CN102660622A - 一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物类，具体是一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，以脱脂豆粕为原料，进行预处理后加入芽孢杆菌与乳酸菌或酿酒酵母的混合发酵剂，进行固态发酵，混合发酵剂的乳酸菌或酿酒酵母与枯草芽孢杆菌的活菌数比例为1∶1～10；再经提取分离、喷雾干燥而成，本发明克服了现有技术的不足，提供一种利用脱脂豆粕作为原料，生产大豆活性肽的制作方法直接以豆粕为原料固态发酵生产大豆肽；生产工艺简单，成本低，而且有利于环境友好保护；利用不同微生物混合发酵时产生蛋白酶和多种代谢产物，大大简化了工艺过程，节省了生物酶制剂的使用，降低了工业化生产成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法。
背景技术
功能性营养物质的开发是国内外食品领域最热门的研究课题，具有深远的生物学意义和重要的应用价值，是二十一世纪食品工业发展的重点。大豆蛋白是优良的植物蛋白源，其资源丰富、价格低廉，并在经过微生物发酵或酶水解后产生大量不同活性的生物活性肽。大豆活性肽的氨基酸组成与大豆蛋白完全相同，必需氨基酸平衡且含量丰富。由于大豆活性肽的分子量较小，在小肠内能以完整肽段的形式被人体或动物吸收，且具有降低血清胆固醇、降血压和促进脂肪代谢等多种特殊的生理活性功能。因此，大豆活性肽可广泛应用于食品和医药等行业，具有广阔的市场应用前景。
目前，制作大豆活性肽的方法主要是酶解法。主要是将大豆蛋白加水混合，然后加入复合蛋白酶进行酶解，再经过分离、浓缩和干燥，制成大豆活性肽产品。但是由于豆粕中抗营养因子不能完全去除，影响了蛋白酶的活性，因此水解程度不高；同时，利用酶解法生产大豆活性肽一直存在生产成本偏高的问题，主要原因包括：(1)酶解法一般采用大豆分离蛋白作为生产原料，原料成本较普通脱脂豆粕增加5-10倍；(2)液体酶解使用的酶量大，且多为进口酶。同时，酶解法生产大豆活性肽的苦味明显，口感较差，这些都是阻碍大豆活性肽产业化的主要因素。因此，需要一种新的生产工艺来降低大豆活性肽生产成本。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种以脱脂豆粕为原料，利用两种微生物混合培养、固态发酵完成对脱脂豆粕中大豆蛋白质的水解，生产成本低的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法。
本发明的技术方案如下：
一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于：以脱脂豆粕为原料，进行预处理后加入芽孢杆菌与乳酸菌或酿酒酵母的发酵剂，进行固态发酵；再经提取分离、喷雾干燥而成。
本发明具体工艺步骤包括：A、预处理豆粕；B、固态发酵：向经过预处理的脱脂豆粕中加入芽孢杆菌与乳酸菌(或酿酒酵母)的混合发酵剂，进行固态发酵；C、加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣；D、脱色；E、精制：将脱色处理后的酶水解液进行超滤处理；F、喷雾干燥。其中
本发明所加入的混合发酵剂的乳酸菌或酿酒酵母与枯草芽孢杆菌的复配方法为：配制无菌培养基；将活化后各微生物菌种用无菌培养基，按照乳酸菌(或酿酒酵母)与枯草芽孢杆菌的活菌数比例为1∶1～10配制成混合发酵剂，按照固液质量比10～20∶1加入混合发酵剂；发酵温度是30-40℃；发酵时间为24-48小时。
本发明与现有的技术相比，反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质的作用并能降解豆粕中的抗营养因子，从而1)利用普通脱脂豆粕为原料，完成对脱脂豆粕中大豆蛋白质的水解；2)减少外加蛋白酶量，有效的降低生产成本。优点是：克服了现有技术的不足，提供一种利用脱脂豆粕作为原料，生产大豆活性肽的制作方法：(1)直接以豆粕为原料固态发酵生产大豆肽；生产工艺简单，成本低，而且有利于环境友好保护(2)利用不同微生物混合发酵时产生蛋白酶和多种代谢产物，大大简化了工艺过程，节省了生物酶制剂的使用，降低了工业化生产成本。经检测，本发明方法所制备的大豆活性肽含量(以干基计)高达70.12％；肽分子量分布范围为小于10000道尔顿的达到90％以上。
本发明方法所制备得到的大豆活性肽主要是由2-10个氨基酸组成的多肽混合物，是一种多功能营养型因子，具有免疫调节、降压等功能。
具体实施方式
一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，具体工艺步骤包括：
(1)预处理豆粕；将压榨制油得到豆粕进行粉碎，获得粉碎的大豆粕，而后加水调浆至原料浓度10-15％的溶液，在100-120℃温度条件下灭菌处理，冷却至30-40℃。
(2)固态发酵：向经过预处理的脱脂豆粕中加入芽孢杆菌与乳酸菌或酿酒酵母的混合发酵剂，进行固态发酵；按照固液质量比10～20∶1加入发酵菌剂；发酵温度是30-40℃；发酵时间为24-48小时。
(3)加水提取：加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣；分离去除残渣的方法为过滤法或者离心处理，离心转速4000-6000转/分钟，得到大豆活性肽的粗提液。
