CN102659864B - 一种抗过敏天然产物thbp的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种抗过敏天然产物THBP即2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的制备方法。其特征是包括：将白木香叶用水提取，提取液用大孔树脂除杂、乙醇洗脱，洗脱液浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取部分重结晶，即得。本发明以水作为提取溶剂，极大的节约了成本，且方便后续的提取液浓缩；不但革除了Sephadex LH-20和ODS高成本分离材料的使用，而且省去了硅胶柱层析这种常用分离方法，改进后的提取方法工艺简单、易于操作，且成本大大降低，得率极高。

Description

一种抗过敏天然产物THBP的制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种抗过敏天然产物THBP即2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的制备方法。

背景技术

白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.)为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属常绿乔木,其含树脂的木材作沉香入药,为我国沉香药材的唯一来源。长期以来,由于森林资源和生态环境遭受自然灾害和人为破坏,白木香野生资源量在不断减少,已被列为国家二级保护野生植物。白木香叶在民间常被用来治疗一些伴有炎症和疼痛的外伤疾病，近年来,已有白木香叶制成的茶饮品在市面上销售。

白木香仅有含树脂的木材作为药用,其他部位如叶、树枝、不含树脂的木材均被作为废物处理,造成资源的大量浪费；对白木香叶的合理利用可以对白木香资源综合利用以及提高白木香的经济价值起到十分重要的促进作用。目前，在广东、海南、广西、福建、云南等我国的南方地区已经形成了不少的规模化的种植基地。对白木香叶的研究表明，其主要化学成分为二苯甲酮类、黄酮类等等（王洪刚，周敏华，路晶晶，余伯阳.沉香叶抗肿瘤活性成分研究[J]，林产化学与工业，2008，28（5）：1-5.；聂春晓,宋月林，陈东，等.白木香叶化学成分的研究[J],中国中药杂志，2009，34（7）：858-860.；聂春晓.白木香叶化学成分的研究[D]，呼和浩特:内蒙古医学院，2009.）。发明人前期对白木香叶多酚类成分的研究结果表明，其具有十分显著的抗炎和镇痛活性（Minhua Zhou，Honggang Wang，Suolangjib a,JunpingKou，Boyang Yu.Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.Leaves extract.Journal of Ethnopharmacology：2008，117：345-350.）。另有研究表明，白木香叶的提取物可用于制备用于治疗防治便秘（Hideaki H，Yasuaki I,Nobutak M,et al.LaxativeEffect of Agarwood Leaves and Its Mechanism.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2008，72(2)：335-345.；余伯阳，寇俊萍，周敏华，朱丹妮，袁胜涛.一种沉香叶提取物及其医药和保健用途[P].申请号：200710019969.3）、治疗出血性疾病、降血糖、抗肝癌的药物（余伯阳，寇俊萍，周敏华，朱丹妮，袁胜涛.一种沉香叶提取物及其医药和保健用途[P].申请号：200710019969.3）。从白木香叶分离得到的化合物，特别是二苯甲酮类化合物，各化合物对α-糖苷酶抑制活性均十分显著（Feng J，Yang X W，Wang R F.Bio-assay guided isolation andidentification of a-glucosidase inhibitors from the leaves of Aquilaria sinensis[J].Phytochemistry.2011,72(2-3)：242-247.），而且具有显著的抗氧化活性（路晶晶,戚进,朱丹妮,余伯阳.白木香叶中黄酮类成分结构与抗氧化功能的相关性研究.中国天然药物，2008，6（6）：456-460.）。此外，从白木香中获得的单体化合物：2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮（THBP），为白木香叶的主要成分，具有十分显著的抗过敏、抗炎等生物活性（寇俊萍，余伯阳，戚进，等.2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的医药用途：CN200810244795.5；寇俊萍，余伯阳，戚进，等.2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的医药用途.CN 201010143336.5），且抗过敏性作用机制独特。THBP化学名为2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮，结构式如下：

