CN102711795A - 用于治疗***滥用的BChE白蛋白融合体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种减弱灵长类动物由***（***e）暴露所致的生物效应的方法。所述方法包括给予所述灵长类动物一定量的包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白，其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述灵长类动物由所述***暴露所致的所述生物效应减弱。
Description
本申请案主张2010年11月10日提交的美国临时申请案第61/412,205号和2009年12月8日提交的美国临时申请案第61/283,791号的优先权，所述申请案的內容以全文引用的方式并入本文中。
在本申请案中，参考了各种出版物、已公开的专利申请案和专利。为了更详细地描述与本发明有关的技术现状，特此将这些文献的公开内容以全文引用的方式并入本申请案中。
技术领域
无
背景技术
***（***e）滥用和依赖具有灾难性的医学和社会后果，这些后果已使得对有效治疗的开发尤为迫切（潘Y.（Pan,Y.）,高D.（Gao,D.）,杨W.（Yang,W.）,曹H.（Cho,H.）,杨G.（Yang,G.）,台H.（Tai,H.）,詹C.（Zhan,C.）,“用于抗***药物的人类丁酰胆碱酯酶的计算机重新设计（Computational redesign of humanbutyrylcholinesterase for anti***e medication）”,美国国家科学院院刊（PNAS）,102(46):16656-61,2005）。然而，如布瑞米乔因（Brimijoin）等人所述：“尚无可靠手段能治疗***过量或降低已实现戒断成瘾者的复发可能性。人类血浆丁酰胆碱酯酶（BChE）有助于正常的***代谢且已被考虑用于治疗***毒性”（布瑞米乔因S.（Brimijoin,S.）,高Y.（Gao,Y.）,安克J.（Anker,J.）,格利登L.（Gliddon,L.）,拉弗勒D.（LaFleur,D.）,沙哈R.（Shah,R.）,赵Q.（Zhao,Q.）,辛格M.（Singh,M.）,卡罗尔M.（Carroll,M.）,“自人类丁酰胆碱酯酶工程化的***水解酶在大鼠中选择性阻断***毒性和药物寻求的恢复（A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement of DrugSeeking in Rats）”,神经精神药理学（Neuropsychopharmacology）,33:2715-25,2008）。
野生型BChE虽然在体内对于***代谢很重要，但对***的催化效率低。野生型BChE的低***水解酶活性将需要使用不可承受的大量纯化酶来治疗***滥用或过量。出于增强***水解酶活性的目的对人类BChE执行诱变导致开发了双突变体A328W/Y332A（相对于全长BChE的残基356和360），这一突变体的kcat为野生型BChE的40倍，且KM仅略微升高（孙H.（Sun H.）,沈M.（Shen M.）,彭Y.（Pang Y.）,洛克里奇O.（Lockridge O.）,布瑞米乔因S.（Brimijoin,S.）,“重新工程化的人类丁酰胆碱酯酶加速的***代谢（Cocaine Metabolism Accelerated by a Re-Engineered HumanButyrylcholinesterase）”,药理学与实验治疗杂志（Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics）,302(2):710-716,2002）。
利用分子动力学模拟***受BChE催化水解的第一化学反应步骤的过渡态的进一步实验产生了BChE突变体A227S/S315G/A356W/Y360G，这一突变体的催化效率为野生型BChE的500倍且高于其它先前设计的BChE突变体（潘Y.（Pan,Y.）,高D.（Gao,D.）,杨W.（Yang,W.）,曹H.（Cho,H.）,杨G.（Yang,G.）,台H.（Tai,H.）,詹C.（Zhan,C.）,“用于抗***药物的人类丁酰胆碱酯酶的计算机重新设计（Computationalredesign of human butyrylcholinesterase for anti***e medication）”,美国国家科学院院刊（PNAS）,102(46):16656-61,2005）。
为了获得可适用于治疗性用途的A227S/S315G/A356W/Y360G BChE突变体形式，将由潘（Pan）等人设计的BChE突变体的C端融合至人血清白蛋白（HSA），因为已观察到，类似的融合体展现出稳定性高且血浆半衰期延长的有利药物动力学性质。曾观察到，包含上述突变的BChE-白蛋白融合体保有对***的高催化效率且在对大鼠静脉内注射之后展现出8小时的血浆半衰期。（布瑞米乔因S.（Brimijoin,S.）,高Y.（Gao,Y.）,安克J.（Anker,J.）,格利登L.（Gliddon,L.）,拉弗勒D.（LaFleur,D.）,沙哈R.（Shah,R.）,赵Q.（Zhao,Q.）,“自人类丁酰胆碱酯酶工程化的***水解酶在大鼠中选择性阻断***毒性和药物寻求的恢复（A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement of DrugSeeking in Rats）”,神经精神药理学（Neuropsychopharmacology）,33:2715-25,2008）。
迄今为止，尚未开发出利用包含突变A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合体治疗灵长类动物***滥用或过量的有效方法。
发明内容
本发明提供一种减弱灵长类动物由***暴露所致的生物效应的方法，其包含给予灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含：
（a）突变的丁酰胆碱酯酶（BChE）多肽，其包含序列
EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA
TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGG
GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA
LQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA
VTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF
GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK
EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFT
KKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS
RSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW
TSFFPKV(SEQ ID NO：1)，
（b）人血清白蛋白（HSA）多肽，其包含序列
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV
RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK
AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI
AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR
LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA
LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLH
EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ
IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL(SEQ ID NO：2)，和
（c）信号肽，其包含序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO：3)，
其中所述融合蛋白的所述量有效引起灵长类动物由***暴露所致的生物效应减弱。
附图说明
图1（SEQ ID NO:4）展示AlbuBChE，一种包含突变A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。
图2展示在单次IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后个别猕猴（cynomolgus monkey）中的AlbuBChE血清浓度-时间分布（上图为线性标度，下图为半对数标度）。
图3展示在单次IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后猕猴中的平均AlbuBChE血清浓度-时间分布（上图为线性标度，下图为半对数标度）。
图4展示对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中的平均***浓度相对于时间的分布。
图5展示对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中的平均苯甲酰芽子碱浓度相对于时间的分布。
图6展示对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中的平均芽子碱甲酯浓度相对于时间的分布。
图7展示***对照组第1天与0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE给药后第11天（240小时）的平均***浓度-时间分布的比较。
图8展示在单次IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后猕猴的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物或AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时的动物中IV给予1mg/kg剂量的***。
图9展示***代谢途径。
图10展示在对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中IV给予1mg/kg***之后的平均***AUC(0-t)。
图11展示在对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中IV给予1mg/kg***之后的平均苯甲酰芽子碱AUC(0-t)。
图12展示在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后个别松鼠猴的AlbuBChE血清浓度-时间分布（半对数标度）。
图13展示对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）的平均***浓度相对于时间的分布。
图14展示在对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中IV给予1mg/kg***后5分钟时的平均芽子碱甲酯浓度。
图15展示在对照动物（n=2）和随AlbuBChE给药后时间推移的动物（n=3）中IV给予1mg/kg***后5分钟时的平均苯甲酰芽子碱浓度。
图16展示***注射后5分钟（上图）和30分钟（下图）时***以及***代谢物芽子碱甲酯（EME）和苯甲酰芽子碱（BZ）的松鼠猴血液水平的汇总。
图17展示在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后松鼠猴的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物（n=2）或在AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。
图18展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均心率相对于时间的分布。
图19展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均心率血压乘积相对于时间的分布。
图20展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均动脉血压相对于时间的分布。
图21展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均舒张压（diastolic blood pressure）相对于时间的分布。
图22展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均收缩压（systolic blood pressure）相对于时间的分布。
图23展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均体温相对于时间的分布。
图24A展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均呼吸速率相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图24B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图24B的下图中。
图25A展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均SPO2水平相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图25B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图25B的下图中。
图26展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均ETCO2水平相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图26B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图26B的下图中。
