CN102712947A

CN102712947A - 检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法

Info

Publication number: CN102712947A
Application number: CN2010800508038A
Authority: CN
Inventors: H·M·萨克塞纳
Original assignee: GURU ANGAD DEV VETERINARY AND ANIMAL SCIENCES UNIVERSITY; Department of Biotechnology
Current assignee: GURU ANGAD DEV VETERINARY AND ANIMAL SCIENCES UNIVERSITY; Department of Biotechnology
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-09-16
Also published as: EP2483418B1; US8835121B2; WO2011039775A1; CN102712947B; ZA201202312B; US20120244552A1; EP2483418A1

Abstract

检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法包括：用蛋白质染色剂对试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体进行染色；将具有染色的抗体的血清、血浆或血液与等量的着色的在玻璃玻片上的抗原颗粒进行混合；向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白；对混合物进行混合步骤；向混合物中添加经稀释的亲和素（优选地用可见指示剂进行标记），并将所有成分充分混合。

Description

检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法

发明领域

本发明涉及检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法。

本发明还涉及高灵敏的凝集试验，称为“超凝集试验”，用于诊断由多种微生物引起的感染，并且避免在使用常规凝集试验通常产生的假阳性和假阴性结果。

发明背景

凝集试验能够用作测定抗原或抗体存在的定性试验，或者用作测量针对特定抗原的抗体水平的定量试验。快速平板试验（Rapid PlateTest，RPT）或平板凝集试验（Plate Agglutination Test，PAT）/玻片凝集试验（Slide Agglutination Test，SAT）是用于检测针对血清中微生物的抗体的筛选试验。阳性血清样品进行试管凝集实验（TubeAgglutination Test，TAT）用于进一步验证和对抗体滴度的定量。在定量试验中，制备待针对抗体进行试验的血清样品的系列稀释物，并随后添加固定量的颗粒抗原。产生可见凝集反应的最大稀释度被称作滴度。凝集反应的强度是血清中抗体浓度的最好指示。非常低浓度的抗体不产生可见的凝集反应。在高浓度的抗原或抗体缺少凝集反应被称作前带效应（Prozone effect）。在前带中形成非常少的复合物，其不聚集而形成可见的凝集反应。这些因素也导致假阴性结果。

在许多国家，标准的平板凝集试验是用于人布鲁杆菌病的常规试验。然而，其会产生假阴性结果（WHO报告，1986；Lucero和Bolpe，1998）。玫瑰红平板试验（Rose Bengal Plate Test，RBPT）是平板/玻片凝集试验的变体，其中用玫瑰红染料染色的杀死的布鲁杆菌属（Brucella）微生物用作检测血清中抗体的抗原。国际兽疫组织（TheInternational Office of Epizootics）推荐将RBPT作为诊断牛布鲁杆菌病诊断的一种试验（Corbel和MacMillan，1995）。RBPT是用于诊断布鲁杆菌病的快速、廉价和有效的试验。其可以使用最低限度的设备进行，并且最终结果通过裸眼读取。然而，有许多因素影响RBPT反应及其读取结果。有些人能够看出较细小的凝集反应，而许多其他人不行。这导致了结果的多变。一些作者（Saravi等人，1990）报道了使用RBPT产生假阴性的不可接受的比例。当用于对来自低患病率群/组中动物的血清进行试验时，从不同来源获得的RBPT抗原的灵敏度也变化很大（Blasco等人，1994）。

常规凝集试验是用于诊断感染性疾病的简单廉价方法。然而与其他血清学试验例如ELISA、Western印记等相比，其具有较低的灵敏度及因此更高几率的假阴性结果。早期增强凝集反应的尝试开发出了非直接库姆斯氏试验（Indirect Coombs’Test）和共凝集试验（Coagglutination Test）。使用抗球蛋白的非直接库姆斯氏试验已经用于血清抗体的交联以产生凝集的更大团块（clump）而易于检测。然而，抗球蛋白单独与抗球蛋白的疏松末端形成抗体的扩散网，这用肉眼很难检测。共凝集是用于筛选和快速诊断感染性疾病的灵敏试验。然而，其需要以非特异性方式结合免疫球蛋白的蛋白质A，并是昂贵的且制备方法复杂。此外，由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异性凝集，库姆斯氏抗球蛋白试验和共凝集试验两者都可能产生假阳性结果。