随着感染性疾病的控制和工业化程度的提高，过敏性鼻炎、哮喘、特发性皮炎、结肠炎、食物过敏、药物过敏等过敏性疾病的发病率，在全世界范围内呈逐年增高趋势，已成为各国政府高度关注的全球健康问题。世界卫生组织已把过敏性疾病列为21世纪需重点研究和防治的三大疾病之一。发明人前期的研究表明，预先以5，20mg·kg^-1灌胃给予THBP可显著或非常显著抑制被动过敏模型小鼠的皮肤水肿、瘙痒行为和自发活动，抑制率分别为64.93％、68.91％、91.11％；可明显改善组胺、P物质诱发的小鼠皮肤过敏反应、IgE依赖性的小鼠三相过敏反应、二硝基氟苯反复涂布引起的小鼠慢性皮肤过敏反应；但无激素类药物抑制免疫器官的副作用，表明化合物是潜在的抗过敏性皮炎，过敏性哮喘等天然药物，具有广阔的应用前景（寇俊萍，余伯阳，戚进，等.2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的医药用途：CN201010143336.5；寇俊萍，余伯阳，戚进，等.2-O-α-L-鼠李糖-4，6，4′-三羟基二苯甲酮的医药用途：CN200810244795.5）。

发明人在前期的研究中试图从白木香叶中分离THBP，采用50％乙醇热回流提取，乙酸乙酯或正丁醇萃取，反复的硅胶柱层析色谱分离，再经Sephadex LH-20和ODS反复纯化，重结晶得到（王洪刚，周敏华，路晶晶，余伯阳.沉香叶抗肿瘤活性成分研究[J]，林产化学与工业，2008，28（5）：1-5.）。该方法成本高，周期长，THBP的得率也低，约0.25‰，相对于THBP在药材中的含量（平均值1.4％）来说是对原料资源的极大浪费，而且无法进行工业化生产，这限制了该药物的进一步研究开发。

发明内容

本发明在前期研究的基础上，对提取分离方法进行了改进，改50％的乙醇提取为廉价易得水溶剂提取，极大的节约了成本，且方便后续的提取液浓缩；不但革除了Sephadex LH-20和ODS高成本分离材料的使用，而且省去了硅胶柱层析这种常用分离方法，改进后的提取方法工艺简单、易于操作，且成本大大降低，得率极高，转移率高达61.80％。

本发明是大极性溶剂--水提取，树脂除杂与乙酸乙酯萃取三个常用简单步骤的融合，通过这三步从白木香叶中制备的THBP，纯度达78.94％，回收率高达82.46％，其中任何一项步骤的改变都将导致产率大幅下降，纯度大大降低，达不到预期效果。

本发明的制备方法包括：将白木香叶用水提取，提取液用大孔树脂除杂、乙醇洗脱，洗脱液浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取部分重结晶，即得。

其中大孔树脂柱层析用乙醇洗脱前，优选先用水和10％-20％乙醇淋洗除杂，本发明中的百分比均为体积百分比。

提取用水的量优选：药材∶水：1∶8～1∶12w/v。

洗脱用乙醇浓度优选50％-70％。

大孔树脂柱层析优选D301、D280或D101型。

用水提取时优选用加热回流方法提取。

重结晶溶剂优选自丙酮、乙酸乙酯、氯仿、甲醇中的一种或几种。更优选下列混合溶剂：丙酮-氯仿：1∶1～1∶30v/v、甲醇-氯仿：1∶10～1∶100v/v或乙酸乙酯-氯仿：1∶6～1∶100v/v。最优选丙酮-氯仿混合溶剂，优选丙酮-氯仿比例为1∶1～1∶30v/v。

白木香叶优选粉碎后10～30目筛。更优选过10目筛。

下面是对提取方法的部分研究：

1不同药材粒度的单因素考察

白木香叶粉碎，分别过10目，20目，30目的筛子，再取原药材，剪碎，宽度为1cm左右，以上三种不同的药材粒度的供试药材，分别称取50g，加入50％的乙醇600ml（12倍量）浸泡两小时，回流提取2h，过滤，冷却，定容至1000ml，离心，得样品溶液。用HPLC法测定THBP的含量并比较，结果如图1所示，其中转移率=提取的THBP含量（％）/原药材中THBP的量（％）。

图1的结果表明，白木香叶中THBP的提取效果受药材粉碎的粒度的部分影响，过10～30目筛均可提取，过10目筛的提取效果最佳。

2不同溶剂对白木香叶中THBP的提取效果物考察

称取白木香叶粉末，每份50克，分别置于1000ml的茄形瓶中，各加入20％、40％、60％、80％的乙醇，水各600ml（12倍量），浸泡2h，加热回流提取3h，过滤，冷却，用提取的溶剂定容至500ml，摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤，按药材含量测定法测定。另将提取液浓缩至干，称重，计算提取物重量，试验结果见表1。

