-Rd的透皮吸收剂型或经皮吸收剂型。本发明还涉及含有所述渗透促进剂的人参皂苷-Rd的药物制剂。

Description

人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂及其应用

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，更具体地，本发明涉及人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂及其应用。本发明还涉及含有所述渗透促进剂的人参皂苷-Rd的药物制剂。

背景技术

人参皂苷-Rd是从三七总皂苷中分离提取出来的单体，三七总皂苷是五加科植物三七的有效成分。人参皂苷-Rd还广泛存在于五加科植物人参的根、花蕾、叶、芦头、茎中。同时人参皂苷-Rd也是二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物。

人参皂苷-Rd(Ginsenoside Rd)是四环三萜类衍生物，属原人参二醇型皂苷。它的中文化学名为20-(S)-原人参二醇-3[O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，英文化学名为20(S)-Protopanaxadiol3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-β-glucopyranoside，分子式：C₄₈H₈₂O₁₈·3H₂O，相对分子量1001.20；外观为白色至微黄色粉末，无臭，易溶于甲醇、乙醇、丙二醇及正丁醇，溶于丙酮、氯仿及热水。主要理化常数为：熔点206-209℃，在甲醇介质中紫外吸收λmax＝203nm。人参皂苷-Rd的结构式见图1。

已有的研究表明，人参皂苷-Rd具有多种医药功效，其中包括：

(a)保护心脑血管的作用。已通过微循环、血浆复钙试验证实人参皂苷-Rd是三七等中药具有活血化瘀作用的有效成分。广东泰和医药科技有限公司所做的药效学实验也证实，人参皂苷-Rd是一种血管平滑肌受体操纵Ca²⁺通道抑制剂，与三七总皂苷具有相同的作用靶点，即能通过受体操纵途径特异性地阻断受体操纵Ca²⁺通道，是活血化瘀药的有效单体。动物实验也表明，人参皂苷-Rd能明显抑制高血压脑血管重构，降低易卒中型自发性高血压大鼠(SHR-SP)中风率及死亡率，保护脑细胞。

(b)免疫调节作用。人参皂苷-Rd可以显著提高刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠脾细胞白细胞介素-2(IL-2)、干扰素、IL-4和IL-10mRNA表达，表明人参皂苷Rd有免疫佐剂活性。动物试验还证实人参皂苷-Rd有免疫抑制作用，能明显抑制小鼠迟发型超敏反应、ConA诱导的人T淋巴细胞增殖及大鼠同种异体皮肤移植后的免疫排斥反应。

(c)抗炎作用。人参皂苷-Rd(100μg/ml)可以诱导环氧合酶COX-2的表达。动物试验证实，人参皂苷-Rd静脉和肌肉注射均有显著的抗炎作用，能显著抑制角叉菜胶引起的大鼠及小鼠足肿，使足肿胀度明显下降。

(d)镇痛作用。人参皂苷-Rd具有抗伤害性感受能力，并且呈现剂量依赖性关系，但不会影响到运动功能；且人参皂苷-Rd抗伤害性感受不被阿片受体阻断剂纳洛酮阻滞，说明其主要抑制化学成因疼痛，而对非阿片受体引起的热痛无效。

(e)抗自由基作用。缺血再灌注体内外实验中发现，人参皂苷-Rd可以保护相关酶系，对氧化应激有抑制作用，具有抗氧化活性。已发现人参皂苷-Rd可以修复损坏的自由基清除***，减少自由基诱导的损伤。

(f)神经***保护作用。人参皂苷-Rd对突变型模型神经干细胞球分化为星形胶质细胞有显著的促进作用，从而保护中枢神经***。此外，人参皂苷-Rd能够改善运动***功能，减小纹状体损伤面积，具有神经保护作用。

药物应用于皮肤上后，穿过角质层，扩散通过皮肤，由毛细血管吸收转运至局部靶组织或全身血液循环的过程称为透皮吸收或经皮吸收。经皮给药***(transdermal drug delivery system，TDDS)一般是指经皮肤给药而起全身治疗作用的控释制剂，是经皮给药的新剂型，包括软膏、硬膏、贴剂、巴布剂，还可以是涂剂和气雾剂等。

经皮给药***具有超越一般给药方法的独特优点：(1)提高药物在体内的预见性，可避免口服给药可能发生的肝脏首过效应和药物在胃肠道的降解，药物吸收不受胃肠道影响，比口服给药更稳定地直接进入血流，减少用药的个体差异，也可减少药物对胃肠道的刺激作用，提高制剂的生物利用度和治疗效果；(2)一次给药可以长时间使药物以恒定速率进入体内，减少给药次数，延长给药间隔；(3)可按需要的速率将药物输入体内，维持恒定的血药浓度，避免口服给药等引起的血药浓度峰谷现象，降低了毒副作用，是具有更好性能的药物制剂；(4)使用方便，可以随时中断给药，去掉给药***后，血药浓度下降，减少了口服或注射给药的危险性，特别适合于婴儿、老人或不宜口服的病人。

但是，并不是所有的药物都适于开发成经皮给药***，选择经皮给药所考虑的最主要因素是临床的合理性。药物在胃肠道的降解、通过肝脏的首过效应、生物半衰期短和需长期给药等都是应考虑的因素。其次，由于皮肤(特别是角质层)对药物透皮吸收的屏障作用，除了少数剂量小和具有适宜溶解性的小分子药物，大部分药物的透皮速率都满足不了治疗要求，因此克服皮肤屏障作用，提高药物的透皮速率，促进药物在一定时间内透皮渗透达到治疗量也是开发经皮给药***的关键。

促进药物经皮渗透主要是通过提高药物通过皮肤的能力、降低皮肤的屏障性能和利用微粒载体帮助药物穿透皮肤等途径而实现的。根据不同药物，促进药物经皮渗透的方法有多种，但主要有：(1)渗透促进剂法；(2)超声波渗透法；(3)离子电渗法。

应用渗透促进剂是目前研究最多的降低皮肤屏障性能的方法。渗透促进剂是指能够透入皮肤降低药物透过皮肤阻力的材料，作用原理可能是通过增加类脂骨架无序性二增加皮肤的非均匀性，打开新的渗透途径。

理想的渗透促进剂应具备的条件包括：(1)对皮肤及机体无药理作用、无毒、无刺激性及无过敏反应；(2)起效快，应用后立即起作用，具有预期作用时间，能可逆地降低皮肤的屏障性能，而又不损害皮肤的其它功能，去除后皮肤能恢复正常的功能；(3)不引起体内营养物质及水分通过皮肤损失；(4)理化性质稳定，与制剂中所有组分不出现配伍禁忌；不与药物及其他附加剂产生物理化学作用；(5)无色、无臭、无刺激性气味。

渗透促进剂种类繁多，化学结构不同，对不同有效成分的促渗透作用也不相同。例如，尿素是一种常用的渗透促进剂。已报道，1％尿素可使氟比洛芬经皮渗透速率提高1.1倍(田薇，王茂义，杨亚惠，等.促渗剂对布洛芬透皮吸收速率的影响.中国医药工业杂志，1996；27(4)：161-162)。

