CN102670625A

CN102670625A - 一种脲类化合物的应用

Info

Publication number: CN102670625A
Application number: CN2011104474889A
Authority: CN
Inventors: 缪朝玉; 张偌瑜; 管云枫; 秦烨
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2031-11-30
Also published as: CN102670625B

Abstract

本发明公开了一种如式I所示的脲类化合物在制备烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂中的应用；本发明还公开了化合物I在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明发现了化合物I的全新用途，该化合物对于烟酰胺磷酸核糖转移酶表现出很好的抑制活性，可用于制备通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来预防和/或治疗的疾病的药物，也可用于防治癌症等疾病。

Description

一种脲类化合物的应用

技术领域

本发明涉及一种脲类化合物的新应用。

背景技术

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又名内脏脂肪素visfatin或前B细胞克隆增强因子PBEF，调控哺乳动物细胞内必需能量物质NAD的水平。癌细胞具有很高的NAD消耗和代谢速率，因而NAD合成途径的限速酶Nampt成为癌症治疗的新靶标，其酶抑制剂FK866(Hasmann M，et al.，CancerResearch 2003；63：7436-7442.)和CHS-828(Hjarnaa PJV，et al.，Cancer Research1999；59：5751-5757.)目前已进入癌症治疗的临床研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种脲类化合物在制备烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂中的应用，以及其在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明发现了一种脲类化合物的全新用途，该化合物对于烟酰胺磷酸核糖转移酶表现出较好的抑制活性，可用于制备通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来预防和/或治疗的疾病的药物，也可用于防治癌症等疾病。

因此，本发明涉及如式I所示的脲类化合物(化学命名为：N-[4-(哌啶磺酰基)苯基]-N′-(3-吡啶基甲基)硫脲即：N-[4-(piperidinosulfonyl)phenyl]-N′-(3-pyridylmethyl)thiourea)在制备烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂中的应用；

因此，本发明的化合物I可用于制备通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来预防和/或治疗的疾病的药物。所述的疾病包括本领域通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来预防和/或治疗的所有疾病，如癌症。

本发明进一步涉及上述化合物I在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

本发明中，所述的癌症可以为卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、或骨肉瘤。

本发明中，所述的癌症的肿瘤细胞可以为人卵巢癌细胞(如人卵巢癌细胞株A2780)、人肝癌细胞(如人肝癌细胞株HepG 2)、人高转移肺癌细胞(如人高转移肺癌细胞株95-D)、人结肠癌细胞(如人结肠癌细胞株HCT-116)、人非小细胞肺癌细胞(如人非小细胞肺癌细胞A549)、或者人骨肉瘤细胞(如人骨肉瘤细胞株U2OS)。

本发明中，所述的药物可为任何适用的常规剂型，其中所含如式I所示的化合物的用量为治疗有效量以上，可根据具体情况选择，一般为0.01～100mg/kg/天。所述的药物可以仅以如式I所示的化合物作为唯一活性成分，也可还含有除如式I所示的化合物以外的其它活性成分。所述的其它活性成分为对如式I所示的化合物的抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶的活性没有不良影响可联合适用的其他活性成分，如其他通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来防治的药物的活性成分。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得，其中的式I化合物可通过英国maybrige公司购得。

本发明的积极进步效果在于：本发明发现了一种脲类化合物的全新用途，该化合物对于烟酰胺磷酸核糖转移酶表现出较好的抑制活性，可用于制备通过抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶来预防和/或治疗的疾病的药物，也可用于防治癌症等疾病。

附图说明

图1为效果实施例1中，式I化合物对烟酰胺磷酸核糖转移酶的抑制曲线图。

图2为效果实施例2中，化合物I对HepG 2肝癌细胞24小时NAD水平抑制的量效曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

效果实施例1化合物I抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶的活性

以下的酶是指烟酰胺磷酸核糖转移酶，可购自康肽生物科技有限公司，也可自行制备。

1、酶的制备：将转化有重组质粒(Nampt-pET28a+)的BL21(DE3)plysS细胞接种于2×YT培养基(37ug/ml氯霉素和75ug/ml卡那霉素)中，37℃振摇过夜，收集菌体后用20倍于原体积的新鲜培养基重悬，37℃培养至OD600约0.6，在0.3mM IPTG、28℃条件下诱导5h。离心收集菌体，并重悬于lysis buffer(20mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl)中，200W超声裂解细胞，超声1s间隙9s，共进行30min。将裂解液于12500rpm、4℃离心50min吸取上清液。该上清液与Ni-NTA柱(购自QIAGEN公司)在冰上振摇孵育1h，再依次用binding buffer(5mM imidazole，0.5M NaCl，20mMTris-Hcl，pH＝7.5)、wash buffer(40mM imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH＝7.5)依次洗去杂蛋白，最后用Elution buffer(200mM imidazole，0.5MNaCl，20mM Tris-Hcl，pH＝7.5)洗脱目的蛋白，并进行SDS-PAGE检测。将洗脱的目的蛋白转移到透析袋中，在4℃冰箱中用灭菌的Tris-HCl(20mM pH＝7.5)透析4～5次，20％PEG20000浓缩后，用Bradford方法测定蛋白浓度。