图27展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均动脉血压相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图28展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均舒张压相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图29展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均收缩压相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图30展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均心率相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图31展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均心率血压乘积相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图32展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予1mg/kg剂量的***之后猕猴的平均体温相对于时间的分布。在t=0时给予***剂量。
图33展示在可自行给予***或盐水的连续数天内在自行给药阶段期间松鼠猴的反应率（上图）和注射次数（下图）。在给予媒剂或AlbuBChE（5mg/kg）之后追踪反应持续5天。
图34展示在给予AlbuBChE或AlbuBChE媒剂之后***自行给药的恢复程度。肌肉内给予AlbuBChE或媒剂。2小时、48和96小时后，在盐水替代阶段前5分钟静脉内给予0.3mg/kg***（左图）或静脉内给予0.1mg/kg***（右图）。
图35展示AlbuBChE对经甲基***训练的个体中***区别性刺激效应的调节。
图36展示AlbuBChE给药后经甲基***训练的个体中的甲基***区别性刺激效应。
图37展示白蛋白融合体与非融合肽相比的相对血清浓度，其中白蛋白融合体每周给予一次且非融合肽每日给予。
图38展示自CHO细胞纯化的AlbuBChE的SDS-PAGE。泳道1是分子量标记物，且泳道2和泳道4分别展示在还原和非还原条件下的纯化的AlbuBChE。
图39展示在***给药之前经野生型BChE或Albu-CocH处理的大鼠、仅给予***剂量的大鼠和既未给予***也未给予BChE的大鼠中的光束穿过次数（beamcrossing）相对于时间的分布。如布瑞米乔因（Brimijoin）等人中所述，通过检测红外线光束的断开数来评估自主活动（Locomotor activity）。
图40展示AlbuBChE给药后小鼠中的AlbuBChE浓度相对于时间的分布，而且展示AlbuBChE给药后***水解（以***给药60分钟内***转化成苯甲酸的百分比（BA%）表示）相对于时间的分布。
图41展示自大鼠（n=6）收集的脑和心中的***含量，所述大鼠通过尾静脉给予AlbuBChE（3mg/kg）剂量或盐水，接着10分钟后同样通过尾静脉给予30μCi 3H-***（3.5mg/kg）。3H-***给药后10分钟收集脑和心。从左到右，对照数据是第1条和第3条，而AlbuBChE数据是第2条和第4条。
图42展示自大鼠收集的脑、心和血浆中的***水平（左图）和苯甲酸酯水平（右图），所述大鼠被给予3mg/kg AlbuBChE剂量或盐水，10分钟后给予30μCi 3H-***剂量（3.5mg/kg）。***给药后10分钟收集脑、心和血浆。
图43展示检查AlbuBChE防止致命性过度剂量的能力的研究的实验设计。
图44展示应答0mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg剂量的AlbuBChE后10分钟所给予的100mg/kg剂量的***而展现出机能亢进、癫痫和死亡的大鼠的百分比。
图45展示史泊格多利（Sprague Dawley）大鼠中***浓度相对于时间的分布，所述大鼠被给予0mg/kg、2mg/kg和10mg/kg IV剂量的AlbuBChE，接着5分钟后给予60mg/kg或100mg/kg IP剂量的***。
图46展示成瘾和复发的行为模型。“S”和“D”分别表示盐水和药物***。训练动物触发杠杆按压以达成***输注。在稳定（维持）之后，用盐水替代***且使行为消退。在随后的恢复阶段中，交替给予***引发性注射与盐水。
图47展示由AlbuBChE处理产生的对***引发的药物寻求行为恢复的选择性阻断。用IV注射盐水（S）、***（C，10mg/kg）或***（A，2mg/kg）来引发已先前自行给予***且在***置换为盐水时消退的大鼠。在行为阶段前2小时，IV给予AlbuBChE（E，2mg/kg）。
图48展示在成瘾阶段和强迫戒断后，在盐水注射、***注射（10mg/kg，IV）或是AlbuBChE（2mg/kg，IV）后给予***（10mg/kg，IV）后，大鼠中每阶段的杠杆按压次数。
图49展示在单次静脉内（IV）、皮下（SC）或肌肉内（IM）注射后猕猴的AlbuBChE生物可用性、半衰期和达到最大浓度的时间Tmax，相对于3mg/kg剂量水平下的IV计算IM和SC给药途径的AlbuBChE绝对生物可用性。
具体实施方式
本发明提供一种减弱灵长类动物由***暴露所致的生物效应的方法，其包含给予灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含
（a）突变的丁酰胆碱酯酶（BChE）多肽，其包含序列
EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA
TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGG
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GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK
EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFT
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TSFFPKV(SEQ ID NO：1)，
（b）人血清白蛋白（HSA）多肽，其包含序列
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IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL(SEQ ID NO：2)，和
（c）信号肽，其包含序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO：3)，
其中所述融合蛋白的所述量有效引起灵长类动物由***暴露所致的生物效应减弱。
在方法的一个实施例中，融合蛋白包含序列
MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQ
PPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCL
YLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGAL
GFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLL
SPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNK
DPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDE
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MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR
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LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL
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YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE
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VDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD
FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO：4)。
在方法的另一实施例中，在***暴露之前给予融合蛋白。
在另一实施例中，在***暴露前至多一天给予融合蛋白。
在另一实施例中，在***暴露前至多216小时给予融合蛋白。可在***暴露前1、2、3、4、5、6、7、8或9天给予融合蛋白。
在方法的另一实施例中在***暴露之后给予，融合蛋白。在另一实施例中，在***暴露后至多六小时给予融合蛋白。在另一实施例中，在***暴露后至多一小时给予融合蛋白。
在方法的另一实施例中，***暴露是单次***暴露。
在方法的另一实施例中，***暴露是重复性***暴露。在方法的另一实施例中，重复性***暴露是***滥用或***依赖。
在方法的另一实施例中，重复性***暴露包含在12个月期间至少六次单次***暴露。
在方法的另一实施例中，重复性***暴露包含在灵长类动物一生期间至少二十次单次***暴露。
在方法的另一实施例中，生物效应由灵长类动物中***过量引起，且减弱是治疗或预防所述生物效应。
在方法的另一实施例中，生物效应是血压增高。
在方法的另一实施例中，血压增高的持续时间被降低60%到90%。
在方法的另一实施例中，血压增高的持续时间被降低约78%。
在方法的另一实施例中，生物效应是心率或体温增高。在方法的另一实施例中，减弱程度为45%到70%。在方法的另一实施例中，减弱程度为57%。
在方法的另一实施例中，生物效应是灵长类动物的***寻求行为。
在方法的另一实施例中，***寻求行为出现在***暴露之后的***戒断时期期间。
在方法的另一实施例中，***寻求行为伴有复发。
在方法的另一实施例中，在复发前两小时给予融合蛋白在复发后立即减弱灵长类动物的***寻求行为。
在方法的另一实施例中，在***暴露前两小时给予融合蛋白引起灵长类动物的***寻求行为减少50%到100%。
在方法的另一实施例中，在给予融合蛋白后至多四天观察到***寻求行为的减弱。
在方法的另一实施例中，给予融合蛋白所产生的灵长类动物的总***暴露比不给予时低。
在方法的另一实施例中，减弱***寻求行为产生灵长类动物的***戒断时期。在方法的另一实施例中，戒断时期为2周到3周。
在方法的另一实施例中，减弱***寻求行为所产生的灵长类动物不暴露于***的天数比不给予时多。
在方法的另一实施例中，减弱***寻求行为所产生的灵长类动物不暴露于***的连续天数比不给予时多。
在方法的另一实施例中，如利用***选择性严重程度评估（***e selectiveseverity assessment，CSSA）或精神疾病诊断与统计手册IV（Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders IV，DSM-IV）所评估，减弱***寻求行为引起***依赖或滥用的严重程度减弱。
在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量为在静脉内给予1mg/kg***约30分钟内使灵长类动物的血清***水平降低到约0ng/ml的量。
在方法的另一实施例中，给予融合蛋白在静脉内给予1mg/kg***约5分钟内使灵长类动物的血清***水平降低到低于不给予时血清***水平的12%。
在方法的另一实施例中，给予融合蛋白在静脉内给予1mg/kg***约5分钟内使灵长类动物的血清***水平降低到不给予时血清***水平的7%。
在方法的另一实施例中，仅一次、每日、每半周、每周、每两周或每月给予融合蛋白。
在另一实施例中，每周一次或每周两次给予融合蛋白。
在另一实施例中，在***暴露之后以单剂量形式给予融合蛋白。
在另一实施例中，在***过量之后以单剂量形式给予融合蛋白。
在方法的另一实施例中，通过肌肉內注射或皮下注射来给予融合蛋白。
在方法的另一实施例中，融合蛋白是在包含10mM磷酸钠、200mM甘露糖醇、60mM海藻糖和0.01%（w/v）聚山梨醇酯80，pH值为7.2的调配缓冲液（）中。
在方法的另一实施例中，融合蛋白在调配物中的浓度为至少30mg/ml。
在方法的另一实施例中，在给予融合蛋白后至多72小时观察到生物效应的减弱。
在方法的另一实施例中，灵长类动物是人类。
在方法的另一实施例中，***暴露是10mg到60mg的单次***暴露；或是重复性***暴露，其中重复性***暴露中各单次***暴露是10mg到60mg。
在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是在静脉内给予40mg***约30分钟内使人类的血清***水平降低到约0ng/ml的量。
在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是0.06mg/kg到5mg/kg。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是0.06mg/kg、0.3mg/kg、1.6mg/kg或4.8mg/kg。
在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是50mg到300mg。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是50mg、100mg、150mg或300mg。
包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的一个实施例展示于图1中（SEQ ID NO:4）。图1中所展示的氨基酸序列包含异源信号肽（通过加下划线来展示）、包含人类BChE氨基酸E29到V529的BChE域和人血清白蛋白（HSA）（以斜体展示）。在图1中，氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G以粗体展示并加下划线。取代的编号是相对于全长BChE的编号。由图1氨基酸序列编码的蛋白质在本申请案中称为“AlbuBChE”。
应理解本发明上述实施例的所有组合均在本发明的范畴内。
如本文所用，“灵长类动物”是指哺乳纲的一个目中的任一者，这一目的特征尤其在于双目视觉、抓握附属肢体特化和大脑半球扩大的高等发育，且包括人类、猿类、猴类及相关种类。
如本文所用，“减弱程度”是指与缺乏BChE-白蛋白融合蛋白时所观察到的由***暴露所致的生物效应相比，给予BChE-白蛋白融合蛋白之后所观察到的由***暴露所致的生物效应的降低。减弱程度由下式计算：
