CN102698291A - 一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合rob - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB。利用基因重组技术，将本申请人前期扩增的布鲁菌抗原基因片段rplL、omp31和bcsp31克隆入pcDNA3.1真核表达载体，并转染CHO细胞，IFA检测结果显示，其所表达的蛋白可以被抗布鲁菌血清识别。进而将上述组合连同佐剂pcDNA3.1-IL-2按一定比例混合免疫小鼠，并对其免疫学指标进行检测，结果显示本发明所涉及的组合免疫效果最好，能有效提高细胞免疫应答，可以作为一种候选的布鲁菌DNA疫苗（核酸疫苗）。

Description

一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物学、分子生物学、实验动物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明涉及一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB，含有布鲁菌抗原基因载体的构建及其组合对提高细胞免疫应答的作用。

背景技术

布鲁菌（Brucella）为胞内寄生的革兰阴性菌，可以引起多种动物及人类布鲁菌病（Brucellosis）。布鲁菌病是在全球范围内传播最为广泛的动物疫源性疾病之一。布鲁菌病不仅严重危害人类健康，而且对畜牧业发展影响巨大。牛、羊、猪等家畜感染布鲁菌后，可造成大量家畜***、不育或大量流产、死胎等。近年来，随着利福平、链霉素与强力霉素的联合应用，人布鲁菌病治愈率显著提高，但是在全球范围内每年仍有布鲁菌病的流行和死亡病例的报道。因此，控制畜间布鲁菌病的流行是消除人布鲁菌病的关键，而作为消除或控制布鲁菌病流行的主要手段，疫苗无疑是最好的选择。

预防布鲁菌病主要依靠接种疫苗。现有的疫苗种类有灭活疫苗和减毒活疫苗，其中应用效果较好的是减毒活疫苗。现有的畜用灭活疫苗有牛布鲁菌45/20，羊布鲁菌H38等，减毒活疫苗有牛布鲁菌S19和RB5l、猪布鲁菌S2、羊布鲁菌M5等，人用减毒活疫苗主要有104M。目前我国使用比较广泛的减毒活疫苗株有M5、S2以及S19等。现有减毒活疫苗的广泛使用，对于预防布鲁菌病的发生、防止疫情进一步蔓延以及疫源地扩大等方面起到了关键性的作用。但灭活疫苗免疫效果比较有限，减毒活疫苗存在毒力恢复而感染动物或人类的风险，且不能区分感染和免疫。这对于隔离病畜，进而防治疫情扩散起到制约作用。因此，研究有效的新型疫苗已经成为布鲁菌疫苗研究的重点。

2002年，伴随布鲁菌基因测序的完成，布鲁菌疫苗研制进入了新的时代，DNA疫苗（即核酸疫苗）等基因工程疫苗成为研究热点。DNA疫苗可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应，它通过MHC I类分子递呈抗原表位，诱导CTL反应。除了具有减毒活疫苗具有的诱导保护的特点外，DNA疫苗还拥有其他疫苗所无法比拟的优势，主要包括：(1)DNA疫苗易于构建、改造及制备；(2)对热稳定，无需冷链***；(3)适合规模化生产、成本低；(4)以天然抗原形式被免疫***识别而产生有效的中和抗体；(5)能够激活全面而持久的免疫保护；(6)不在体内复制；(7)可诱导Thl或Th2的偏向性应答。鉴于以上优点，目前DNA疫苗已成为疫苗研究的重要方向。并且有些DNA疫苗已经上市，如Merck公司生产的融合了HPV L1基因片段的DNA疫苗，用于人类***的预防。

DNA疫苗的免疫水平可受多种因素的影响，如保护性抗原的选择，抗原成分单一；目的基因表达水平受到表达载体的限制，表达水平低、维持时间短；免疫剂量较大，需多次免疫。此外，DNA疫苗的免疫效果还受佐剂和接种方法等的影响。

由于目前的布鲁菌DNA疫苗所诱导的保护性免疫反应不够高，因此还没有一种DNA疫苗可以有效地保护动物，从而代替现有的灭活疫苗和减毒活疫苗。其原因可能是所选择的保护性抗原免疫原性不高，或是所构建的布鲁菌DNA疫苗虽然能在真核细胞中表达目的抗原，但在动物体内其表达量较低，或在某个时间出现了基因沉默不表达的情况。