目前，虽然人参皂苷-Rd的药物组合物有多种剂型，常见剂型是口服剂型和注射剂型。然而，这些剂型也存在一些缺点。

例如，人参皂苷-Rd临床现有制剂只有注射剂，规格较小，仅10mg/支，且限制于静脉滴注，不能直接静脉注射给药。肌肉注射刺激性大，且有一定副作用。此外，人参皂苷-Rd作为三七中活血化瘀药的有效成分，主要用于脑出血、脑血栓形成、脑梗塞等脑血管疾病的治疗。若人参皂苷-Rd用于脑梗塞等脑血管疾病的治疗，静脉滴注给药途径只能用于此类疾病的急性期，而在疾病的预防和恢复期，静脉滴注的给药方式难以长期应用。

此外，对于口服而言，研究表明，三七提取物及人参皂苷-Rd等18种单体纯品对大鼠灌胃，发现结肠内有大量脱糖基皂苷存在，血浆中的主要皂苷是Ra₃、Rb₁和Rd，但血浆中药物浓度很低，平均口服生物利用度仅0.1％-0.2％(Liu H F，etal.Absorption and disposition of ginsenosides after oral administration of Panaxnotoginseng extract to rats.Drug Metab Dispos，2009；37：2090-8)。因此人参皂苷-Rd口服生物利用度低，不宜通过口服途径给药治疗全身性疾病。

经皮给药制剂具有超于一般给药方法的独特优点，可以避免口服给药生物利用度低和注射给药的一系列问题，而且可以长期给药，尤其适用于脑血管疾病预防和恢复期的长期治疗，但是，目前本领域未见令人满意的透皮吸收或经皮吸收剂型。

因此，本领域迫切需要开发新的能够有效通过透皮给药或经皮给药的人参皂苷-Rd的制剂。

发明内容

本发明的一个目的就是提供适用于制备人参皂苷-Rd经皮给药制剂的渗透促进剂及其组合。

本发明的另一个目的就是提供有效的人参皂苷-Rd经皮给药制剂或透皮给药制剂的制备方法。

本发明的另一个目的就是提供有效的人参皂苷-Rd经皮给药制剂或透皮给药制剂及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂，其中所述的渗透促进剂选自下组：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂含有氮酮、薄荷醇、月桂醇中的两种或三种物质。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂同时含有氮酮、薄荷醇和月桂醇。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂中各组分的含量如下：

0-10重量份数的氮酮；

0-15重量份数的薄荷醇；

0-15重量份数的月桂醇；

附加条件是至少一种组分的含量不等于0重量份数。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂中各组分的含量如下：

1-5重量份数的氮酮；

0.5-10重量份数的薄荷醇；

0.5-10重量份数的月桂醇。

在本发明的第二方面，提供了一种物质的用途，所述物质选自下组：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合，其中所述的物质被用于制备促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂或药物组合物。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(a)人参皂苷-Rd；(b)药学上可接受的载体；和(c)本发明第一方面中所述的人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为透皮吸收剂型或经皮吸收剂型。

更佳地，所述的药物组合物的剂型包括：软膏、硬膏、贴剂、巴布剂、涂剂或气雾剂。

在另一优选例中，所述的药物还含有丙二醇作为人参皂苷-Rd的药物溶媒。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂选自下组：

(i)1.5-2.5wt％氮酮+2.5-7.5wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇；

(ii)2-4wt％氮酮+0.5-2wt％薄荷醇+2.5-7.5wt％月桂醇；或

(iii)2-4wt％氮酮+2-4wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂选自下组：

(i)1.5-2.5体积％氮酮+2.5-7.5wt％薄荷醇+0.5-2体积％月桂醇；

(ii)2-4体积％氮酮+0.5-2wt％薄荷醇+2.5-7.5体积％月桂醇；或

(iii)2-4体积％氮酮+2-4wt％薄荷醇+0.5-2体积％月桂醇。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂选自下组：

(i)2体积％氮酮+5重量％薄荷醇+1体积％月桂醇；

(ii)3体积％氮酮+1重量％薄荷醇+5体积％月桂醇；或

(iii)3体积％氮酮+3重量％薄荷醇+1体积％月桂醇。

在本发明的第四方面，提供了一种提高人参皂苷-Rd或含人参皂苷-Rd的制剂中的人参皂苷-Rd的体外透皮吸收的方法，所述的方法包括：向人参皂苷-Rd或所述制剂中添加选自下组的渗透促进剂：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合。

在另一优选例中，所述的制剂是药物制剂，更佳地所述的制剂包括：软膏、硬膏、贴剂、巴布剂、涂剂或气雾剂。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂选自下组：

(i)1.5-2.5wt％氮酮+2.5-7.5wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇；

(ii)2-4wt％氮酮+0.5-2wt％薄荷醇+2.5-7.5wt％月桂醇；或

(iii)2-4wt％氮酮+2-4wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇。

在另一优选例中，所述的渗透促进剂选自下组：

(a)2体积％氮酮+5重量％薄荷醇+1体积％月桂醇；

(b)3体积％氮酮+1重量％薄荷醇+5体积％月桂醇；

(c)3体积％氮酮+3重量％薄荷醇+1体积％月桂醇。

在本发明的第五方面，提供了一种由氮酮、薄荷醇和月桂醇构成的混合物，所述混合物中各组分比例如下：

1-5重量份数的氮酮；

0.5-10重量份数的薄荷醇；

0.5-10重量份数的月桂醇。

在另一优选例中，所述的混合物中各组分如下：

1.5-4重量份数的氮酮；

0.75-7.5重量份数的薄荷醇；

0.75-7.5重量份数的月桂醇。

在另一优选例中，所述的混合物的配方如下：

(a)2体积份数氮酮+5重量份数薄荷醇+1体积份数月桂醇；

(b)3体积份数氮酮+1重量份数薄荷醇+5体积份数月桂醇；

(c)3体积份数氮酮+3重量份数薄荷醇+1体积份数月桂醇。

在本发明的第六方面，还提供上述混合物的用途，它被用于制备促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的药物组合物；或者用于制备或用作促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂。

在本发明中，当1重量份数＝1克时，则1体积份数＝1毫升。因此，1体积份数氮酮可对应于1毫升氮酮，1重量份数薄荷醇可对应于1g薄荷醇，而1体积份数月桂醇可对应于1毫升月桂醇。其他各重量份数或体积份数可依次类推。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人参皂苷-Rd的化学结构。