举例来说，如果在缺乏BChE-白蛋白融合蛋白时***暴露使基线温度38℃升高到38.7℃，并且在存在BChE-融合蛋白时***暴露使基线温度38℃升高到38.3℃，那么减弱程度是57.1%（(0.7℃-0.3℃)/0.7℃）。
如本文所用，“单次***暴露”是指孤立于任何其它***暴露的一次***暴露。“重复性***暴露”是指一次以上的单次***暴露。重复性***暴露可以是从个体的第二次或后续单次***暴露起定期或不定期模式的单次***暴露。经历重复性***暴露的个体可能符合精神疾病诊断与统计手册IV（DSM-IV）的***依赖或***滥用准则。
如本文所用，术语“总***暴露”是指在既定时间间隔期间的累计***暴露。总***暴露可在旨在减弱***寻求行为或其它由***暴露所致的生物效应的治疗期间或一段时期后测量。
如本文所用，术语“***戒断时期”是指在***暴露之后灵长类动物不经历新***暴露的一段时期。
如本文所用，术语“复发”是指在***戒断时期之后的***暴露。
应理解当提供参数范围时，本发明所提供的所述范围内的整数精确到十分位。举例来说，“0.2mg/kg到15mg/kg”包括0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg等直至并包括15.0mg/kg。
通过使用可见于出版物“行业指南：针对成年健康志愿者治疗估算初期临床试验的最大安全起始剂量（Guidance for Industry:Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers）”,美国卫生与人类服务部（U.S.Department of Health and Human Services）,美国食品药品管理局（Food and DrugAdministration）药品评估和研究中心（Center for Drug Evaluation and Research，CDER）,2005年7月中的换算表，可将动物剂量换算成人类等效剂量（HED）。以mg/kg为单位的猕猴剂量可通过将猕猴剂量除以3.1来换算成以mg/kg为单位的HED。以mg/kg为单位的松鼠猴（squirrel monkey）剂量可通过将松鼠猴剂量除以5.3来换算成以mg/kg为单位的HED。
缩写清单
将图1所示的BChE-白蛋白融合蛋白（AlbuBChE）应用于如以下实例中所述的试验。
实例1-猕猴单次肌肉内给予AlbuBChE并多次静脉内给予***之后的药代动力学和药效学研究
目的
这一试验的目的在于测定雄性猕猴单次肌肉内给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kgAlbuBChE剂量水平后的AlbuBChE药代动力学（PK）分布，和通过在给予AlbuBChE剂量后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时静脉内给予1mg/kg剂量的***来测定AlbuBChE随时间推移的活性。
基本原理
AlbuBChE是人血清白蛋白（HSA）和遗传改良型人类丁酰胆碱酯酶（BChE）的融合蛋白，其对***水解成苯甲酸展现出高催化效率。AlbuBChE作为一种预防药物寻求行为复发的潜在介入术正在开发中。已显示蛋白质与白蛋白的融合通过降低清除率和延长半衰期来改良所述蛋白质的药代动力学性质。预期较长的半衰期将意味着较长的给药间隔以及对药物方案的较佳顺应性。
物种选择的基本原理
基于解剖学、生理学和生化方面与人类的相似性选择猕猴（Cynomolgusmonkey/macaca mulatta）用于本研究，这些相似性会有助于将所观察到的药代动力学和药效学性质外推到人类。已知猴可表达丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶是这一药物的组分。猴在生理上对***也有反应。
剂量水平和途径的基本原理
在先前研究中，AlbuBChE药代动力学分布是在猕猴中进行评估的。在所述研究中，SC（7.8mg/kg、2.4mg/kg和0.78mg/kg）、IM（2.4mg/kg）和IV（2.4mg/kg）给予测试物品。AlbuBChE的药代动力学性质在所有所测量的SC剂量下呈线性。本研究选择IM是基于在先前研究中观察到与SC相比IM的生物可用性较大（分别为35%到39%和79%）。此外，选择0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg的AlbuBChE IM剂量水平来定义猕猴的AlbuBChE药效学范围。
1mg/kg IV***剂量被选择为足以产生生理相关反应并在血液中达到可测量浓度***同时不过度刺激动物的剂量。
各组中的动物数目是评估动物间变异性所必需的每组动物的最低数目。由于这是初步研究，因此仅评估一种性别（雄性）。
测试溶液
测试物品AlbuBChE在-70±15℃下以浓度为29.9mg/mL的冷冻液体调配物的形式储存在储备溶液中。给药前，在室温下解冻测试物品调配物。当测试物品调配物完全解冻时，通过轻轻翻转来混合容器，且用适当体积的测试物品稀释剂稀释以获得20mg/mL的浓度。用测试物品稀释剂连续稀释这一调配物以获得4mg/mL和0.8mg/mL的浓度。
盐酸***、药效学测试物品是购自西格玛公司（Sigma）。剂量水平以盐酸盐的形式表示。
实验设计
研究包括总共11只未经任何处理的成年雄性猕猴，分成以下四个剂量组：
对照组，两只猕猴，仅接受单次IV剂量***；
三个剂量组，用0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg单次IM剂量AlbuBChE处理。各剂量组中使用三只未经任何处理的成年雄性猕猴。AlbuBChE处理后，在AlbuBChE剂量给予后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时给予1mg/kg IV剂量***。
剂量设计和剂量水平的汇总可见于表1中。个体剂量基于剂量给予当天所记录的体重加以计算。动物在剂量给予之前不禁食。
表1：组设计和剂量水平
1所有时间将均在所列时间的±5分钟内
针对AlbuBChE的样品收集
在研究第1天时执行AlbuBChE的单次肌肉内（IM）给药，且在表2中汇总的时间点下收集血液。将约0.5mL全血自股静脉中收集到血清分离管（SST）中。
表2：AlbuBChE的药代动力学
针对***的样品收集
在***各次给药（对照组的研究第1天以及AlbuBChE剂量给予后的第1天（2小时）、第3天（48小时）、第5天（96小时）、第6天（120小时）和第11天（240小时））后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟和60分钟时自股静脉中收集约0.5mL全血。将血液放入具有酯酶抑制剂氟磷酸二异丙酯（diisopropylfluorophosphate，DFP）的K2EDTA血液收集管中。收集后将管翻转数次且置于湿冰上。在收集的45分钟内在2℃到8℃下离心样品。回收所得血浆，且将血浆的单份200μL等分试样置于聚丙烯管中。血浆样品在干冰上冷冻且储存在-75±15℃下。
测定方法
以下概要描述了在给药前和给药后不同时间所获得的猴血清样品之AlbuBChE浓度测量中所用的基于ELISA的测定。
在4℃下用100μL含1μg/mL抗BChE mAb 002-01（艾碧康公司（Abcam）ab17246）的PBS涂布Immulon 4HBX板过夜。在室温下用含2%酪蛋白的1×PBS以200微升/孔阻断2小时。洗涤后，向板中添加100μL经稀释的血清样品以及标准品。标准品是通过将AlbuBChE从2000ng/mL以3.64倍连续稀释到3.1ng/mL产生的。通过用含有合并的猕猴血清的缓冲液稀释来使血清样品和标准品维持在10%血清下。在洗涤步骤后，用100μL 0.04μg/mL的抗has mAb-6502-HRP检测1小时。再次洗涤各孔，随后用100μlTMB底物显色。15分钟后，用100微升/孔1N H2SO4终止反应，且在SpectraMax读板机上在450nm/570nm下读数。通过内推由AlbuBChE标准品的4参数拟合所生成的标准曲线来计算未知血清样品的值。猕猴血清的定量限是21.1ng/mL。
血清中***的LC-MS定量
以下概要描述了血浆样品之***测量中所用的基于LC-MS的测定。在MS分析之前，使用支撑式液体萃取（SLE-ISOLUTE,宝他公司（Biotage））来萃取血浆样品、校准标准品和对照品。25微升样品（25μL）接受150μl 5%氢氧化铵和25μl内标溶液（***-d3）。在混合和转移到SLE板之后，用二氯甲烷洗脱样品，且蒸发到干燥。再悬浮于50μl复原溶液（含5%ACN的10mM乙酸铵水溶液）中后，以0.5ml/min将10μl进样到Thermo Hypercarb柱上。流动相是双相流动相。使用APCI正离子界面（positiveinterface）且多反应监测（MRM）的Api 4000执行质谱检测。使用这一测定来测定***、苯甲酰芽子碱（benzoylecgonine）和芽子碱甲酯（ecgonine methyl ester）的血浆浓度。
AlbuBChE的PK分析
使用个别动物的血清浓度-时间分布来测定AlbuBChE药代动力学参数值。使用计算机软件专业版WinNonlin（4.0.1版，药视公司（Pharsight Corporation）,美国（USA））。具体地说，应用伴以血管外输入（extravascular input）的非房室分析模型。如果血清浓度曲线末端相中的数据点少于3个，那么不计算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK参数。计算所分析的参数，包括tmax,、Cmax、t1/2，AUC(0-t)和AUC(0-∞)。
***的PK分析
当数据允许时，使用***给药的所有研究日个别动物的血浆浓度-时间分布来测定***和其代谢物的药代动力学参数值。使用计算机软件专业版WinNonlin（4.0.1版，药视公司（Pharsight Corporation）,美国（USA））。具体地说，针对***使用伴以IV推注输入（IV bolus input）的非房室分析模型，且针对代谢物使用伴以血管外输入的非房室分析模型。如果血浆浓度曲线末端相中的数据点少于3个，那么不计算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK参数。
PK/PD分析
使用计算机软件专业版WinNonlin（4.0.1版，药视公司（Pharsight Corporation）,美国（USA））来定义AlbuBChE PK/PD关系。具体地说，使用直接S形抑制效应Emax模型，其中假设如由***AUC测量为最大效应（Emax）时，AlbuBChE浓度为零。可如下描述模型方程：
抑制效应S形Emax，Emax时，C=0；E0时，C=无穷大
E=Emax-(Emax-E0)×(Cγ/(Cγ+EC50γ))
由于在48小时时间点时观察到的活性比2小时时间点时高，因此选择S形模型。
用于分析的PD参数是***AUC。模型中所用的PK参数是AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时的AlbuBChE血浆浓度。由于在AlbuBChE给药后2小时未测量到AlbuBChE浓度，因此分析中使用给药后3小时的浓度，且假设AlbuBChE给药后3小时的AlbuBChE浓度可反映AlbuBChE给药后2小时的AlbuBChE浓度。
统计方法
使用WinNonlin中的描述性统计功能来计算实验组的浓度分布和PK参数值的汇总统计。所报导的统计参数是N、平均值、SD和变异系数百分比（CV%）。
结果
AlbuBChE浓度分布
AlbuBChE浓度-时间数据和汇总统计列于表3和表4中。单次0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM注射之后个别动物AlbuBChE血清浓度-时间分布展示于图2中。三个AlbuBChE剂量组的平均血清浓度-时间分布展示于图3中。
在IM注射之后，所有动物均具有可测量的AlbuBChE浓度。如由所有时间点的CV%均在8.2到78.4范围内所指示，每个剂量组的动物间变异性看似合理。AlbuBChE血清浓度随剂量增加而增大。
表3：在单次IM给予每只动物0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后，猕猴的个别和平均AlbuBChE血清浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的分布。
--不适用
LLOQ为27.2ng/ml
表4：在单次IM给予每只动物0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后，猕猴的平均AlbuBChE血清浓度（ng/ml）相对于时间（hr）的汇总。
| 时间（hr） | 0.2mg/kg | 1mg/kg | 5mg/kg |
| 1 | 128 | 1040 | 4324 |
| 3 | 245 | 1665 | 7869 |
| 6 | 210 | 1377 | 10078 |
| 12 | 143 | 967 | 6792 |
| 24 | 94.4 | 625 | 3732 |
| 36 | 61.8 | 398 | 2134 |
| 48 | 73.6 | 306 | 1860 |
| 72 | 42.0 | 163 | 851 |
| 96 | -- | 98.0 | 534 |
| 128 | -- | 48.8 | 256 |
| 144 | -- | 35.5 | 192 |
| 168 | -- | -- | 138 |
| 216 | -- | -- | 81.6 |
| 264 | -- | -- | 46.7 |
--不适用
LLOQ为27.2ng/ml
***、苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的浓度分布
对所有样品执行LC/MS分析以分析猴血浆中的***、苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯水平。对照动物和0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg后的动物中***、苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的平均血浆浓度-时间分布可分别见于表5、表6和表7以及图4、图5和图6中。
一般来说，***血浆浓度似乎随AlbuBChE剂量变化而降低，且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。在AlbuBChE给药后240小时的***浓度似乎与第1天***对照组在相同范围中（图7）。这表明AlbuBChE在0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kgAlbuBChE给药后240小时无活性。这也指示***动力学在猕猴中并不展示时间依赖性动力学，使得可将第1天单次IV剂量***对照组与AlbuBChE给药后多次剂量***分布比较。