表1不同提取溶剂对白木香叶中THBP提取效果的考察

上述的结果表明：水作为提取溶剂，已能将白木香叶中80.06％的THBP提取出来，其成本远远低于各浓度乙醇，后续操作简单，且根据工业生产的毒性、综合成本和对环境的污染考虑，优选水作为提取THBP的溶剂。

3不同的提取方法对白木香叶THBP的提取效果的考察

热提法：提取方法同2中水的加热回流的方法。

冷浸法：称取白木香叶粉末50g，加入水600ml，浸泡5h，过滤，加水定容至1000ml，摇匀，待测。

渗漏法：称取白木香叶粉末50g，加适量水（280ml）浸泡2h，320ml的水渗漏提取3h。渗漏液加水定容至1000ml。

以上提取液分别经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。按药材含量测定法测定。另将提取液浓缩至干，称重，计算提取物重量。试验结果见表2。

表2白木香叶中THBP的提取方法的选择

上述结果表明：热提法作为提取方法对白木香叶中的THBP提取效果明显优于冷浸和渗漏，故选择热提作为为本工艺的提取方法。

4提取溶剂倍数的筛选

本试验从提取溶剂倍数6、8、10、12、15、18倍中考察。分别称取白木香叶粉末，加入不同的溶剂倍数，用“2”中的提取方法提取，提取液浓缩，再用水分散定容至1000ml，离心，吸取上清液作为供试品溶液。结果如图2所示。

从图2结果看，提取溶剂水的体积倍数越高提取效果越好，但是根据工业生产的提取因素考虑，提取体积倍数越高，能耗越大，各项成本支出较大，而且体积倍数12倍与18倍之间提取效果的差距不是特别大，所以优选体积倍数8-12倍量体积提取药材。

5大孔树脂的选用

已处理好的上述各树脂，用滤纸吸干表面水份，精密量取2ml，置于锥形瓶中，表3中前7种树脂（特异型）用移液管移入40ml药液（含THBP 1.196mg/ml），非特异性树脂移入30ml(1.2151mg/ml)。置于摇床上振荡24h（180r/min,28℃），使其达到饱和吸附。然后抽滤出药液，用蒸馏水洗三遍，每次10ml，合并以上滤液，为未吸附的量，定容至100ml，测定未吸附THBP的量。

将吸附饱和的树脂置回锥形瓶中，加入50ml 90％的乙醇，至摇床中振荡24h，使其充分解吸附，合并解吸液，定容至100ml，测定解吸的THBP的量。测定结果如下：

表3THBP静态吸附与解吸附的实验结果

上述试验结果表明：吸附较好的是D301、D280或D101树脂，最好的是D301树脂，1ml湿树脂能吸附10.9321mg THBP，并且解析比例也高于其他树脂。

6重结晶溶剂选择

选取乙酸乙酯、氯仿、丙酮或者甲醇溶液为重结晶溶剂，重结晶得到的THBP的纯度和得率如下：

由上表可知，用甲醇-氯仿结晶的成品纯度较高，但回收率偏低；用丙酮-氯仿结晶纯化THBP粗品，THBP的得率最高，纯度也较为理想，故最优选丙酮-氯仿作为最佳结晶溶剂。

传统上一般以白木香以含树脂的木材入药或做成香料，而将白木香叶作为废物被废弃。本发明采用了白木香叶作为原料，实现了药用资源的节约与合理利用，适合规模生产。

本发明中的药材来源上选用废弃的白木香叶作为原料，节约了与合理利用了资源；提取过种选用了最廉价易得的水作为提取溶剂并且只提取半小时，大大减低了工业生产的成本；分离提纯过种只采用大孔树脂一步纯化再重结晶，降低了生产周期。

本发明通过对热回流提取各影响因素、大孔树脂静态动态各参数、结晶纯化各条件进行了考察，并经中试放大实验验证，优选了最合理的整套从白木香叶中提取分离二苯甲酮类单体化合物THBP的方法。整套工艺流程简单科学，操作过程稳定可控，作业周期十分短，生产成本低，得到的THBP收率可观，纯度较高，为目前提取分离THBP的最佳工艺，适合工业化生产。

