CN102716470B - 一种治疗周围神经损伤的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰岛素生长因子-1在制备用于治疗周围神经损伤的药物中的应用，及一种治疗周围神经损伤的药物组合物，该药物组合物的活性成分为胰岛素生长因子-1。该药物组合物具有促进雪旺细胞增殖和存活，抑制细胞死亡，参与神经元的保护和伤后突触重建及抑制失神经肌肉萎缩等作用，能够直接有效改善严重周围神经损伤，药效明确，安全性高。

Description

一种治疗周围神经损伤的药物组合物

技术领域

本发明涉及胰岛素生长因子-1（IGF-1）的新用途，具体涉及胰岛素生长因子-1在制备用于治疗周围神经损伤药物中的应用，本发明还进一步提供了一种用于治疗周围神经损伤的药物组合物。

背景技术

周围神经损伤的再生与修复一直是广大神经科学者和临床医学工作者密切关注的问题。周围神经包括31对脊神经及12对脑神经，周围神经损伤为多发性疾病，交通事故、自然灾害，甚至在其他疾病的临床治疗过程中都可能发生周围神经的损伤。表现为各种因素所导致的周围神经发生病理改变，以及其支配的皮肤、肌肉、运动、血管等功能发生障碍。周围神经损伤发生率高，修复困难，致残严重，是当今临床医疗面临的严重挑战之一。虽然目前已有大量的基础和临床研究报道，并取得了一些可喜的进展，然而周围神经损伤后的再生修复是一个复杂的病理生理过程，影响此修复过程的关键是如何促进损伤神经快速生长，并在远端神经变性前建立起联系。

周围神经的基本单位是神经元轴突、髓鞘和效应靶器官。周围神经损伤后，表现为神经元胞体的改变、神经纤维变性以及微环境改变。在损伤信号的传递中涉及损伤信号快速传导，并有相关转录因子、粘附分子、生长相关蛋白以及轴突再生的结构成份反应。成年哺乳动物的周围神经表现出旺盛的再生能力，而轴突损伤，无论其胞体是否在中枢，通常情况下皆无法再生。从神经发育看，神经轴突沿特定的路径延伸，到达将与它建立突触联系的靶细胞的胞体、树突或轴突。在神经突起末端存在一个扇形结构——生长锥(axonal growth cone)，它表面的受体能选择性地识别胞外环境中的导向信号，经过一系列信号转导机制引起自身的伸展和回缩反应，从而指导轴突生长。当周围神经损伤后，神经纤维和***（从外到内分为神经内膜、神经束膜和神经外膜）依次发生神经元胞体肿胀，尼氏体消失，细胞核偏移，突触终端减少；远端轴突和髓鞘发生华勒氏（Waller）变性而崩解，雪旺氏细胞增殖，胞体轴突产生生长锥，开始在多因素调控下的再生过程。

目前周围神经损伤的治疗仍然是临床难题之一，困难多在于损伤神经的功能恢复不能令人满意，其治疗手段主要有手术治疗、药物治疗以及物理治疗。药物治疗是周围神经损伤修复治疗的重要措施，对于没有手术适应证或是手术治疗后的周围神经损伤，药物治疗必不可少。当前主要采用神经营养药物，包括维生素B类，维生素B1、维生素B6、地巴唑、维生素B12、弥可保(甲钴胺)等，这类药物种类很多，临床使用广泛，但单用疗效欠佳且不稳定，常须联合用药或者合用其他药物；外源性神经营养因子比如神经生长因子NGF半衰期短，水溶液中活性容易受其他因素影响，且其不能透过血脑屏障和血神经屏障。因此，临床应用主要限于神经损伤局部应用，效应难以长期维持。因此，如何进一步发挥NGF在周围神经损伤治疗中的作用，还需要进一步的研究；目前临床用成纤维细胞生长因子(FGF)为基因重组的碱性FGF(bFGF）以及脑源性神经营养因子(BDNF)，其对动物急性脊髓损伤作用明显，但对周围神经损伤目前尚未见报道。对于神经节苷脂，目前其注射液已应用于临床，商品名为康络素(Cronassial)，用于各种神经损伤、神经吻合术后以及多发性神经炎等周围神经病变，但其作用的分子机制仍不大明了，且目前临床应用病例不多，实际疗效尚需大样本病例治疗验证。此外还有其他如激素类药物，白细胞介素、中草药比如当归、红花等注射液等，抑制局部瘢痕形成的药物甲基强的松龙等有利于神经再生，蛋白水解酶抑制剂、Ca2+拮抗剂、模拟轴突成分的灌流液等药物使用由于受神经损伤的不同时期、炎症、血液供应以及不良反应等的限制，虽然局部应用也可促进周围神经再生，但实际临床应用不多，疗效需要进一步研究确证。因此寻找一种广谱性促神经生长的因子非常有必要。

