CN102697808B - 一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，利用体外淋巴细胞培养方式，经过鸭肝炎病毒的诱导制备抗鸭病毒性肝炎转移因子。本发明是以鸡脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子。该转移因子能够有效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，使正常的机体免受鸭病毒性肝炎的感染，起到根本的预防作用。本发明方法方法具有简单、易操作等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，属于免疫学领域。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DVH）引起的雏鸭一种急性高度致死性传染病，这种病的特点是发病急、病程短、传染快、发病率与死亡率都比较高的疾病，给养殖业带来重大经济损失。
转移因子（TF，Transfer Factor）又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子分子量小、无毒、活性强、无抗原性、不起过敏反应等优点，对于治疗动物病毒性疾病、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤、真菌性疾病时，可以起辅助治疗作用。
尽管目前已经有一些抗鸭病毒性肝炎的药品和制剂，但由于现有的药品制剂针对性不强，疗效有限，而且治疗性的制剂多是在发病之后才应用的，不能起到根本的治疗作用。
目前已报道的转移因子的提取方法大多关于非特异性转移因子的制备方法，而且多是体内转移因子免疫法的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法。
本发明所采用的技术方案如下：一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，以鸡脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子。
本发明制备方法的具体步骤如下：
1）淋巴细胞的制备：首先选择健康鸡，在无菌的条件下采取鸡脾脏或抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2）淋巴细胞的培养：淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3）病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于9-10日龄鸡胚的尿囊腔内，37℃培养72-120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
4）转移因子的制备:经过植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，即得抗鸭病毒性肝炎转移因子。
步骤1）所述鸡脾细胞制备过程中胰酶浓度要求0.22-0.25%，pH为7.3-7.6，用量为组织体积量的5-7倍。
步骤4）所述促进鸡脾脏细胞或血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为60-180mg/L。
本发明关于体外制备的抗鸭病毒性肝炎转移因子能够高效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染，达到根本上预防的作用。这种通过传代培养可以生产出大量的产品，出产率高，成本低，可以节约大量的人力、物力，可避免产品携带外援病毒及其他病源微生物。这制备方法具有简单、易操作、生产成本低等特点。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明的内容作进一步的说明。
实施例1
一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，本实施例是以鸡外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子，具体步骤如下：
1.抗凝血的采集：选择健康无传染病鸡，采血部位消毒，用50mL的无菌注射器，心脏采集抗凝血，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL；
2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，3000r/min离心15min，收集中间的白色层；然后用pH7.0的Hanks液反复清洗淋巴细胞4次，5000r/min，离心10min，收集沉淀，用含30%的犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃恒温箱中培养，经2天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层；
3.淋巴细胞的培养：单层淋巴细胞进行传代培养，首先将长成单层淋巴细胞层用0.22%的胰酶37℃短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO2，37℃恒温培养,每天观察一次，长成单层为止；
4.病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于9日龄鸡胚的尿囊腔中，37℃培养72h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
5.诱导培养：当单层淋巴细胞长成后，更换成维持液（含5%犊牛血清DMEM），同时加入浓度为60mg/L的植物血凝素，鸭肝炎病毒（浓度为1280血凝单位/mL）进行诱导培养；经过3天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液；
6.转移因子的制备：上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：破碎3s停3s， 400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即得抗鸭病毒性肝炎转移因子。
实施例2
一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，本实施例是以鸡外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子，具体步骤如下：
1.抗凝血的采集：选择健康无传染病鸡，采血部位消毒，用50mL的无菌注射器，心脏采集抗凝血，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL；
2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min，收集中间的白色层；然后用pH7.2的Hanks液反复清洗淋巴细胞4次，4000r/min，离心10min，收集沉淀，用含30%的犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃转瓶机中培养，经3天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层；
3.淋巴细胞的培养：单层淋巴细胞进行传代培养，首先将长成单层淋巴细胞层用0.25%的胰酶37℃消化2 min，吹打分散，加入pH7.2的Hanks液终止，再洗2遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO2，37℃恒温培养，每天观察一次，长成单层为止；
4.病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于10日龄鸡胚的尿囊腔中，37℃培养96h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
5.诱导培养：当单层淋巴细胞长成后，更换成维持液（含5%犊牛血清DMEM），同时加入浓度为180mg/L的植物血凝素，鸭肝炎病毒（浓度为1280血凝单位/mL）进行诱导培养，经过3天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液；
6.转移因子的制备：上清液经过超声波细胞破碎仪（工作状态：破碎3s停3s，300W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即得抗鸭病毒性肝炎转移因子。
实施例3