目前可用诊断试验的局限性包括：

a）可用凝集试验和基于其的试剂盒具有较低灵敏度和更高几率的假阴性结果。

b）不能区分不恰当混合形成的颗粒抗原的非特异性凝集和抗原与抗体的特异性凝集，从而在常规凝集试验中产生假阳性结果。

c）使用抗球蛋白的非直接库姆斯氏试验已经用于血清抗体的交联以产生凝集的更大团块而易于检测。然而，抗球蛋白单独与抗体结合抗球蛋白的疏松末端形成抗原-抗体团块的广泛扩散网，而用肉眼很难检测。

d）共凝集试验依赖蛋白质A，其是昂贵的并非特异性地结合免疫球蛋白。

e）由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异性凝集，库姆斯氏抗球蛋白试验和共凝集试验两者都可能产生假阳性结果。

f）ELISA和Western印记需要受训的技术人员以及配置良好的实验室，而这在发展中国家比较少。基于这些测定法的试剂盒是昂贵的。

g）分子诊断技术只能由训练良好的技术人员在配置良好的实验室中进行，这在发展中国家比较少。基于这些测定法的商用试剂盒是昂贵的。

发明目的

本发明的一个目的是提供检测由多种由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法。

本发明的另一个目的是提供开发用于感染性疾病的非常灵敏、特异性、廉价并易于使用的诊断测定法和基于其的诊断试剂盒的方法。

本发明的另一个目的是提供用于准确诊断以及用于快速筛选和监测大量感染性疾病的方法。

另外，本发明的目的还在于提供开发可靠凝集试验以消除常规凝集试验通常具有的假阳性结果的可能性的方法。

本发明的再另一个目的是提供开发可靠凝集试验以消除常规凝集试验通常具有的假阴性结果的可能性的方法。

本发明还有一个目的是提供诊断方法和基于其的诊断试剂盒，其是penside方式并且其结果易于通过肉眼检测。

发明简述

检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法包括：

用蛋白质染色剂对试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体进行染色；

将具有染色的抗体的血清、血浆或血液与等量的着色的在玻璃玻片上的抗原颗粒进行混合；

向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白；

对混合物进行混合步骤；

向混合物中添加经稀释的亲和素（优选地用可见指示剂进行标记），并将所有成分充分混合。

附图说明

图A.使用抗原（Ag）和阳性血清（Ab）的常规凝集。

图B.使用IgG和IgM抗球蛋白（AG）的增强凝集。

图C.使用生物素化的抗球蛋白（bAG）和亲和素（Av）的超凝集。

图1.由抗原和阳性血清引起的正常凝集。

图2.使用染色的抗体、生物素化的抗球蛋白和亲和素的超凝集（宏观）。

图3.超凝集（微观）

发明详述

颗粒抗原与抗体的反应产生抗原的聚集，这称为凝集反应。凝集测试通过显示血清、血浆或血液中针对感染性微生物的抗原的抗体存在，用在感染的诊断中。凝集试验只在使用颗粒抗原中有效。然而，可以用可溶性抗原（例如病毒抗原）包被颗粒例如乳胶珠，并将经包被的颗粒用在凝集试验中以检测针对所述可溶性抗原的抗体。在乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test）中，将用抗原包被的显微乳胶珠的悬浮液与血清、血浆或全血样品混合。如果样品中存在抗体，它们将与珠上的抗原结合，引起它们凝集或聚集。这种聚集可以可视地进行检测。凝集试验非常迅速，因为与使用基于其他试验的试剂盒需要几个小时来显示结果相比，其可以在5分钟内检测抗体。

凝集试验是用于诊断感染性疾病的简单廉价方法。然而与其他血清学试验例如ELISA、Western印记等相比，其具有较低的灵敏度及因此更高几率的假阴性结果。早期增强凝集反应的尝试开发出了非直接库姆斯氏试验（也称为库姆斯氏抗球蛋白试验，Coombs’Antiglobulin Test）和共凝集试验（Coagglutination Test）。然而，库姆斯氏抗球蛋白试验由于抗球蛋白Fc区的松散末端而具有形成更大抗原-抗体团块网的局限。共凝集是用于筛选和快速诊断感染性疾病的灵敏试验。然而，其需要以非特异性方式结合免疫球蛋白的蛋白质A，并是昂贵的且制备方法复杂。此外，由于不能区分单独抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体结合形成的特异性凝集，库姆斯氏抗球蛋白试验和共凝集试验两者都可能产生假阳性结果。