***-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）属于***家族成员，是一种与组织代谢和细胞分化、增殖有关的细胞因子。它来源于体内许多细胞，神经***的神经元和神经胶质细胞可以产生IGFs，此外巨噬细胞、成纤维细胞亦可产生IGFs，通过自分泌、旁分泌和内分泌机制发挥作用。近年研究发现，胰岛素生长因子-1是一类多功能的神经营养因子，具有促进雪旺细胞增殖和存活，抑制凋亡；促进神经损伤后轴突再生和髓鞘化，参与神经元的保护和伤后突触重建及抑制失神经肌肉萎缩等作用。提示胰岛素生长因子-1可能为一种有效的广谱类神经损伤修复药物制剂，但有关其促进神经损伤修复研究国内外尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供胰岛素生长因子-1在制备用于治疗周围神经损伤的药物中的应用，该药物中胰岛素生长因子-1的使用剂量为10ng/kg-1000ng/kg，优选地，使用剂量为100ng/kg。

本发明还提供一种用于治疗周围神经损伤的药物组合物，活性成分为胰岛素生长因子-1。

优选地，该药物组合物还进一步包含几丁糖。

优选地，该药物组合物中胰岛素生长因子-1的使用剂量为10ng/g-1000ng/kg。

更优选地，所述药物组合物中胰岛素生长因子-1的使用剂量为100ng/g。

本发明的有益效果：本发明提供了胰岛素生长因子-1在制备用于治疗周围神经损伤的药物中的新应用，并进一步提供了一种用于治疗周围神经损伤的药物组合物，其包含胰岛素生长因子-1和几丁糖，该药物组合物具有促进雪旺细胞增殖和存活，抑制其死亡；促进神经损伤后轴突再生和髓鞘化，参与神经元保护和伤后突触重建及抑制失神经肌肉萎缩等作用，能够直接有效改善严重周围神经损伤，药效明确，安全性高。

附图说明

图1A和图1B分别是胰岛素生长因子-1的平面和立体结构图。

图2是神经损伤及缝合示意图。

图3A至图3I是周围神经损伤后胰岛素生长因子-1不同剂量治疗组大体标本图。图3A-C是使用硅胶管，治疗4周后的情况，图3A：小腿肌肉萎缩，足趾僵硬；图3B：神经离断；图3C：硅胶管周围无再生的组织血管；图3D-F是使用硅胶管+几丁糖治疗4周后的情况；图3D：小腿肌肉稍微萎缩，足趾可微屈曲；图3E：神经断段有细丝样再生组织；图3F：硅胶管周围有血管样组织包裹；图3G-I是使用硅胶管+几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周后的情况；图3G：小腿肌肉萎缩不明显，足趾可同时伸展、屈曲；图3H：神经断端有肉眼可见的韧性纤维组织再生；图3I：硅胶管周围组织包裹较规则，断端再生组织与原组织相似。

图4A至图4E是周围神经损伤后不同剂量胰岛素生长因子-1连续治疗4周后组织学观察(H.E染色)。图4A是对照组神经；图4B是使用几丁糖治疗4周的情况；图4C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图4D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图4E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

图5A至图5E是周围神经损伤后不同剂量胰岛素生长因子-1连续治疗4周后组织学观察(Holmes银染)。图5A是对照组神经；图5B是使用几丁糖治疗4周的情况；图5C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图5D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图5E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

图6A至图6D是不同组别周围神经损伤后4周腓肠肌运动终板染色。图6A是对照组神经；图6B是使用几丁糖治疗4周的情况；图6C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图6D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图6E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

图7是对照组大鼠感觉皮层诱发电位。

图8是胰岛素生长因子-1（10ng）治疗4周感觉皮层诱发电位。

图9是胰岛素生长因子-1（100ng）治疗4周感觉皮层诱发电位。

图10是对照组运动皮层诱发电位。

图11是胰岛素生长因子-1（10ng）治疗4周运动皮层诱发电位。

图12是胰岛素生长因子-1（100ng）治疗4周运动皮层诱发电位。

图13A至图13C是内皮细胞鉴别。图13A是DAPI标记内皮细胞核；图13B是Ⅷ因子标记内皮细胞；图13C是DAPI、Ⅷ因子联合标记。

图14是胰岛素生长因子-1对细胞损伤的影响（1×100）。实验组培养基含40ng/ml IGF-l，对照组加入常规培养基。A1，B1：损伤后的即时情况；A2，B2：损伤后24h的情况，24h时实验组内皮细胞己开始向中间划痕处生长，而对照组无明显改变；C1，C2：损伤后48h的情况，48h后实验组细胞迁移的数量明显比对照组细胞迁移数多，实验组划痕的缝隙宽度也较对照组明显变窄，对照组中有许多己死亡的细胞漂浮于培养基里。

图15是胰岛素生长因子-1对细胞死亡的影响。箭头b、d所示是DAPI细胞核蓝色染色，箭头a、c所示是PI为死亡细胞红色核染色。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实验材料：