目前已经鉴定出一些布鲁菌核糖体蛋白（L7/L12）、外膜蛋白（outermembrane protein，OMP）和细胞膜表面蛋白（Brucella cell surface protein，BCSP）具有强的免疫原性。它们除能够引起宿主体液反应外，还与布鲁菌在巨噬细胞内存活和抗巨噬细胞杀伤能力有关。对上述核糖体蛋白、OMP和细胞膜表面蛋白的研究，将有助于揭示布鲁菌抗原诱导和躲避T细胞介导的巨噬细胞杀伤的机理，从而研制出安全有效的新型布鲁菌疫苗。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可以提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合，作为候选DNA疫苗组合。

本发明目的是以下述方式实现的：

一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB，成分如下：

（1）将布鲁菌基因rplL基因克隆到真核表达载体，得到含有rplL基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-rp1L，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示；

（2）将布鲁菌基因omp31基因克隆到真核表达载体，得到含有omp31基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-omp31，其全基因序列为SEQ IDNO：2所示；

（3）将布鲁菌基因bcsp31基因克隆到真核表达载体，得到含有bcsp31基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-bcsp31，其全基因序列为SEQ IDNO：3所示；

所述的组合ROB中三种重组表达载体的质量比例为Wrp1L:W omp31:Wbcsp31＝1:1:1。

所述的组合ROB还含有佐剂pcDNA3.1-IL-2，其质量比例为Wrp1L:Womp31:W bcsp31:W IL-2＝1:1:1:0.5。

本发明所用的载体pcDNA3.1含有CMV（Human cytomegalovirusimmediate-early）强启动子，确保目的抗原基因在动物细胞内高效转录。其图谱如图9所示。

本发明利用基因重组技术，将申请人前期扩增的布鲁菌抗原基因片段rp1L、omp31和bcsp31克隆入pcDNA3.1真核表达载体，并转染CHO细胞，IFA检测结果显示，其所表达的蛋白可以被抗布鲁菌血清识别。进而将上述组合连同佐剂pcDNA3.1-IL-2按一定比例混合并免疫小鼠，并对其免疫学指标进行检测，结果显示本发明所涉及的组合免疫效果最好，能有效提高细胞免疫应答，是一种候选的布鲁菌DNA疫苗。

附图说明

图1.含rplL、omp31和bcsp31基因真核表达载体的BamH I+Xho I双酶切鉴定结果；其中：Lane M:marker;Lane 1:pcDNA3.1vector;Lane 2:pcDNA3.1-rp1L;Lane 3:pcDNA3.1-bcsp31;Lane 4:pcDNA3.1-omp31；

图2.间接免疫荧光法检测目的蛋白在CHO细胞中的表达；

图3.间接免疫荧光法检测目的蛋白在B16细胞中的稳定表达；

图4.ELISA法分析免疫小鼠特异性抗体水平；

图5.ELISA法分析免疫小鼠IgG_2a/IgG₁值；

图6.ELISA法分析免疫小鼠血清的细胞因子水平；(A)The level of Th1type cytokines.(B)The level of Th2 type cytokines；

图7.ELISpot法分析脾细胞分泌IFN-γ的能力；*VS.saline group,p<0.05;#Vs.M5group,p<0.05；

图8.免疫小鼠体外细胞杀伤实验结果；*VS.saline group,p<0.01;#Vs.M5 group,p<0.05；

图9.pcDNA3.1载体图谱；

具体实施方式

一、布鲁菌抗原基因混合物的制备

1.含rp1L、omp31和bcsp31基因真核表达载体的构建及其鉴定：将申请人前期构建的pGEX-4T-1-rp1L、pGEX-4T-1-omp31和pGEX-4T-1-bcsp31（司瑞，白文涛，张芳琳，刘艳丽，胡刚，吴兴安，阎岩，徐志凯.羊布鲁菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达.中国***共患病杂志.2005,21(11):961-964.）用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ（购自Takara公司）双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，与相同酶切的pcDNA3.1真核载体连接，电转化E.coli.DH5α，培养于含氨苄青霉素抗性的琼脂平板，次日挑取克隆，提取质粒。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，阳性克隆分别命名为pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31。

结果成功构建了pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31，经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，分别切出约390bp、730bp和1000bp的条带与目的片段大小一致（图1）