图2显示了人参皂苷-Rd的标准曲线。

图3显示了溶剂(甲醇/生理盐水，1/1，v/v)的HPLC图。

图4显示了人参皂苷-Rd在溶剂(甲醇/生理盐水，1/1，v/v)中的HPLC图。

图5显示了不加渗透促进剂时接受液的HPLC图。

图6显示了渗透促进剂为2％氮酮时接受液中人参皂苷-Rd的HPLC图。

图7显示了渗透促进剂为3％薄荷醇时接受液中人参皂苷-Rd的HPLC图。

图8显示了渗透促进剂为3％月桂醇时接受液中人参皂苷-Rd的HPLC图。

图9显示了渗透促进剂2％氮酮单用和联合应用(2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)促进人参皂苷-Rd体外经皮渗透吸收的曲线。

图10显示了本发明一个实例中，人参皂苷-Rd贴剂制备工艺I的流程图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，考察和筛选了各种不同种类的渗透促进剂以及渗透促进剂联合应用对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响，筛选出了能够有效促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂，并且确定了渗透促进效果最好的渗透促进剂组合。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人采用改良的Franz扩散池，在体外透皮吸收试验装置上，以离体小鼠皮肤为渗透屏障，生理盐水为接收液，高效液相色谱法测定各时间点接受液中人参皂苷-Rd的含量，考察不同种类渗透促进剂以及渗透促进剂联合应用对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响。

与对照比较，5％松节油、3％丁香油、5％N-甲基吡咯烷酮、1％尿素、3％冰片没有渗透促进作用，2％氮酮、3％薄荷醇、5％月桂醇对人参皂苷-Rd体外透皮吸收有较好的促进作用，促进强度依次为2％氮酮＞3％薄荷醇＞3％月桂醇。

此外，氮酮、薄荷醇、月桂醇以一定比例组合时，可以提供更佳的促进渗透作用。例如，将这三种渗透促进剂以一定百分浓度联合应用(2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇、3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇或3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇)时，可产生协同促进作用。2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇组合、3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇组合以及3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇组合，12h时单位面积累积渗透量分别为3404.18μg/cm²、2832.54μg/cm²、2932.53μg/cm²。

为了验证，本发明采用角叉菜胶所致小鼠足肿胀的急性非感染性炎症模型，观察人参皂苷-Rd经皮吸收给药的抗炎作用。即以聚丙烯酸酯EUDRAGIT E100为压敏胶、2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇为渗透促进剂，配以交联剂(琥珀酸)、增塑剂(葵二酸二丁酯)，制备人参皂苷-Rd贴剂，并采用角叉菜胶诱发小鼠足肿胀模型，设立模型对照组，阳性对照组，人参皂苷-Rd肌肉注射组以及人参皂苷-Rd经皮给药组，考察人参皂苷-Rd经皮吸收给药的抗炎活性。

结果表明，人参皂苷-Rd肌肉注射(小鼠剂量为50mg/kg)和经皮吸收给药(小鼠剂量约为1mg/只，50mg/kg)均能显著抑制角叉菜胶诱发的小鼠足肿，肿胀抑制率分别为41.49％和26.78％，与模型对照组比较，均有显著性差异)(P＜0.01)。因此，人参皂苷-Rd经皮吸收给药与肌注给药一样，均是有效的，均具有显著的抗炎作用。

主要成分

如本文所用，术语“氮酮”指1-正十二烷基氮杂环庚-2-酮，分子式：C₁₈H₃₅NO，分子量约281，外观为无色透明油状液体。比重为约0.904-0.914。

如本文所用，术语“月桂醇(lauryl alcohol)”指1-十二烷醇，分子式C₁₂H₂₆O，其分子量约186。淡黄色油状物或低熔点固体。有特殊气味，比重0.8309(24/4℃)，熔点24℃，沸点259℃，不溶于水，溶于乙醇、***。

如本文所用，术语“薄荷醇(1-menthol)”指[1R-(1α，2β，5α)]-5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇；分子式：C₁₀H₂₀O；分子量约156，比重0.890(15/15℃)。中文名称还包括薄荷脑；薄荷冰；萜醇-[3]；对烷-3-醇等。

人参皂苷-Rd和丙二醇水溶液

本发明中，术语“人参皂苷-Rd”、“本发明的药物活性物质”和“活性药物”可互换使用，均指具有图1所示结构式的化合物。

本发明所用的人参皂苷-Rd，可自中药五加科植物(例如三七、人参)中经多步分离得到、可通过化学合成的方法合成，也可由其他人参皂苷(如Rb₁、Rb₂、Rc、Re)转化而来，或由绞股蓝皂苷-5经绞股蓝皂苷-α-鼠李糖苷酶转化得到。在本发明中，优选使用纯度为90％以上的人参皂苷-Rd，优选纯度为95-99.99wt％，更优选纯度为95-99wt％。

本发明中，术语“丙二醇”是指1，2-丙二醇，“丙二醇水溶液”是指由丙二醇和水组成的复合溶剂。

药物组合物

在本发明中提供了一种药物组合物，其含有本发明的人参皂苷-Rd、药学上可接受的载体、以及本发明上述的渗透促进剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，其本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后或给予保健品后没有过分的毒性。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991年)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。

在本发明的一个实施方式中，以所述药物组合物的总重量为基准计，所述药物组合物中包含0.01～100wt％本发明的人参皂苷-Rd溶液，优选0.1～99.9wt％，更优选1-99wt％。(此处wt％指人参皂苷-Rd溶液在药物组合物中所占的重量百分比，重量单位为克)。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物中包含0.5-7.5g％(W/V)的本发明的人参皂苷-Rd溶液，优选0.5-7.5g％(W/V)，更优选0.5-2.5g％(W/V)。(其中的单位(W/V)是指每100ml药物组合物中含有的人参皂苷-Rd溶液的克数)。在本发明的另一实施方式中，以药物组合物总体积为基准计，所述药物组合物中所含人参皂苷-Rd的量为5-100mg/ml，更优选5-75mg/ml，最优选5-25mg/ml。

本发明的药物组合物为外用制剂形式，包括

透皮吸收剂型或经皮吸收剂型。代表性的剂型包括(但并不限于)：软膏、硬膏、贴剂、巴布剂、涂剂或气雾剂。

在本发明的另一实施方式中，所述药物组合物还包含其它活性物质或可与这些活性物质联用，所述其它活性物质选自(但并不限于)：抗炎药、免疫抑制剂、急性缺血性脑卒中治疗剂、抗器官移植排斥剂、抗溃疡性结肠炎药、抗血小板药、纤维蛋白溶解药、抗凝血药、脑保护药。

本发明的药物组合物可用常规方法和设备进行制备。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的渗透促进剂可以有效促进人参皂苷-Rd的透皮吸收；

(b)本发明的透皮或经皮给药制剂可以避免口服给药生物利用度低，适合长期给药，尤其适用于脑血管疾病预防和恢复期的长期治疗；

(c)本发明的透皮吸收渗透促进剂的组合物有使人参皂苷Rd释放缓慢，在血浆中存在时间长而使其作用持续时间长的特点，可用于慢性炎症及自身免疫性疾病的长期治疗，如可用于溃疡性结肠炎、器官移植排斥的长期治疗，以及风湿性关节炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、风湿与类风湿性脊柱炎的长期治疗。