一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，本实施例主要包括鸡脾脏制备单层淋巴细胞、添加植物血凝素和病毒诱导等步骤，具体步骤如下：
1. 脾脏的采集：选取健康无传染病的鸡，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质，尽可能保证组织干净；
2. 脾细胞制备：上述碎组织中加入5倍量的pH为7.3、浓度0.22%的胰酶液，放入37℃的水浴锅中消化20min ，每5 min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰液，加入预热维持液pH7.2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液；
3. 淋巴细胞的培养：采用血球计数板进行计数，取滤液10uL，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DMEM液稀释后的滤液分装于细胞培养瓶中，培养条件：5% CO2、37℃恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养；
4.病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于9日龄鸡胚的尿囊腔中，37℃培养120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
5.诱导培养：传代培养成单层淋巴细胞后，更换营养液为维持液，同时加入浓度为100mg/L植物血凝素和鸭肝炎病毒（浓度为1280血凝单位/mL），进行2天的诱导培养；
6.转移因子的制备：利用超声波细胞破碎仪（工作状态：破碎3s停3s， 400W，10 min）破碎后，离心取上清，过滤，再经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即为抗鸭病毒性肝炎转移因子。
实施例4
一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，本实施例主要包括鸡脾脏制备单层淋巴细胞、添加植物血凝素和病毒诱导等步骤，具体步骤如下：
1. 脾脏的采集：选取健康无传染病的鸡，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.0的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质，尽可能保证组织干净；
2. 脾细胞制备：上述碎组织中加入7倍量的pH为7.6、浓度0.25%的胰酶液，放入37℃的水浴锅中消化30min ，每5 min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰液，加入预热维持液pH7.0的Hanks液，用吸管吹打90次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液；
3．淋巴细胞的培养：采用血球计数板进行计数，取滤液10uL，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DMEM液稀释后的滤液分装于细胞转瓶中，培养条件：5% CO2、37℃恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养；
4．病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于10日龄鸡胚的尿囊腔中，37℃培养120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
5．诱导培养：传代培养成单层淋巴细胞后，更换营养液为维持液，同时加入浓度为140mg/L植物血凝素和鸭肝炎病毒（浓度为1280血凝单位/mL），进行2天的诱导培养；
6．转移因子的制备：利用超声波细胞破碎仪（工作状态：破碎3s停3s， 400W，10 min）破碎后，离心取上清，过滤，再经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即为抗鸭病毒性肝炎转移因子。
实验例1：动物保护试验:
取300只12日龄健康雏鸭，随机分成对照、试验、空白三组，每组100只，在新环境中适应三天，自由采食，攻毒剂量为1.0??108CFU/只，攻毒后第三天试验组开始接种抗鸭病毒性肝炎转移因子，每只肌注0.2ml/只，每天一次，对照组注射生理盐，空白全程生理盐水，观察临床症状和死亡率作为指标反应本品的临床应用效果。结果显示：对照组发病率100%和死亡率100%，空白组没有变化，试验组发病率25%，而死亡率3%。
实验例2：动物安全试验
取健康小白鼠150只，随机分成空白、注射组、口服三组，每组50只，空白口服和注射蒸馏水2 ml/只，注射组注射本品5 ml/只，口服组灌服本品5 ml/只，观察小白鼠的变化。结果显示三组都无异常变化，说明本品安全，无不良反应。
实验例3：皮肤刺激性试验
取30只小白兔，分成对照、皮下注射、皮内注射2组，采用脱毛剂对家兔脊柱两侧被毛脱去，保证皮肤的完整性，然后注射本品1 ml/只，对照组注射生理盐水，分成单次给药、多次给药观察皮肤的变化。结果显示，注射生理盐水的10只中，有5只发生红肿，一天消肿，试验组中各有3只发生，12小时内全部消肿。
实验例4
本实验例采用各种常规方法对发明的抗鸭病毒性肝炎转移因子的检测：
1、多肽含量的测定：用Folin-酚法或分光光度法测定多肽，以鸭外周血液为基础原料多肽含量0.46g/L，以鸭脾脏为原料制备的转移因子多肽含量0.39g/L。
2、蛋白质的测定：采用20%磺基水杨酸方法，提取液没有发生浑浊和沉淀现象，呈阴性，不含蛋白质。
3、无菌检测：根据《中华人民共和国兽药典2011版》进行检测，没有细菌生长。
4、核糖含量测定：利用分光光度法测定，以鸭外周血液为基础原料核糖含量0.34g/L，以鸭脾脏为原料制备的转移因子核糖含量0.43g/L。
5、外观及pH值测定：黄色澄明液体，酸度值为7.0-7.3之值。
通过以上实验例，我们可以得到本发明所提取的抗鸭病毒肝炎转移因子不仅能安全高效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，还能够保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染，提高机体的免疫力。本品的体外制备方法是可行的，这种发明方法不仅操作简便，减小工作强度，生产成本低，应在临床上广泛推广。
Claims (3)
1.一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征在于：以鸡脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗鸭肝炎病毒特异转移因子，具体步骤如下：
1）淋巴细胞的制备：首先选择健康鸡，在无菌的条件下采取鸡脾脏或鸡抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2）淋巴细胞的培养：淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3）病毒的接种：将鸭肝炎病毒接种于9-10日龄鸡胚的尿囊腔内，37℃培养72-120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；
4）转移因子的制备：经过植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎后，离心取上清，经0.22μm滤膜过滤，滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即得抗鸭病毒性肝炎转移因子；超声波细胞破碎仪的工作状态：破碎3s停3s，400W，10min。
2.根据权利要求1所述的一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征是：步骤1）所述鸡脾细胞制备过程中胰酶浓度要求0.22-0.25%，pH为7.3-7.6，用量为组织体积量的5-7倍。
3.根据权利要求1所述的一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征是：步骤4）所述促进鸡脾脏细胞或血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为60-180mg/L。
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