CN102657693A - 蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1抑制剂及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，是以降香黄檀枝或/和降香黄檀叶为原料，经粉碎、水浸泡、过滤分离、加热蒸发浓缩，干燥，加水溶解，得水提物，与常规量的医药辅料混合后，按常规制备成医药上可接受的胶囊、冲剂、片剂、丸药或口服液。应用SHP-1的催化结构域?SHP-1为靶标，在体外对降香黄檀水提物对?SHP-1的抑制作用进行了检测，结果显示：降香黄檀水提物可以在体外抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的活性。因此，可用降香黄檀水提物，来制备用于治疗SHP-1过表达或活力过高所致的相关疾病的各种药物或药物的组成成分。

Description

蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂及其制备
技术领域
本发明涉及一种蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂，特别涉及一种能对蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1体外酶活力进行抑制的抑制剂，属于生物技术领域。
背景技术
SHP-1为含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶-1(SH2-containing tyrosine phosphatase 1, SHP-1) ，又称为HCP、SHPTP1、PTP1C或PTPN6，是含有SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族中的重要成员。20世纪90年代初，由华盛顿大学等研究组相继分离纯化，并成功克隆其cDNA，蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1全长共641个氨基酸残基，分子量为70510Da。研究证明，胃癌和免疫缺陷综合症大多与SHP-1的活力异常增高密切相关，因此，SHP-1已成为开发治疗胃癌和免疫缺陷综合症药物的重要靶标。近年来的研究还发现，SHP-1能够在控制血糖方面发挥作用，研究者用先天功能性缺失SHP-1的Ptpn6me-v/me-v小鼠以及与该小鼠同时出生的野生型小鼠进行比较研究后发现，先天功能性缺失SHP-1的小鼠具有明显的葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性，这预示着通过抑制 SHP-1在体内的活性，有可能恢复糖尿病人对血糖的控制能力。此外，研究人员还发现，SHP-1在肝脏附近会抑制胰岛素的分解，这解释了为什么因新陈代谢紊乱而引起肥胖的患者的胰岛素浓度会升高。因此研究、寻找针对SHP-1的特异性抑制剂，不仅在开发治疗胃癌和免疫缺陷综合症药物上有应用前景，也有望提高人体对胰岛素的敏感性，有效地治疗2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖等疾病。由于SHP-1全酶活性很低，因此，应用SHP-1的催化结构域（∆SHP-1，分子量4.5kD）为靶标，通过体外酶反应动力学实验，从中药中筛选对其有高效专一抑制作用的中药具有实际应用价值。
近年来，国内外的很多研究人员一直都在寻找高效、专一的蛋白质酪氨酸磷酸酶PTPs抑制剂，虽然特异的和安全的蛋白质酪氨酸磷酸酶PTPs抑制剂产品还未有问世，但PTPs抑制剂的研究，尤其是PTP1B抑制剂的研究已经取得了一定的进展，但目前尚未发现SHP-1抑制剂的有关报导。
降香黄檀的别名为黄花梨、花梨木或降香木或降香，降香黄檀为半落叶乔木，高10－25米，胸径可达80厘米；树冠广呈伞形，分枝较低，树皮浅灰黄色，略粗糙。主要分布在常年气温较高的亚热带，在我国南方的海南、云南等省均有分布。降香黄檀的萌芽力较强，现存林木多为萌生小径木，而天然林木生长较慢，人工栽培的林木生长较快，长势良好。降香黄檀一般每年换叶一次，特别干旱时则叶全落，初雨时，降香黄檀花叶同时抽出，每年的10～12月果实陆续成熟。降香黄檀即降香的药用价值在《本草纲目》、《海南本草》、《类证本草》中均有记载，具有行气活血、止血止痛、辟秽等功效，民间用于治疗呕吐、心胃气痛、冠心病以及高血压和皮肤过敏等，目前尚未发现降香黄檀在抑制SHP-1方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂及其制备方法。
本发明提供的是这样一种蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于以降香黄檀枝或/和降香黄檀叶为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过40～60目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1:3～5的体积比，在降香黄檀粉中加水搅拌均匀后，浸泡1～3小时，过滤分离出残渣，得降香黄檀浸泡液；
C、将步骤B的降香黄檀浸泡液加热至100℃，蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于80～150℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:10～100的质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用水溶解，得降香黄檀水提物。
所述步骤E的降香黄檀水提物与常规量的医药辅料混合后，按常规制备成医药上可接受的任何制剂，如胶囊、冲剂、片剂、丸药、口服液等口服制剂，得蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂。
所述步骤B的水为自来水。
所述步骤B的搅拌时间为0.5～1小时，搅拌速度为60～300转/分。
所述步骤E的水为蒸馏水。
所述蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂的人体剂量推荐为2～5克降香黄檀提取粉/人/日（按人均体重60公斤计）。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案得到的降香黄檀水提物，经常规方法制备成医药上可接受的任何制剂后，应用SHP-1的催化结构域∆SHP-1为靶标，在体外对降香黄檀水提物对∆SHP-1的抑制作用进行了检测，结果显示：降香黄檀水提物可以在体外抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的活性。因此，可用降香黄檀水提物，来制备用于治疗SHP-1过表达或活力过高所致的相关疾病的各种药物或药物的组成成分。
附图说明
图1为降香黄檀枝水提物对SHP-1的IC50：233.5ug/ml；
图2为降香黄檀叶水提物对SHP-1的IC50：333.6ug/ml；
图3为降香黄檀枝水提物对ERK的磷酸化影响；
图4为降香黄檀叶水提物对ERK的磷酸化影响。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提供的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，以降香黄檀枝为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过40目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1:3的体积比，在降香黄檀粉中加自来水，在速度为60转/分下搅拌1小时，浸泡1小时，过滤分离出浸泡液及残渣，得降香黄檀水提液；
C、将步骤B的水提液加热至100℃，以蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于80℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:10质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用蒸馏水溶解，得降香黄檀水提物。
在步骤E的降香黄檀水提物中配加常规医药辅料，并按常规制备成胶囊。
实施例2
本发明提供的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，以降香黄檀叶为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过60目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1: 5的体积比，在降香黄檀粉中加自来水，在速度为300转/分下搅拌0.5小时，浸泡3小时，过滤分离出浸泡液及残渣，得降香黄檀水提液；
C、将步骤B的水提液加热至100℃，以蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于150℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:40质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用蒸馏水溶解，得降香黄檀水提物。
在步骤E的降香黄檀水提物中配加常规医药辅料，并按常规制备成片剂。
实施例3
本发明提供的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，以降香黄檀枝和降香黄檀叶为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过50目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1:4的体积比，在降香黄檀粉中加自来水，在速度为150转/分下搅拌0.8小时，浸泡2小时，过滤分离出浸泡液及残渣，得降香黄檀水提液；
C、将步骤B的水提液加热至100℃，以蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于100℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:50质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用蒸馏水溶解，得降香黄檀水提物。
在步骤E的降香黄檀水提物中配加常规医药辅料，并按常规制备成口服液。
实施例4
本发明提供的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，以降香黄檀枝和降香黄檀叶为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过60目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1:4的体积比，在降香黄檀粉中加自来水，在速度为100转/分下搅拌 1小时，浸泡2小时，过滤分离出浸泡液及残渣，得降香黄檀水提液；
C、将步骤B的水提液加热至100℃，以蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于120℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:40质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用蒸馏水溶解，得降香黄檀水提物。
在步骤E的降香黄檀水提物中配加常规医药辅料，并按常规制备成冲剂。
为表明本发明对蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的抑制作用，本发明经检验，结果如下：
1）、测定原理和方法：
SHP-1是一种磷酸化酶，它可以使磷酸化的蛋白去磷酸化。对-硝基苯磷酸二钠盐（pNPP）可以被SHP-1去磷酸化，变成对-硝基苯酚，颜色呈黄色。因此，通过检测410nm处光吸收值的变化，来间接检测蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的酶活性的变化情况。测定体系如下：25mM 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），1mM 牛血清白蛋白（BSA），1mM 二硫苏糖醇（DTT），0.1mM 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA），20mM对-硝基苯磷酸（p-NPP），5nM PTP1B，在37℃反应30min，加入100μl 0.2M NaHCO3终止反应,在410nm处测定光吸收的变化值；
2）降香黄檀水提物对SHP-1的抑制能力测定：
用本发明实施例1、实施2的E步骤的水提物分别对SHP-1的抑制能力的考察，是通过测定半数抑制浓度（IC50）来衡量。将实施例1、实施2的E步骤的水提物分别按2倍梯度用蒸馏水稀释，将稀释后的水提物加入反应体系中，同时设置不加水提物的空白对照样，测定37℃，30min内光吸收的变化值，之后将各个梯度的吸收值与空白对照样的吸收值相除，得出的数值为抑制百分数，当达到50%时，所对应的稀释梯度的倍数做为IC50（参见图1和图2）。具体是：
将实施例1、实施2的E步骤的水提物分别按2倍梯度用蒸馏水稀释，测定每个稀释浓度对SHP-1的抑制能力，测得IC50，以水提液的浓度（mg/ml）作为IC50的单位，经测定，实施例1的E步骤的降香黄檀枝水提物的IC50为233.5ug/ml，实施2的E步骤的降香黄檀叶的水提物的IC50为333.6ug/ml。两者IC50不同是各自所含有的抑制SHP-1的有效成分不同所致。
细胞水平检测发现，实施例1、实施2的E步骤的水提物均对HepG2细胞内ERK蛋白的磷酸化水平有升高作用，说明了它们通过抑制PTPs的活力而影响了细胞信号转导，发挥了生物学作用（参见图3和图4）。

