CN102653762B - 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法 - Google Patents

具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102653762B
CN102653762B CN201110431938.5A CN201110431938A CN102653762B CN 102653762 B CN102653762 B CN 102653762B CN 201110431938 A CN201110431938 A CN 201110431938A CN 102653762 B CN102653762 B CN 102653762B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cancer cell
gastric cancer
bgc
cell bgc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201110431938.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102653762A (zh
Inventor
陈媛媛
朱静嬿
李哲
武岳
余抗抗
宋一超
陈付学
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Shanghai for Science and Technology
Original Assignee
University of Shanghai for Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Shanghai for Science and Technology filed Critical University of Shanghai for Science and Technology
Priority to CN201110431938.5A priority Critical patent/CN102653762B/zh
Publication of CN102653762A publication Critical patent/CN102653762A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102653762B publication Critical patent/CN102653762B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因及其制备方法。该基因是根据胃癌细胞BGC-823设计出的Stat5b-shRNA的两条部分互补核苷酸序列，再将该两条互补核苷酸序列和市售SilenCircleTMRNAi转录试剂盒中的SilenCircle质粒进行连接，得到具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因。本发明设计对与胃癌细胞BGC-823增殖有关联的基因的RNAi，并应用胃癌细胞BGC-823模型研究其对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用。为RNAi在胃癌治疗应用提供了一种新方法。

Description

具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因及其制备方法。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一 ,其发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤的前二位。胃癌因缺乏特异性的初筛指标以及早期患者症状不明显，因此早期胃癌很难发现，大部分胃癌患者就诊时已进入进展期。目前，尽管采用手术、化疗和放疗等综合措施治疗胃癌, 但总体疗效仍欠理想。随着胃癌分子生物学研究的不断深入, 针对肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期、侵袭浸润以及血管生成等分子生物靶点提出的分子靶向治疗成为胃癌综合治疗的重点和热点。
信号转导和转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，Stats)家族是一种存在于胞浆，并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控的双重功能。Stat5作为该家族的成员之一，它涉及到由细胞因子，激素和生长因子所介导的各类信号转导过程，参与了细胞生长、分化、凋亡等多种生理功能的调控，并与造血功能、免疫反应以及肿瘤的发生和发展关系密切。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链 RNA（double stranded RNA, dsRNA）介导的序列特异性转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing , PTGS）的过程，通过反义链与正义链形成双链RNA，特异性地抑制靶基因的表达，即通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（正义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因。
本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。
本发明的目的之三在于提供该基因在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于抑制胃癌细胞BGC-823增殖的Stat5b-RNAi质粒，其特征在于该质粒是将设计的干扰片段进行合成，然后与pSilenCircle质粒连接而得到的；所述的干扰片段的序列为：
Sense： 5'-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCT-3’
Anti-sense:： 5'-AAA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCG -3’。
一种制备上述的具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据SilenCircle TM RNAi 转录试剂盒中载体设计的具体要求，设计对应于Stat5基因中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC核心序列的shRNA的两条部分互补的寡核苷酸序列进行合成，即得到具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因；所述的两条互补寡核苷酸序列为：
Sense： 5'-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCT-3’
Anti-sense:： 5'-AAA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCG -3’
其中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC为与Stat5b基因进行互补配对的序列。
上述的具有抑制胃癌细胞增殖功能的基因在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。
本发明设计对与胃癌细胞BGC-823增殖有关联的基因的RNAi，并应用胃癌细胞BGC-823模型研究其对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用。为RNAi在胃癌治疗应用提供了一种新方法。
附图说明
图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和PSilenCircle质粒的连接图。
图2为实验分组与检测指标  未转染对照组数据对比图。
具体实施方式
1.胃癌细胞BGC-823的培养：将长满细胞的培养皿中培养基吸出,加2ml无菌1×D-Hanks洗涤两次,弃去洗涤液,加0.25%胰蛋白酶1-1.5 ml,消化液均匀覆盖细胞表面,消化时间约1-3分钟。消化后在倒置显微镜下可见细胞皱缩变圆,边缘折光性增强,在细胞尚未脱落时倒掉消化液,立即加入血清或含血清的培养基,终止消化。将培养瓶壁上的细胞吹打下来, 1000 rpm/分钟，离心5分钟,弃去培养基,加入含10%FBS的RPMI-1640培养液6ml,吹打混匀, 视细胞密度以1:2或1:3分皿培养,当细胞长满培养瓶且形成致密单层时即可再传代。
2.Stat5b-RNAi质粒的设计和转染：根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于Stat5b基因的干扰碱基，各为57bp，并进行合成。
Stat5b-RNAi 对应的序列为：
SEQ NO.1:
Sense： 5'-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCT-3’
Anti-sense:： 5'-AAA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCG -3’
根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，将设计的shRNA和SilenCircle质粒连接，参见图1，然后转染进胃癌细胞BGC-823。
图1为 SilenCircleTM质粒原理的图解，它使用基于RNA的U6聚合酶III启动子和优化的终止子，从而在靶细胞内可以精确地形成小分子干扰RNA(shRNA)。 shRNA的表达质粒是一个预切好的备用载体。通过质粒上携带的筛选标记，进行哺乳动物细胞的共转染，可建立shRNA表达的稳定细胞系。通过两个SilencircleTM的质粒各自与正义的DNA***片段及反义的DNA***片段相连接，便可介导shRNA的产生。或者单个质粒与一个具有发夹结构的DNA***片段相连接，也可介导shRNA的产生。无论哪种方法，首先必须合成两段互补的DNA片段。而U6启动子则控制着shRNA的生成（参附图）。对于需要进行干扰的目的基因，选择一段靶序列为A2GN17C的DNA片段（靶序列的正义序列），其GC含量接近50％。
3.Stat5b-RNAi质粒的转染：转染前一天，在含有5ml 无抗生素的RPMI 1640生长培养基的60-mm培养皿里种上2×107个胃癌细胞BGC-823。然后用500μl无血清的培养基（RPMI1640）溶解8.0μg的Stat5b-RNAi表达载体，用500μl培养基（RPMI1640）溶解LipofectamineTM2000(20μl)，轻轻地混匀，再室温孵育5分钟。孵育5分钟后，这个shRNA表达载体与LipofectamineTM2000充分结合，然后将它们轻轻混匀，室温孵育20分钟，这样做是为了形成LipofectamineTM2000的复合物。DNA-LipofectamineTM2000复合物被加入到60mm培养皿里，之后细胞在37℃，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。
4.实验分组与检测指标  未转染对照组组：未经转染Stat5b-RNAi的人胃癌细胞BGC-823细胞；空载体对照组：转染空载体质粒的人胃癌细胞BGC-823细胞；RNAi组：转染Stat5b-RNAi的人胃癌细胞BGC-823细胞。 
胃癌细胞BGC-823增殖：在转染后48小时，将CCK-8加入细胞培养液后1h，使用酶标仪检测胃癌细胞BGC-823的增殖情况。
结果请参见图2，图2结果：RNAi组胃癌细胞BGC-823在48h以后胃癌细胞增殖明显少于对照组胃癌细胞BGC-823(P<0.05)。说明在胃癌细胞BGC-823中Stat5b-RNAi在48h后可明显胃癌细胞增殖。