动物：SD大鼠，雄性，体重210±26g，重庆市第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供，普通级动物，许可证：SCXK(yu)2007017。

试药试剂：

胰岛素生长因子-1   货号：MSDS I8779，美国Sigma医药有限公司生产；

医用几丁糖，批号070674-01，上海其胜生物制剂有限公司生产；

医用硅胶管，长15mm，其外径2.0mm，内径1.5mm，苏州橡胶厂

戊巴比妥钠，丹麦进口分装；

多聚甲醛分析纯，批号20100501，成都市科龙化工试剂厂生产；

无水乙醇，批号20100509，重庆茂业化学试剂有限公司生产；

磷酸二氢钠，批号20091105，重庆川东化工集团有限公司生产；

磷酸氢二钠，批号90519，重庆博弈化学试剂有限公司生产；

蔗糖分析纯，批号20081113，成都市科龙化工试剂厂生产；

二甲苯，批号20090911，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产；

乙酸钠    批号20070920重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产；

乙酸      批号20080310重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产；

柠檬酸钠批号20090910重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产；

硫酸铜    批号2010718重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产；

铁***批号20090908    成都市科龙化工试剂厂生产；

乙酰胆碱  货号：60-31-1 美国Sigma医药有限公司生产

人脐静脉内皮细胞株(由重庆医科大学传染科提供)

二甲基亚砜 货号：SH30021.01(美国Hyclone公司)

DMEM/F12培养基 货号：SH30023.01B(美国Hyclone公司)

10%胎牛血清 货号：SH30070.01(美国Hyclone公司)

0.25%胰蛋白酶 货号：SH30042.01B(美国Hyclone公司)

四甲基偶氮唑盐 货号：708569(美国Sigma公司)

0.3%Tritonx-100 货号：9002-93-1(Sigma公司)

4',6-二脒基-2-苯基吲哚 货号：11032(DAPl)抗体(Sigma公司)

碘化丙啶(Pl) 货号：P4170(sigma公司)

兔抗Ⅷ因子抗体货号：F3520(Sigma公司)

羊抗兔IgG-FITC货号：ZPR5211(北京中杉公司)

正常封闭山羊血清货号：C-0005(北京中杉公司)

VEGF-ELISA试剂盒货号：EK0540(武汉博士德公司)

实验仪器：

生理多导仪(澳大利亚ADI公司)，冰冻切片机（CM1900美国Leica），激光共聚焦扫描***（TCSSP2,德国Leica），蜡块切片机（SM2000R，德国Leica），台式低温离心机（美国Sigma-16k），Ix-50倒置相差显微镜(Olympus公司)，MD型酶标仪(Thermo公司)，80-3离心机(上海手术器械厂)

实施例1：胰岛素生长因子-1的制备

胰岛素生长因子-1，也被称作“促生长因子”（即somatomedin C），是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。本发明所述的胰岛素生长因子-1是一种活性蛋白多肽物质，是一个有70个氨基酸的单链碱性蛋白，由3个双硫键交叉连接而成，分子量7649Da，耐热；与人类胰岛素原的结构和功能约50%相似。所述的胰岛素生长因子-1为美国Sigma生物公司购买(货号:MSDS I8779),也可采用基因重组方法合成，具体参见：（黄鹂蕙，朱裕鼎CN98106111.7***-1工程菌构建及制备类胰岛素生长因子-1的方法；CN200410053399.6朱成钢，王利忠一种从鲜鹿茸提取***(胰岛素生长因子-1)的方法；张新宇，刘越，刘洋，袁婧婷CN200810084902.2一种从鹿茸提取***(胰岛素生长因子-1)的方法）以获得实验所需成品。胰岛素生长因子-1的平面和立体结构图请参照图1A和图1B。

实施例2：药物组合物的制备

医用几丁糖凝胶（上海其胜生物制剂有限公司）加胰岛素生长因子-1组:管内注入医用几丁糖凝胶10μl后,再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μl,20ng/μ,200ng/μl美国Sigma公司)注入消毒医用硅胶管内。除了采用上述方法可保证药物有效成分持久而缓慢局部作用，也可以采用传统针管局部注射、涂抹法等作用于损伤神经局部，不同方法均具有改善周围神经损伤的药效。

以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果。

实施例3：胰岛素生长因子-1对大鼠周围神经损伤的一般状态的观察

SD大鼠210只，雌雄不拘，体重210±26g，实验分组为假手术组(只暴露神经)20只、神经切断后加硅胶管加几丁糖组20只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)40只；每组又分为：1，2，3，4周时相点。