2、酶反应体系为25μl，其中各种组分的浓度为：50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.02％BSA、12mM MgCl2、2mM ATP、0.4mM PRPP、2mM DTT、2μg/mlNampt、0.2μM NAM、2％DMSO和倍比稀释的化合物。先将0.5μl化合物的不同浓度的DMSO溶液加于96孔板，再加入20μl酶反应混合溶液(除底物之外的酶反应组分)，37℃预孵育5min后，加入4.5μl底物NAM溶液以启动反应，37℃反应15min后于95℃加热1min终止酶反应。

3、待酶反应液在冰上冷却后，依次加入10μl 20％苯乙酮和2M KOH，涡旋混合仪上混匀后于0℃作用2min，加入45μl 88％甲酸，70℃加热5min，冰上冷却。

4、使用酶标仪测定激发波长382nm、发射波长445nm处的荧光值。

5、根据公式：E＝R/(1+(C/IC₅₀)^S)+B(其中E为酶活性，C为化合物浓度，R、IC₅₀、S、B为待拟合的参数)，在origin软件中将酶活性对化合物浓度的曲线进行拟合(见图1)，求出化合物的IC₅₀，结果见表1：

表1

效果实施例2化合物I降低细胞内NAD的水平的实验

肿瘤细胞有着高水平的NAD生成和消耗速率，为满足其快速增值的需要，肿瘤细胞对细胞内NAD水平的依赖比正常细胞更强，而Nampt是哺乳动物体内NAD合成的限速酶，因此肿瘤细胞更容易受到Nampt抑制剂的影响。我们按照如下方法检测化合物对细胞内NAD水平的影响：

(1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液密度后，在96孔细胞培养板中铺制细胞，每孔200μl细胞悬液，约5000个细胞，密度约为2.5×10⁴/ml。

(2)待细胞长至约60～70％，换做含药培养基孵育细胞24小时。

(3)用高氯酸法裂解细胞：吸弃含药培养基，用4℃预冷1×D-Hanks液洗细胞3次，拍干。加入50μl 1M HClO₄液，在冰上反应30min。取40μl反应液，加入16μl1M K₂CO₃，冰上反应20min。用13000g，4℃离心2min。

(4)NAD测定：取用高氯酸法处理的细胞裂解液10μl依次加到96孔透明板中，加入以下各种组分：50mM Tris-HCl(pH 7.5)、3％无水乙醇、1.66mMPES、0.42mM MTT、90μg/ml ADH。反应体系总体积为100μl，将各组分混合均匀后于37℃反应40min，用酶标仪测定570nm处产物MTT-formazan的紫外吸收值，NAD的浓度与紫外信号呈线性。

如图2所示，随着化合物I浓度的增高，细胞内NAD水平逐步降低，在0.8μM左右时对NAD合成的抑制作用达到平台，最大抑制率约为70％。化合物I的半数抑制浓度IC₅₀值为93.7±3.4nM。

效果实施例3化合物I抑制肿瘤细胞的体外增殖的实验

我们考察了化合物I对肿瘤细胞体外增殖能力的抑制作用。用梯度浓度的化合物作用于对数生长期的细胞株3天，利用SRB法进行检测：

(1)将对数生长期的细胞消化后，吹打成单细胞悬液，接种于96孔培养板；5×10³细胞/孔，每孔培养基100μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(2)待细胞贴壁后，加入梯度浓度的受试化合物在培养箱中再培养3天。

(3)10％三氯醋酸固定，4mg/ml SRB(磺酰罗丹明B，购自sigma公司)染色，1％醋酸洗净SRB。

(4)加入10mM Tris(100μl/孔)，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解。

(5)酶标仪检测各孔OD值(检测波长：515nm)，记录结果，按下列公式计算抑制率：抑制率(％)＝(OD对照一OD给药)/OD对照×100％。

结果显示，化合物I对所测试的几种细胞株的增殖表现出不同程度的抑制作用，表2显示了化合物I的IC₅₀值。

表2

细胞株	IC₅₀(μM)
		人卵巢癌细胞株A2780	4.61±2.37
人肝癌细胞株HepG 2	2.43±0.47
		人高转移肺癌细胞株95-D	4.25±1.15
人结肠癌细胞株HCT-116	41.76±3.08
		人非小细胞肺癌细胞A549	2.00±0.50
人骨肉瘤细胞株U2OS	8.69±3.84

Claims

1.一种如式I所示的脲类化合物在制备烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂中的应用；

2.如权利要求1所述的化合物I在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

3.如权利要求2的应用，其特征在于：所述的癌症为卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、或骨肉瘤。

4.如权利要求2的应用，其特征在于：所述的癌症的肿瘤细胞为人卵巢癌细胞、人肝癌细胞、人高转移肺癌细胞、人结肠癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、或者人骨肉瘤细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人卵巢癌细胞为人卵巢癌细胞株A2780。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人肝癌细胞为人肝癌细胞株HepG 2。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人高转移肺癌细胞为人高转移肺癌细胞株95-D。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人结肠癌细胞为人结肠癌细胞株HCT-116。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人非小细胞肺癌细胞为人非小细胞肺癌细胞A549。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的人骨肉瘤细胞为人骨肉瘤细胞株U2OS。