(d)本发明的另一个特点是透皮或经皮给药制剂临床用药方便，病人的依从性更好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本申请和实施例中，除非另外说明，否则氮酮和月桂醇的百分比和份数为体积百分比和体积份数，薄荷醇的百分比和份数为重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

人参皂苷-Rd的体外透皮吸收的渗透促进剂的筛选

1材料与仪器

1.1动物

昆明种小鼠，

，体重18-22g，购自兰州大学实验动物中心，合格证号：SCXK(甘)2005-0007。

1.2药品与试剂

人参皂苷-Rd，由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号：080312。

氮酮，上海元越化工有限公司，分析纯；

薄荷醇，上海中秦化学试剂有限公司，分析纯，批号：20081225；

N-甲基吡咯烷酮，天津市博迪化工有限公司，分析纯；

月桂醇，天津市光复精细化工研究所，分析纯；

尿素，上海建信化工有限公司试剂厂，分析纯；

松节油，天津市红岩化学试剂厂，分析纯，批号：20060602；

丁香油，国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：F20060403；

冰片，四川青神康华制药有限公司，分析纯；

1.3仪器

TT-6(B)透皮吸收试验仪(包括HC-188加热水循环器、MSE-1600磁力搅拌器、TT-6(B)有机玻璃水箱、Franz扩散池)，由天津市正通科技有限公司提供；岛津公司高效液相色谱仪LC-10AT，SPD-M10AvP二极管阵列检测器，SIL-HT自动进样器，DGU-HA在线脱气机，LC-10ATvP输液泵，CTO-10AvP柱温箱，Solution色谱工作站。722s可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品。XW-80A涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂产品；电子天平，型号：FA1604S，上海天平仪器厂制造。

2方法

2.1人参皂苷-Rd测定方法的建立

2.1.1测定条件

色谱柱：岛津VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-乙腈-10mM乙酸胺(70/10/20，v/v/v)；流速0.450ml/min；检测波长：203nm；柱温：25℃；室温：20-23℃；进样量：10μl；保留时间：11.40-12.20min。

2.1.2标准曲线

用甲醇/生理盐水(1/1，v/v)准确配制浓度为1mg/ml的人参皂苷-Rd贮备液。进一步用该溶剂稀释成浓度为5、10、100、300、500μg/ml的标准工作液。标准工作液经0.22μm滤膜过滤，取10μl进样，按上述色谱条件测定相应的人参皂苷-Rd色谱峰面积。以测得的人参皂甙-Rd色谱峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得人参皂苷-Rd在溶剂(甲醇/生理盐水，1/1，v/v)中的标准曲线方程为A＝3678.9C+28603(r＝0.9995，n＝5，图2)，表明人参皂苷-Rd浓度在10-500μg/ml范围内线性关系良好，而且，从图3和图4中可明显看出，在203nm处，人参皂苷-Rd在溶剂(甲醇/生理盐水，1/1，v/v)中的色谱吸收峰不会受到溶剂色谱吸收峰的干扰。

2.1.3方法精密度和回收率

按2.1.2项下配制方法配20、100、400μg/ml的人参皂苷-Rd样品溶液，连续测定其峰面积，依据标准曲线方程换算，得回收率分别为102.60％、102.56％和98.56％(n＝6)，日内RSD分别为4.11％、4.17％、2.09％(n＝3)，日间RSD分别为3.42％、7.76％、1.50％(n＝3)。

2.2体外透皮吸收实验接受液中蛋白质的定量研究

2.2.1蛋白质试剂

称取考马斯亮蓝G-25025mg溶于12.5ml 95％的乙醇，加入25ml 85％(W/V)磷酸，将溶液用双蒸水稀释到250ml，滤纸过滤，4℃保存备用。

2.2.2蛋白质溶液标准曲线

准确配制浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白贮备液，分别取上述溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml加双蒸水至1ml，即得0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。取标准蛋白质溶液0.1ml，加入5ml蛋白试剂，充分振荡混合，以0.1ml双蒸水加5ml蛋白试剂作为空白对照，595nm测定光吸收值Y，以光吸收值(Y)对标准蛋白质溶液浓度(c)进行直线回归，得标准曲线方程为Y＝0.5998c+0.0058(r＝0.9995，n＝8)。

2.2.3接受液中蛋白质的定量研究

依2.4.2.1项下方法，供给体中只加入1，2-丙二醇溶液，在相同条件下于12h收集样品，按蛋白质溶液标准曲线项下方法，取待测样品0.1ml，加入5ml蛋白质试剂，充分振荡混合，595nm处测定溶液吸光度，代入蛋白质溶液标准曲线计算蛋白质含量。测得接受液中蛋白质含量分别是37.07、45.42、60.44、10.35、27.05、7.01、15.36μg/ml，可见接受液中蛋白质含量很低，表明各个时间点所取的样品不除蛋白质，可以直接采用高效液相色谱进行药物的检测和分析。

2.3药物溶媒的选择依据

人参皂苷-Rd难溶于水，易溶于甲醇、乙醇及丙二醇，在丙二醇中可溶解达150mg/ml，丙二醇是有机溶剂类渗透促进剂，作用原理为溶胀角质层中的类脂，增加药物的溶解度，并且丙二醇用作亲脂性药物的溶剂所产生的渗透促进作用往往比用于亲水性药物好，在体外透皮吸收试验中，丙二醇单独应用时促进作用不明显，常作为一种优良的助渗剂，与月桂氮酮、油酸、月桂醇等合用，可发挥协同作用，产生显著的渗透促进作用，从而减少渗透促进剂的用量，降低毒性反应，又可使主药发挥最佳效能，所以选择丙二醇为药物溶媒。

2.4体外经皮透过实验

2.4.1离体皮肤的制备

将松香-石蜡按1∶1(w/w)在沸水浴中溶解、混匀，放置至室温，配制成脱毛剂。脱毛剂在每次临用前于沸水浴中重新溶解，置室温到即将凝固时使用。取健康昆明种小鼠，

，体重18-22g，***麻醉，固定，用脱毛剂脱去腹部皮肤的毛。然后用生理盐水擦拭干净，处死后迅速剥取腹部皮肤(2cm×1cm)，去除皮下组织及脂肪，用生理盐水反复冲洗干净后检查皮肤是否有破损，无破损则置生理盐水中，4℃保存备用(1d内用完)。