方法：1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位,剃毛、消毒后,取股后斜切口,暴露右侧坐骨神经,10倍手术显微镜下游离坐骨神经,并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm,任其回缩,造成10mm缺损,用消毒好的硅胶管桥接缺损段,用9-0无损伤显微缝合线将神经近、远断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针,使得再生神经断端套入桥接管内,并距管约2.5mm（图2）。根据管内加入的药物不同将动物随机分5组分别为假手术组(只暴露神经)、神经切断后加硅胶管加几丁糖组、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)；每组又分为：1，2，3，4周时相点，每组5-10只。几丁糖加硅胶管组为硅胶管内分别注入医用几丁糖凝胶20μl(上海其胜生物制剂有限公司)；几丁糖加胰岛素生长因子-1组:管内注入医用几丁糖凝胶10μl后,再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μ1,20ng/μ,200ng/μ1美国Sigma公司)注入管内，用9-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上,逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。

结果：术后观察发现3周时桥接管无裂口、变形、变薄、变色、移位和塌陷，其表面为膜状组织包绕。各组管内医用几丁糖凝胶完全降解，管内再生坐骨神经近端呈芽状再生的时间硅胶管加几丁糖组于4周出现再生物，并有膜状组织包绕；术后12周出现断段吻合再生物；几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)在1周时出现丝状新生毛细血管，并在2周时逐渐增多，3周时两断端芽状再生神经向前延伸；4周时可见有完全吻合的再生束状物；几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)1周时开始出现较密集的膜状组织，2周时可见有吻合如束状的再生组织，4周时可见再生物两端粗，中间细如硅胶管的直径1/2；几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)在4周时可见2/5有再生物吻合，3/5没有吻合，且呈细丝状。

结论：从一般情况看，胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗组4周能够显著促进周围神经再生。

实施例4：胰岛素生长因子-1对周围神经损伤修复的病理改变

采用H.E和银染病理染色方法检测。SD大鼠，雌雄不拘，体重210±26g；实验分组为：假手术组(只暴露神经)20只、神经切断后加硅胶管加几丁糖组20只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)40只；每组又分为：1，2，3，4周时相点。

方法：1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位,剃毛、消毒后,取股后斜切口,暴露右侧坐骨神经,10倍手术显微镜下游离坐骨神经,并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm,任其回缩,造成10mm缺损,用消毒好的硅胶管桥接缺损段,用9-0无损伤显微缝合线将神经近、远断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针,使得再生神经断端套入桥接管内,并距管约2.5mm（如图2）。根据管内加入的药物不同将动物随机分5组分别为假手术组(只暴露神经)、神经切断后加硅胶管加几丁糖组、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)；每组又分为：1，2，3，4周时相点，每组5－10只。几丁糖加硅胶管组为硅胶管内分别注入医用几丁糖凝胶20μl(上海其胜生物制剂有限公司)；几丁糖加胰岛素生长因子-1组:管内注入医用几丁糖凝胶10μl后,再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μl,20ng/μl,200ng/μl美国Sigma公司)注入管内，用9-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上,逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。具体请参照图3A至图3I，其是周围神经损伤后胰岛素生长因子-1不同剂量治疗组大体标本图。图3A至图3I是周围神经损伤后应用硅胶管、几丁糖、胰岛素生长因子-1不同剂量治疗组大体标本图。图3A-C是使用硅胶管，治疗4周后的情况，图3A：小腿肌肉萎缩，足趾僵硬；图3B：神经离断；图3C：硅胶管周围无再生的组织血管；图3D-F是使用硅胶管+几丁糖治疗4周后的情况；图3D：小腿肌肉稍微萎缩，足趾可微屈曲；图3E：神经断段有细丝样再生组织；图3F：硅胶管周围有血管样组织包裹；图3G-I是使用硅胶管+几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周后的情况；图3G：小腿肌肉萎缩不明显，足趾可同时伸展、屈曲；图3H：神经断端有肉眼可见的韧性纤维组织再生；图3I：硅胶管周围组织包裹较规则，断端再生组织与原组织相似。上述各组动物在实验后经1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌注0.01M PBS 200ml，随后灌注4％多聚甲醛-PB液200ml (0.1mol/L，pH:7.4)进行内固定，然后取出脑标本，放入4％的多聚甲醛液固定24h，充分水洗后过夜，行脱水、透明、石蜡包埋、每张脑片厚5um～10um，行HE染色，透明、封固。同时行Holmes银染,评价再生神经纤维的优劣。

结果：H.E染色观察所见，与对照组相比，几丁糖组4周组再生“神经”仅为染成较多的细胞样结构，神经纤维状结构，但束状结构空隙多；胰岛素生长因子-1低剂量组再生神经可见少量再生纤维，胰岛素生长因子-1中剂量组可将血细胞和纤维细胞交织，纤维成束状排列并且密集；几丁糖高剂量组再生神经纤维有断裂端，吻合不好，且排列较杂乱，具体请参照图4A至图4E，图4A是对照组神经；图4B是使用几丁糖治疗4周的情况；图4C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图4D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图4E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

