CN102675655B - 一种水溶性富勒烯及其制备应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水溶性富勒烯及其制备方法，可有效解决现有富勒烯可溶性差，光敏活性低，生物相容性差的问题，解决的技术方案是：在富勒烯分子上通过化学键连接有水溶性聚合物聚乙烯亚胺水溶性富勒烯，所述的聚乙烯亚胺和富勒烯的重量比为0.08-0.12:1；所述的水溶性富勒烯的制备方法为：将富勒烯与氨化试剂反应，得到氨基富勒烯，再与氮丙啶反应，在质子化氢离子的存在下，氮丙啶不断的在氨基上进行接枝，最终得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯，本发明制备的水溶性富勒烯不会对富勒烯本身的特性进行破坏，水分散性强，毒性低，稳定性良好，制备方法简单，成本低，并可作为光敏剂和药物载体制备治疗癌症的药物。

Description

一种水溶性富勒烯及其制备应用方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种水溶性富勒烯及其制备应用方法。

背景技术

作为碳元素的第三种同素异形体富勒烯家族的发现，是上世纪自然科学发展史最重要的突破之一。Kroto等三人也因为他们在富勒烯研究中开创性的工作而荣获1996年诺贝尔化学奖。富勒烯（又称C₆₀）以其独特的结构和性质倍受人们重视，近十年来，几乎全世界所有著名大学和研究所的科学家都进行了与富勒烯有关的研究。它已成为当今物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。富勒烯分子的重要科学意义，被美国《Science》杂志评为1991年的“明星分子”。在纳米材料中，包括富勒烯、碳纳米管在内的碳纳米材料一直是近年来国际科学的前沿领域之一。富勒烯是由60个碳原子组成的球形分子，包含12个五元环和20个六元环，直径为0.71nm。近年来，富勒烯在生物医药领域的研究相当引人瞩目，研究发现富勒烯具有多种特殊的生物学效应：(1)可抑制多种酶的活性，包括HIV蛋白酶以及逆转录酶；(2)对肿瘤细胞显示出细胞毒性；(3)具有神经保护剂的作用；(4)还具有在可见光照射下产生氧自由基、切割 DNA的作用。

富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。富勒烯光照下产生活性氧为高度反应性的，并且可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝***以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，富勒烯可以用于肿瘤的治疗。为此利用富勒烯作为光敏剂开展光动力疗法，即使其在肿瘤组织中蓄积，利用光照产生活性氧来选择性的破坏肿瘤组织。

目前，光动力疗法在肿瘤治疗中起到一定的辅助作用，为了更有效的***，可以使富勒烯作为光动力治疗的光敏剂的同时，作为抗肿瘤药物的载体。发挥光动力治疗和化学药物治疗相结合的优势，更好的起到抗肿瘤作用。

但由于富勒烯的碳笼结构具有强亲脂性，使其在水等极性溶剂中的溶解度非常有限，限制了其在生物体系中的研究和应用。为此，迫切需要设计并合成出水溶性好、光敏活性高、毒性小、生物相容性好、适合作为药物载体的富勒烯衍生物。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种水溶性富勒烯及其制备方法，可有效解决现有富勒烯可溶性差，光敏活性低，生物相容性差的问题。

本发明的技术方案是：在富勒烯分子上通过化学键连接有水溶性聚合物聚乙烯亚胺水溶性富勒烯，所述的聚乙烯亚胺和富勒烯的重量比为0.08-0.12:1，所述的富勒烯为C₆₀富勒烯，得到水溶性富勒烯；

所述的水溶性富勒烯的制备方法，由以下步骤实现：

（1）将氨化试剂20ml和氢氧化钠1.0g加入到60ml的水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的转速下，30℃温度下，搅拌7天使其反应充分，除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；所述的富勒烯甲苯溶液是由富勒烯每1mg加入甲苯1ml混匀制得；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1ml、浓盐酸10μl在二氯甲烷20ml中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯；