本文所述对常规凝集试验（例如RBPT、PAT和SAT）的新改良能够通过区分抗原颗粒的非特异性凝集和抗原与抗体的特异性凝集而消除假阳性结果，并能够通过成倍（2倍-10倍）增强它们的灵敏度并不影响特异性而避免假阴性结果的问题。在改良的平板/玻片凝集试验中，将3μl（或者1滴）颗粒抗原（例如在RBPT中是玫瑰红染色的、杀死的布鲁氏杆菌属微生物）或抗原包被的颗粒（例如乳胶颗粒）与3μl（或者1滴）试验血清、血浆或血液或者经纯化的抗体在玻璃平板或玻璃玻片上混合，如常规方法中那样。然而，在改良试验中，通过与具有对比色（例如考马斯蓝或酰胺黑）的2-3μl蛋白质染色剂混合对试验血清、血浆或者经纯化的抗体进行预染色而对抗体进行着色。然后将3μl（或者1滴）与生物素缀合的适当稀释的抗球蛋白（针对免疫球蛋白的抗体，对来源物种特异并且是试验抗体的同种型）添加入反应混合物（即，着色的抗原和染色的抗体），并且随后通过摇动4分钟或者借助干净牙签或微量洗液管头来混合这3种反应剂（即，着色的抗原、染色的抗体和生物素化的抗球蛋白）。然后将3微升适当稀释的亲和素（或与可见指示剂例如铁蛋白缀合的亲和素）添加入混合物并使用干净牙签或微量洗液管头彻底混合这4种反应剂（即，着色的抗原、染色的抗体、生物素化的抗球蛋白和亲和素）。因为亲和素对生物素具有强亲和力，其与结合抗原-抗体团块的生物素化的抗球蛋白交联，产生更大更紧密的团块。对试验抗体进行染色以及添加生物素化的抗球蛋白和亲和素的附加步骤是对凝集试验的常规方法的3个新的改良。

通过裸眼或借助放大镜或放置盖玻片在玻片上之后置于普通光学显微镜下读取结果。如果形成可见团块，试验样品对于针对该抗原的抗体是阳性的。上述构思也适用于在标准试管凝集试验（StandardTube Agglutination Test，STAT）中的应用。在抗体对照（即，抗原、阴性血清和物种-特异性抗球蛋白）中，没有抗原颗粒的凝集反应。在抗球蛋白对照（即，抗原、阳性血清和非相关抗球蛋白）中，有正常凝集反应但没有凝集反应的增强。通过示意图（图A、B和C）以及诊断布鲁杆菌病的超凝集的实际结果照片（图1-3）示例显示了原理。

这些简单容易的改良非常显著地增强了凝集试验的灵敏度，因为生物素化的抗球蛋白与亲和素的交联产生抗原-结合抗体的交联而造成形成紧密的、更大的团块，且没有损害特异性并因此由于在血清中的低滴度抗体或者因为抗原或抗体过量造成的前带效应，最小化发生假阴性结果的几率。对血清/血浆中的抗体进行染色消除了由于不恰当混合引起抗原颗粒非特异性聚集所产生的假阳性结果。由于着色的抗原和染色的抗体，实际的凝聚反应是2种颜色的，而抗原颗粒的团块单独只有1种颜色。

本文提供的凝集试验的新的改良方法不需要任何额外设备，并且费用不高因为每次试验只需要几微升的染色剂、经稀释的生物素化的抗球蛋白和经稀释的亲和素。也可以使用来自血清的多克隆抗球蛋白替换昂贵的商用单克隆抗球蛋白。此外，对抗体进行染色、添加生物素化的抗球蛋白和亲和素、以及混合反应剂的附加步骤不需要超过5分钟。IgG同种型的抗球蛋白是二价的，可以在凝集反应中产生大约2倍的增强，而IgM同种型的抗球蛋白由于其10个结合位点而可以在凝集反应中产生高至10倍的增强。在生物素化的抗球蛋白上，亲和素与生物素的结合产生更大的、更紧密的团块，并因此更容易通过裸眼检测。上文所述改良的凝集试验被称为“超凝集试验”。

