CN102670661B - 用于刺激胰高血糖素样肽-1分泌的药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于糖尿病防治领域，特别涉及用于刺激与糖尿病相关的高血糖素样肽-1分泌的药物。本发明所述的一种用于刺激胰高血糖素样肽-1分泌的药物，包括有效剂量的益生菌。所述的药物还包括有效剂量的黄连提取物。本发明所提供的药物，可有效刺激细胞分泌GLP-1，改善肠道内菌群尤其是提高益生菌的质量，并结合中药成分，促进GLP-1的分泌，从而达到防治糖尿病的目的。

Description

用于刺激胰高血糖素样肽-1分泌的药物

技术领域

本发明属于糖尿病防治领域，特别涉及用于刺激与糖尿病相关的高血糖素样肽-1分泌的药物。

背景技术

糖尿病是一种血糖水平高于正常的疾病。糖尿病有三种主要类型，即Ⅰ型糖尿病（青少年糖尿病）、Ⅱ型糖尿病和妊娠糖尿病。在Ⅰ型糖尿病中，胰腺的β细胞不能合成足够的胰岛素。Ⅱ型糖尿病是糖尿病的主要形式，约占所有糖尿病患者的90-95%。这种类型的糖尿病通常开始于胰岛素抵抗，在这种情况下肌肉、肝脏和脂肪细胞不能对胰岛素做出恰当的反应。胰腺最终丧失了响应食物摄入而生产和分泌足够胰岛素的能力。妊娠糖尿病是因怀孕期间荷尔蒙变化或因胰岛素不足而引起的。血液中的葡萄糖不能进入细胞，从而升高血液中的葡萄糖水平。高浓度的血糖葡萄糖，也称为高血糖症，会损害神经和血管，引起并发症如心脏病、中风、肾功能障碍、失明、神经问题、牙龈感染以及截肢。胰岛素注射、降糖药物和生活方式改变如运动、体重控制和饮食疗法，是推荐的糖尿病治疗方法。目前也缺乏有效的预防措施，如任其发展，将成为不可逆性的改变，可导致患者病残或死亡，因此，对提高糖尿病的认识，重视早期诊断，有效预防和治疗并发病是当今值得重视的问题。

西方糖尿病药物通过补充胰岛素、改善胰岛素敏感性、增加胰腺的胰岛素分泌和/或组织细胞的葡萄糖摄取来纠正高血糖症。在正常情况下，胰腺β细胞分泌足够的胰岛素来维持血糖浓度在一个狭窄范围内（72–126 mg/dL）。胰岛素刺激引发级联信号，增强了各种组织中葡萄糖的摄取、利用和储存。在糖尿病患者中，机体失去生产胰岛素的能力是由于β细胞凋亡或胰岛素抵抗。细胞因子、脂毒性和糖毒性是β细胞凋亡的三种主要刺激因素。

有许多类型的降糖药物，包括胰岛素促分泌剂（磺脲类、茴苯酸类）、胰岛素增敏剂（双胍类、二甲双胍、噻唑烷二酮类）、α-葡萄糖苷酶抑制剂（米格列醇，阿卡波糖）。大多数降糖药物可能有副作用，如严重低血糖、乳酸性酸中毒、特质肝细胞损伤、永久性的神经缺陷、肠胃不适、头痛、头晕甚至死亡。

肠促胰素主要由胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）组成。其中，GLP-1在2型糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用。GLP-1是人体内一种肠源性激素，在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。GLP-1由胰高血糖素原基因表达，在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素，而在肠黏膜的L细胞中，前激素转换酶（PC1）将胰高血糖素原剪切为其羧基端的肽链序列，即GLP-1。GLP-1有2种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，两者之间仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80%的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。已证实，肠促胰素以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而降低血糖。正常人在进餐后，肠促胰素开始分泌，进而促进胰岛素分泌，以减少餐后血糖的波动。但对于2型糖尿病患者，其“肠促胰素效应”受损，主要表现为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减小，但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用并无明显受损，因此GLP-1及其类似物可以作为2型糖尿病治疗的一个重要靶点。