Claims (5)

1.一种蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于以降香黄檀枝或/和降香黄檀叶为原料，经过下列步骤：
A、按常规干燥、粉碎至过40～60目筛，得降香黄檀粉；
B、按降香黄檀粉:水=1:3～5的体积比，在降香黄檀粉中加水搅拌均匀后，浸泡1～3小时，过滤分离出残渣，得降香黄檀浸泡液；
C、将步骤B的降香黄檀浸泡液加热至100℃，蒸发去除水分，得到降香黄檀水提浸膏；
D、将步骤C的降香黄檀水提浸膏于80～150℃下干燥至去除水分后，粉碎成粉，得降香黄檀提取粉；
E、按降香黄檀提取粉:水=1:10～100的质量比，将步骤D的降香黄檀提取粉用水溶解，得降香黄檀水提物。
2.如权利要求1所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于所述步骤E的降香黄檀水提物与常规量的医药辅料混合后，按常规制备成医药上接受的胶囊、冲剂、片剂、丸药或口服液。
3.如权利要求1所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于所述步骤B的水为自来水。
4.如权利要求1所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于所述步骤B的搅拌时间为0.5～1小时，搅拌速度为60～300转/分。
5.如权利要求1所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂，其特征在于所述步骤E的水为蒸馏水。
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