2.4.2实验方法

2.4.2.1体外透皮吸收实验装置

采用改良的Franz扩散池做渗透装置，从冰箱中取出备用鼠皮，恢复至室温，用生理盐水冲洗，滤纸吸干表面液体，取适当面积(1cm×1cm)的鼠皮夹在扩散池盖(供给体)与扩散池(接受体)之间。扩散面积为0.636cm²(扩散池内径为0.900cm)，接受体容积为500ml，皮肤角质层面向供给体，用生理盐水作接受液，皮肤内表面沉浸在接受液中。以20mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液为对照(经测试无药物透过)，在扩散池中分别加入对照溶液以及不同的样品1ml，(37+0.1)℃恒温水浴，400r/min恒速磁力搅拌，分别于不同时间点取样05ml，同时加入同体积生理盐水。每次取样05ml，加甲醇05ml稀释至1ml，涡旋震荡混匀，置4℃保存待测。待测样品经0.22μm滤膜过滤，取10μl进样分析，将所测得的药物峰面积代入人参皂苷-Rd标准曲线求人参皂苷-Rd浓度，乘以稀释倍数即得接受液中人参皂苷-Rd的浓度，并计算单位面积累积渗透量。而且，从图5、图6、图7和图8中可明显看出，在203nm处，接受液中人参皂苷-Rd的色谱吸收峰不会受到接受液以及渗透促进剂色谱吸收峰的干扰。

2.4.2.2渗透促进剂的初步筛选

依2.4.2.1项下方法，扩散池中分别加入20mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液(其中分别含5％松节油、3％丁香油、2％氮酮、3％薄荷醇、5％N-甲基吡咯烷酮、3％月桂醇、1％尿素、3％冰片)，在4h、8h、12h取样测定。每个样品重复两次，从中初步筛选有促进作用的渗透促进剂。

2.4.2.3氮酮、薄荷醇、月桂醇单用时渗透促进效果的比较

依2.4.2.1项下方法，根据初步筛选结果，扩散池中加入样品为20mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液(其中分别加入不同百分浓度的2％氮酮、3％薄荷醇、3％月桂醇)，在4h、8h、12h取样测定。每个样品重复三次，比较氮酮、月桂醇、薄荷醇单用时的渗透促进效果。

2.4.2.4氮酮、薄荷醇、月桂醇联合应用时渗透促进效果的比较

依2.4.2.1项下方法，根据初步筛选结果，采用正交试验方法，扩散池中加入20mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液(其中分别含氮酮、薄荷醇和月桂醇不同百分浓度的正交组合，见表1和表2)，在4h、8h、12h取样测定。每个样品重复三次，比较氮酮、月桂醇、薄荷醇以不同百分浓度联合应用时的渗透促进效果。

表1正交试验因素水平表

表2 L₉(3⁴)正交试验表

2.4.2.5最佳渗透促进剂的渗透参数计算

依2.4.2.1项下方法，扩散池中加入的样品为20 mg/l人参皂苷-Rd丙二醇溶液(其中分别含2％氮酮和2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)，在2h、4h、6h、8h、10h、12h取样测定。每个样品重复五次，求算各自的渗透参数。

2.4.3  数据处理

2.4.3.1人参皂苷-Rd单位面积累计渗透量的的计算

因为接受池连续取样并每次加入空白接受液，使各测得值较真实值偏小，故测定每个样品含量后，要进行浓度校正，根据Fick扩散定律，校正公式为：

$C_r=C_n+\frac{V_i}{V}\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i$

则单位面积累积渗透量按下式计算：

$Q=\frac{C_r\×V}{A}=\frac{C_{n}V+V_i\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i}{A}$

式中Q为单位面积累积渗透量(μg/cm²)；Cr为校正的浓度(μg/ml)；Cn为n时间点的接受液中人参皂苷-Rd的浓度(μg/ml)；V为取样体积(ml)；V₀为接受体中接受液的总体积(ml)。本实验中，A＝0.636cm²，V＝05ml，V₀＝5ml。

2.4.3.2透皮吸收曲线的绘制

以单位面积累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标，绘制人参皂苷-Rd透皮吸收曲线。

2.4.3.3渗透速度与渗透系数的计算

将透皮吸收曲线尾部直线部分的Q-t数据进行线性回归，求得直线斜率即为渗透速率J(μg/cm²/h)。将渗透速率除以给药池的药物初始浓度(C₀＝20mg/ml)得渗透系数P(cm/h)。曲线尾部的直线部分外推与横坐标相交，求得滞后时间T_lag(h)。

2.4.3.4统计学处理

采用Excell 2003软件进行统计学分析，所得数据用均值±标准差表示。

3实验结果

3.1渗透促进剂的初步筛选

人参皂苷-Rd体外透皮吸收实验，加入对照溶液和分别含不同的渗透促进剂的人参皂苷-Rd溶液，不同时间点(4h、8h、12h)接受液中的药物含量见表3。

结果显示：不加渗透促进剂的情况下，人参皂苷-Rd体外经皮不能透过；5％松节油、3％丁香油、5％N-甲基吡咯烷酮、1％尿素、3％冰片对人参皂苷-Rd体外透皮吸收没有促进作用。2％氮酮、3％薄荷醇、3％月桂醇有不同程度的渗透促进作用，促进强度依次为2％氮酮＞3％薄荷醇＞3％月桂醇。

表3几种渗透促进剂促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的初步筛选结果(n＝2)

3.2有效的渗透促进剂单用时的渗透促进效果

人参皂苷-Rd丙二醇溶液中分别含2％氮酮、3％薄荷醇、3％月桂醇，不同时间点(4h、8h、12h)接受液中人参皂苷-Rd浓度见表4，不同时间点的单位面积累计渗透量见表5。

结果显示，2％氮酮、3％薄荷醇、3％月桂醇，渗透促进效果为：2％氮酮＞3％薄荷醇＞3％月桂醇，与初步筛选时的结果一致。

表4渗透促进剂单用时对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝3)

表5渗透促进剂单用时对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝3)

3.3渗透促进剂联合应用时的渗透促进效果

按正交试验，氮酮、薄荷醇和月桂醇以不同浓度进行组合，不同时间点(4h、8h、12h)接受液中人参皂苷-Rd的浓度见表6，单位面积累计渗透量见表7。

结果显示，氮酮、薄荷醇和月桂醇三者联合应用时，具有明显的渗透促进作用。

以12h接受液中人参皂苷-Rd单位面积累积渗透量计，1％氮酮+1％薄荷醇+1％月桂醇，1％氮酮+5％薄荷醇+5％月桂醇，2％氮酮+1％薄荷醇+3％月桂醇的渗透促进效果不如2％氮酮，1％氮酮+3％薄荷醇+3％月桂醇，2％氮酮+3％薄荷醇+5％月桂醇，3％氮酮+5％薄荷醇+3％月桂醇的渗透促进效果和2％氮酮相当，而2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇，3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇，3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇的渗透促进效果远优于2％氮酮。

其中，2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇组合的渗透促进效果最好，12h时单位面积累积渗透量为3404.18μg/cm²，3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇组合和3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇组合渗透促进效果次优，12h时单位面积累积渗透量分别为2832.54μg/cm²、2932.53μg/cm²。

表6渗透促进剂联合应用时对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝3)

注：A₁B₁C₁：1％氮酮+1％薄荷醇+1％月桂醇；A₁B₂C₂：1％氮酮+3％薄荷醇+3％月桂醇；

A₁B₃C₃：1％氮酮+5％薄荷醇+5％月桂醇；A₂B₁C₂：2％氮酮+1％薄荷醇+3％月桂醇；

A₂B₂C₃：2％氮酮+3％薄荷醇+5％月桂醇；A₂B₃C₁：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇；