2.间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31在CHO细胞中的表达：转染前一天，将2×10⁵CHO细胞接种于500μl无抗生素的10%完全1640细胞培养液（购自GIBCO公司）。待细胞增殖至24孔板培养孔面积约95%时，进行转染。用50μl无抗生素无血清的1640培养液稀释1μgDNA，轻轻混匀。再用50μl无抗生素无血清的1640培养液稀释2μl lipofectamine 2000（购自Invitrogen公司），轻轻混匀，室温静置5min。将上述两种液体轻轻混匀，室温静置20min。将此混合物100μl/孔，加入到已经用无血清无抗生素的不完全1640培养液洗涤好的铺有CHO细胞的24孔板内。置入含5%CO₂，37℃细胞培养箱内培养6h后，加入含10%血清的1640培养液，每孔500μl。阴性对照为pcDNA 3.1空载体转染和未转染的CHO细胞。

转染48h后，吸去24孔板内的细胞培养液，用高压灭菌处理过的PBS缓冲液洗涤3次。吸尽残液后，每孔加入200μl-20℃的冷甲醇，-20℃冷冻放置20min。待细胞固定好后，吸去甲醇，PBS洗涤3次。加入3%BSA封闭，37℃孵育1h。PBS洗涤3次后，加入兔抗布鲁菌血清，37℃孵育1h。洗涤后，加入含有0.1g/L Evans的FITC-羊抗兔IgG（购自Bioview公司），避光，37℃孵育1h。PBS洗涤3次后，荧光显微镜下镜检。

结果表明实现组均可观察到特异的绿色荧光，而而阴性对照没有检测到绿色荧光，说明实验组细胞表达能够被兔抗布鲁菌血清识别的蛋白，即为目的蛋白L7/L12、OMP31和BCSP31（图2）。

3.间接免疫荧光检法测pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31在B16细胞中的稳定表达：待细胞增殖至6孔板培养孔面积约95%时，将pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31脂质体法转染B16细胞。培养48h后，加入含400μg/ml G418（购自Gibco公司）的1640完全培养液。培养两周后，将长出的细胞克隆克隆化至96孔板，换成含有800μg/ml G418的1640完全培养液再培养两周。用400μgmlG418的1640完全培养液作为维持液，扩大培养稳定转染细胞系。

转染前一天，将2×10⁵B16细胞接种于500μl无抗生素的10%完全1640细胞培养液，置入含5%CO₂，37℃细胞培养箱培养过夜。待细胞增殖至24孔板培养孔面积约95%时，将pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31分别转染B16细胞。48h后吸去培养上清，PBS洗涤后，冷甲醇固定20min。3%BSA封闭后，用兔抗布鲁菌血清检测各蛋白在B16细胞中的表达。

结果共获得稳定转染细胞系9株，其中3株为pcDNA3.1-rp1L/B16、4株为pcDNA3.1-omp31/B16和2株为pcDNA3.1-bcsp31/B16。采用间接免疫荧光法检测的结果表明，pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31在稳定转染B16细胞后，可以稳定表达能够被兔抗布鲁菌血清识别的蛋白，即为目的蛋白L7/L12、OMP31和BCSP31（图3）。将此细胞作为CTL杀伤实验的靶细胞。

4.重组DNA的大量制备：将pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31分别转化E.coli并培养在氨苄琼脂培养板上，挑取单克隆至5ml Amp.抗性的LB培养液，37℃摇床培养8h。1:1000接种菌液至装有400ml Amp.抗性的LB培养基的2000ml三角摇瓶。待菌液OD600nm至3时，收集细菌。后续处理方法参考Mahcherey-Nagel公司的Plasmid DNAPurification产品说明书。提取质粒并将浓度调至3mg/ml，-20℃保存，用前混匀。

5.免疫动物：将6周龄雌性C57BL/6小鼠30只随机分成3组，即是三种抗原基因重组DNA免疫组（rp1L、omp31和bcsp31等量混合，简称ROB），M5免疫组（阳性对照）和生理盐水组（阴性对照）。免疫前3天，在小鼠双后腿内侧肌注0.25%布比卡因50μl做预处理。将pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31等量混合，每次免疫总量为300μg/只，再加入基因佐剂pcDNA3.1-IL-2，每次用量为50μg/只。将上述混合物免疫于小鼠双后腿内侧肌，每两周免疫一次，共免疫三次。阳性对照组和阴性对照组分别用M5疫苗株（5×10⁶CFU/ml）和生理盐水进行腹腔注射。小鼠在免疫4、6、8、10周剪尾取血，收集血清，-20℃保存。