正如基于***代谢路径（图9）可预计，苯甲酰芽子碱血浆浓度似乎随AlbuBChE剂量变化而降低且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。
理论上，芽子碱甲酯的血浆浓度应在AlbuBChE给药之后增大（图9）。在所有三个AlbuBChE剂量水平下，这一增大仅在AlbuBChE给药后2小时给予***剂量时较明显。AlbuBChE给药后48小时、96小时、120小时或240小时给予***后的芽子碱甲酯血浆浓度无法轻易地与对照组区分。
表5：对照动物（n=2）或0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM剂量后2小时、48小时、72小时、96小时、120小时和240小时的动物（每剂量组n=3）在猕猴接受1mg/kg IV剂量的***之后的平均***血浆浓度（ng/mL）相对于时间（min）的分布。
对照组和0.2mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和1mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和5mg/kg AlbuBChE剂量
表6：对照动物（n=2）或0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM剂量后2小时、48小时、72小时、96小时、120小时和240小时的动物（每剂量组n=3）在猕猴接受1mg/kg IV剂量的***之后的平均苯甲酰芽子碱血浆浓度（ng/mL）相对于时间（min）的分布。
对照组和0.2mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和1mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和5mg/kg AlbuBChE剂量
表7：对照动物（n=2）或0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM剂量后2小时、48小时、72小时、96小时、120小时和240小时的动物（每剂量组n=3）在猕猴接受1mg/kg IV剂量的***之后的平均芽子碱甲酯血浆浓度（ng/mL）相对于时间（min）的分布
对照组和0.2mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和1mg/kg AlbuBChE剂量
对照组和5mg/kg AlbuBChE剂量
AlbuBChE的药代动力学分析
个别动物在单次IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后的AlbuBChE药代动力学参数值和每组的描述性统计可见于表8中。在IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg之后，AlbuBChE的平均PK参数值汇总于表9中。
一般来说，IM给药位点的吸收快，在所收集的第一样品（给药后1小时）中即观察到可测量的浓度。在0.2mg/kg和1mg/kg剂量水平下，3小时时观察到最大浓度。5mg/kg剂量的Tmax值稍长（6小时）。
AlbuBChE暴露随剂量增加而增大。经剂量归一化的Cmax和AUC值似乎随剂量变化而增大，表明暴露以高于相称比例的方式随剂量变化而增大。这也伴有末端消除t1/2随剂量变化而增大，尤其在1mg/kg与5mg/kg剂量水平之间，t1/2值几乎翻倍。
表8：在单次IM给予每只动物0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后，猕猴的个别和平均AlbuBChE药代动力学参数值。
0.2mg/kg AlbuBChE剂量
1mg/kg AlbuBChE剂量
5mg/kg AlbuBChE剂量
表9：AlbuBChE以0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg单次IM注射于猕猴中之后的平均药代动力学参数值。
| AlbuBChE剂量 | 0.2mg/kg IM | 1.0mg/kg IM | 5.0mg/kg IM |
| t1/2（hr） | 27.2 | 31.0 | 61.8 |
| tmax（hr） | 3 | 3 | 6 |
| Cmax（ng/mL） | 245 | 1665 | 10078 |
| AUC(0-t)（hr·ng/mL） | 6368 | 46871 | 291862 |
| AUC(0-∞)（hr·ng/mL） | 7658 | 48357 | 296006 |
| AUC外推% | 17.4 | 3.04 | 1.55 |
| 经剂量归一化的Cmax | 1226 | 1665 | 2016 |
| 经剂量归一化的AUC(0-∞) | 38292 | 48357 | 59201 |
***和代谢物的药代动力学分析
每个剂量组的平均***药代动力学值的汇总表呈现于表10中。
除了以下一点之外，所有剂量组和时间点的***药代动力学分布均得以充分表征：对于所有剂量组，AlbuBChE给药后2小时所给予的***剂量的血浆浓度-时间分布均可变。因此，在这一***给药时刻，大多数动物的末端消除t1/2均无法精确表征。
***AUC(0-t)似乎随AlbuBChE剂量变化而降低且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。类似地，***全身血浆清除率似乎随AlbuBChE剂量变化而增大且随着AlbuBChE给药后时间推移而回到对照值。AlbuBChE给药后240小时的***AUC和清除率似乎与第1天***对照组在相同范围中。
在所有三个AlbuBChE剂量水平下，给药后48小时观察到AlbuBChE对***清除率或AUC的最大效应。效应的持续时间与AlbuBChE剂量水平有关。在5mg/kg剂量后，直到给药后120小时，AlbuBChE对***AUC和清除率的效应均较明显。在1mg/kg剂量下，在AlbuBChE给药后96小时到120小时，AlbuBChE对***AUC或清除率的效应相对于对照组或240小时值仍较明显。当AlbuBChE剂量降低到0.2mg/kg时，效应持续时间也降低，其中48小时为高***清除率的最后一个时间点。基于这一数据，每周一或两次的AlbuBChE给药方案较为适宜。
如图5中可观察到，苯甲酰芽子碱的浓度-时间分布并不包括末端消除相。因此，苯甲酰芽子碱的药代动力学表征限于对AUC(0-t)的表征。随AlbuBChE剂量和AlbuBChE给药后时间而变的平均AUC值与***对照组相比较的汇总表可见于表11中。如图11中所示，与***代谢路径（图9）一致，苯甲酰芽子碱AUC随AlbuBChE剂量变化而降低且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。
如图6中可观察到，芽子碱甲酯的浓度-时间分布是平直的且并不包括末端消除相。因此，不执行芽子碱甲酯的药代动力学表征。理论上，芽子碱甲酯的AUC应在AlbuBChE给药之后增大（图9）。在所有三个AlbuBChE剂量水平下，这一增大仅在AlbuBChE给药后2小时给予的***剂量时较明显。AlbuBChE给药后48小时、96小时、120小时或240小时***给药后AlbuBChE对芽子碱甲酯的效应无法轻易地与对照组区分。
表10：对照动物（n=2）或0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kgAlbuBChE IM剂量后2小时、48小时、72小时、96小时、120小时和240小时的动物（每剂量组n=3）在猕猴接受1mg/kg IV剂量的***后的平均***药代动力学参数值。
NA不适用或因数据不允许而未测定。
表11：对照动物和随AlbuBChE给药后时间推移的动物的平均苯甲酰芽子碱AUC(0-t)（min·ng/mL）的汇总表。
| 2hr | 48hr | 96hr | 120hr | 240hr | |
| 对照组 | 4641 | -- | -- | -- | -- |
| 0.2mg/kg | 3136 | 1989 | 3270 | 3583 | 4089 |
| 1mg/kg | 1960 | 1668 | 2741 | 2809 | 3660 |
| 5mg/kg | 1405 | 1441 | 3222 | 3624 | 5088 |
PK/PD分析
基于AlbuBChE的作用机理，预期直接效应抑制Emax模型将能表征AlbuBChE和***的PK/PD关系。
分析中所用的PK和PD数据展示于表12中。由直接S形抑制效应Emax模型产生的拟合展示于图8中。
数据清楚地展示出AlbuBChE血清浓度与***暴露之间呈反比关系。由模型估算出可引起***浓度降低50%的AlbuBChE血清浓度（EC50）为约600ng/mL。Emax、E0和γ值分别为12909（min·ng/mL）、1096（min·ng/mL）和0.708。
表12：在单次IM给予0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后猕猴中的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物或AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时的动物中IV给予1mg/kg剂量的***。
PK参数：AlbuBChE给药后3小时#、48小时、96小时、120小时和240小时，每只动物的AlbuBChE血浆浓度。
PD参数：AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时，每只动物的***AUC(0-t)。
#AlbuBChE给药后2小时未测量到AlbuBChE浓度，分析中使用AlbuBChE给药后3小时的AlbuBChE浓度。
动物观察
在整个研究中对动物进行观察。在研究期间无死亡，且无与任一剂量AlbuBChE给药有关的临床或笼边观察。在未用测试物品预处理的情况下给予1mg/kg剂量的***引起机能亢进和伴以腹式呼吸的呼吸速率增大。***相关的观察在用测试物品预处理后在0.2mg/kg到5mg/kg范围内的AlbuBChE剂量下持续五天未观察到，但在研究第6天和第11天时重现。
结论
在0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg单次IM剂量后，猕猴对AlbuBChE耐受良好。
IM给药位点的AlbuBChE吸收快。0.2mg/kg和1mg/kg剂量在3小时时观察到Tmax，且5mg/kg剂量在6小时时观察到Tmax。AlbuBChE暴露似乎以高于相称比例的方式随剂量变化而增大。在1mg/kg与5mg/kg剂量水平之间，末端消除t1/2从31小时增大到62小时。
对照动物在第1天以及AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时给予***。在各***给药之后，抽取多个样品，以测定应答AlbuBChE血清水平降低的药代动力学分布。***AUC(0-t)随AlbuBChE剂量变化而降低且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。
效应的持续时间与AlbuBChE剂量水平有关。AlbuBChE对***AUC和清除率的效应在5mg/kg剂量下直到120小时为明显的，在1mg/kg剂量下直到96小时至120小时为明显的，且在0.2mg/kg剂量下直到48小时为明显的。基于这一数据，每周一或两次的AlbuBChE给药方案较为适宜。
猕猴中的PK/PD关系似乎指示AlbuBChE血清浓度与***暴露之间呈反比关系。由直接S形抑制效应Emax模型模型估算出可引起***浓度降低50%的AlbuBChE血清浓度（EC50）为约600ng/mL。
实例2-松鼠猴的AlbuBChE药代动力学药效学（PK/PD）研究
目的
为了评估向松鼠猴单次肌肉內注射5mg/kg AlbuBChE后AlbuBChE的药代动力学和药效学。在对照动物或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物中IV给予1mg/kg剂量的***之后，测量AlbuBChE药效学效应。
研究设计
剂量水平：基于先前对猕猴的研究选择5mg/kg的AlbuBChE剂量水平，在所述研究中发现这一剂量水平有效减少***暴露。1mg/kg的***IV剂量是以文献报导为基础的，这一剂量足以在猴中引起效应，且不会造成过度机能亢进。针对AlbuBChE给药选择IM给药途径，因为这一途径是向人类给药的预定途径。
表13：测试***和不含溶剂的物质
表14：组设计和剂量水平
AlbuBChE药代动力学样品
在给药前、给药后24小时、72小时、96小时和336小时，自股静脉收集血液样品（0.4mL），且放入血清分离管（SST）中（在给药后336小时（14天）下收集的样品预定用于评估免疫原性。所述样品也用于分析AlbuBChE浓度）。在离心之前，将管在室温下维持至少1小时，但不超过4小时。离心样品，且收集至少200μL血清并维持在干冰上，随后在约-70℃下储存。
***药代动力学样品
在各***给药后，在给药后5分钟和30分钟，自股静脉收集约0.4mL全血。将血液放入具有酯酶抑制剂（二异丙基氟磷酸酯（DFP））的K2EDTA血液收集管中。收集后将管翻转数次且置于湿冰上。在收集的45分钟内在2℃到8℃下离心样品。回收所得血浆，且将血浆的单份200μL等分试样置于聚丙烯管中。血浆样品在干冰上冷冻且储存在约-70℃下。
AlbuBChE样品分析
以下段落简单地描述了血清样品AlbuBChE浓度测量中所用的基于ELISA的测定。
在4℃下用100μl含1μg/mL抗人类BChE mAb 002-01（艾碧康公司（Abcam））ab17246）的PBS涂布Immulon 4 HBX板过夜。在室温下用含2%酪蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBS）以200微升/孔阻断2小时。洗涤后，向板中添加100μL经稀释的血清样品以及标准品。标准品是通过将AlbuBChE从420ng/mL以2.6倍连续稀释到5.2ng/mL产生的。通过用含有合并的猕猴血清的缓冲液稀释来使血清样品和标准品维持在10%血清下。在洗涤步骤后，用100μl 0.04μg/mL的抗HSA mAb-6502-HRP检测1小时。再次洗涤各孔，随后用100μL四甲基联苯胺底物显色。15分钟后，用100微升/孔1N H2SO4终止反应，且在SpectraMax读板机上在450nm/570nm下读数。通过内推由AlbuBChE标准品的5参数拟合所生成的标准曲线来计算未知血清样品的值。同样，分析在给药前和给药后第14天收集的血清样品的免疫原性。