Holmes银染结果：术后硅胶管内再生神经形态与对照组，几丁糖4周组再生神经粗细不匀、并且神经有未吻合端，但排列较整齐；胰岛素生长因子-1低剂量组再生神经纤维束较粗大，但排列粗糙；胰岛素生长因子-1中剂量组排列较整齐，粗细均匀，且有神经的波纹曲线，胰岛素生长因子-1高剂量组排列呈波纹状，但纹理粗糙，粗细不匀，具体请参照图5A至图5E，图5A是对照组神经；图5B是使用几丁糖治疗4周的情况；图5C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图5D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图5E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

结论：胰岛素生长因子-1可有效减少周围神经的细胞死亡，并且再生的神经细胞数目逐渐增加，纤维排列整齐。

实施例5：胰岛素生长因子-1对周围神经损伤后支配的运动终板的影响

SD大鼠，雌雄不拘，体重210±26g；实验分组为：假手术组(只暴露神经)20只、神经切断后加硅胶管加几丁糖组20只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)40只；每组又分为：1，2，3，4周时相点。

方法：1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位,剃毛、消毒后,取股后斜切口,暴露右侧坐骨神经,10倍手术显微镜下游离坐骨神经,并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm,任其回缩,造成10mm缺损,用消毒好的硅胶管桥接缺损段,用9-0无损伤显微缝合线将神经近、远断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针,使得再生神经断端套入桥接管内,并距管约2.5mm（图2）。根据管内加入的药物不同将动物随机分5组分别为假手术组(只暴露神经)、神经切断后加硅胶管加几丁糖组、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)；每组又分为：1，2，3，4周时相点，每组5－10只。几丁糖加硅胶管组为硅胶管内分别注入医用几丁糖凝胶20μl(上海其胜生物制剂有限公司)；几丁糖加胰岛素生长因子-1组:管内注入医用几丁糖凝胶10μl后,再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μl,20ng/μ,200ng/μl美国Sigma公司)注入管内，用9-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上,逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。

运动终板的检测：上述各组动物在实验后经1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌注0.01M PBS 200ml，随后灌注4％多聚甲醛-PB液200ml(0.1mol/L，pH：7.4)进行内固定，取出损伤侧的腓肠肌，放入30%的蔗糖溶液中过夜，待组织沉底后，进行冰冻切片(30-40um)。以硫代已酰化胆碱染色观察运动终板的变化情况。

染色方法

分别取一下液体，组成混合液：0.06N(0.82%)乙酸钠6.32ml；0.1N(0.6%)乙酸0.20ml；0.1M(2.94%)柠檬酸钠0.48ml；30mM(0.75%)硫酸铜1ml；5mM(0.165%)铁***1ml；H₂O 0.8ml；将乙酰胆碱5mg溶于上述混合液中，调节PH5.5-5.6，将冰冻切片浸于上述液体中，37℃，30-120分钟即可。光镜下运动终板染棕红色。

结果：手术后4周，损伤组的运动终板表现为退变，终板染色变浅，边缘出现空泡样的淡染区，终板的数量无显著变化；几丁糖组4周治疗组的终板数目有减少，边缘发生皱缩，有少量明显的染色缺失区。胰岛素生长因子-1低剂量组数目不变，但存在终板边缘皱缩，少量空白缺色区；胰岛素生长因子-1中剂量组有些边缘较饱满，皱缩较少；高剂量组部分终板有皱缩和缺色区。具体请参照图6A至图6D，图6A是对照组神经；图6B是使用几丁糖治疗4周的情况；图6C是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(10ng/kg)治疗4周的情况；图6D是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周的情况；图6E是使用几丁糖+胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)治疗4周的情况。

结论：胰岛素生长因子-1(100ng/kg)可有效改善周围神经损伤后效应器运动终板的恢复。

实施例6：胰岛素生长因子-1对周围神经损伤大鼠感觉、运动功能的影响

SD大鼠，雌雄不拘，体重210±26g；实验分组为：假手术组(只暴露神经)20只、神经切断后加硅胶管加几丁糖组20只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)40只；每组又分为：1，2，3，4周时相点。

方法：1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位,剃毛、消毒后，取股后斜切口，暴露右侧坐骨神经,10倍手术显微镜下游离坐骨神经，并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm,任其回缩，造成10mm缺损，用消毒好的硅胶管桥接缺损段，用9-0无损伤显微缝合线将神经近、远断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针，使得再生神经断端套入桥接管内,并距管约2.5mm（如图2）。根据管内加入的药物不同将动物随机分5组分别为假手术组(只暴露神经)、神经切断后加硅胶管加几丁糖组、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)；每组又分为：1，2，3，4周时相点，每组5-10只。几丁糖加硅胶管组为硅胶管内分别注入医用几丁糖凝胶20μl(上海其胜生物制剂有限公司)；几丁糖加胰岛素生长因子-1组：管内注入医用几丁糖凝胶10μl后，再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μl,20ng/μ,200ng/μl美国Sigma公司)注入管内，用9-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上,逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。感觉诱发电位检测：术后1周，2周，3周，4周随机选取3只大鼠，用澳大利亚ADI公司生产的Powerlab多导记录仪测皮层感觉诱发电位(CSEP)。采用电刺激强度3mA，延时2ms，周期200ms，叠加128次重复刺激，以Scope软件记录和分析。