A₃B₁C₃：3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇；A₃B₂C₁：3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇；

A₃B₃C₂：3％氮酮+5％薄荷醇+3％月桂醇

表7渗透促进剂联合应用时对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝3)

注：A₁B₁C₁：1％氮酮+1％薄荷醇+1％月桂醇；A₁B₂C₂：1％氮酮+3％薄荷醇+3％月桂醇；

A₁B₃C₃：1％氮酮+5％薄荷醇+5％月桂醇；A₂B₁C₂：2％氮酮+1％薄荷醇+3％月桂醇；

A₂B₂C₃：2％氮酮+3％薄荷醇+5％月桂醇；A₂B₃C₁：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇；

A₃B₁C₃：3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇；A₃B₂C₁：3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇；

A₃B₃C₂：3％氮酮+5％薄荷醇+3％月桂醇

3.42％氮酮和A₂B₃C₁渗透参数的计算

人参皂苷-Rd丙二醇溶液分别含2％氮酮、或2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇，渗透促进剂单用(2％氮酮)和联合应用(2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的曲线见图9；不同时间点(2h、4h、6h、8h、10h、12h)接受液中人参皂苷-Rd的浓度见表8，单位面积累计渗透量见表9，它们各自的渗透参数见表10。

结果显示：渗透促进剂联合应用(2％氮酮和2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)的渗透速率314.575μg/cm²/h，单用(2％氮酮)的渗透速率是144.495μg/cm²/h，联合应用的渗透速率是单用的2.18倍，渗透促进剂联合使用(2％氮酮和2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)的滞后时间是0.925h。

表8 2％氮酮和A₂B₃C₁对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝5)

注：A₂B₃C₁：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇

表9 2％氮酮和A₂B₃C₁对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响

(n＝5)

注：A₂B₃C₁：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇

表10 2％氮酮和A₂B₃C₁的渗透参数

注：A₂B₃C₁：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇；Q：单位面积累计渗透量；t：时间；J：渗透速率；P：渗透系数；T_lag：滞后时间

4讨论

为了便于理解，本发明人提供对渗透促进剂作用机理的说明。然而，应理解，本发明的保护范围并不受以下机理和讨论的限制。

渗透促进剂的主要作用部位是角质层，角质层的细胞间途径是药物透过的主要途径。角质层由类脂分子的双分子层组成，角质层中的脂肪酸、胆固醇、神经酰胺和神经酰胺糖苷元等的极性头区结合水分子形成水性区，而类脂分子的碳氢链组成疏水区。

渗透促进剂主要作用于类脂分子的双分子层，通过增加类脂骨架无序性而增加皮肤的非均匀性，打开新的渗透途径，产生渗透促进作用。渗透促进剂促进透皮吸收的机制主要有以下几种假说：(1)改变皮肤角质层类脂排列：渗透促进剂渗入皮肤中，改变皮肤角质层中类脂双分子层的有序排列，增加它们的流动性，促使药物分子顺利通过；(2)影响皮肤角质层水合作用：渗透促进剂能提高角质层角蛋白中含氮物质与水的结合能力，提高水合作用，便于药物分子穿透，从而促进药物的透皮吸收；(3)溶解皮脂腺管内皮质：渗透促进剂渗入皮肤皮脂腺管内，溶解皮质或腺腔壁上皮脂性分化细胞，从而降低皮脂腺管内的疏水性，使皮脂腺成为离子型药物透过皮肤的主要通道；(4)扩大汗腺和毛囊开口：渗透促进剂通过膨胀和软化角质层，使汗腺、毛囊的开口变大，有利于药物通过从而促进药物透皮吸收。

本发明的结果显示：

(1)在不用渗透促进剂(20mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液)的情况下，人参皂苷-Rd体外经离体小鼠皮肤不能透过，这可能是由于人参皂苷-Rd分子量大(1001.20)，使药物分子很难通过皮肤表面角质层向内渗透。丙二醇对不同药物的经皮吸收促进作用有最适浓度，主要是作为药物的溶剂和助渗剂在制剂中被应用，一般认为单独使用渗透促进效果不好，有时反而阻滞药物透过。而且，丙二醇随着浓度的提高，黏性增加，阻滞药物扩散。本实验用丙二醇作为人参皂苷-Rd的溶媒，可能由于丙二醇黏性较高，使人参皂苷-Rd通过细胞内途径转运的阻力增加，从而未能促进药物经皮渗透。适合人参皂苷-Rd的溶剂包括：甲醇、乙醇、丙二醇、正丁醇及二甲基亚砜，但符合对人参皂苷-Rd溶解度高而又低毒条件的溶媒以丙二醇最佳。

(2)在经皮给药***及制剂的研发过程中，通常用到的渗透促进剂种类繁多，根据其化学结构的不同，可以简单分为以下几类：(I)有机溶剂类，主要有乙醇、丙二醇、醋酸乙酯、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等；(II)脂肪酸与脂肪醇类，主要有油酸、亚油酸、月桂醇、月桂酸等；(III)月桂氮酮及其衍生物；(IV)角质保湿与软化剂：尿素、水杨酸、吡咯酮类；(V)萜烯与植物挥发油：薄荷醇、丁香油、松节油等；(VI)表面活性剂；(VII)环糊精类。但是，对不同药物的经皮吸收，具有最佳渗透促进作用的渗透促进剂也不尽相同。所以，在特定的药物的经皮给药制剂的研发过程中，需要筛选出最优的渗透促进剂及其最佳组合，才能使药物通过经皮给药吸收而发挥作用。例如在本发明中，对8种渗透促进剂的筛选实验证明，这种理论推测对多种渗透促进剂的促渗透效果的推测是错误的(表3)，在渗透促进剂单用时，只有氮酮、薄荷醇、月桂醇对人参皂苷-Rd的体外透皮吸收有一定的促进作用(表3)。

(3)渗透促进剂单独使用时效果往往不是很好，故经常以水溶性渗透促进剂与脂溶性渗透促进剂联合应用以起到较好的促渗透作用。渗透促进剂联用可能对药物的渗透产生协同作用，这样既可减少渗透促进剂的用量，降低毒性反应，又可使药物发挥最佳效能。但即使有效的渗透促进剂也随比例不同，效果也不尽相同，需实验加以筛选以确定最佳比例。本实验结果显示，当氮酮、薄荷醇、月桂醇联合应用时，并不是以任何浓度组合都能产生协同促进作用，而是只有当以恰当的浓度组合时，才能发挥协同作用。在本实验中，氮酮、月桂醇以及薄荷醇联合应用时，2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇的渗透速率是单用2％氮酮时的2.18倍，可能是因为氮酮、薄荷醇、月桂醇三者以恰当百分浓度合用，能从不同方面影响角质层的屏障功能，产生近似相加的效果，也可能由于药物溶媒丙二醇增加了氮酮、薄荷醇、月桂醇在角质层中的分配，从而使渗透促进作用更强。本实验结果提示渗透促进剂联合使用时，要以恰当的浓度组合，才能发挥协同促进作用。