    GLP-1主要通过以下几方面发挥降糖作用：（1）GLP-1具有保护β细胞的作用。GLP-1可作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌[1]，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。此外，GLP-1还可作用于胰岛α细胞，强烈地抑制胰高血糖素的释放，并作用于胰岛δ细胞，促进生长抑素的分泌；（2）GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用；（3）GLP-1具有减轻体重的功效。除此之外，GLP-1还具有许多其他生物学特性及功能，例如，GLP-1可能发挥降脂、降压作用，从而对心血管***产生保护作用；它还可通过作用于中枢增强学习和记忆功能，保护神经。 然而，要将GLP-1应用于临床也面临着问题，那就是人体自身产生的GLP-1 极易被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了GLP-1的临床应用。 为解决这一难题，学者们已经提出两种方案，一是开发GLP-1类似物，让其既保有GLP-1的功效，又能抵抗降解；二是开发DPP-IV抑制剂，使体内自身分泌的GLP-1不被降解。目前临床已经开发成功的这类药物有新型肽类似物如艾塞那肽、利拉鲁肽和DPP-4抑制剂，能增加GLP-1血清浓度并减缓胃排空。

某些中药能降低血糖，但是其测试结果受多种因素影响。首先，每种中药含有成千上万的成分，其中只有少数是有效的。第二，一种中药的不同部分具有不同的构成组分。而且，不同的提取方法会产生不同的活性成分。第三，含多种中药的中药配方可能会有协同效应。一些中草药作为降糖草药已被用于中药治疗糖尿病，例如，人参、苦瓜和黄连可用于I和II型糖尿病。还有许多的植物被用于糖尿病治疗，这些降糖中药的功效是通过增加胰岛素分泌、增强脂肪和肌肉组织的葡萄糖摄取、抑制肠道对葡萄糖的吸收以及抑制肝细胞产生葡萄糖而实现的。

益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。益生菌存在于地球上的各种角落里面，动物体内有益的细菌或真菌主要有：乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌。双歧杆菌是其中最重要的益生菌之一。一些研究表明，双歧杆菌明显减轻NOD小鼠胰岛炎，减少糖尿病的发生。双歧杆菌组胰岛Fas的表达少于对照组，FasL的表达也有显著差异，表明早期应用双歧杆菌可以减少NOD小鼠胰岛炎和延缓糖尿病的发生．其机制与Fas／FasL***介导的胰岛p细胞凋亡有关。同样，通过口服喂养糖尿病KK-AY小鼠乳酸杆菌casei证实能显著性的降低血糖的水平，其机理可能是抑制了动物体内一些炎性因子的产生，如IFN-a，IL-2等。这些因子能够诱发机体产生自身免疫糖尿病，L. casei能够抑制四氧嘧啶所引起的胰腺B细胞的破坏，和非糖尿病小鼠的自身免疫病所导致的B细胞的损伤（M. Serino，E. Luche et al. Intestinal microflora and metabolic diseases.Diabetes & Metabolism 35 (2009) 262–272） 。

发明内容

如前所述，肠道细胞所产生的GLP-1对糖尿病的预防和治疗都具有重要的作用。本发明的目的在于提供一种用于刺激GLP-1分泌的药物，采用中药和改善肠道内益生菌的质量的方法来刺激肠道GLP-1的产生，从而达到防治糖尿病的效果。

 本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

本发明所述的一种用于刺激胰高血糖素样肽-1分泌的药物，包括有效剂量的益生菌。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的益生菌选自：长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的一种或一种以上的组合。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的益生菌用于动物的有效剂量为2.5亿个细菌/kg 体重。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的药物还包括有效剂量的黄连提取物。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的黄连提取物的有效成分是盐酸小檗碱生物碱。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的黄连提取物用于动物的有效剂量为900 ug /kg 体重。

通过实验验证，本发明所提供的药物，可有效刺激细胞分泌GLP-1，改善肠道内菌群尤其是提高益生菌的质量，并结合中药成分，促进GLP-1的分泌，从而达到防治糖尿病的目的。

具体实施方式

下面对本发明做具体说明，应该指出的是，以下实施例用于对本发明的说明而并非限制本发明。尽管用较佳的实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围下可以对本发明进行修改、变形或等同替换，均属于本发明的保护范围。

一、          益生菌培养：

长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌。菌种均由美国安德森生物科技公司（美国加州洛杉矶1008 Ashbourne Place）提供。

20% PTYG培养基。PTYG含：胰蛋白胨5 g，酵母提取物 10 g，大豆蛋白胨5 g，葡萄糖 10g,吐温-80  1 mL，盐溶液40mL，0.1％刃天青l mL，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 15 g， pH值为6.8～7.0，113 ℃ 。购自GIBCO-BRL公司（美国马里兰州盖瑟斯堡）。

