CN102692435A - 一种基于电化学dna生物传感器的1,8-二氨基萘的测定方法 - Google Patents

Abstract

一种基于电化学DNA生物传感器的1,8-二氨基萘的测定方法。本发明属于基于hairpin DNA修饰的金电极进行1，8-二氨基萘检测的电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种对1，8-二氨基萘有电化学响应的hairpin DNA修饰的金电极的制备以及运用此电极1，8-二氨基萘的检测。具体的以双硫修饰的hairpin DNA为原料，通过金-硫键作用自组装到金电极表面制备hairpin DNA修饰电极。此hairpin DNA电极与1，8-二氨基萘作用后，导致DNA膜层的阻抗发生变化，根据其响应的阻抗的变化可以对1，8-二氨基萘进行检测。该DNA传感器制备方法条件温和，简单方便，稳定性好，且具有高灵敏度且操作简单等优点。

Description

一种基于电化学DNA生物传感器的1,8-二氨基萘的测定方法

技术领域

本发明属于电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种基于hairpin DNA的电化学DNA生物传感器的制备及将所制备的hairpin DNA生物传感器用于检测1，8-二氨基萘。 

背景技术

芳香胺是一类重要的环境污染物，已被列为优先监控的环境污染物之一。在工业上芳香胺用途非常广泛，作为重要的化工原料和精细化工中间体，常被用于印染、制药、食品、医药、***、农药、化妆品、塑料、橡胶、纺织、造纸、陶瓷上釉和油漆等工艺生产过程，尤其是印染工业，废水常含高浓度的芳香胺中间体，而且部分染料经过复杂的化学反应和微生物作用也最终释放出芳香胺，从而造成大范围的水体等环境体系的污染。研究表明，许多芳香胺进入人体后经过体内的活化作用可改变DNA的结构，引起人体病变和诱发癌症，如导致膀胱癌、输尿管癌、肾癌等恶性疾病，对人们的健康构成极大的威胁。因此，建立、完善和发展芳香胺污染物的分析方法是环境综合治理的关键环节之一，也是分析化学和环境化学的热点研究课题，具有重要的研究意义。 

传统的芳香胺的分析检测方法很多，如比色法、滴定法、薄层色谱法和分光光度法等，但这些方法的灵敏度低、选择性差，而且很难测定每种芳香胺含量。随着仪器和分析手段的发展，气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等开始应用于分析芳香胺化合物，这些方法能同时定量测定多种芳香胺污染物，具有高效灵敏等特点，但是具有设备昂贵、需专业技术人员操作、样品处理繁琐等缺点。 

近年来，随着电化学技术和DNA生物传感技术的发展，DNA生物传感器作为一种新型的检测技术被用于检测环境污染物，具有特异性、高灵敏性、选择性、操作简单等优点。基于芳香胺小分子与双链DNA的***作用实现了应用电化学DNA生物传感器对芳香胺的检测。Wang等应用天然小牛胸腺DNA修饰的碳糊电极生物传感器，实现了对2-氨基萘、1-氨基蒽、2-氨基蒽、9，10-二氨基菲、1-氨基吡等芳香胺类污染物的检测，与未采用DNA修饰的电极相比，灵敏性显著提高，检测限可达到纳摩尔数量级。研究发现，这种DNA传感器对不同芳香胺类污染物电化学响应信号因氨基取代位置不同有较大差异。Mascini等采用单链、双链小牛胸腺DNA修饰的丝网石墨印刷电极传感器，采用计时电势分析法研究并比较了2-氨基萘、2-氨基蒽、1，2-二氨基蒽醌等芳香胺化合物与DNA的相互作用。研究发现芳香胺类化合物与单、双链DNA修饰的DNA生物传感器作用后鸟嘌呤氧化峰电流均降低，这主要是源于芳香胺分子与DNA碱基发生作用后产生保护作用，使得电极表面的碱基更不容易被氧化。Chiti等采用天然小牛胸腺DNA、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA和含23个碱基的DNA片段修饰的丝网石墨印刷电极传感器，采用计时电势分析法研究并比较了2-氨基萘、2-氨基蒽、1，2-二氨基蒽醌、吖啶黄等芳香胺化合物与双链DNA的相互作用。以鸟嘌呤氧化峰电流变化为指标，研究发现DNA碱基的序列越长鸟嘌呤氧化峰电流响应信号越强，在此基础上采用天然DNA序列修饰的DNA生物传感器对芳香胺进行检测，检测限达到亚微摩尔。Prabhakar等应用天然小牛胸腺DNA修饰的聚吡咯-聚氯乙烯磺酸盐/氧化铟膜电极传感器，用循环伏安法对芳香族化合物2-氨基蒽进行了检测，鸟嘌呤氧化峰电流与浓度具有较好的线性关系，信号-浓度在0.001×10^-6～6.00×10^-6范围线性相关，检测限达到亚微摩尔。 