(4)这些人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂的组合物有释放缓慢，在血浆中作用持续时间长的特点，最重要的是临床用药方便，可在临床上用于腔隙性脑梗塞的预防和治疗、脑梗塞的预防及恢复期治疗、风湿与类风湿性关节炎及脊柱炎等疾病的治疗、器官移殖排斥反应的预防与治疗、溃疡性结肠炎及红斑狼疮的治疗等。

5结论

本发明人先筛选出了对人参皂苷-Rd体外透皮吸收有促进作用的渗透促进剂，而且由于渗透促进剂单用的效果不好，一般是两个或三个同时应用，所以采用正交试验法，考察几种渗透促进剂之间相互的影响以及对人参皂苷-Rd体外透皮吸收的影响，最后选出最优的渗透促进剂组合，得出以下结论：

1.以丙二醇为溶媒，人参皂苷-Rd体外不能经离体小鼠皮肤透过。

2.以离体小鼠皮肤为模型，测定不同渗透促进剂单用时对人参皂苷-Rd体外经皮吸收的影响，渗透促进作用强度依次为2％氮酮＞3％薄荷醇＞3％月桂醇。

3.以离体小鼠皮肤为模型，测定氮酮、薄荷醇、月桂醇以不同的百分浓度联合应用时对人参皂苷-Rd体外经皮吸收的影响，在渗透促进剂联合应用时，只有以恰当的百分浓度联合应用(2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇、3％氮酮+1％薄荷醇+5％月桂醇或3％氮酮+3％薄荷醇+1％月桂醇)，才能发挥协同渗透促进作用。

4.人参皂苷-Rd体外透皮吸收最优渗透促进剂组合为：2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇。

5.这些人参皂苷-Rd透皮吸收渗透促进剂的组合物临床用药方便，可在临床上用于腔隙性脑梗塞的预防和治疗、脑梗塞的预防及恢复期治疗、风湿与类风湿性关节炎等疾病的治疗及器官移殖排斥反应的预防等。

实施例2

人参皂苷-Rd经皮给药的抗炎作用

1材料与仪器

1.1动物

昆明种小鼠，

，体重18-22g，购自兰州大学实验动物中心，合格证号：SCXK(甘)2009-0004。

1.2药品与试剂

人参皂苷-Rd，由广东泰禾生物药业有限公司提供，批号：080312。

丙二醇，中国派尼化学试剂厂，分析纯，批号：20060708；

氮酮，上海元越化工有限公司，分析纯；

薄荷醇，上海中秦化学试剂有限公司，分析纯，批号：20081225；

月桂醇，天津市光复精细化工研究所，分析纯；

EUDRAGIT E100，德国生产，批号：E080501129；

癸二酸二丁酯，上海中秦化学试剂有限公司，化学纯，批号：20100312；

琥珀酸，上海中秦化学试剂有限公司，分析纯，批号：20100120；

丙酮，天津化学试剂有限公司，分析纯，批号：20080702；

异丙醇，上海中秦化学试剂有限公司，分析纯，批号：20100105；

无水乙醇，天津市光复科技发展有限公司，分析纯，批号：20080327)；

***磷酸钠注射液：天津药业基团新郑股份有限公司，产品批号：0912012，临用前用生理盐水稀释成相应浓度；

角叉菜胶：和光纯药工业株式会社生产，产品批号：037-09692，临用前24h用生理盐水配制成浓度为1％的溶液，4℃密封保存；

生理盐水：甘肃扶正药业科技股份有限公司生产，产品批号：20091219；

灭菌注射用水：天津药业焦作有限公司，批号：10021731

2方法

2.1人参皂苷-Rd贴剂的制备

2.1.1压敏胶的选择

在经皮吸收给药***的开发中需要多种材料来满足经皮给药的需要，其中压敏胶(PSA)是关键的材料，压敏胶的选择应用正确与否关系到产品的成败。理想的压敏胶应具备以下条件：(1)在所含的治疗药物浓度和化学性质的前提下，对药物有理想的溶解度，粘度适当，但又不产生溢胶现象，在皮肤上不留痕迹；(2)在常用面积大小的条件下，能提供足够的经皮流率；(3)能提供足够长时间的载药量；(4)在正常的室温下，能保持药物的化学稳定性或贴剂的稳定性；(5)在正常的季节下，对汗液有一定吸收性；(6)与所有的贴剂的添加剂，如渗透促进剂、增塑剂和有机溶剂有配伍相容性；(7)患者顺应性好，无致敏性和刺激性；(8)易于生产。

目前，应用于透皮吸收给药***的压敏胶有三类：硅酮压敏胶、聚异丁烯压敏胶和丙烯酸酯压敏胶。其中丙烯酸酯类压敏胶具有优良的粘合性、耐老化性、耐光性和耐水性，长期存放对压敏性没有明显影响，是较理想的一类材料，作为医用胶带已有30多年的历史。由于以聚丙烯酸酯为基质制成的医用胶带本身对皮肤刺激性小，而且可以直接用作基质，不需要加入增粘剂、抗氧化剂等，所以很少引起过敏，而且丙烯酸酯还具有良好的耐热性，性质稳定，无色透明，无公害，皮肤应用后无残留物等特点，所以本实验选择丙烯酸酯压敏胶作为基质。

2.1.2制备工艺的分类

贴剂的制备工艺主要有三种：(1)水性分散体法，此种方法以水作为溶媒，避免了有机溶剂的使用，有利于环保；但是由于许多适于经皮给药的药物不溶于水，所以限制了此法的应用；(2)有机溶剂分散体法，虽然存在有机溶剂的使用的危险和不利于环保，但因为操作简便，易于实验室和工业生产，且可以通过减压回流和其他工艺来减少有机物的用量，成为最常用的制备贴剂的方法，本实验人参皂苷-Rd贴剂制备采用此种方法；(3)热熔工艺法，在80-120℃将药物和辅料一起熔融后铺胶的方法，增塑剂用量大，对于热敏感的药物和辅料不适用。

2.1.3人参皂苷-Rd贴剂的制备工艺流程：

制备工艺I：聚丙烯酸树脂Eudragit E100(42.2％)、癸二酸二丁酯(19.0％)、琥珀酸(3.8％)，加入混合溶剂(21.0％丙酮+2.3％异丙醇+11.7％无水乙醇)，室温放置溶解，搅拌均匀，制得压敏胶液(所含成份均用重量份数比表示)。然后加入75-150mg/ml人参皂苷-Rd丙二醇溶液(其中含2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)0.5ml，搅拌均匀，制得含药压敏胶液15ml；将含药压敏胶液超声脱气40min，取2ml均匀涂布在防粘层上(厚0.4mm，长×宽＝8cm×5.5cm)，室温放置60min自然干燥，覆盖背衬膜(11.5cm×9cm)，包装，即得人参皂苷-Rd胶粘剂骨架扩散型贴剂(制备工艺I流程见图10)，每片贴剂含人参皂苷-Rd约10-20mg。