结果：胰岛素生长因子-1(10ng/kg)组在第4周硅胶管内出现断段吻合的再生神经，感觉诱发电位P1和N1波潜伏期较正常组明显延长，P波变异较大,刺激强度增大到8v；胰岛素生长因子-1(100ng/kg)组在第2周时出现吻合的再生物，P1和N1波潜伏期较正常组短，波形不规则；第3周时，P1和N1波潜伏期进一步缩短，波形差异大；第4周时，P1波潜伏期与正常组相近，但N1波潜伏期较正常组延长，刺激强度为5v时波形趋于正常。具体请参照图7-图9以及表1-表4所示，图7是对照组大鼠感觉皮层诱发电位；图8是胰岛素生长因子-1（10ng）4周感觉皮层诱发电位；图9是胰岛素生长因子-1（100ng）治疗4周感觉皮层诱发电位；图10是对照组运动皮层诱发电位；图11是胰岛素生长因子-1（10ng）治疗4周运动皮层诱发电位；图12是胰岛素生长因子-1（100ng）治疗4周运动皮层诱发电位。

表1.不同组别感觉诱发电位中P1波的潜伏期变化

组别	1周	2周	3周	4周
					正常对照	6.20±0.41	6.20±0.41	6..20±0.41	6..20±0.41
损伤未处理组	0	0	0	0
					硅胶管几丁糖	0	0	0	0
IGF-1 10ng	0	0	0	10.52±2.70**
					IGF-1 100ng	0	无法测量	5.85±1.09**	7.13±1.91**
IGF-1 1000ng	0	无法测量	无法测量	无法测量

与相应正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表2.不同组别感觉诱发电位中N1波的潜伏期变化

组别	1周	2周	3周	4周
					正常对照	16.03±0..87	16.03±0..87	16.03±0..87	16.03±0..87
损伤未处理组	0	0	0	0
					硅胶管几丁糖	0	0	0	0

IGF-1 10ng	0	0	0	27.69±3..65**
					IGF-1 100ng	0	17.71±4.14*	10.55±0.63**	19.57±3..87**
IGF-1 1000ng	0	无法测量	无法测量	无法测量

与相应正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表3.不同组别运动诱发电位中N1波的潜伏期变化

组别	1周	2周	3周	4周
					正常对照	6.00±0.84	6.00±0.84	6.00±0.84	6.00±0.84
损伤未处理组	0	0	0	0
					硅胶管几丁糖	0	0	0	0
IGF-1 10ng	0	0	0	9.63±0.63**
					IGF-1 100ng	0	无法测量	16.15±5.44*	8.60±1.02**
IGF-1 1000ng	0	无法测量	无法测量	无法测量

与相应正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表4.不同组别运动诱发电位中N2波的潜伏期变化

组别	1周	2周	3周	4周
					正常对照	24.35±1.01	24.35±1.01	24.35±1.01	24.35±1.01
损伤未处理组	0	0	0	0
					硅胶管几丁糖	0	0	0	0
IGF-1 10ng	0	0	0	29.70±1.04*
					IGF-1 100ng	0	无法测量	41.60±6.99**	29.85±3.86*
IGF-1 1000ng	0	无法测量	无法测量	无法测量

与相应正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

结论：胰岛素生长因子-1(100ng/kg)在4周后可有效恢复损伤周围神经的感觉和运动传到功能。

实施例7：胰岛素生长因子-1对周围神经损伤大鼠神经传导速度的影响

SD大鼠，雌雄不拘，体重210±26g；实验分组为：假手术组(只暴露神经)20只、神经切断后加硅胶管加几丁糖组20只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)40只、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)40只；每组又分为：1，2，3，4周时相点。

方法：1%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位,剃毛、消毒后,取股后斜切口,暴露右侧坐骨神经,10倍手术显微镜下游离坐骨神经,并在梨状肌出口下方5mm处将坐骨神经切除约8mm,任其回缩,造成10mm缺损,用消毒好的硅胶管桥接缺损段,用9-0无损伤显微缝合线将神经近、远断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针,使得再生神经断端套入桥接管内,并距管约2.5mm（图2）。根据管内加入的药物不同将动物随机分5组分别为假手术组(只暴露神经)、神经切断后加硅胶管加几丁糖组、几丁糖加胰岛素生长因子-1(10ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(100ng/kg)、几丁糖加胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)；每组又分为：1，2，3，4周时相点，每组5-10只。几丁糖加硅胶管组为硅胶管内分别注入医用几丁糖凝胶20μl(上海其胜生物制剂有限公司)；几丁糖加胰岛素生长因子-1组:管内注入医用几丁糖凝胶10μl后,再用微量注射器分别将5μl胰岛素生长因子-1(2ng/μl,20ng/μ,200ng/μl美国Sigma公司)注入管内，用9-0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上,逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。