目前，应用电化学DNA生物传感器对芳香胺类污染物的检测还比较少，且均是采用天然生物体DNA序列。虽然这些DNA生物传感器对芳香胺类污染物具有较高的灵敏性，但其不足之处是通过吸附作用修饰到电极表面的DNA膜的均一性、稳定性较差。到目前为止，应用人工合成的双硫修饰DNA序列制备的金电极传感器对芳香胺类化合物的检测还未见报道，人工合成的含双硫修饰的DNA片段通过金-硫键作用自组装修饰到金电极表面，DNA膜结构高度有序，稳定性好且可以根据实验对DNA碱基序列设计、调整，从而制备专一性、高灵敏性的DNA生物传感器，这在完善我国现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金电极表面hairpin DNA的电化学生物传感器的快速检测1，8-二氨基 萘的方法。本发明所采用的hairpin DNA修饰电极的制备方法条件温和，操作简单，稳定性好，运用此法制备的hairpin DNA生物传感器对1，8-二氨基萘的检测具有高灵敏性的优点。 

1本发明的第一方面，涉及一种hairpin DNA修饰的金电极的制备方法，具体包括下列步骤： 

1)电极的预处理与活化： 

将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al₂O₃粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在0.5mol/L H₂SO₄溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极。 

2)Hairpin DNA溶液的配制： 

将固体hairpin DNA用pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO₄缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，静置于室温下12h，备用。 

3)Hairpin DNA修饰电极的制备 

将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpin DNA溶液中，静置于室温下4-5天。巯基修饰的hairpin DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，即得到hairpin DNA修饰电极。 

优选地，上述步骤2)中Tris-NaClO₄缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO₄浓度为300mM。 

优选地，上述步骤2)中所使用的hairpin DNA为5′端硫基修饰的含30个碱基的hairpin DNA序列。其中共包含三部分：hairpin DNA序列靠近5′端的前9个碱基胸腺嘧啶为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分以及hairpin DNA结构的“环”状部分。 

优选地，上述步骤2)中所述hairpin DNA双链部分匹配碱基数为5对。 

优选地，上述步骤2)中所述hairpin DNA浓度为5μM。 

本发明中，所使用的hairpin DNA结构是本领域人员所熟悉的，其获得可以通过供应商获得。 

本发明的另一方面，涉及应用如上述制备方法得到的hairpin DNA修饰电极对1，8-二氨基萘检测的方法，其具体检测方法为：以Ag/AgCl(饱和KCl溶液)为参比电极，铂电极为对电极，以hairpinDNA修饰电极为工作电极构筑三电极体系，将hairpin DNA修饰电极在K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](2mM)溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于缓冲溶液Tris-NaClO₄(20mM，pH＝7.4)配制的一定浓度的1，8-二氨基萘溶液中20min，然后再进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。 