二、重组DNA的免疫学特性研究

1.ELISA法检测免疫小鼠抗体水平：采用ELISA法检测各组免疫小鼠血清中抗体滴度。包被灭活的羊布鲁菌10⁸CFU/ml于ELISA板，100μl/孔，4°C过夜，充分洗涤后，用3%BSA封闭1h，洗涤后加入不同稀释度的小鼠血清，100μl/孔，37°C反应1h。充分洗涤后，再加入以1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG（购自Southernbiotech公司），37°C反应1h，充分洗涤后OPD显色，H₂SO₄终止反应并在492nm测OD值。

结果表明随着免疫时间的增加，ROB免疫组小鼠的抗体水平持续增高，小鼠在末次免疫后4周的抗体水平最高，平均抗体滴度为1:1280（P<0.01）。M5组的特异性抗体水平的最高值（1:5120，P<0.01）出现在末次免疫后2周，之后有所回落，但是依然保持在很高的水平（图4）。

2.ELISA法检测免疫小鼠IgG_2a/IgG₁比例：包被灭活的羊布鲁菌10⁸CFU/ml于ELISA板，100μl/孔，4°C过夜，充分洗涤后，用3%BSA封闭1h，洗涤后加入1:100稀释的小鼠血清，100μl/孔，37°C反应1h。充分洗涤后，再加入1:6000稀释的HRP-羊抗鼠IgG_2a或HRP-羊抗鼠IgG₁（购自Southernbiotech公司）。37°C反应1h，充分洗涤后OPD显色，H₂SO₄终止反应，并在492nm测OD值。

结果表明ROB组IgG_2a/IgG₁比值为1.48（P<0.05），主要以IgG2a为主（图5）。

3.ELISA法检测脾细胞因子：采用R&D Systems公司的小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒，严格按照说明书操作。每孔加入50μl试剂盒中的Assay Diluent后，再加入50μl稀释好的待检血清和标准液，轻轻摇晃混匀后，室温静置2h。洗涤5次后拍干。分别加入100μl标记的鼠IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、和IL-10，封条封闭好后，室温反应2h。洗涤5次，拍干。每孔加入100μl底物显色液，避光，室温反应30min。加入终止液后，30min内测OD_450nm值。

结果虽然ROB组较M5组的IL-2水平差异不大，但诱导的TNF-α和IFN-γ水平则是M5的2.9倍和1.6倍（P<0.05）。而IL-4和IL-10等Th2型细胞因子的水平在各组之间无显著差异（P>0.05）（图6）。

4.小鼠脾细胞制备：末次免疫后4周处死小鼠，无菌环境分离小鼠脾脏，并研磨获得脾细胞。用Hank’s液或不完全1640培养液洗涤细胞3次，离心收集脾细胞，将细胞重悬于含2%血清完全PRIM-1640培养基中，计数备用。

5.ELISpot检测IFN-γ：用无菌过滤的PBS洗涤ELISpot板（购自Mabtech公司），200μl/孔，洗涤4次。用10%血清的1640室温封闭30min。弃去封闭液，加入含有刺激物（L7/L12、OMP31、BCSP31蛋白，5μg/ml）的脾细胞混合液（2×10⁶/ml）,100μl/孔，放入5%CO₂，37℃细胞培养箱培养24h。PBS洗涤5次后，加入生物素标记的抗体，100μl/孔，室温反应2h。PBS洗涤5次后，加入1:1000稀释的Streptavidin-HRP，100μl/孔，室温反应1h。洗涤后，加入TMB底物显色液，直到有清晰地斑点出现。大量自来水冲洗以停止显色。室温避光晾干后，使用ELISpot Plate Reader读出数据。

结果ROB组免疫小鼠的脾细胞经特异性抗原刺激后能产生IFN-γ的细胞数目为50±3.7，而M5组则有17±4.2个细胞可以分泌IFN-γ。ROB组和M5组均高于盐水组（P<0.05），且ROB组也高于M5组，约为3倍（P<0.05）（图7）。

6.CTL实验：采用Promega公司的CytoTox

Non-RadioactiveCytotoxicity Assay，具体方法参考其说明书。

A.预处理效应细胞：无菌获取的免疫小鼠脾细胞，5%CO₂，37℃细胞培养箱中用相应抗原刺激培养6天，期间换液2次。

B.计数细胞，按100:1、50:1及25:1的效应细胞与靶细胞（pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31稳定转染的B16细胞）比例加入U型底的96孔板中，每组设3个复孔，并以正常鼠脾细胞作为阴性对照。