所述的浓盐酸体积浓度为37-38%；

所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种。

本发明制备的水溶性富勒烯不会对富勒烯本身的特性进行破坏，水分散性强，对生物体的毒性低，物理及化学稳定性良好，质量好，制备方法简单，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低，并可作为光敏剂和药物载体制备治疗癌症的药物。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。

实施例1

（1）将乙二胺20ml和氢氧化钠1.0g加入到60ml水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50ml重量体积比为1mg/ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的转速下，30℃温度下，搅拌7天使其反应充分，除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1ml、浓盐酸10μl在二氯甲烷20ml中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。

实施例2

（1）将1,3-丙二胺20ml和氢氧化钠1.0g加入到60ml水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50ml重量体积比为1mg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30℃，400r/min下搅拌7d使其反应充分。除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1ml、浓盐酸10μl在二氯甲烷20ml中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。

实施例3

（1）将1,6-己二胺20ml和氢氧化钠1.0g加入到60ml水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50ml重量体积比为1mg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30℃，400r/min下搅拌7d使其反应充分。除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1ml、浓盐酸10μl在二氯甲烷20ml中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。

本发明的第一个目的就是提供一种新型的水溶性富勒烯—富勒烯聚乙烯亚胺聚合物。

本发明的第二个目的就是提供上述富勒烯聚乙烯亚胺聚合物的制备方法。

本发明的第三个目的就是提供上述富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为光敏剂在***药物中的应用。

本发明的第四个目的就是提供上述富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为药物转运载体在***药物中的应用。

本发明的第一个目的通过以下技术方案予以实现：

一种富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，它是在原始的富勒烯经过纯化处理的基础上，与氨化试剂反应，将富勒烯表面连接上反应活性较强的氨基后，再与氮丙啶反应，在质子化氢离子的存在下，氮丙啶不断的在氨基上进行接枝，最终在富勒烯表面形成聚乙烯亚胺（PEI）树枝状聚合物。该富勒烯聚乙烯亚胺聚合物中，聚乙烯亚胺和富勒烯的质量含量比为0.08-0.12:1。

本发明的第二个目的通过以下技术方案予以实现：

一种富勒烯聚乙烯亚胺聚合物的制备方法，它包括以下步骤：

1）将氨化试剂和氢氧化钠加入混合溶剂A中，搅拌均匀后逐滴加入富勒烯的B溶液，充分搅拌使反应充分。除去上层的有机溶剂B层溶液，蒸除混合溶剂A，再经过有机溶剂C洗净后，抽真空干燥，得到表面带有氨基的富勒烯。

2）将上述带有氨基的富勒烯、氮丙啶和浓盐酸在有机溶剂D中混合均匀，搅拌使其充分反应，经有机溶剂E洗净后，真空干燥，得到表面接枝形成聚乙烯亚胺的富勒烯聚乙烯亚胺衍生物。

上述步骤1中富勒烯为50mg；氢氧化钠为1g；氨化试剂为20ml；混合溶剂A为60ml；有机溶剂B为50ml；有机溶剂C为500ml；搅拌条件为400r/min，30-50℃，时间为1-7d；真空干燥的条件为：在20-60℃真空干燥24-56h。

上述步骤1中的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种

上述步骤1中混合溶剂A由水和无水乙醇组成，其中水和无水乙醇的比例为：1:5。

上述步骤1中有机溶剂B为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种，或为任意的混合物。

上述步骤1中有机溶剂C为无水乙醇。

上述步骤2中含氨基的富勒烯为50mg；氮丙啶为1ml；浓盐酸为10ul，有机溶剂D为20ml；有机溶剂E为500ml；搅拌条件为：400r/min，40-60℃下回流，搅拌48h；有机溶剂E洗净的条件为：加入有机溶剂E 50-100ml，超声0.5-1h，再通过0.45um的尼龙微孔滤膜抽滤，并用20ml溶剂E润洗滤饼；将滤饼转入500ml的烧杯中，加入溶剂E 50-100ml，超声0.5-1h后再通过0.45μm的尼龙微孔滤膜抽滤，并用20ml溶剂E润洗滤饼，如此重复操作5-10次；真空干燥的条件是在20-60℃真空干燥24-72h。