与现有技术相比本专利技术具有以下优点： 

1.本发明所采用的DNA序列为人工合成的双硫修饰的DNA序列，DNA序列可以进行调整； 

2.本发明所采用的hairpin DNA序列的“茎”部分的匹配碱基对为5对，对1，8-二氨基萘检测具有较高的灵敏性； 

3.本发明是通过金-硫键作用将hairpin DNA自组装于金电极表面，该方法得到的DNA膜稳定性好，表面结构高度有序，方法简单易行，抗环境因素干扰性能强； 

4.本发明所制备的hairpin DNA生物传感器对1，8-二氨基萘的检测具有操作简单、响应速度快、成本较低等特点； 

5.本发明所采用的电化学交流阻抗法是研究电极界面现象的一种重要手段，对DNA电极膜层电阻的变化具有高灵敏度性。 

附图说明

图1为金电极(●)及hairpin DNA修饰电极(□)的阻抗谱图； 

图2为使用本发明的hairpin DNA修饰电极与1，8-二氨基萘作用前后的尼奎斯特阻抗谱图：DNA膜(□)，与1，8-二氨基萘作用(●)；其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω·cm²，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω·cm²； 

图3为使用本发明的hairpin DNA修饰电极测定的电荷传递电阻的变化值(ΔR_CT)与1，8-二氨基萘浓度关系曲线(□)，(●)为空白对照；其中，横坐标代表1，8-二氨基萘浓度，单位为nM，纵坐标代表电荷传递电阻的变化值，单位为Ω·cm²； 

具体实施方式

以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。 

实施例1 

1)将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al₂O₃粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在1mol/L H₂SO₄溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极； 

2)以pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO₄缓冲溶液将固体hairpin DNA溶解，其中Tris浓度为20mM，NaClO₄浓度为300mM，用漩涡振荡器混匀，并静置于室温下12h，在此条件下形成hairpin DNA结构； 

3)将活化处理的金电极浸泡在预先配制的5μM的hairpin DNA溶液中，静置于室温下4-5天，即得到hairpin DNA修饰电极； 

实施例2 

以本发明的hairpin DNA修饰电极作为工作电极，以Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，电解液为pH＝7.4的20mmol/L Tris-NaClO₄缓冲溶液配制的2mMK₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]，1，8-二氨基萘溶液配制浓度分别为：0.1nmol/L、0.3nmol/L、0.6nmol/L、3nmol/L、6nmol/L、30nmol/L、60nmol/L、120nmol/L、300nmol/L及600nmol/L。应用PARSTAT2273电化学综合测试***进行电化学阻抗测定，实验表明，此hairpin DNA修饰电极具有优异的性能，响应时间快，灵敏度高，对1，8-二氨基萘的检测线性范围：0.6～120nmol/L。 

表1Hairpin DNA生物传感器与1，8-二氨基萘作用后的电化学阻抗变化(ΔR_CT) 

Claims (7)

1.一种基于电化学DNA生物传感器的1，8-二氨基萘的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)电极的预处理与活化：

将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al₂O₃粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在0.5mol/L H₂SO₄溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，得到表面干净的金电极；

2)Hairpin DNA溶液的配制：

将固体hairpin DNA药品用pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO₄缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，于室温下静置12h以备用；

3)Hairpin DNA修饰电极的制备：

将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpin DNA溶液中，静置于室温下4-5天。巯基修饰的hairpin DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，从而得到hairpin DNA修饰电极。

2.如权利要求1所述的hairpin DNA修饰的金电极的制备方法，其特征在于：所述Tris-NaClO₄缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO₄浓度为300mM。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所使用的hairpin DNA为5′端双硫修饰的含30个碱基的hairpin DNA序列。其中共包含三部分：hairpin DNA序列靠近5′端的前9个碱基胸腺嘧啶为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分及hairpin DNA结构的“环”状部分。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：hairpin DNA的“茎”部分匹配的碱基为5对。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述hairpin DNA的浓度为5μM。

6.一种应用如权利要求1-4中任一项所述制备方法得到的hairpin DNA修饰电极对1，8-二氨基萘检测的方法，其特征在于具体步骤为：以Ag/AgCl(饱和KCl溶液)为参比电极，铂电极为对电极，以hairpin DNA修饰电极为工作电极构筑三电极体系，将hairpin DNA修饰电极在K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](2mM)溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于缓冲溶液Tris-NaClO₄(20mM，pH＝7.4)配制的一定浓度的1，8-二氨基萘溶液中20min，然后再进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。

7.如权利要求6所述的hairpin DNA修饰电极在水中对1，8-二氨基萘的检测。

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