C.按表2-1方法布板，每孔设3个复孔。

表1CTL实验中的布板

D.将细胞培养板在细胞培养箱中培养4h后（离心前45min，靶细胞最大释放LDH孔内加入10μl裂解液），250×g离心4min，吸50μl细胞培养上清液转至新的96孔板。加反应底物液50μl/孔，避光室温反应30min。每孔加入50μl终止液，测定OD_490nm值。计算杀伤活性。

结果ROB组在不同的效靶比均可诱导T细胞介导的特异性杀伤作用，且CTL效应随着效靶比值的升高而增强，在效靶比100:1的时，杀伤效果最显著。其效靶比在100:1和50:1时，ROB组和M5组诱导的的杀伤效应均高于盐水组（P<0.01），且ROB组诱导的杀伤效应也高于M5疫苗对照组（P<0.05）（图8)。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB

<130>无

<160>2

<170>PatentIn version 33

<210>1

<211>5753

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240

GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300

TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420

ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480

ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540

ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 780

GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 840

CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTGGCTAGC 900

GTTTAAACTT AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG ATCCATGGCT GATCTCGCAA AGATCGTTGA 960

AGACCTTTCG GCCCTGACCG TTCTGGAAGC CGCTGAGCTG TCCAAGCTTC TCGAAGAGAA 1020

GTGGGGCGTT TCGGCTGCTG CTCCGGTCGC TGTTGCTGCT GCCGGTGGCG CTGCCCCTGC 1080

TGCTGCCGCA GAAGAAAAGA CCGAATTCGA CGTCGTTCTC GCTGACGGCG GCGCTAACAA 1140

GATCAACGTG ATCAAGGAAG TGCGCGCACT CACCGGTCTC GGCCTCAAGG AAGCCAAGGA 1200

CTTGGTCGAA GGCGCTCCGA AGGCTGTCAA GGAAGGCGCC TCGAAGGACG AAGCTGAGAA 1260

GATCAAGGCA CAGCTCGAAG CTGCTGGCGC CAAGGTTGAA CTCAAGTAAC TCGAGTCTAG 1320

AGGGCCCGTT TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT 1380

TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC 1440

CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG 1500

TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA 1560

TGCGGTGGGC TCTATGGCTT CTGAGGCGGA AAGAACCAGC TGGGGCTCTA GGGGGTATCC 1620

CCACGCGCCC TGTAGCGGCG CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC 1680

CGCTACACTT GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT CCTTTCTCGC 1740

CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGG CTCCCTTTAG GGTTCCGATT 1800

TAGTGCTTTA CGGCACCTCG ACCCCAAAAA ACTTGATTAG GGTGATGGTT CACGTAGTGG 1860

GCCATCGCCC TGATAGACGG TTTTTCGCCC TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG 1920

TGGACTCTTG TTCCAAACTG GAACAACACT CAACCCTATC TCGGTCTATT CTTTTGATTT 1980

ATAAGGGATT TTGCCGATTT CGGCCTATTG GTTAAAAAAT GAGCTGATTT AACAAAAATT 2040

TAACGCGAAT TAATTCTGTG GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC 2100

CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 2160

TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC 2220

ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC CGCCCATTCT 2280

CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCTGCCTCT 2340

GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAAAGCTC 2400

CCGGGAGCTT GTATATCCAT TTTCGGATCT GATCAAGAGA CAGGATGAGG ATCGTTTCGC 2460

ATGATTGAAC AAGATGGATT GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA GAGGCTATTC 2520

GGCTATGACT GGGCACAACA GACAATCGGC TGCTCTGATG CCGCCGTGTT CCGGCTGTCA 2580

GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT GAATGAACTG 2640

CAGGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG CGCAGCTGTG 2700

CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT GCCGGGGCAG 2760

GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC TGATGCAATG 2820

CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC GAAACATCGC 2880

ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA TCTGGACGAA 2940

GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGCG CATGCCCGAC 3000

GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT GGTGGAAAAT 3060

GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG CTATCAGGAC 3120

ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC TGACCGCTTC 3180

CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTT 3240

GACGAGTTCT TCTGAGCGGG ACTCTGGGGT TCGAAATGAC CGACCAAGCG ACGCCCAACC 3300

TGCCATCACG AGATTTCGAT TCCACCGCCG CCTTCTATGA AAGGTTGGGC TTCGGAATCG 3360

TTTTCCGGGA CGCCGGCTGG ATGATCCTCC AGCGCGGGGA TCTCATGCTG GAGTTCTTCG 3420

CCCACCCCAA CTTGTTTATT GCAGCTTATA ATGGTTACAA ATAAAGCAAT AGCATCACAA 3480

ATTTCACAAA TAAAGCATTT TTTTCACTGC ATTCTAGTTG TGGTTTGTCC AAACTCATCA 3540

ATGTATCTTA TCATGTCTGT ATACCGTCGA CCTCTAGCTA GAGCTTGGCG TAATCATGGT 3600

CATAGCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC CGCTCACAAT TCCACACAAC ATACGAGCCG 3660

GAAGCATAAA GTGTAAAGCC TGGGGTGCCT AATGAGTGAG CTAACTCACA TTAATTGCGT 3720

TGCGCTCACT GCCCGCTTTC CAGTCGGGAA ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG 3780