上述步骤2中有机溶剂D为二氯甲烷。

上述步骤2中有机溶剂E为二氯甲烷。

本发明的第三个目的通过以下技术方案予以实现：

富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为光敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分：

1）将制得的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物溶于水中制成溶液，加入到癌细胞A中进行培养，给药后3h后用光源B光照，光照30-120min，继续培养24小时，测定癌细胞A的存活率。

2）将制得的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物溶于水中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C体内，给药后3h后用光源D光照，光照时间为30-120min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。

上述步骤1中的癌细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，***，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，***癌，***癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，***恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤1中的光源B为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，***，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，***癌，***癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，***恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的光源D为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为光敏剂来进行光动力治疗体内深度肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可以通过适用与所述部位的方法来改善外部光源照射的穿透力进行肿瘤的治疗。

本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型，作为光敏剂应用在光动力***的药物中。比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。

本发明的第四个目的通过以下技术方案予以实现：

富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用，分为以下几个步骤：

1）将制得的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物和抗肿瘤药物A通过方式B进行结合。

2）将装载药物的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物进行抗肿瘤细胞C和体内的抗肿瘤D的评价。

上述步骤1中的抗肿瘤药物A为：难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物，比如：多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。

上述步骤1中的方式B为：超声、搅拌、探超和旋转蒸发中的一种或几种。

上述步骤2中的肿瘤细胞C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，***，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，***癌，***癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，***恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的肿瘤D为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，***，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，***癌，***癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，***恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为药物转运载体可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用光源进行照射时能够在肿瘤组织中产生更多的活性氧，并且可以使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。但也会分布在正常的组织器官中，为了避免产生的活性氧对正常组织产生损伤，可以通过一些手段来加以改善，比如：可以在富勒烯聚乙烯亚胺聚合物上装载一些具有靶向性质的靶头，也可以使用抗体等手段介导，可以使用临床手段比如说内窥镜的方式来直接输送载药***到达靶组织，聚焦光照面积等方式。

本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物作为药物转运载体可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯聚乙烯亚胺聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射等。

本发明作为光敏剂和药物载体在制备***的药物，经过多次试验，均取得了良好的试验结果，相关试验数据如下：

实验1

通过光照射水溶性富勒烯，测定其对肿瘤细胞生长的抑制作用，在体外测定其抗肿瘤活性。将PC3***癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO₂，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（12.5、25、50、100μg/ml）的水溶性富勒烯聚乙烯亚胺，设置复孔为4～6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

经证实当用光照射60min，水溶性富勒烯聚乙烯亚胺的加入直接影响了PC3细胞的增殖。

实验2

光照射时，水溶性富勒烯聚乙烯亚胺的体内抗肿瘤活性测定。取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7 d后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水激光组；(3)水溶性富勒烯聚乙烯亚胺组；(4)水溶性富勒烯聚乙烯亚胺激光组。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2 d给药一次，每次注射生理盐水或者2mg/ml的水溶性富勒烯聚乙烯亚胺100μl，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，计算肿瘤体积。

当给药水溶性富勒烯聚乙烯亚胺合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。

实验3

水溶性富勒烯聚乙烯亚胺作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用。

取水溶性富勒烯聚乙烯亚胺10mg和多西紫杉醇（由北京怡和生物科技有限公司提供）20mg，加入超纯水2mL，混合均匀后，探头超声（工作3s，间隔6s，工作12次，功率为400W），将探超完成的样品进行离心（4000rpm，15min）除去大颗粒。得到了以水溶性富勒烯为载体的抗肿瘤药物多西紫杉醇给药***。通过40倍（体积比）乙醇提取出给药***中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度计测定为载体包封的多西紫杉醇的含量，载药量为2.1 mg/mL。

已经证实，水溶性富勒烯聚乙烯亚胺可以吸附抗肿瘤药物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作为抗肿瘤药物的载体使用。