(4)脱色将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量1.0-5.0％的活性炭粉末或微粒，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0小时后过滤分离。
(5)精制：将大豆活性肽用超滤膜按分子量进行分级分离，操作压力0.3-1.0Mpa，得到不同分子量的不同功能大豆活性肽溶液；截留分子量分别为1000道尔顿，或3000道尔顿，或5000道尔顿，或10000道尔顿。精制是将脱色处理后的酶水解液进行超滤处理；
(6)喷雾干燥。进口温度150-180℃，干燥器内温度100-110℃，出口温度65-100℃。
本发明对步骤(2)的混合发酵剂进行了菌种的筛选，筛选对象包括白地霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽胞杆菌，具体筛选方法是先制备发酵菌剂：活化后的菌种扩大培养后，用无菌水稀释使菌体或者孢子浓度达到3×106个/m1；然后将大豆粕粉碎为粒径在80目左右，121℃下灭菌20min。在固态发酵罐内按照固液比10∶1的比例加入发酵剂，发酵温度为30℃，采用离心力10000g高速离心去除杂质，得到大豆活性肽；
比较不同菌种发酵后大豆粕的水解度、肽得率和微生物产蛋白酶活力及粗提液中大豆蛋白肽的分子量分布，得到芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌的发酵效果较好。
本发明步骤(2)的混合发酵剂的制备方法如下：
A、枯草芽孢杆菌的制备：
斜面培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000ml，pH 7.2。
种子培养基：在斜面培养基的基础上添加KCl 5g。
从活化的菌种斜面培养基中，跳去枯草芽孢杆菌的种子接种于种子培养基，130r/min摇瓶培养48h，达到菌体浓度108个/ml。
B、乳酸菌的制备：
斜面培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000ml，pH 7.2。
种子培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，碳酸钙20g，自来水1000ml，pH 7.2。
从活化的菌种斜面培养基中，挑取乳酸菌的种子接种于种子培养基，静置培养48h，达到菌体浓度108个/ml。
C、酵母菌的制备：
斜面培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖5g，自来水1000ml，pH 7.2。
种子培养基：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖5g，自来水1000ml，pH 7.2。
从活化的菌种斜面培养基中，挑取酵母菌的种子接种于种子培养基，摇瓶培养24h，达到菌体浓度107个/ml。
D、混合发酵剂复配方法为：配制无菌培养基，成分为葡萄糖10g，酵母膏5g，KH2PO4 1g，无菌水1000ml，pH为6.8；将活化后各微生物菌种用无菌培养基，按照乳酸菌(或酿酒酵母)与枯草芽孢杆菌的活菌数比例为1∶1～10配制成混合发酵剂。
下面通过几个实施例具体说明混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法及其产品性能：
实施例1
1)预处理脱脂豆粕：取脱脂豆粕原料150公斤，将大豆粕粉碎至颗径大小为80目，加水调降至原料浓度10％的溶液，在110℃条件下灭菌15分钟，并冷却到35℃；
2)发酵：按固液比10∶1(质量比)的比例加入乳酸菌与枯草芽孢杆菌混合发酵剂，发酵温度为40℃，发酵时间为48小时；
3)加水提取：加水提取固态发酵后的培养基，低速离心处理(3000g)去除发酵液中的固体杂质，从而得到大豆活性肽粗提液；
4)脱色：将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量1.0％的活性炭粉末，于35℃条件下进行脱色处理，1小时后通过板框过滤机去除活性炭粉末；
5)精制：将大豆活性肽用超滤膜按分子量进行分级分离，得到不同分子量和不同功能的大豆肽活性溶液；截留分子量为：1000道尔顿；
6)喷雾干燥：进口温度150℃，干燥器内温度100℃，出口温度75℃。得到的大豆活性肽蛋白质含量为85.1％，分子量在10000Da以下的肽含量为90.2％，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。
实施例2：
(1)取脱脂豆粕200公斤，将脱脂豆粕加水调降至原料浓度12％的溶液，在100℃下灭菌35分钟，并冷却到40℃；
(2)发酵：按固液比15∶1(质量比)的比例加入乳酸菌与枯草芽孢杆菌混合发酵剂，发酵温度为30℃；发酵时间为24小时；
(3)离心：离心转速6000转/分钟；去除发酵液中的固体杂质，从而得到大豆活性肽粗提液；
(4)脱色：将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量3.0％的活性炭粉末，于40℃条件下进行脱色处理，2小时后通过板框过滤机去除活性炭粉末；
(5)精制：用超滤膜按分子量进行分级分离，截留分子量为5000道尔顿。