先行益生菌计数，相同数量（100万/ml）的细菌被培养12小时后(1640 培养基，不含血清和抗菌素)，高速离心，收集上清，分装后保存在-20°C。采用Bradford 法测定细菌培养液中的蛋白质含量。简述之，用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液做标准曲线，给个试管分别加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用水补充到0.1ml，最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为1号管。用标准蛋白质(mg)为横坐标，用吸光值A595为纵坐标，作图，即得一标准曲线。样品测试采用同样的方法，首先对每组样品做1:25和1:50倍稀释，取0.05ml然后用水补充到0.1ml最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，再测定样品A595值。根据标准曲线的线性斜率，即可计算样品中的蛋白质浓度。测定结果表明，各种细菌培养基中蛋白质的蛋白质浓度范围为25-75mg/ml。 

二、中药提取物的制备：

黄连，由美国安德森生物科技公司提供。

称取50-100克的单味中药黄连，加适量蒸馏水至浸没，煎煮3次（每次15分钟），合并煎液过滤，浓缩至1克/毫升，离心（300转/分钟），收取上清液体，分装保存于-20°C。

黄连提取物的测定采用其中的盐酸小檗碱生物碱为标准。 首先配制标准溶液，精密称取盐酸小檗碱（Sigma-Aldrich ， Saint Petersburg, FL）对照品9.88，5.05 mg，分别依次用甲醇和pH 7.0的缓冲溶液配制，得对照液Ⅰ（0.395 mg·ml-1）和对照液Ⅱ（0.101 mg·ml-1）。 然后，绘制标准测定曲线：精密吸取对照液Ⅱ0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，用pH 7.0的缓冲液稀释至2.0 ml。加入0.007%溴麝香草酚蓝8.0 ml，摇匀，加入氯仿10.0 ml，振摇，静置分层2 min。分取氯仿层，用干燥滤纸滤过，相应试剂为空白，在413 nm测定（Hach DR/3000 分光光度计），以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，做回归方程，计算线性系数（r= 0.999 6）（n=5）。 样品测定：制备液先用水做1:2、1:5、1:10倍稀释， 然后取不同稀释度的提取物0.15 ml，按上述方法，顺序加入各种试剂，依法测定，以计算生物碱含量。

标准曲线的线性范围1.2.～12.94 μg之间。黄连提取物的浓度为54 ug/ml。

三、GLP-1分泌细胞系和培养：

NCI-H716人结肠腺癌细胞系，购自美国菌种保藏中心（ATCC）。

细胞生长在1640培养液中，分别添加10％（体积/体积）胎牛血清和4.5克/升葡萄糖。试验前72小时，将细胞培养在24孔培养板中，密度50%。实验前4小时，用无血清培养基培养细胞冲洗细胞2次，然后用同样培养基培养细胞2小时。更换新培养基，并分别加入前述的黄连提取物（稀释为4-20 ug/ml）或双歧杆菌代谢物（按1:5和1:3稀释），对照区采用同样体积的生理盐水。放置细胞于培养箱中培养30分钟，收集细胞培养液，高速离心后收集上清，分装成2份。一份储存于-80°冰箱中用于GLP-1的测定，一份用于测定蛋白质含量，用于校对细胞GLP-1的分泌量。

四、动物实验：

糖尿病动物模型（ob/ob），购自Jackson Laborator（美国马里兰州巴尔港）。ob/ob小鼠为2型糖尿病模型动物，属常染色体隐性遗传。ob/ob小鼠糖尿病发病是由于ob基因突变，造成其编码的蛋白leptin缺乏，引起肝脂肪生成和肝糖原异生显著增加，高血糖又刺激胰岛素分泌,引起胰岛素抵抗，刺激脂肪的形成。

取ob/ob糖尿病小鼠共12只，分为4组，无菌清洁柜内饲养，温度24°C， 光照和黑暗每12小时转换一次，保持环境安静，自由摄食、饮水。

在进行药物处理前从眼眶收集全血，制备血清病储存在-20°C。

实验方案：动物实验中，共分为4个组：对照组（给予生理盐水），中药黄连处理组，双歧杆菌处理组；中药黄连和双歧杆菌复合处理组。

每日分别给予益生菌（2.5亿个细菌/kg 体重）、中药（黄连 0.3ml、54 ug/ml 浓度，经测算，给药量为900 ug/kg）、 益生菌加黄连饲养，1周后再次从眼眶中收集全血，制备血清，储存。用于测定血清中的GLP-1水平。