当需要快速筛选结果时，凝集试验是有用的，并且当因为缺少冷冻和高级设备而不能进行其他类型的抗体检测试验时，可以使用凝集试验。凝集试验特别可用在缺少其他高级试验的设施的世界偏僻地区，并且在发展中国家的急救情况中作为初步筛选测量也十分有用。凝集试验可以用作定性试验以测定抗原或抗体的存在，或者作为定量试验以测量针对特定抗原的抗体水平。快速平板试验（RPT）或平板凝集试验（PAT）/玻片凝集试验（SAT）是用于检测针对血清中微生物的抗体的筛选试验。阳性血清样品进行标准试管凝集试验（STAT）用于进一步验证和对抗体滴度的定量。在定量试验中，制备待针对抗体进行试验的血清样品的系列稀释物，并随后添加固定量的颗粒抗原。产生可见凝集反应的最大稀释度被称作滴度。凝集反应的强度是血清中抗体浓度的最好指示。非常低浓度的抗体不产生可见的凝集反应。在高浓度的抗原或抗体缺少凝集反应被称作前带效应（Prozoneeffect）。在前带中形成非常少的复合物，其不聚集而形成可见的凝集反应。这些因素也导致假阴性结果。

在许多国家，标准的平板凝集试验是用于人布鲁杆菌病的常规试验。然而，其会产生假阴性结果（WHO报告，1986；Lucero和Bolpe，1998）。玫瑰红平板试验（RBPT）是平板/玻片凝集试验的变体，其中用玫瑰红染料染色的杀死的布鲁杆菌属（Brucella）微生物用作检测血清中抗体的抗原。国际兽疫组织（The International Office ofEpizootics）推荐将RBPT作为诊断牛布鲁杆菌病诊断的一种试验（Corbel和MacMillan，1995）。RBPT是用于诊断布鲁杆菌病的快速、廉价和有效的试验。其可以使用最低限度的设备进行，并且最终结果通过裸眼读取。然而，有许多因素影响RBPT反应及其读取结果。有些人能够看出较细小的凝集反应，而许多其他人不行。这导致了结果的多变。一些作者（Saravi等人，1990）报道了使用RBPT产生假阴性的不可接受的比例。当用于对来自低患病率群/组中动物的血清进行试验时，从不同来源获得的RBPT抗原的灵敏度也变化很大（Blasco等人，1994）。

使用对凝集的抗体具有反应性的生物素缀合的抗球蛋白引起抗体的交联。这种由生物素化的抗球蛋白产生的抗体聚集至抗原包被的颗粒（或颗粒抗原）的附加连接产生更大的团块，其由于亲和素结合生物素而进一步变得更大、紧密和坚固，并因此容易通过裸眼可见。使用预染的抗体有助于区分单色的颗粒抗体的非特异性聚集和具有双色的特异性抗原-抗体凝集。添加生物素化的抗球蛋白和亲和素以增强凝集反应（抗原颗粒与抗体的聚集）以及对试验抗体的染色是本发明的新构思和创造性步骤。生物素化的抗球蛋白交联与抗原颗粒聚集的抗体分子，而亲和素进一步连接生物素化的抗球蛋白分子。因此形成了更大的紧密团块（即，发生超凝集），这可以通过裸眼容易地进行检测。

Claims

1.检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法，其包括：

向所述混合物中添加与生物素缀合的经稀释的抗球蛋白；

对混合物进行混合步骤；

2.权利要求1的方法，其中所使用的所述着色的/白色的抗原颗粒选自玫瑰红染色的、杀死的布鲁氏杆菌属微生物或用抗原包被的乳胶珠。

3.权利要求1的方法，其中用于对抗体进行染色的蛋白质染色剂选自考马斯蓝或酰胺黑。

4.权利要求1的方法，其中对亲和素进行标记的所述指示剂是铁蛋白。

5.权利要求1的方法，其中生物素-缀合的抗球蛋白选自IgG或IgM同种型。

6.权利要求5的方法，其中当抗球蛋白是二价的IgG时，在凝集反应中产生大约2倍的增强，而当抗球蛋白是具有10个抗原结合位点的IgM同种型时，在凝集反应中产生大约10倍的增强。