AlbuBChE药代动力学和PK/PD分析
使用个别动物的血清浓度-时间分布来测定AlbuBChE药代动力学参数值。使用计算机软件专业版WinNonlin（4.0.1版，药视公司（Pharsight Corporation）,美国（USA））。具体地说，应用伴以血管外输入的非房室分析模型。
尽管数据有限，但仍试图表征PK/PD关系。使用计算机软件专业版WinNonlin（4.0.1版，药视公司（Pharsight Corporation）,美国（USA））。具体地说，使用直接抑制效应Emax模型，其中假设Emax时，AlbuBChE浓度为零。可如下描述模型方程：
E=Emax×(l-(C/(C+EC50)))
分析中所用的PD参数是***给药后5分钟的***血浆浓度。模型中所用的PK参数是AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的AlbuBChE血浆浓度。由于AlbuBChE给药后2小时未测量到AlbuBChE浓度，因此分析中使用所收集的第一时间样品（AlbuBChE给药后24小时），且假设AlbuBChE给药后24小时的AlbuBChE浓度可反映AlbuBChE给药后2小时的AlbuBChE浓度。由于分析中所用的数据有限且附有假设，因此需将来自这一PK/PD分析的参数值视作近似估算值。
结果
AlbuBChE
表15和图12提供单次肌肉内给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后三只雄性松鼠猴中的AlbuBChE血清浓度-时间分布。表16汇总了AlbuBChE松鼠猴药代动力学参数值。
如由高于0.9的Rsq值所指示，AlbuBChE末端消除斜率经充分表征。如由不到20%的外推AUC%所指示，曲线下面积也经充分表征。由于第一样品是在给药后24小时收集到，因此AlbuBChE浓度-时间分布的初始吸收相未经表征。因此，所报导的Tmax和Cmax是表观值，因为可预计实际Tmax出现在3小时与6小时之间。三只动物的AlbuBChE暴露一致，且水平差异仅在2周之后才明显。举例来说，三只动物的AUC值在狭小的范围中，且CV%为约7%。估算AlbuBChE末端消除t1/2在45.5小时到65.5小时范围内（平均半衰期为56.6小时）。
表15：在单次IM给予每只动物5mg/kg AlbuBChE剂量之后，个别松鼠猴的AlbuBChE血清浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的分布。
表16：在单次IM给予每只动物5mg/kg AlbuBChE剂量之后，个别松鼠猴的AlbuBChE药代动力学参数值。
***和代谢物
在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。生物分析方法测量***和其两种代谢物（芽子碱甲酯和苯甲酰芽子碱）的血浆浓度。***代谢路径展示于图9中，芽子碱甲酯代谢物通过丁酰胆碱酯酶由***直接形成。因此，可预测这一代谢物在AlbuBChE给药之后将增多。
对照组和经AlbuBChE处理的松鼠猴中的个别和平均***血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的数据展示于表17中。平均***浓度相对于时间的汇总展示于图13中。在对照动物中观察到最高***浓度。在AlbuBChE给药后2小时观察到最低***水平，值达到对照组的约7%。***浓度随AlbuBChE给药后时间推移而增大，但即使在AlbuBChE给药后96小时，***浓度仍为对照动物的60%。
对照组和经AlbuBChE处理的松鼠猴中的个别和平均芽子碱甲酯血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的数据展示于表18中。平均芽子碱甲酯浓度的汇总展示于图14中。正如所料，***给药后5分钟对照动物中的芽子碱甲酯浓度较低。经AlbuBChE处理的动物中的所述值为约40倍，且在AlbuBChE给药后2小时观察到最高浓度。芽子碱甲酯浓度随AlbuBChE给药后时间推移而降低，但即使在AlbuBChE给药后96小时，芽子碱甲酯浓度仍高于对照动物。
对照组和经AlbuBChE处理的松鼠猴中的个别和平均苯甲酰芽子碱血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的数据展示于表19中。平均苯甲酰芽子碱浓度的汇总展示于图15中。正如所述，AlbuBChE对***代谢物苯甲酰芽子碱的效应不太明显。
图16展示***注射后5分钟和30分钟时***和***代谢物芽子碱甲酯（EME）和苯甲酰芽子碱（BZ）血液水平的汇总。与媒剂给药后注射***的对照组相比，AlbuBChE给药后2小时的***血液水平在5分钟与30分钟时间点时均显著降低（分别为F3.7=7.34，p<0.05和F3.7=14.4，p<0.005）。***后30分钟，AlbuBChE后72小时的***水平仍显著低于对照组水平。在给药后96小时的5分钟或30分钟时间点时，AlbuBChE的效应不显著。AlbuBChE对EME水平的效应类似，但与对***的效应的方向相反。AlbuBChE给药后2小时的EME血液水平在5分钟与30分钟时间点时均升高（分别为F3.7=5.6，p<0.05和F3.7=33.3，p<0.001）。EME的血液水平在AlbuBChE后72小时的30分钟时间点时仍然显著升高。虽然AlbuBChE后2小时的BZ血液水平似乎稍降低，但这些效应并不显著。
表17：在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后，个别松鼠猴的***血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的分布。在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后5分钟时的***浓度
<LLOQ(1ng/mL）
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后30分钟时的***浓度
<LLOQ(1ng/mL）
对照动物中***给药后5分钟和30分钟时的***浓度
| ***给药后的时间 | MKY548 | MKY27B | 平均值 |
| 5min | 185 | 239 | 212 |
| 30min | 82.6 | 154 | 118 |
<LLOQ(1ng/mL）
对照动物和随AlbuBChE给药后时间推移的动物中的平均***浓度相对于时间的汇总表
表18：在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后个别松鼠猴的芽子碱甲酯血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的分布。在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后5分钟时的芽子碱甲酯浓度
| AlbuBChE给药后的时间 | MKY 547 | MKY 3434 | MKY 53B | 平均值 | SD | CV% |
| 2 | 109 | 417 | 333 | 286 | 159 | 55.6 |
| 72 | 29.3 | 101 | 73.2 | 67.8 | 36.2 | 53.3 |
| 96 | 40.5 | 72.3 | 35.8 | 49.5 | 19.9 | 40.1 |
<LLOQ(1ng/mL）
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后30分钟时的芽子碱甲酯浓度
| AlbuBChE给药后的时间 | MKY 547 | MKY 3434 | MKY 53B | 平均值 | SD | CV% |
| 2 | 252 | 314 | 218 | 261 | 48.7 | 18.6 |
| 72 | 61.3 | 112 | 81.7 | 85.0 | 25.5 | 30.0 |
| 96 | 25.7 | 76.8 | 45.2 | 49.2 | 25.8 | 52.4 |
<LLOQ(1ng/mL）
在对照动物中给予***后5分钟和30分钟时的芽子碱甲酯浓度
| ***给药后的时间 | MKY 548 | MKY 27B | 平均值 |
| 5min | 1.61 | 12.8 | 7.21 |
| 30min | 1.27 | 1.34 | 1.31 |
<LLOQ(1ng/mL）
对照动物和随AlbuBChE给药后时间推移的动物中的平均芽子碱甲酯浓度相对于时间的汇总表
表19：在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后，个别松鼠猴的苯甲酰芽子碱血浆浓度（ng/mL）相对于时间（hr）的分布。在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后5分钟时的苯甲酰芽子碱浓度
| AlbuBChE给药后的时间 | MKY 547 | MKY 3434 | MKY 53B | 平均值 | SD | CV% |
| 2 | 4.83 | 23.3 | 20.1 | 16.1 | 9.87 | 61.4 |
| 72 | 9.93 | 41.7 | 28.8 | 26.8 | 16.0 | 59.6 |
| 96 | 15.5 | 36.2 | 26.3 | 26.0 | 10.4 | 39.8 |
<LLOQ(1ng/mL）
AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时给予***后30分钟时的苯甲酰芽子碱浓度
<LLOQ(1ng/mL）
在对照动物中给予***后5分钟和30分钟时的苯甲酰芽子碱浓度
| ***给药后的时间 | MKY 548 | MKY 27B | 平均值 |
| 5min | 34.4 | 31.6 | 33.0 |
| 30min | 25.1 | 29.9 | 27.5 |
<LLOQ(1ng/mL）
对照动物和随AlbuBChE给药后时间推移的动物中的平均苯甲酰芽子碱浓度相对于时间的汇总表
AlbuBChE PK/PD关系
尽管时间点和动物有限，但仍试图表征雄性松鼠猴的AlbuBChE PK/PD关系。分析中所用的PK和PD数据展示于表20中。个别数据和由直接抑制效应Emax模型产生的拟合展示于图17中。数据清楚地展示出AlbuBChE血清浓度与***水平之间呈反比关系。由模型估算出可引起***浓度降低50%的AlbuBChE血清浓度（EC50）为约400ng/mL。Emax为213ng/mL。由于分析中所用的数据有限且附有假设，因此需将来自这一PK/PD分析的参数值视作近似估算值。
表20：在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后松鼠猴的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。
PK参数：AlbuBChE给药后24小时#、72小时和96小时的AlbuBChE血浆浓度。
PD参数：***给药后5分钟时的***血浆浓度。
#由于在AlbuBChE给药后2小时未测量到AlbuBChE浓度，因此分析中使用所收集的第一时间样品（AlbuBChE给药后24小时），且假设AlbuBChE给药后24小时的AlbuBChE浓度可反映AlbuBChE给药后2小时的AlbuBChE浓度。
结论
在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE后的三只雄性松鼠猴中表征AlbuBChE药代动力学分布。暴露的变异性程度最小（约7%）。估算AlbuBChE末端消除t1/2在45.5小时到65.5小时范围内。
在对照动物（n=2）或AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物（n=3）中IV给予1mg/kg剂量的***。AlbuBChE引起***暴露降低。AlbuBChE给药后2小时的效应最为显著（低于对照组的7%）。在AlbuBChE给药后96小时***暴露为对照组的约60%。
与AlbuBChE作用机理一致，***代谢物芽子碱甲酯暴露在AlbuBChE给药后2小时增大约40倍且随着AlbuBChE给药后时间推移而降低。
AlbuBChE对***代谢物苯甲酰芽子碱的效应不太明显。
松鼠猴的PK/PD关系似乎指示AlbuBChE血清浓度与***水平之间呈反比关系。由直接抑制效应Emax模型模型估算出可引起***浓度降低50%的AlbuBChE血清浓度（EC50）为约400ng/mL。由于分析中所用的数据有限且附有假设，因此需将来自这一PK/PD分析的参数值视作近似估算值。
实例3-AlbuBChE：在给予或不给予***的情况下对猕猴心血管安全药理学的研究
目的
为了评估3只雄性猕猴和3只雌性猕猴中通过肌肉内（IM）途径给予的AlbuBChE的心血管和呼吸安全性。另外，在另一组的3只雄性猕猴和3只雌性猕猴中评估***（通过静脉内（IV）途径给予）、AlbuBChE和其组合对心血管安全性的效应。
研究设计
在研究开始之前，以外科手术方式给猴装上遥测发射机和血管通路入口。监测以下CV参数：收缩压、舒张压、平均动脉血压、平均心率和平均心率-血压乘积。此外，监测体温变化。
研究组1（3只雄性和3只雌性）作为对照组，用于测试单独AlbuBChE与其媒剂相比的效应。在研究日（SD）1和4，给予（IM）猴对照物品AlbuBChE调配缓冲液。给予调配缓冲液后3小时，分别记录呼吸和心血管（CV）参数。
在SD 8和11，给予单次IM剂量的测试物品（15mg/kg AlbuBChE）。AlbuBChE给药后3小时（对应于AlbuBChE的Tmax），分别监测CV和呼吸参数。
对第二组（组2）动物（3只雄性和3只雌性）测试***剂量之前AlbuBChE预处理对CV参数的效应。在SD 15，在IM给予AlbuBChE调配缓冲液，接着3小时后单次IV给予盐水（***媒剂）后，记录第一基线CV参数。在SD 18，使动物接受AlbuBChE调配缓冲液的单次IM注射，接着3小时后接受单次IV剂量的***（1mg/kg，IV），测量***对CV参数的效应。
在SD 22，监测AlbuBChE预处理对经***诱导的CV参数变化的效应。单次IM剂量的AlbuBChE（15mg/kg），接着3小时后单次IV剂量的***（1mg/kg）后，记录CV参数（参见表21）。
观察所有动物的发病率、死亡率、损伤以及食物和水的利用度，每日至少两次。监测对测试物品给药的生理反应，包括血压、心率、体温和心电图（ECG）。
表21：组设计和剂量水平
结果
所有动物均存活到研究结束。
研究组1
如图18到图26中所示，与在AlbuBChE调配缓冲液的情况下测定的基线值相比，15mg/kg的AlbuBChE（IM）在所记录的CV参数或体温方面均未产生任何显著变化。
研究组2