神经传导速度检测：暴露双侧坐骨神经，游离神经干及实验侧桥接再生组织。刺激电极为2个钩形保护电极（极间距2mm），置于桥接管近端距离梨状肌下缘约0.3cm的神经干近心、远心端，记录电极采用金属电极，于踝关节上方10mm处***腓肠肌肌腹中部，两极排列方向与腓肠肌纤维方向垂直，两极尖端相距2mm，深度为5mm。接地线钳夹鼠尾接地。刺激强度3mA，刺激间期2ms，每只实验动物测量三次，取波幅居中者进行统计，以神经传导速度为刺激电极距离差/时间差。

结果：术后检测各组神经传导速度（见表5），正常组坐骨神经传导速度为20.60±2.10m/s，胰岛素生长因子-1(10ng/kg)组神经传导速度为11.76±2.10m/s，波形低平、短小。胰岛素生长因子-1(100ng/kg)组传导速度随时间延长逐渐增快，略快于正常组，动作电位波形宽平。胰岛素生长因子-1(1000ng/kg)因神经再生不良无法检测。

表5.不同组别再生神经4周传导速度变化

组别

传导速度

正常对照	20.60±2.10
		损伤未处理组	0
硅胶管几丁糖	0
		IGF-1 10ng	11.76±2.10**
IGF-1 100ng	24.41±5.22*
		IGF-1 1000ng	无法测量

与相应正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

结论：胰岛素生长因子-1(100ng/kg)治疗4周后周围神经传导速度有改善作用。

实施例8：胰岛素生长因子-1对受损血管内皮细胞存活及增殖的影响

将内皮细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，5%CO₂培养箱培养；每3d更换一次培养基，每7d用胰酶消化传代(1：3)，取对数生长期细胞用于实验。

(l)将内皮细胞以1×10⁶个/ml的密度接种于己涂好多聚赖氨酸无菌盖玻片，培养3d，细胞铺满玻片约90%时用镊子取出玻片进行免疫荧光染色；

(2)弃去培养基，0.0lmmol/LpH7.4PBS清洗3min×3次；

(3)用4%多聚甲醛固定20min，0.01lmmol/LpH7.4PBS清洗5min×3次；

(4)用0.3%TritonX-100打孔10min，0.01mmol/LpH7.4PBS清洗5min×3次；

(5)用正常山羊血清封闭20min，弃去血清，不清洗；

(6)加入兔抗Ⅷ因子(1：200稀释)，4℃孵育过夜；

(7)吸去抗体，0.01mmol/LpBS清洗smin×3次；

(8)加入二抗FITC(1：50稀释)，37℃孵育1h；

(9)吸去抗体，0.01mmol/LpH7.4PBS清洗3min×3次；

(10)加入DAPI，室温孵育3min；

(11)吸去液体，0.0lmmol/LPBS清洗5min×3次；

(12)用甘油封片，激光共聚焦显微镜下进行观察。

采用MTT法测定胰岛素生长因子-l对内皮细胞增殖的影响，具体操作如下：

(l)用培养基将内皮细胞悬液细胞密度调为l×10⁷/mI，接种于96孔板上，每孔100μl。

(2)分组：实验组分为A、B、C、D、E5个亚组：在培养基中分别加入浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml的胰岛素生长因子-l对内皮细胞进行培养。对照组：将内皮细胞悬液加入无胰岛素生长因子-1的培养基中进行培养；空白组：仅有单纯培养基，无细胞，空白组用于调零。实验每孔设置6个复孔。

(3)在37℃，5%CO₂培养箱培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃孵育4h。

(4)加入100μl DMSO，置于摇床低速振荡5min，充分显色后，用酶标仪在波长570nm处测定各孔A值。

结果：内皮细胞进行免疫荧光染色后可见细胞多呈梭形、三角形，团簇存在，胞核清晰，胞浆丰富，细胞生长活跃，传代48h后即成“铺路石”排列生长(图13A至图13C)。通过免疫细胞化学染色鉴定发现，培养细胞表达内皮细胞特异的标志物Ⅷ因子。TTC检测结果显示，对照组A值为0.33土0.03，随着剂量的增加，胰岛素生长因子-1对内皮细胞的增殖效果越明显。但是胰岛素生长因子-1浓度为160ng/ml的E组胰岛素生长因子-l对细胞的增殖作用减弱。见表6。

表6.胰岛素生长因子-1对血管内皮细胞增殖的影响

与对照组相比*P<0.05，**P<0.01

结论：胰岛素生长因子-1对血管内皮细胞有促进增生的作用。

实施例9:胰岛素生长因子-1对损伤的内皮细胞（细胞划痕）的影响

(l)将内皮细胞以1×10⁶/ml的密度接种于35mm培养皿中，于37℃，5%CO₂孵箱培养；

(2)培养3d后，在培养皿底部划宽约1.0mm的“一”字划痕;