GCCAACGCGC GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCTC TTCCGCTTCC TCGCTCACTG 3840

ACTCGCTGCG CTCGGTCGTT CGGCTGCGGC GAGCGGTATC AGCTCACTCA AAGGCGGTAA 3900

TACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA CATGTGAGCA AAAGGCCAGC 3960

AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC 4020

CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT 4080

AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC 4140

CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCATAGCT 4200

CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TGTGTGCACG 4260

AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC 4320

CGGTAAGACA CGACTTATCG CCACTGGCAG CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA 4380

GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA 4440

GAACAGTATT TGGTATCTGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA 4500

GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG GTAGCGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA 4560

TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG 4620

CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT 4680

TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT 4740

AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC 4800

TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG 4860

GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG 4920

ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT 4980

TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG 5040

TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT 5100

TTGGTATGGC TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA 5160

TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG 5220

CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT 5280

CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA 5340

TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA 5400

GAACTTTAAA AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT 5460

TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT 5520

CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA 5580

AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT 5640

GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA 5700

ATAAACAAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTC        5753

<210>2

<211>6101

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240

GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300

TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420

ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480

ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540

ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 780

GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 840

CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTGGCTAGC 900

GTTTAAACTT AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG ATCCATGAAG TCCGTAATTT TGGCGTCCAT 960

CGCCGCTATG TTCGCCACGT CCGCTATGGC TGCCGACGTG GTTGTTTCTG AACCTTCCGC 1020

CCCTACTGCT GCTCCTGTTG ACACCTTCTC GTGGACCGGC GGCTATATCG GTATCAACGC 1080

CGGTTACGCA GGCGGCAAGT TCAAGCATCC ATTTTCTAGC TTTGACAAGG AAGACAACGA 1140

ACAGGTTTCC GGTTCGCTCG ACGTAACAGC TGGCGGCTTC GTCGGTGGTG TTCAGGCCGG 1200

TTACAACTGG CAGCTCGACA ACGGCGTCGT GCTCGGCGCG GAAACCGACT TCCAGGGATC 1260

GAGCGTTACG GGTTCGATTT CAGCCGGTGC CAGCGGTCTC GAAGGCAAAG CTGAAACCAA 1320

GGTCGAGTGG TTCGGCACAG TTCGTGCCCG TCTTGGCTAC ACGGCTACCG AACGCCTCAT 1380

GGTTTATGGT ACCGGCGGTC TGGCCTATGG TAAGGTCAAG TCTGCGTTCA ACCTGGGTGA 1440

TGATGCAAGT GCCCTGCACA CGTGGTCCGA CAAGACGAAA GCTGGCTGGA CCCTCGGCGC 1500

TGGTGCTGAA TATGCCATCA ACAACAACTG GACGCTCAAG TCGGAATACC TCTACACCGA 1560

CCTCGGCAAG CGCAACCTCG TCGACGTTGA CAATAGCTTC CTTGAGAGCA AGGTCAATTT 1620

CCACACTGTT CGCGTCGGTC TGAACTACAA GTTCTAACTC GAGTCTAGAG GGCCCGTTTA 1680

AACCCGCTGA TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC 1740

CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA 1800

GGAAATTGCA TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA 1860

GGACAGCAAG GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC 1920

TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG GGGCTCTAGG GGGTATCCCC ACGCGCCCTG 1980

TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG CTACACTTGC 2040

CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA CGTTCGCCGG 2100

CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG 2160

GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC CATCGCCCTG 2220

ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG GACTCTTGTT 2280

CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATTTT 2340

GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA ACGCGAATTA 2400

ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA 2460

AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC 2520

CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC 2580

CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC 2640

TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CTGCCTCTGA GCTATTCCAG 2700

AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA GGCTTTTGCA AAAAGCTCCC GGGAGCTTGT 2760

ATATCCATTT TCGGATCTGA TCAAGAGACA GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA 2820

GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA GGCTATTCGG CTATGACTGG 2880

GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC GCAGGGGCGC 2940

CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA GGACGAGGCA 3000

GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC 3060

ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA 3120

TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT 3180

ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA 3240

CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC TGGACGAAGA GCATCAGGGG 3330

CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGCGCA TGCCCGACGG CGAGGATCTC 3360

GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT 3420

GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT 3480

ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC 3540

GGTATCGCCG CTCCCGATTC GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC 3600

TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG 3660

ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT CGGAATCGTT TTCCGGGACG 3720

CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC CACCCCAACT 3780

TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA 3840

AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC 3900

ATGTCTGTAT ACCGTCGACC TCTAGCTAGA GCTTGGCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC 3960

CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA AGCATAAAGT 4020

GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC 4080

CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG 4140

GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCTCTT CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT 4200

CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA 4260

CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA 4320

ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC 4380

ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG 4440

CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT 4500

ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCATAGCTCA CGCTGTAGGT 4560

ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC 4620

AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG 4680

ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG 4740

GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGA ACAGTATTTG 4800

GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG 4860

GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA 4920

AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG 4980

AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC 5040

TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG 5100

ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT 5160

CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG 5220

GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA 5280

TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA 5340

TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC 5400

GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT 5460

CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA 5520

AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT 5580

CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT 5640

TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA 5700

GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG 5760

TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA 5820

GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA 5880

CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG 5940

CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC 6000

AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG 6060

GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT C                     6101

<210>3

<211>6368

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240

GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300

TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420

ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480

ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540

ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 780

GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 840

CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTGGCTAGC 900

GTTTAAACTT AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG ATCCATGAAA TTCGGAAGCA AAATCCGTCG 960

CTTGGCTGTT GCAGCGGTGG CGGGCGCGAT TGCGTTGGGA GCGAGCTTTG CGGTTGCACA 1020

GGCCCCGACA TTTTTCCGTA TCGGCACTGG CGGCACAGCC GGAACCTATT ATCCGATTGG 1080

TGGTCTGATC GCGAACGCGA TTTCCGGCGC AGGCGAAAAG GGCGTGCCGG GTCTCGTCGC 1140

GACGGCCGTT TCGTCGAATG GCTCGGTTGC CAATATCAAT GCGATCAAGT CGGGCGCTCT 1200

GGAGTCCGGC TTTACGCAGT CAGACGTTGC CTATTGGGCC TATAACGGCA CCGGCCTTTA 1260

TGATGGCAAG GGCAAGGTGG AAGATTTGCG CCTTCTGGCG ACGCTTTACC CGGAAACGAT 1320

CCATATCGTT GCGCGTAAGG ATGCAAACAT CAAATCGGTC GCAGACCTGA AAGGCAAGCG 1380

CGTTTCGCTG GATGAGCCGG GTTCTGGCAC CATCGTCGAT GCGCGTATCG TTCTTGAAGC 1440

CTACGGCCTC ACGGAAGACG ATATCAAGGC TGAACACCTG AAGCCGGGAC CGGCAGGCGA 1500

GAGGCTGAAA GATGGTGCGC TGGACGCCTA TTTCTTTGTG GGCGGCTATC CGACGGGCGC 1560

AATCTCGGAA CTGGCCATCT CGAACGGTAT TTCGCTCGTT CCGATCTCCG GGCCGGAAGC 1620

GGACAAGATT CTGGAGAAAT ATTCCTTCTT CTCGAAGGAT GTGGTTCCTG CCGGAGCCTA 1680

TAAGGACGTG GCGGAAACAC CGACCCTTGC CGTTGCCGCA CAGTGGGTGA CGAGCGCCAA 1740

GCAGCCGGAC GACCTCATCT ATAACATCAC CAAGGTTCTC TGGAACGAGG ATACACGCAA 1800

GGCACTCGAT GCGGGCCATG CGAAGGGCAA GCTCATCAAG CTCGATAGTG CGACGAGCAG 1860

CCTCGGTATT CCGCTGCATC CCGGCGCAGA ACGCTTTTAC AAGGAAGCGG GCGTGCTGAA 1920

ATAACTCGAG TCTAGAGGGC CCGTTTAAAC CCGCTGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG 1980

TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC 2040

TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA 2100

TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG 2160

CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG 2220

CTCTAGGGGG TATCCCCACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT 2280

TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT 2340

CCCTTCCTTT CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC 2400

TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTAGGGTGA 2460

TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC 2520

CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGT 2580

CTATTCTTTT GATTTATAAG GGATTTTGCC GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT 2640