在***（1.0mg/kg，IV）给药后2分钟内，平均动脉血压（MAP）升高，比基线值105mmHg高约35mmHg。如图27中所示，在***给药之前用15mg/kgAlbuBChE预处理不仅展示出AlbuBChE使最大血压降低，而且展示出逆转效应的时间缩短为原来的1/4.5（在***给药前用AlbuBChE预处理后为17分钟，而单独给予***时为77分钟）。
***给药（1.0mg/kg，IV）引发心率在约3分钟内从基线值140次心跳/分钟快速升高达到峰值240次心跳/分钟（升高了70%)。这一***诱导的心率升高持续约15分钟，在***给药后2小时逐渐消失并回到基线值。用AlbuBChE预处理削弱了***诱导的心率升高，在约3分钟内展示出快速但适度的升高（30%），达到峰值182次心跳/分钟。如图30中所示，心率的这一适度升高在***给药之后30分钟就完全逆转回到基线值。
与基线温度38℃相比，***给药（1.0mg/kg，IV）引起体温适度并逐步的升高，其中峰值出现在给药后45分钟，为38.7℃。如图32中所示，在***给药之前用AlbuBChE（15mg/kg，IM）预处理仅引起体温的略微升高，达到值38.3℃。
实例4-AlbuBChE：对松鼠猴***自行给药和***自行给药恢复的研究
方法
对象
使用体重0.8kg到1.2kg的成年雄性松鼠猴（squirrel monkey，Saimiri sciureus）作为对象。所有猴均个别圈养在湿度和温度受控的房间中且可自由饮水。根据任何实验程序喂给猴经测定量的食物（实验室膳食5045（Lab Diet 5045）,PMI营养国际公司（PMINutrition International）,印第安纳州里士满（Richmond,IN）；香蕉软饼（Banana Softies）,生物服务公司（BioServ）,新泽西州弗伦奇敦（Frenchtown,NJ））来维持稳定体重。每日还提供新鲜水果、蔬菜和环境丰容（environmental enrichment）。动物照护设施得到AAALAC的充分认证，且所有实验均经过NIDA机构研究项目动物照护和使用委员会（NIDA Intramural Research Program Animal Care and Use Committee）批准。
***自行给药
训练三只猴静脉内自行给予30微克/千克/注射***。自行给药训练程序的细节可见于别处（贾斯汀诺瓦（Justinova）等人，2003）。简单地说，将猴以坐姿置于普列克斯（Plexiglas）约束椅中。将所述椅封闭于较大声学室中。约束椅的前壁上有反应杠杆（response lever）和刺激光。绿光意味阶段开始。训练猴作出10次接受***静脉内注射的反应（固定比率，FR，10）。***的注射伴随有绿光关闭以及呈现2秒的黄色刺激光。各次***注射之后，还有60秒的暂停。在暂停结束时，绿光开启。阶段持续1小时。有时，用盐水替代***。在确立了稳定的***自行给药和盐水替代后可靠的反应消退之后，在自行给药阶段前2小时，给予AlbuBChE（5mg/kg，肌肉內）或其媒剂（肌肉內）。随后，连续5天测量自行给药反应。在各次药物测试或盐水替代之后，重建对30微克/千克/注射***的反应，持续至少5天。在恢复测试（参见下文）之后，将自行给药可获得的***剂量降低到10微克/千克/注射，且再次测定AlbuBChE（5mg/kg，肌肉內）的效应。
***自行给药的恢复
能可靠地静脉内自行给予30微克/千克/注射***的猴中，用盐水替代***。反应快速减少且在多天内保持在所述低水平下。随后，先给予AlbuBChE媒剂，2小时后给予***（0.3mg/kg，静脉内），***给予后5分钟进行可自行给予盐水的阶段以判定***是否将恢复自行给药反应。48小时和96小时后，在盐水自行给药阶段之前也给予相同剂量的***。随后，给予AlbuBChE（5mg/kg，肌肉内），2小时后进行第二次序的使用0.3mg/kg静脉内***的3次恢复测试。在这些测试之后，使猴回到可自行给予30微克/千克/注射***的基线。随后，再次用盐水替代***，且以类似方式执行第二系列的恢复测试，除了在恢复阶段之前静脉内给予0.1mg/kg***。
药物
AlbuBChE由梯瓦药物公司（TEVA Pharmaceutical，以色列内坦亚（Netanya,Israel））提供，呈30mg/ml浓度的冷冻溶液形式。溶液一旦解冻后，就用媒剂稀释到15mg/ml，且随后给予猴0.33ml/kg的量。***（NIDA，马里兰州巴尔的摩（Baltimore,MD））在无菌盐水中制备，且自行给药时给予0.2ml的体积。当作为恢复研究的预处理时，***的给予量为0.3ml/kg。
数据分析
针对各代谢物和时间点（5分钟或30分钟），分别分析血液水平数据。使用经媒剂处理的猴的结果作为对照组，执行单因素方差分析（ANOVA）及跟踪邓尼特检验（Dunnetttest）。在媒剂处理或AlbuBChE处理后，针对反应率或注射分别分析自行给药数据。通过求取前面刚描述的基线条件最后3天的平均值，将对照数据包括于分析中。随后执行个体内ANOVA及跟踪检验以对比媒剂或AlbuBChE后的数天与对照组。在恢复测试中，针对反应率和注射执行双因素ANOVA，其中以媒剂或AlbuBChE后的时间作为个体内因素且预处理（媒剂或AlbuBChE）作为个体间因素。跟踪对比比较各时间点的媒剂和AlbuBChE。
结果
在自行给予30微克/千克/注射***的猴中，AlbuBChE减少自行给药。图33的图展示在连续数天内的反应率（上图）和注射（下图）。前5天展示基线反应。随后，用盐水替代***，且当与前述基线期间最后3天的平均值相比时，比率（F5,10=37.0，p<0.001）与注射（F5,10=188.7，p<0.001）在替代的5天中均显著降低。在回到基线的5天后，用媒剂处理猴且进行5天的自行给药训练。当与前述基线期间最后3天的平均值相比时，媒剂处理对注射无影响（F5,10=2.6，p=0.10）。关于反应率观察到数天的整体效应（F5,10=4.6，p<0.05），然而，跟踪对比未能揭示在反应方面媒剂处理后5天中的任一天与对照有任何显著变化。在媒剂处理之后，给予猴5mg/kg AlbuBChE且追踪***自行给药持续5天。观察到反应率（F5,10=4.6，p<0.05）与注射（F5,10=14.1，p<0.001）与先前基线最后3天平均值相比均发生显著变化。跟踪对比揭示反应率在处理后第1天到第4天与对照组不同，且注射在处理后第1天和第4天与对照组显著不同。
在恢复测试（参见下文）之后，使猴回到较低***剂量（10微克/千克/注射）的自行给药。降低维持剂量会使反应率和注射次数降低（图33右图）。在基线稳定之后，给予猴媒剂注射且自行给药持续5天。
与基线最后3天的平均值相比，媒剂注射后，反应率和注射均未显著改变。随后，给予AlbuBChE（5mg/kg），且***自行给药再持续5天。在AlbuBChE注射后2小时，反应率与注射均降低，但这些效应未能达到显著程度。
在对30微克/千克/注射***反应的猴中，用盐水替代***引起反应快速减少。随后，肌肉內给予AlbuBChE媒剂。2小时、48小时和96小时后，静脉内给予0.3mg/kg***，5分钟后进行盐水替代阶段。如图34的左图黑条中所示，***给药引起***自行给药反应的恢复。当肌肉内给予5mg/kg AlbuBChE且2小时、48小时和96小时后静脉内给予0.3mg/kg***随即开始盐水替代阶段时，反应恢复的反应率（F1,4=16.9，p<0.05）与注射（F1,4=34.9，p<0.001）在2小时时间点时被显著阻断。随后，以相同方式用0.1mg/kg***作为恢复剂量对猴进行测试。虽然对较低***剂量的恢复变异性较大，但观察到类似模式的结果，其中5mg/kg AlbuBChE的效应在反应（F1.4=15.2，p<0.05）与注射（F1.4=129.7，p<0.001）方面在2小时时均再次变显著。
在经训练以区别0.6mg/kg甲基***与盐水的4只猴中，在0.3mg/kg剂量下，***完全替换为甲基***（图35，上图）。当在***剂量-效应功能测定前2小时给予5mg/kgAlbuBChE时，0.3mg/kg***未能泛化成甲基***暗示。
在较高***剂量（1.0mg/kg）下，观察到部分替代（约70%）。AlbuBChE后24小时，0.3mg/kg剂量的***仍未能完全泛化成甲基***暗示（约70%），但1.0mg/kg现完全泛化成甲基***。AlbuBChE后48小时，0.3mg/kg剂量完全泛化成甲基***暗示。甲基***剂量-效应功能测定前2小时用AlbuBChE预处理并不影响甲基***泛化成甲基***暗示（图36，上图）。用AlbuBChE预处理并不影响在任一治疗条件下的反应率（图35和图36，下图）。
猴经训练自行给予***且同时测试恢复程序，接受总共4次AlbuBChE注射。在第一次、第二次和第四次AlbuBChE注射之后采集血液以测定AlbuBChE抗体。在前两次注射后，抗体水平低于检测水平（效价水平为20）。然而，在第四次注射之后，抗体水平似乎升高。在2只猴中，抗体效价稍高过检测限（21和43）。在第3只猴中，抗体水平明显升高（643）。AlbuBChE注射后一周这只猴子血液中的AlbuBChE浓度也降低（27ng/ml相对于其它2只猴的55ng/ml和53ng/ml）。
讨论
这些研究的结果清楚展示用BChE改良型预处理在非人类灵长类动物中有效拮抗***行为效应。这一工作使先前在啮齿动物中使用这一化合物的工作得以延伸，先前工作展示AlbuBChE可拮抗大鼠***毒性效应，而且可阻断***诱导的***自行给药恢复（布瑞米乔因（Brimijoin）等人，2008）。这里，用5mg/kg AlbuBChE预处理降低了自行给予30微克/千克/注射***的猴的反应率与注射。在这些针对自行给药消退后***自行给药恢复而测试的相同猴中，5mg/kg AlbuBChE能够阻断由0.3mg/kg或0.1mg/kg***造成的反应恢复。在自行给药可用剂量降低到10微克/千克/注射时，AlbuBChE似乎再次降低反应率和接受注射次数，不过在10微克/千克/注射***的情况下，这些效应变异性较大且未能达到显著程度。最后，5mg/kgAlbuBChE剂量也能够拮抗***泛化成甲基***区别性刺激，但这一效应对***具有专一性，因为AlbuBChE不能拮抗甲基***的区别性刺激效应。
当针对自行给予30微克/千克/注射***而测试时，AlbuBChE的效应在3天后仍然明显，不过效用降低。然而，在恢复和区别时，AlbuBChE的效应在治疗后48小时已不明显。AlbuBChE的半衰期展示为约56小时且对***代谢的效应在AlbuBChE给药后72小时仍然明显，所以已可预期对这些程序的一些效应在72小时时应明显。多种因素可造成在72小时时看不到恢复降低或***泛化。在自行给药期间，长期给予较小剂量的***。在其它程序中，相对较大剂量的***以推注注射的形式给予。与在其它条件下相比，在自行给药条件下，AlbuBChE可能更容易在***到达脑之前代谢***。当AlbuBChE在自行给药下代谢***时，其效应为建立消退条件。自消退的行为恢复也可延长AlbuBChE处理对自行给药的效应。在恢复研究中，反应产生盐水和先前与强化有关的刺激。当猴在***注射后恢复反应时，猴仍然针对反应接受盐水，但其也接受先前与***有关刺激。这一刺激的存在也可促进在恢复条件下继续反应（斯皮尔曼（Spealman）等人，1999），遮蔽AlbuBChE的一些效应。
AlbuBChE的效应几乎一定与其对***代谢的效应有关。AlbuBChE给药使血液中***的量降低持续至少72小时。在AlbuBChE之后EME水平也增大至少72小时的事实表明AlbuBChE与天然BChE类似地代谢***（琼斯（Jones），1984）。***代谢的这一时程与在用30微克/千克/注射***强化猴的自行给药实验中所见的时程类似。此外，AlbuBChE在区别研究中对反应率无影响，表明其并不对与血液中***存在无关的操作性反应产生非专一性效应。
一只猴在第四次注射后观察到相对较高的AlbuBChE抗体水平，指示AlbuBChE对多次注射可能丧失其部分效用。虽然这只特定的猴子的结果并未呈现不同于受试的其它2只猴子，但抗体的观察表明一些AlbuBChE将被抗体结合，可能使其代谢***的能力降低。将需要进一步工作来确定灵长类动物中抗体生成有多普遍且所观察到的抗体水平是否足以降低AlbuBChE代谢***的效用。
在DAWN调查中，在急诊室提述和法医（medical examiner）报导中均持续出现***。因此，可抵消***毒性效应的药物可成为针对滥用***患者的急诊室治疗的有效辅助物。使用代谢***的药物的优势在于其将对***具有专一性且应具有最小副作用。然而，应必需证实患者使用***，因为AlbuBChE不会有效针对由其它滥用药物（例如***）产生的毒性（其可能产生类似型谱的毒性效应）。
除治疗***的毒性效应以外，AlbuBChE也可适用作其它***滥用疗法的辅助物。服用***的具足量AlbuBChE血液水平的人预期将经历***的主观效应减少。在当前研究的情形下，这意味着***自行给药减少、***自行给药恢复减少以及***不能泛化成甲基***区别性刺激。由于***滥用复发在治疗中仍是一个问题，因此将预期***主观效应减少可减少复发。对于复发使用的正接受治疗者，血液中AlbuBChE的存在将代谢大部分***且潜在地降低连续使用***的可能性。这将需要个体在将预期复发的整个时期连续服用AlbuBChE。因此，关键将在于确定AlbuBChE抗体的发展有多普遍且所述现象可如何影响AlbuBChE代谢***的能力。
总之，用AlbuBChE预处理松鼠猴能够降低***推注处理之后血液中***的量。用AlbuBChE预处理也能够减少已经训练自行给予10微克/千克/注射和30微克/千克/注射***的猴的***自行给药。AlbuBChE能够针对2种不同剂量的***阻断***诱导的***自行给药恢复。最后，AlbuBChE也能够在松鼠猴中拮抗***的区别性效应。AlbuBChE能够在3种不同的***行为效应模型中拮抗***行为效应的研究结果，表明其作为***滥用的潜在疗法应有效。
实例5-双盲、安慰剂对照、单次递增剂量的AlbuBChE之后多次给予***以评估***消遣志愿者在AlbuBChE给药后的***药代动力学和药效学参数
目的
为了测定在AlbuBChE给药之后多次给药后***的血液水平，和测定在AlbuBChE给药之后多次给药后***的行为、心理和安全性效应。为了评估AlbuBChE的药代动力学、安全性和耐受性。
研究设计
这是一个5个平行组的活性物和安慰剂对照的双盲随机研究，以比较AlbuBChE处理与作为阴性对照组的安慰剂。
将使用过***的四十（40）位非治疗寻求健康成人随机分配成五（5）个处理组。各组将含有八位个体。
组A（低剂量）：个体接受50mg AlbuBChE的单次肌肉内注射。
组B（中剂量）：个体接受100mg AlbuBChE的单次肌肉内注射。
组C（高中剂量）：个体接受150mg AlbuBChE的单次肌肉内注射。
组D（高剂量）：个体接受300mg AlDuBChE的单次肌肉内注射。
组E（阴性对照组）：个体接受安慰剂的单次肌肉内注射。
研究分成5个群组，每群组8位个体且相隔2到3天。
住院病人住院阶段
个体从第一天的前一晚（报到；第-1天）到第11天的上午保持居住在诊所中。个体在第18±2天时回到诊所做跟踪访问。