目前尚未见有关从药用植物中大量分离制备二苯甲酮类单体的工艺报道，本发明对天然来源的THBP及二苯甲酮分离制备方法的研究开发具有较高的经济价值和学术价值。

附图说明

图1是不同粒度的药材的提取效果的考察

图2是不同的提取溶剂体积倍数的筛选

具体实施方式

实施例1

取白木香叶200g，粉碎至10目，一次加入水1200mL，回流提取3次，每次0.5小时，保持沸腾。过滤药渣，合并提取液，计算药材中THBP的提取转移率为99.41％。浓缩至3000mL后上D301型大孔树脂进行分离。先后用水、10％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿：甲醇：水（80∶20∶0.5），收集含THBP的部分，减压浓缩，待残留液体为200mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，萃取后的乙酸乙酯部分浓缩至完全干，得THBP的粗品。将THBP粗品用丙酮-氯仿结晶，抽滤，滤饼用氯仿反复洗涤后，真空干燥，得THBP白色粉末。最后THBP的转移率为62.12％，纯度达93.44％。

实施例2

取白木香叶200g，粉碎至10目，一次加入水1200mL，回流提取3次，每次0.5小时，保持沸腾。过滤药渣，合并提取液，计算药材中THBP的提取转移率为99.38％。浓缩至3000mL后上D101型大孔树脂进行分离。先后用水、10％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用30％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿：甲醇：水（80∶20∶0.5），收集含THBP的部分，减压浓缩，待残留液体为200mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，萃取后的乙酸乙酯部分浓缩至完全干，得THBP的粗品。将THBP粗品用丙酮-氯仿结晶，抽滤，滤饼用氯仿反复洗涤后，真空干燥，得THBP白色粉末。最后THBP的转移率为68.15％，纯度为89.23％。

实施例3

取白木香叶200g，粉碎至20目，一次加入水2000mL，回流提取3次，每次1小时，保持回流。过滤药渣，合并提取液，计算药材中THBP的提取转移率为98.91％。浓缩至3000mL后上D301型大孔树脂进行吸附。先后用水、20％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用80％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿：甲醇：水（80∶20∶0.5），收集含有THBP的部分，减压浓缩，待残留液体为200mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取5次，减压旋干该部分得THBP粗品。将THBP粗品用丙酮-氯仿结晶，滤饼用氯仿反复洗涤后，真空干燥，得THBP白色粉末。最后THBP收率为60.23％，纯度达92.06％。

实施例4

取白木香叶200g，剪碎至0.5cm长的碎片，一次加入20％的乙醇水1100mL，回流提取3次，每次0.5小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中THBP的提取转移率为94.66％。浓缩至3500mL后上D101大孔树脂进行分离。先后用水、10％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用30％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为氯仿：甲醇：水（80∶20∶0.5），收集含有THBP的部分，减压浓缩，待残留液体为250mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，萃取后减压旋干该部分得THBP粗品，粗品用乙酸乙酯溶解成饱和溶液，于滤纸上垫一层100-200目硅胶，抽滤，再用120ml的乙酸乙酯淋洗硅胶，收集滤液，减压回收溶剂得THBP白色粉末。将该粉末用丙酮-氯仿结晶，抽滤，滤饼用少量氯仿洗涤后，真空干燥，得THBP白色粉末。最后THBP收率为52.34％，纯度达94.45％。

实施例5

取白木香叶5kg，粉碎至10目，一次加入水60L，回流提取3次，每次0.5小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中THBP的提取转移率为99.84％。浓缩至18L后上D301大孔树脂进行吸附。先后用水、10％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为展开剂为氯仿：甲醇：水（80∶20∶0.5），收集含有THBP的部分，减压浓缩，待残留液体为3L左右时加入3L的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，萃取后减压回收溶剂，得THBP粗品。将THBP粗品用丙酮-氯仿结晶，抽滤，滤饼用氯仿反复洗涤后，真空干燥，得THBP白色粉末。最后THBP收率为61.80％，纯度达92.74％。

Claims (1)

1.2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羟基二苯甲酮的制备方法，包括：将白木香叶粉碎后，过10～30目筛，用水以1:8～1:12w/v比例加热回流提取，提取液用大孔树脂除杂，先用水和10％-20％乙醇淋洗，70％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取部分以丙酮和氯仿按体积比1:1～1:30混合的混合溶剂重结晶，即得，其中大孔树脂柱层析为D301或D280，所述百分比为体积百分比。