GLP-1的测定：按照《人胰高血糖素样肽 1（GLP-1）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书》（由Linco Research公司提供，美国密苏里州）操作。其实验原理是：用纯化的 GLP-1 抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的 GLP-1 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 GLP-1 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

实验开始前，各试剂均被平衡至室温。 

1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100ml，余孔分别加标准品或待测样品 100 ml，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育 2 小时。 

2、 弃去液体，甩干。每孔加检测溶液 A 工作液 100 ml （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温育 1 小时。

3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 400 ml/每孔，甩干。

4、 每孔加检测溶液 B 工作液（临用前配制）100 ml，加上覆膜，37度温育 1 小时。

5、 弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 3。

6、 每孔加底物溶液 90 ml，酶标板加上覆膜， 37 度孵育，避光显色（反应时间在 15-30 分钟）。

7、 每孔加终止溶液 50 ml，终止反应，此时蓝色立转黄色。

8、 立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD值）。

统计分析：结果数据用平均值±标准误标表示。统计分析采用Graphpad InStat公司（www.graphpad.com）的Prism软件。组件比较采用配对t检验，P值小于0.05时判定为显着差异。 

五、结果分析

1.  中药提取物刺激的NCI-H716细胞分泌GLP-1 

表1：中药提取物刺激的NCI-H716细胞分泌GLP-1 (pg/ml/mg 蛋白质)（n=3）

中药提取物	剂量1（4 ug/ml）	剂量2 (10 ug/ml)	剂量3 (20 ug/ml)	P值
					对照组	63.2 +/- 4.6	60.9 +/- 3.5	67.1 +/- 4.3
黄连	235.2 +/- 24.9	429.2 +/- 38.3	687.5 +/- 43.2	**

** P <0.05

对照组为生理盐水。

上述数据分析表明，中药黄连在本实验剂量范围内，具有刺激L-分泌GLP-1的作用，在高剂量时，细胞GLP-1的分泌量增加了10倍。

2. 双歧杆菌代谢产物诱导NCI-H716细胞分泌GLP-1

表2：双歧杆菌代谢产物诱导NCI-H716细胞分泌GLP-1(pg/ml/mg蛋白质) （n=3）

双歧杆菌	细菌代谢产物组别1 （细胞培养基体积：细菌培养基体积=5：1）	细菌代谢产物组别2（细胞培养基体积：细菌培养基体积=3：1）	P值
				对照组	5.3 +/- 1.2	6.7 +/- 1.5
短双歧杆菌	34.3 +/- 4.5	65.5 +/- 21.6	**
				长双歧杆菌	54.9 +/- 10.3	89.4 +/- 17.4	**
青春双歧杆菌	76.8 +/- 20.4	174.7 +/- 31.4	**
				两歧双歧杆菌	62.3 +/- 12.1	89.4 +/- 15.3	**
婴儿双歧杆菌	89.1 +/- 22.4	132.5 +/- 34.9	**

** P <0.05

对照组为生理盐水。

上述数据分析表明，长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的代谢产物，均具有刺激L-分泌GLP-1的作用，其中青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌、的作用最强，在高剂量时，细胞GLP-1的分泌量增加了20倍以上。 

3. 青春双歧杆菌和黄连分别或复合饲养动物时动物体内的GLP-1水平

表3：青春双歧杆菌和黄连分别或复合饲养动物时动物体内的GLP-1水平（pg/ml）（n=3）

动物	对照组	青春双歧杆菌	黄连	青春双歧杆菌和黄连
					ob/ob 小鼠	7.23+/-1.38	24.87+/-4.12**	29.65+/-3,09**	45.04+/-5.37**

** P <0.05

对照组为生理盐水。

上述数据分析表明，在活体动物内，单独给予青春双歧杆菌和黄连均能刺激肠道L-分泌GLP-1的，其GLP-1浓度分别提高了3倍和4倍。但当两者共同使用时，其GLP-1的血液浓度提高了近6倍。  

Claims (1)

1.一种用于刺激胰高血糖素样肽-1分泌的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为用于动物的有效剂量为2.5亿个细菌/kg 体重的青春双歧杆菌与用于动物的有效剂量为900 ug /kg 体重的黄连提取物，所述黄连提取物的有效成分是盐酸小檗碱生物碱。