制备工艺II：聚丙烯酸树脂Eudragit E100(42.2％)、癸二酸二丁酯(19.0％)、琥珀酸(3.8％)，加入混合溶剂(21.0％丙酮+2.3％异丙醇+11.7％无水乙醇)，室温放置溶解，搅拌均匀，制得压敏胶液(所含成份均用重量份数比表示)。配制含5-150mg/ml人参皂苷-Rd的丙二醇溶液(其中含2％氮酮+5％薄荷醇+1％月桂醇)2ml，搅拌均匀，制得含人参皂苷-Rd药液，将药液超声脱气40min后灌入小袋中密封保存。同时在背衬膜(11.5cm×9cm，正中贴有一层8cm×5.5cm的防水纸)上均匀涂上压敏胶，并将一定大小的药垫(8cm×5.5m)粘贴于背衬膜防水纸上，然后贴上防粘层。临用前撕开防粘层，将2ml药液滴到药垫表面(含人参皂苷-Rd 10-300mg)，然后粘贴于皮肤表面。

2.2人参皂苷-Rd经皮给药对角叉菜胶致小鼠足肿胀的抑制作用

昆明种小鼠，64只，

，体重18～22g，随机分为4组，每组16只。分组及给药情况如下：

第一组：模型对照组，55％丙二醇，im，0.1ml/10g；

第二组：阳性对照组，***磷酸钠，im，2mg/kg，0.1ml/10g；

第三组：人参皂苷-Rd肌肉注射组，50mg/kg，im，0.1ml/10g；

第四组：人参皂苷-Rd经皮给药组，经皮给药，lmg/只。

第四组小鼠用0.3％戊巴比妥钠(0.3ml/10g)麻醉后，各组小鼠给予相应药物或溶媒，给药后1h分别在每组每只小鼠左后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶致炎，50μl/只。致炎后4h，处死小鼠，沿足踝关节迅速剪下左右后足，精确称重。按下列公式计算各组的肿胀度和肿胀抑制率：

肿胀度(mg)＝左足重量-右足重量

2.3数据处理

使用Excel-2003进行统计，各组数据均为计量资料，以

表示，组间差异的显著性用t-检验。

3.结果

人参皂苷-Rd经皮给药的抗炎作用研究，该实验分为模型对照组、阳性对照组、人参皂苷-Rd肌肉注射组以及人参皂苷-Rd经皮给药组，各组足肿胀度和肿胀抑制率见表11。结果显示：阳性对照组小鼠足肿胀减轻最为明显，肿胀抑制率为44.10％，与模型对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)；人参皂苷-Rd肌肉注射组小鼠足肿胀也明显减轻，肿胀度抑制率为41.49％，与模型对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)；人参皂苷-Rd经皮给药组小鼠足肿胀也明显减轻，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)，肿胀度抑制率为26.78％。

表11人参皂苷-Rd经皮给药对角叉菜胶致小鼠足肿胀的抑制作用

注：与模型对照组比较，^**P＜0.01

4.讨论

炎症是许多疾病的基本病理过程，根据病程经过的不同，炎症可分为急性炎症和慢性炎症两大类。急性炎症是机体对致炎因子发生的即刻和早期反应，病程短，持续数小时或数天，其病理特征是血管变化和渗出性改变：表现为炎性出血、血管通透性增高而出现炎性渗出和炎性细胞浸润。慢性炎症的炎性刺激常持续存在，长达数周或数月，病灶既有炎症反应、阻止破坏，又有修复现象。

角叉菜胶是一种中性致炎剂，它所诱发的小鼠足肿胀是一急性非特异性的经典炎症模型，是以血管***的反应为主所构成的炎症，以发红、肿胀、疼痛等为主要症候，肿胀高峰在致炎后4-6h，该模型的特点是致炎局部白细胞浸润、***素合成增加，并与血管活性物质和激肽类一起诱发水肿。该模型能成功地复制化学性因素和生物性因素所导致的渗出性炎症变化，具有高度的重复性，模型稳定，结果可靠，常用于抗炎药物的筛选和评价，是筛选抗炎药物的常规模型。

本实验采用此种模型观察人参皂苷-Rd通过经皮吸收给药的抗炎作用，实验结果表明，人参皂苷-Rd经皮给药对角叉菜胶诱发的小鼠足急性肿胀有明显的抑制作用，因此，在该模型上证实人参皂苷-Rd通过经皮吸收给药有显著的抗炎作用。

而且，人参皂苷-Rd经皮给药***能够避免了肌肉注射刺激性大以及口服生物利用度低等的一系列问题，为该药的临床应用提供了可靠的实验依据。

5、结论

人参皂苷-Rd经皮吸收给药有显著的抗炎作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂，其特征在于，所述的渗透促进剂选自下组：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合。

2.如权利要求1所述的渗透促进剂，其特征在于，所述的渗透促进剂含有氮酮、薄荷醇、月桂醇中的两种或三种物质。

3.如权利要求1所述的渗透促进剂，其特征在于，所述的渗透促进剂中各组分的含量如下：

0-10重量份数的氮酮；

0-15重量份数的薄荷醇；

0-15重量份数的月桂醇；

附加条件是至少一种组分的含量不等于0重量份数。

4.如权利要求3所述的渗透促进剂，其特征在于，所述的渗透促进剂中各组分的含量如下：

1-5重量份数的氮酮；

0.5-10重量份数的薄荷醇；

0.5-10重量份数的月桂醇。

5.一种物质的用途，所述物质选自下组：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合，其特征在于，所述的物质被用于制备促进人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂或药物组合物。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有(a)人参皂苷-Rd；(b)药学上可接受的载体；和(c)权利要求1所述的人参皂苷-Rd体外透皮吸收的渗透促进剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为透皮吸收剂型或经皮吸收剂型。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的渗透促进剂选自下组：

(i)1.5-2.5wt％氮酮+2.5-7.5wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇；

(ii)2-4wt％氮酮+0.5-2wt％薄荷醇+2.5-7.5wt％月桂醇；或

(iii)2-4wt％氮酮+2-4wt％薄荷醇+0.5-2wt％月桂醇。

9.一种提高人参皂苷-Rd或含人参皂苷-Rd的制剂中的人参皂苷-Rd的体外透皮吸收的方法，其特征在于，所述的方法包括：向人参皂苷-Rd或所述制剂中添加选自下组的渗透促进剂：氮酮、薄荷醇、月桂醇或其组合。

10.一种由氮酮、薄荷醇和月桂醇构成的混合物，其特征在于，所述混合物中各组分比例如下：

1-5重量份数的氮酮；

0.5-10重量份数的薄荷醇；

0.5-10重量份数的月桂醇。

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