(3)用0.01mmol/L pH7.4PBS清洗5min×3次，更换培养基;

(4)设定实验组与对照组2组：取40ng/ml胰岛素生长因子-l加入培养基作为实验组；对照加入常规培养基，于37℃，5%CO₂（请确认）培养箱培养，于倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况。

一部分培养细胞在室温下用4%多聚甲醛固定20min；

(5)用0.01mmol/L pH7.4PBS清洗5min×3次；

(6)在室温下用DAPI孵育3min；

(7)用甘油封片，激光共聚焦显微镜下分别观察两组细胞死亡情况。每组随机各取10个视野，记录每视野中细胞死亡数目。

结果：倒置相差显微镜显示在24h时实验组内皮细胞己开始向中间划痕处生长，而对照组无明显改变，48h后实验组细胞迁移的数量明显比对照组细胞迁移数多，实验组划痕的缝隙宽度也较对照组明显变窄，对照组中有许多己死亡的细胞漂浮于培养基里，说明实验组细胞生长较快，胰岛素生长因子-1具有促进受损内皮细胞增殖的作用(如图14)。激光共聚焦扫描观察到死亡细胞胞核呈红色着色，DAPI标记所有细胞胞核在划痕48h后实验组的死亡细胞数为0.90士1.52个，对照组细胞死亡数为5.90士4.93个（如图15）。实验组细胞死亡数明显小于对照组，差异统计学意义P<0.05。

结论：说明在细胞受损情况下胰岛素生长因子-1可抑制细胞的死亡并促进损伤细胞的存活。

实施例10:胰岛素生长因子-1对损伤内皮细胞分泌VEGF含量检测

内皮细胞培养方法同前。分组同前。

方法：实验组与对照组VEGF水平采用ELISA法测定，检测方法如下:

(l)将2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml的标准品各0.lml依次加入孔中，只加样品稀释液作为零孔。细胞上清液用样品稀释液按1:20稀释后加入孔里；

(2)酶标板加上盖，37℃反应90min；

(3)反应后甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下；

(4)将生物素抗人vEGF抗体工作液按每孔0.lml依次加入，37℃反应60min；

(5)用0.01mmol/LpH7.4PBS洗涤3次，每次浸泡1min左右；

(6)将准备好的ABC工作液按每孔0.lml依次加入，37℃下反应30min；

(7)用0.01mmol/LpH7.4PBS洗涤3次，每次浸泡1min左右；

(8)按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应5-20min，此时肉眼可见标准品前3-4孔有明显蓝色梯度，后3-4孔差别不明显；

(9)按每孔0.1ml依次加入TMB终止液、TMB，此时蓝色转黄色；

(10)用酶标仪在波长450nn下测定A值。

结果：实验组VEGF平均检测值为130.44士9.13pg/ml，对照组VEGF平均测得值为47.68士12.70pg/ml，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：胰岛素生长因子-1促进损伤神经修复可能是通过促进和修复神经供血血管内皮细胞分泌VEGF的能力。

综上所述：胰岛素生长因子-1对严重坐骨神经切割致周围神经严重创伤大鼠的一般情况、病理HE，Nissl和Holmes染色所表现出的坐骨神经神经元数目、尼氏体形态以及神经纤维的病理学改变、肌肉运动终板的恢复、感觉、运动传导功能的检测所表现出的恢复和提高，得出胰岛素生长因子-1可用于周围神经损伤的修复治疗。同时应用细胞损伤模型观察胰岛素生长因子-1对细胞损伤修复的作用和机制。本发明为胰岛素生长因子-1应用提供了新用途，还为治疗神经创伤所致损伤的药品开发提供了新的、广泛的可利用资源。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (4)

1.一种周围神经长距离缺损的再生重建装置，其特征在于：包括一用于桥接长距离神经缺损段的硅胶管，该用于桥接长距离神经缺损段的硅胶管的两端分别留有2.5 mm与神经近、远断端缝合固定，使神经断端套入；以及注入硅胶管内的由活性成分为胰岛素生长因子-1和几丁糖组成的治疗长距离神经缺损性周围神经损伤的药物组合物。

2.根据权利要求1所述的周围神经长距离缺损的再生重建装置，其特征在于：所述药物组合物中几丁糖为10μ1，活性成分为胰岛素生长因子-1为5 μl。

3.根据权利要求2所述的周围神经长距离缺损的再生重建装置，其特征在于：所述活性成分为胰岛素生长因子-1的浓度为2 ng/μ1或20 ng/μ1或 200 ng/μ1。

4.根据权利要求2所述的周围神经长距离缺损的再生重建装置，其特征在于：所述几丁糖为医用几丁糖凝胶。