第-1天：在第-1天的上午，给予40mg静脉内剂量的***。
第1天：给予单次肌肉内剂量的AlbuBChE或安慰剂。
第1天、第4天、第8天和第10天：在第1天在AlbuBChE Cmax（给药后3小时）时以及第4天（72小时）、第8天（168小时）和第10天（216小时）的上午在AlbuBChE/安慰剂给药的相应时间，给予40mg挑战性静脉内剂量的***。
***给药每天均包括盐水输注（与***输注随机给予，相隔2小时给予），且使输注类型次序单盲。
研究药物给予
如上所述针对组A到组E设计AlbuBChE剂量。各个体通过肌肉内（IM）注射接受单次剂量的AlbuBChE或安慰剂。使用恒定速率输注泵将制备呈1mg/ml盐水溶液形式的40mg盐酸***以1毫克/秒的速率注入前臂静脉中。
研究持续时间
各个体的研究持续时间（从筛选直到研究结束（EOS）访问）为约11周到12周。
研究群体
总共四十（40）位为消遣式***使用者的18岁到55岁男性个体。给药后出于任何原因中止研究的个体不加以替换。
主要纳入/排除准则
纳入准则
1.年龄在18岁到55岁（包括18岁和55岁）的男性志愿者；
2.身体质量指数（BMI）为18kg/m2到33kg/m2，且体重至少为50kg；
3.健康，筛选时由无临床显著病史、体检、心电图（ECG）、生命体征和实验室结果来判定；
4.当前通过吸烟、鼻内或静脉内途径使用***；界定为筛选前至少一个月一次，过去一年6次以及一生中20次。在病人入住期间之前（即在筛选时或在筛选与第-1天之间）通过阳性尿液药物测试（UDS）来证实当前使用；
5.能够理解试验的性质和参与试验的任何危害；
6.能够与研究者令人满意地沟通且能够参与并遵照整个试验的要求；和
7.在阅读信息和同意书之后且在有机会与研究者或其代表讨论试验和签署知情同意书之后，愿意给出书面参与同意书。
排除准则
1.根据DSM-IV-TR（精神疾病诊断与统计手册-最终版（Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders-last version））准则，当前有酒精或药物依赖或有相关病史（不包括尼古丁（nicotine）和咖啡因（caffeine）），或参与康复计划（除戒烟之外）；
2.有严重过敏或过敏反应史；
3.已知对天然或重组丁酰胆碱酯酶（BChE）、人血清白蛋白（HSA）或调配物中的任何其它组分过敏或有超敏反应；
4.任何临床上显著的（由主要研究者判定）心脏、内分泌、血液、肝脏、免疫、代谢、泌尿、肺部、神经、皮肤、精神、肾脏或其它重大疾病的病史；
5.任何恶性疾病的病史；
6.在筛选前2个月或在筛选与报到之间的任何时间中有重大创伤或手术；
7.在筛选前2周或在筛选与报到之间的任何时间内有急性感染；
8.如由主要研究者所判定，在筛选或报到访问时有临床上显著的异常ECG发现；
9.在筛选或报到时收缩压超出90mmHg到140mmHg的范围或舒张压超出45mmHg到90mmHg的范围（在休息至少5分钟之后测量）。每隔5分钟到10分钟可以仰卧位重新测试血压。如果收缩压或舒张压在三次评估之后均超过所述限值，那么视血压升高为持续的，且因此个体可能不为随机的；
10.在筛选或报到时心率小于40次心跳/分钟（在休息至少5分钟之后测量）；
11.有人类免疫缺乏病毒（HIV）1型或2型的已知病史或在筛选时人类免疫缺乏病毒1型或2型的测试结果呈阳性；
12.有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）或丙型肝炎病毒（HCV）的已知病史或在筛选时乙型肝炎表面抗原或丙型肝炎病毒的测试结果呈阳性；
13.在给药前2周内或在给药前5个半衰期内（以较长时间为准），使用处方或非处方药（over-the-counter，OTC）（除了≤2克/天的扑热息痛（paracetamol，对乙酰氨基酚（acetaminophen））或≤650毫克/天的布洛芬（ibuprofen））、研究性药物、维生素或草本药物（herbal remedy）；
14.在给药前3个月内或在给药前5个半衰期内（以较长时间为准），参与另一新的化学实体或处方药的临床试验；
15.在给药前2个月内失血大于400mL（例如作为献血者），或在报到前3个月内接受任何血液、血浆或血小板输注，或在研究期间或在研究后3个月内计划献血者；
16.在筛选之前1个月内，平均每日消费超过20根香烟的个体，或不能避免吸烟（或使用任何含尼古丁的物质）至少6小时（以便所有给药前和给药后/输注相关评估可不间断完成）的个体；
17.***、***（仅在第-1天）、阿片（opioid）、***素（cannabinoid）和苯并二氮杂卓（benzodiazepines）UDS阳性。苯并二氮杂卓和***素的阳性结果只要因半衰期长而稳定或递减即可接受。其它药物的UDS阳性会引起研究者/被指派者根据判断重新安排；酒精呼气测试阳性同样会引起研究者/被指派者根据判断重新安排；
18.暴露于杀虫剂或任何其它有机磷酸酯（例如农业工作人员）；
19.在全科医师或研究者看来，不能参与研究或顺利完成研究，因为志愿者；
a.精神上或法律上丧失能力，或出于任何原因不能给出同意书；
b.因行政或法律决定被拘留，或在监督假释中，或住进疗养院或社会机构；
c.无法在紧急情况下联系；或
d.大不可能合作或遵照临床研究方案，或出于任何其它原因不适合。
安全性、耐受性和免疫原性分析
安全性
监测生命体征，包括血压、心率（PD参数的一部分）和体温。执行体检、临床实验室测试和12导联ECG，其中在各***输注之后、在输注前、输注后30分钟和2小时以及首次输注后8小时进行12导联ECG。在各***注射后4小时立即执行遥测。
收集针对BChE和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的样品，但样品不一定都经测定。使用基于埃尔曼测定（Ellman assay，其作为内源性酶的中和测定）的比色法来测定BChE和AChE的活性。取样时间点是筛选时、给药前和给药后168小时（第8天）、240小时（第11天）和跟踪（第18±2天）。在***给药之前进行用于埃尔曼测定的血液测试（当有关时）。
如果出现以下任一项，那么立即终止***静脉内输注：
1.收缩压为180mmHg或180mmHg以上；
2.舒张压为100mmHg或100mmHg以上；
3.心率为130bpm或130bpm以上；或
4.精神***毒性的行为表现（精神激动、精神错乱或无法配合研究程序）。
如果出现以下任一项，那么将认为个体尚未耐受***IV输注：
1.急性胸痛或呼吸短促；
2.收缩压为180mmHg或180mmHg以上；
3.舒张压为120mmHg或120mmHg以上；
4.心率为[220-年龄×0.85]bpm或[220-年龄×0.85]bpm以上（即，对于20岁个体，大于170bpm）；
5.神经或精神事件（例如恐慌或精神错乱）；
6.临床上显著的ECG异常（包括心传导阻滞、三次或三次以上持续异位室性心跳或急速心律失常）；
7.进一步***输注的停止准则在适当时段（例如30分钟）内未回到可接受限值；
8.进一步***输注的停止准则第二次与方案相符；或
9.PI临床判断中的任何条件足以使个体处于危险中。
AlbuBChE IM注射的耐受性
在给药后头24小时期间评估注射部位的局部耐受性和疼痛（由视觉模拟量表（VAS）评估）。时间点是：AlbuBChE给药后20分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时。
在整个研究中监测不良事件（AE）。
免疫原性(IG）
收集针对免疫原性水平的样品，但样品不一定都经测定。评估抗体针对HSA、人类丁酰胆碱酯酶（hBChE）和AlbuBChE的效价。取样时间点是：给药前以及给药后168小时（第8天）、240小时（第11天）和跟踪（第18±2天）。在***给药之前进行用于IG测定的血液测试（当有关时）。
药代动力学变量和取样
为了测定AlbuBChE的血清浓度，在给药前和在给药后数个时间点收集血液样品。当数据允许时，计算以下药代动力学（PK）参数；
如果认为有必要，那么可以计算额外的参数。针对血清中AlbuBChEPK的取样时间点如下：给药前以及给药后20分钟、40分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时（第2天）、36小时（第2天）、48小时（第3天）、72小时（第4天）、96小时（第5天）、120小时（第6天）、144小时（第7天）、168小时（第8天）、192小时（第9天）和216小时（第10天）。适用时，针对AlbuBChE的PK采用临到***输注的取样时间点。
药效学变量和取样
在给药前和在各***给药后数个时间点收集血液样品。体内***（以及其代谢物苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯）水平通过经证实的LC/MS-MS方法来测定且与AlbuBChE血液水平相关联。测定***暴露（Cmax、tmax、AUC(0-t)、AUC(0-∞)和Vd）和清除率(CL、λz、t1/2)。各***给药后血清中***水平的PD取样时间点如下：给药前、给药后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟和120分钟。
输注前以及输注后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、240分钟和300分钟测量血压和心率。
行为和心理效应(主观效应)
使用计算机化（21 CFR 11验证）视觉模拟量表（VAS）来测量主观效应。主观效应的收集时间点与***血液样品的收集时间点一致。以下一组VAS是：药物喜好、再次服药、整体药物喜好、兴奋（High）、良好效应、不良效应、感到冲击、对***的需要、感到焦虑、过度刺激和任何药物效应。
各***给药后VAS参数的PD取样时间点如下：给药前、给药后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、和120分钟。
尿液收集
在第-1天、第4天和第8天在***给药后经52小时间隔时间针对代谢研究收集尿液。收集范围是：（i）***给药后即刻，随后收集间隔时间为（ii）两次三小时的间隔时间和（iii）九次六小时的间隔时间。
统计分析
药代动力学
PK参数来源于各剂量水平的血清浓度（个体数目、平均值、SD、几何平均值（针对AUC和Cmax）、变异系数、最小值、中值和最大值）。针对Cmax、AUC0-t和AUC0-∞使用幂模型来评估剂量比例（仅针对AlbuBChE）。
药效学
测定PD效应（主观效应和客观效应）的时程。PD参数包括：Emax（最大效应）、TEmax（到Emax的时间），平均时间的效应曲线下面积（TA_AUE），早期时间点的部分AUE和累积AUE。
安全性
使用描述性统计和适当时各治疗组自基线的变化来测定安全性数据。使用监管活动医学词典（Medical Dictionary for Regulatory Activities，MedDRA）的最新版来编号AE，且通过来***器官分类和优选术语汇总。
生物分析
用于测定AlbuBChE浓度和抗体的冷冻血清样品在干冰上运输以用于分析。使用经验证的方法执行***和代谢物水平的分析。
结果
安全性、耐受性和免疫原性
给予人类AlbuBChE是安全的。在50mg到300mg肌肉内（IM）AlbuBChE剂量的情况下未观察到显著的安全性问题。AlbuBChE耐受良好，且无不可接受的副作用。IM注射部位的局部耐受性和疼痛可接受，且无重大不良事件。50mg到300mg AlbuBChE作为单次剂量的给药并未激起显著的免疫反应。抗体针对HSA、人类丁酰胆碱酯酶（hBChE）和AlbuBChE的效价均在可接受限值内。
药代动力学变量
观察到的AlbuBChE的最大血清浓度Cmax随AlbuBChE剂量增加而增强。IM给药位点的AlbuBChE吸收快，且短时间达到Cmax。AUC(0-t)和AUC(0-∞)指示AlbuBChE水平持续达显著且临床上有效的时间量。Vd/f值指示在末端相期间大部分AlbuBChE呈现于循环中。CL/f值指示AlbuBChE以可接受的速率自体内清除。表观末端消除半衰期值指示每周一次或每周两次给予AlbuBChE以维持治疗性水平。AlbuBChE的平均停留时间在临床上可接受限值内。
药效学变量
观察到的***的最大血清浓度Cmax随AlbuBChE剂量增加而降低。在40mg静脉内剂量***之后极快速地达到Cmax水平，且tmax短。***以及其代谢物苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的AUC(0-t)和AUC(0-∞)指示***在***暴露之前接受AlbuBChE给药的个体中的代谢比在接受安慰剂的个体中快。***AUC(0-t)随AlbuBChE剂量变化而降低且随AlbuBChE给药后时间推移而增大。Vd值指示在末端相期间大部分***呈现于循环中。CL值指示与安慰剂相比，AlbuBChE给药后的***清除更快速，且清除率随AlbuBChE给药后时间增长而降低。类似地，表观末端消除半衰期值指示与安慰剂相比AlbuBChE给药后的***清除更快速，且清除率随AlbuBChE给药后时间增长而降低。
行为和心理效应
与给予安慰剂的个体相比，给予AlbuBChE的个体关于视觉模拟量表（VAS）报告显著不同的结果。AlbuBChE给药降低***喜好。AlbuBChE给药降低再次服用***的需要。AlbuBChE给药降低整体药物喜好。AlbuBChE给药降低与***暴露有关的“兴奋”。AlbuBChE给药降低***暴露后“良好效应”的主观感觉。AlbuBChE给药降低与***暴露有关的“冲击（rush）”的主观感觉。AlbuBChE给药降低对***的需要。AlbuBChE给药降低***暴露后焦虑的感觉。AlbuBChE给药降低***暴露后过度刺激的感觉。AlbuBChE给药减少“任何药物效应”的报告。
与给予安慰剂的个体相比，在***暴露前给予AlbuBChE的个体在AlbuBChE给药之后并不报告显著不同的“不良效应”。
AlbuBChE降低***暴露后“不良效应”的感觉。
讨论
本实例在住院病人的情况下测定在AlbuBChE给药之后多次给予***后***的血液水平，且测定在AlbuBChE给药之后多次给药后***的行为、心理和安全性效应。
在门诊病人的情况下，***滥用和依赖的成功治疗的初步测量是在治疗期间和治疗之后的戒断时期。戒断时期顺当（例如两周或三周戒断时期）指示治疗成功。如例如通过***选择性严重程度评估（CCSA）所评估，二次结果量度包括***水平或***摄取量的降低、***停用天数的整体比例、成功个体的比例、连续***停用天数的最长天数和***依赖严重程度。
先前研究已发现AlbuBChE在大鼠中具有约8小时的半衰期，且已推测AlbuBChE在人类中的潜在半衰期将在1天到数天范围内。（布瑞米乔因（Brimijoin）等人，2008；高（Gao）等人，2009）。高（Gao）等人指示在大鼠中观察到的单体AlbuBChE的半衰期比天然四聚BChE的半衰期短，且推测AlbuBChE的半衰期可通过翻译后修饰（例如聚乙烯糖基化）来增长。