GATTTAACAA AAATTTAACG CGAATTAATT CTGTGGAATG TGTGTCAGTT AGGGTGTGGA 2700

AAGTCCCCAG GCTCCCCAGC AGGCAGAAGT ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA 2760

ACCAGGTGTG GAAAGTCCCC AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA GTATGCAAAG CATGCATCTC 2820

AATTAGTCAG CAACCATAGT CCCGCCCCTA ACTCCGCCCA TCCCGCCCCT AACTCCGCCC 2880

AGTTCCGCCC ATTCTCCGCC CCATGGCTGA CTAATTTTTT TTATTTATGC AGAGGCCGAG 2940

GCCGCCTCTG CCTCTGAGCT ATTCCAGAAG TAGTGAGGAG GCTTTTTTGG AGGCCTAGGC 3000

TTTTGCAAAA AGCTCCCGGG AGCTTGTATA TCCATTTTCG GATCTGATCA AGAGACAGGA 3060

TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG CAGGTTCTCC GGCCGCTTGG 3120

GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA TCGGCTGCTC TGATGCCGCC 3180

GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG GTTCTTTTTG TCAAGACCGA CCTGTCCGGT 3240

GCCCTGAATG AACTGCAGGA CGAGGCAGCG CGGCTATCGT GGCTGGCCAC GACGGGCGTT 3300

CCTTGCGCAG CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA GGGACTGGCT GCTATTGGGC 3360

GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC CTGCCGAGAA AGTATCCATC 3420

ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG CTACCTGCCC ATTCGACCAC 3480

CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT ACTCGGATGG AAGCCGGTCT TGTCGATCAG 3540

GATGATCTGG ACGAAGAGCA TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG AACTGTTCGC CAGGCTCAAG 3600

GCGCGCATGC CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG GCGATGCCTG CTTGCCGAAT 3660

ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT GTGGCCGGCT GGGTGTGGCG 3720

GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA 3780

TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT ATCGCCGCTC CCGATTCGCA GCGCATCGCC 3840

TTCTATCGCC TTCTTGACGA GTTCTTCTGA GCGGGACTCT GGGGTTCGAA ATGACCGACC 3900

AAGCGACGCC CAACCTGCCA TCACGAGATT TCGATTCCAC CGCCGCCTTC TATGAAAGGT 3960

TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT CCTCCAGCGC GGGGATCTCA 4020

TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCCAACTTGT TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA 4080

GCAATAGCAT CACAAATTTC ACAAATAAAG CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT 4140

TGTCCAAACT CATCAATGTA TCTTATCATG TCTGTATACC GTCGACCTCT AGCTAGAGCT 4200

TGGCGTAATC ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC 4260

ACAACATACG AGCCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC 4320

TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC 4380

TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG 4440

CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC 4500

ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT 4560

GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC 4620

ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA 4680

ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC 4740

CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG 4800

CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC 4860

TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC 4920

GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA 4980

GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT 5040

ACGGCTACAC TAGAAGAACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG 5100

GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTTTTTTTG 5160

TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT 5220

CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT 5280

TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT 5340

AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA 5400

TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA 5460

CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC 5520

GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA 5580

GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG 5640

TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG 5700

TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG 5760

TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG 5820

TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC 5880

TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT 5940

TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA 6000

CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA 6060

AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA 6120

ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC 6180

AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC 6240

TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG 6300

AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC 6360

CTGACGTC                                                          6368

Claims (3)

1.一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB，成分如下：

（1）将布鲁菌基因rplL基因克隆到真核表达载体，得到含有rplL基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-rp1L，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示；

（2）将布鲁菌基因omp31基因克隆到真核表达载体，得到含有omp31基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-omp31，其全基因序列为SEQ ID NO：2所示；

（3）将布鲁菌基因bcsp31基因克隆到真核表达载体，得到含有bcsp31基因的重组表达载体，并命名为pcDNA3.1-bcsp31，其全基因序列为SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB，其特征是：所述的组合ROB中三种重组表达载体的质量比例为W_rp1L:W_omp31:W_bcsp31＝1:1:1。

3.根据权利要求1和2所述的一种可提高细胞免疫应答的布鲁菌抗原基因组合ROB，其特征是：所述的组合ROB还含有佐剂pcDNA3.1-IL-2；其质量比例为W_rp1L:W_omp31:W_bcsp31:W_IL-2＝1:1:1:0.5。 

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