实验4

水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇给药***的粒子大小和表面带电量的确定

使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。

实验5

水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇给药***的体外抗肿瘤活性

将PC3***癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO₂，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（0、0.5、1、2、4、6、8μg/ml）的实例4中的水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇，不加入实例4中的水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇为对照组，设置复孔为4～6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37 ℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

已经证实，水溶性富勒烯作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，更好的发挥出抗肿瘤药物的疗效，而且结合光照后，能够更明显的抑制肿瘤细胞的增殖。

实验6

水溶性富勒烯多西紫杉醇给药***的体内抗肿瘤活性

取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7 d后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm³昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水； (2)多西紫杉醇注射液组；(3)水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇；(4) 水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇光照组。多西紫杉醇注射液组、水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇和水溶性富勒烯聚乙烯亚胺多西紫杉醇光照组的多西紫杉醇给药剂量相等，都为25.125mg/kg。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2 d给药一次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)， 计算肿瘤体积。

当给药水溶性富勒烯多西紫杉醇时，小鼠的肿瘤体积的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明显的抑制。合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了更加明显的抑制。

在做上述实验的同时，还采用其他光源以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果。

本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：

1）本发明的新的水溶性富勒烯不会对富勒烯本身的特性进行破坏，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。

2）本发明提供的水溶性富勒烯可以作为抗肿瘤光动力治疗的一种良好的光敏剂，光照时能够发挥抗肿瘤的活性，而不光照时则副作用很小，可以根据光的聚焦等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞。测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的新的水溶性富勒烯对正常细胞以及组织毒副作用很小。

3）本发明提供的水溶性富勒烯可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，具有缓释性和靶向性，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。测试结果表明，本发明提供的水溶性富勒烯作为抗肿瘤药物的载体时，粒径均匀，能够提高水不溶性抗肿瘤药物的水溶性，能够起到一定的缓释作用，而且还能够更多的到达肿瘤组织中起到靶向给药的作用，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。

Claims (4)

1.一种水溶性富勒烯的制备方法，是在富勒烯分子上通过化学键连接有水溶性聚合物聚乙烯亚胺，所述的聚乙烯亚胺和富勒烯的重量比为0.08-0.12:1，所述的富勒烯为C₆₀富勒烯，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）将氨化试剂20mL和氢氧化钠1.0g加入到60mL的水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50mL的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的转速30℃下，搅拌7天，使其反应充分，除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；所述的富勒烯甲苯溶液是由富勒烯每1mg加入甲苯1mL混匀制得；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1mL、浓盐酸10μL在二氯甲烷20mL中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯；

所述的浓盐酸体积浓度为37-38%；

所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种。

2.根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）将乙二胺20mL和氢氧化钠1.0g加入到60mL的水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50mL重量体积比为1mg/mL的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的转速下，30℃温度下，搅拌7天使其反应充分，除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1mL、浓盐酸10μL在二氯甲烷20mL中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。

3.根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）将1,3-丙二胺20mL和氢氧化钠1.0g加入到60mL的水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50mL重量体积比为1mg/mL的富勒烯甲苯溶液中，30℃，400r/min下搅拌7d使其反应充分；除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1mL、浓盐酸10μL在二氯甲烷20mL中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。

4.根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）将1,6-己二胺20mL和氢氧化钠1.0g加入到60mL的水和无水乙醇的混合溶剂中，其中水和无水乙醇的体积比为1:5，搅拌均匀后逐滴加入到50mL重量体积比为1mg/mL的富勒烯甲苯溶液中，30℃，400r/min下搅拌7d使其反应充分；除去上层的甲苯层溶液、水和无水乙醇混合溶液，再经过有机溶剂甲醇抽滤洗涤15次后，40℃下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；

（2）将步骤（1）所得的氨基富勒烯50mg与氮丙啶1mL、浓盐酸10μL在二氯甲烷20mL中混合均匀，在40℃，转速400r/min下搅拌回流48h，使其充分反应，再经过有机溶剂二氯甲烷抽滤洗涤20次，40℃下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚乙烯亚胺聚合物，即水溶性富勒烯。