本实例测定在通过肌肉内注射给药时AlbuBChE的半衰期具剂量依赖性，其中半衰期值随剂量增加而增大。指定剂量下的半衰期值允许每周一次或每周两次的给药时程，且无需翻译后修饰（例如聚乙烯糖基化）。
先前研究也已报导大鼠静脉内给予AlbuBChE可导致血压适度增大和轻度嗜睡。（布瑞米乔因（Brimijoin）等人，2008）。相反，在通过肌肉内注射给予人类AlbuBChE时，未观察到血压显著增加，在大量个体中亦无嗜睡报导。
给予AlbuBChE的人类个体并未报告***渴望的显著增大。相反，使用***的需要在AlbuBChE给药之后显著降低，且在AlbuBChE单次给药之后长达一周保持显著降低。
本实例的研究结果指示肌肉内给予人类指定剂量的AlbuBChE并不引起任何不可接受的副作用且指示指定剂量将成功治疗由***暴露所致的生物效应的。
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高（Gao）等人(2009)“用于***毒性和成瘾的白蛋白-丁酰胆碱酯酶：催化和药代动力学性质（An Albumin-Bytyrylcholinesterase for Cocaine Toxicity and Addiction:Catalytic and Pharmacokinetic Properties）”,NIH公共访问的作者手稿（NIH Public AccessAuthor Manuscript）,以最终编辑形式发表为化学与生物的相互作用（Chem.Biol.Interact.）2008年9月25日;175(1-3):83-87.
Claims (45)
1.一种减弱灵长类动物由***（***e）暴露所致的生物效应的方法，其包含给予所述灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含：
（a）突变的丁酰胆碱酯酶（BChE）多肽，其包含序列
EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA
TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGG
GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA
LQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA
VTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF
GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK
EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFT
KKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS
RSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW
TSFFPKV(SEQ ID NO：1)，
（b）人血清白蛋白（HSA）多肽，其包含序列
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV
RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK
AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI
AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR
LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA
LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLH
EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ
IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ
AALGL(SEQ ID NO：2)，和
（c）信号肽，其包含序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO：3)，
其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述灵长类动物由所述***暴露所致的所述生物效应减弱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含序列
MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQ
PPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCL
YLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGAL
GFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLL
SPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNK
DPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDE
GTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE
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IEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQK
YLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFA
QYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE
MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR
RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS
LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL
AKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN
YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE
FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVG
SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALE
VDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD
FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO：4)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述融合蛋白在所述***暴露之前给予。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述融合蛋白在所述***暴露前至多一天给予。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述融合蛋白在所述***暴露前至多216小时给予。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述融合蛋白在所述***暴露之后给予。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述融合蛋白在所述***暴露后至多一小时给予。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述***暴露是单次***暴露。
9.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述***暴露是重复性***暴露。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述重复性***暴露为***滥用或***依赖。
11.根据权利要求9至10中任一权利要求所述的方法，其中所述重复性***暴露包含在12个月期间至少六次的单次***暴露。
12.根据权利要求9至10中任一权利要求所述的方法，其中所述重复性***暴露包含在所述灵长类动物的一生期间至少二十次的单次***暴露。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应由所述灵长类动物中***过量引起，且所述减弱是治疗或预防所述生物效应。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是血压增高。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述血压增高的持续时间被降低60%到90%。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述血压增高的持续时间被降低约78%。
17.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是心率或体温增高。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述减弱程度为45%到70%。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述减弱程度为57%。
20.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是所述灵长类动物的***寻求行为。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述***寻求行为出现在所述***暴露之后的***戒断时期期间。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述***寻求行为伴有复发。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在所述复发前两小时给予所述融合蛋白在所述复发后立即减弱所述灵长类动物的***寻求行为。
24.根据权利要求20至23中任一权利要求所述的方法，其中在所述***暴露前两小时给予所述融合蛋白引起所述灵长类动物的所述***寻求行为减少50%到100%。
25.根据权利要求20至24中任一权利要求所述的方法，其中***寻求行为的减弱在给予所述融合蛋白后至多四天观察到。
26.根据权利要求20至25中任一权利要求所述的方法，其中给予所述融合蛋白所产生的所述灵长类动物的总***暴露比不给予时低。
27.根据权利要求20至26中任一权利要求所述的方法，其中减弱***寻求行为产生2周到3周的***戒断时期。
28.根据权利要求20至27中任一权利要求所述的方法，其中减弱***寻求行为所产生的所述灵长类动物不暴露于***的天数比不给予时多。
29.根据权利要求20至28中任一权利要求所述的方法，其中减弱***寻求行为所产生的所述灵长类动物不暴露于***的连续天数比不给予时多。
30.根据权利要求20至29中任一权利要求所述的方法，其中如利用***选择性严重程度评估（CSSA）或精神疾病诊断与统计手册IV（DSM-IV）所评估，减弱***寻求行为引起***依赖或滥用的严重程度减弱。
31.根据权利要求1至30中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量为在静脉内给予1mg/kg***约30分钟内使所述灵长类动物的血清***水平降低到约0ng/ml的量。
32.根据权利要求1至31中任一权利要求所述的方法，其中给予所述融合蛋白在静脉内给予1mg/kg***约5分钟内使所述灵长类动物的血清***水平降低到低于不给予时血清***水平的12%。
33.根据权利要求32所述的方法，其中给予所述融合蛋白在静脉内给予1mg/kg***约5分钟内使所述灵长类动物的血清***水平降低到不给予时血清***水平的7%。
34.根据权利要求1至33中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白每周一次或每周两次给予。
35.根据权利要求1至34中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白通过肌肉內注射或皮下注射来给予。
36.根据权利要求1至35中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白是在包含10mM磷酸钠、200mM甘露糖醇、60mM海藻糖和0.01%（w/v）聚山梨醇酯80,pH值为7.2的调配缓冲液中。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白在所述调配物中的浓度为至少30mg/ml。
38.根据权利要求1至37中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应的减弱在给予所述融合蛋白后至多72小时观察到。
39.根据权利要求1至38中任一权利要求所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述***暴露是10mg到60mg的单次***暴露；或是重复性***暴露，其中所述重复性***暴露中各单次***暴露是10mg到60mg。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是在静脉内给予40mg***约30分钟内使所述人类的血清***水平降低到约0ng/ml的量。
42.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg到5mg/kg。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg、0.3mg/kg、1.6mg/kg或4.8mg/kg。
44.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是50mg到300mg。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是50mg、100mg、150mg或300mg。
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