(6)喷雾干燥：进口温度180℃，干燥器内温度110℃，出口温度100℃。
得到的大豆活性肽蛋白质含量为80.1％，分子量在10000Da以下的肽含量为91.2％，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。
实施例3：
(1)取脱脂豆粕100公斤，将脱脂豆粕加水调降至原料浓度14％的溶液，在120℃下灭菌30分钟，并冷却到35℃；
(2)发酵：按固液比20∶1(质量比)的比例加入乳酸菌与枯草芽孢杆菌混合发酵剂；发酵温度为35℃；发酵时间为36小时；
(3)离心：离心转速5000转/分钟；去除发酵液中的固体杂质，从而得到大豆活性肽粗提液；
(4)脱色：将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量5.0％的活性炭粉末，于45℃条件下进行脱色处理，3小时后通过板框过滤机去除活性炭粉末；
(5)精制：用超滤膜按分子量进行分级分离，截留分子量为5000道尔顿；10000道尔顿。
(6)喷雾干燥：进风温度160℃，干燥器内温度104℃，出口温度95℃。
得到的大豆活性肽蛋白质含量为73.1％，分子量在10000Da以下的肽含量为95.1％，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。
实施例4：
(1)取脱脂豆粕200公斤，将脱脂豆粕加水调降至原料浓度15％的溶液，在115℃下灭菌40分钟，并冷却到35℃；
(2)发酵：按固液比20∶1(质量比)的比例加入酵母菌与枯草芽孢杆菌混合发酵剂，发酵温度为40℃；发酵时间为36小时；
(3)离心：离心转速5000转/分钟；去除发酵液中的固体杂质，从而得到大豆活性肽粗提液；
(4)脱色：将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量1.0％的活性炭粉末，于40℃条件下进行脱色处理，1小时后通过板框过滤机去除活性炭粉末；
(5)精制：用超滤膜按分子量进行分级分离，截留分子量为3000道尔顿；5000道尔顿。
(6)喷雾干燥：进风温度180℃，干燥器内温度110℃，出口温度100℃。
得到的大豆活性肽蛋白质含量为83.1％，分子量在10000Da以下的肽含量为95.1％，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。
Claims (8)
1.一种混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于：以脱脂豆粕为原料，进行预处理后加入芽孢杆菌与乳酸菌或酿酒酵母的发酵剂，进行固态发酵；再经提取分离、喷雾干燥而成。
2.根据权利要求1所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，以压榨制油得到豆粕为原料，其工艺步骤包括：A、预处理豆粕；B、固态发酵：向经过预处理的脱脂豆粕中加入芽孢杆菌与乳酸菌或酿酒酵母的混合发酵剂，进行固态发酵；C、加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣；D、脱色；E、精制：将脱色处理后的酶水解液进行超滤处理；F、喷雾干燥。
3.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于：步骤A中所述的预处理为：将压榨制油得到豆粕进行粉碎，获得粉碎的大豆粕，而后加水调浆至原料浓度10-15％的溶液，在100-120℃温度条件下灭菌处理，冷却至30-40℃。
4.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于：步骤B中所述发酵步骤中，所加入的混合发酵剂的乳酸菌或酿酒酵母与枯草芽孢杆菌的复配方法为：配制无菌培养基；将活化后各微生物菌种用无菌培养基，按照乳酸菌或酿酒酵母与枯草芽孢杆菌的活菌数比例为1∶1～10配制成混合发酵剂，按照固液质量比10～20∶1加入混合发酵剂；发酵温度是30-40℃；发酵时间为24-48小时。
5.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，步骤C中所述的加水提取步骤中，分离去除残渣的方法为过滤法或者离心处理，离心转速4000-6000转/分钟，得到大豆活性肽的粗提液。
6.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，步骤D中所述的脱色处理在以下条件下进行：将大豆活性肽粗提液加入粗提液重量1.0-5.0％的活性炭粉末或微粒，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0小时后过滤分离。
7.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，步骤E中所述的精制是将大豆活性肽用超滤膜按分子量进行分级分离，操作压力0.3-1.0Mpa，得到不同分子量的不同功能大豆活性肽溶液。
8.根据权利要求2所述的混菌固态发酵制备大豆活性肽的方法，其特征在于，步骤F中所述的喷雾干燥在以下条件下进行：进口温度150-180℃，干燥器内温度100-110℃，出口温度65-100℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120912 |