Claims (2)

1.一种用于抑制胃癌细胞BGC-823增殖的Stat5b-RNAi质粒，其特征在于该质粒是将设计的干扰片段进行合成，然后与pSilenCircle质粒连接而得到的；所述的干扰片段的序列为：
Sense： 5'-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCT-3’
Anti-sense:： 5'-AAA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC AAG AAT GCT GGC CAT ATA ACG CCG -3’。
2.一种根据权利要求1所述的用于抑制胃癌细胞BGC-823增殖的Stat5b-RNAi质粒在制备抑制胃癌细胞BGC-823增殖药物中的应用。
CN201110431938.5A 2011-12-21 2011-12-21 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法 Expired - Fee Related CN102653762B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110431938.5A CN102653762B (zh) 2011-12-21 2011-12-21 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110431938.5A CN102653762B (zh) 2011-12-21 2011-12-21 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102653762A CN102653762A (zh) 2012-09-05
CN102653762B true CN102653762B (zh) 2014-10-01

Family

ID=46729493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110431938.5A Expired - Fee Related CN102653762B (zh) 2011-12-21 2011-12-21 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102653762B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103215270B (zh) * 2013-04-28 2015-02-25 上海大学 具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的dna片段及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daoxin Jin.The effect of STAT5 silenced by siRNA onproliferation, apoptosis and invasion ofesophageal carcinoma cell line EC9706.《Chinese-German Journal of Clinical Oncology》.2010,第9卷(第12期),P692–P696. *
DaoxinJin.TheeffectofSTAT5silencedbysiRNAonproliferation apoptosis and invasion ofesophageal carcinoma cell line EC9706.《Chinese-German Journal of Clinical Oncology》.2010
Qin-Chuan Liang.Inhibition of transcription factor STAT5b suppresses proliferation,induces G1 cell cycle arrest and reduces tumor cell invasion in human glioblastoma multiforme cells.《Cancer Letters》.2009,第273卷164–171. *
Qin-ChuanLiang.InhibitionoftranscriptionfactorSTAT5bsuppressesproliferation induces G1 cell cycle arrest and reduces tumor cell invasion in human glioblastoma multiforme cells.《Cancer Letters》.2009
张丽杰.靶向STAT5 的RNAi 重组质粒的构建与鉴定.《临床检验杂志》.2011,第29卷(第3期),199-201. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102653762A (zh) 2012-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hu et al. Antisense oligonucleotide against miR-21 inhibits migration and induces apoptosis in leukemic K562 cells
CN102181445A (zh) 一种靶向lin28基因的干扰小分子rna及其抗胶质瘤增殖的用途
CN101633923A (zh) 人黑色素瘤细胞相关的长非编码rna序列及其用途
CN103233009B (zh) 降低锌指蛋白ctcf表达的物质在制备治疗白血病药物中的应用
CN102653762B (zh) 具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法
CN101353656B (zh) 抑制表皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用
CN102433336A (zh) 用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰rna及其制备方法和应用
CN101338321B (zh) 胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途
Deng et al. Misprocessing and functional arrest of microRNAs by miR-Pirate: roles of miR-378 and miR-17
Huang et al. Effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide on cell apoptosis and expression of hTERT and bcl-2 mRNA in keloid fibroblasts.
CN101096670B (zh) 干扰人甲胎蛋白基因的siRNA及重组腺病毒
CN100386435C (zh) 抑制多效生长因子基因表达的小干扰rna及其应用
CN102229928B (zh) 人rbbp6基因的小干扰rna及其应用
CN102174514B (zh) 一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用
CN101948859A (zh) 特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用
CN101353655B (zh) 抑制血管内皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用
CN101270358A (zh) 一种miRNA序列及其用途
CN104745580B (zh) 沉默人的CDT1基因的siRNA、重组载体及用途
CN113262304B (zh) miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用
CN103952406A (zh) 抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用
CN101787368B (zh) 抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用
CN102453715A (zh) 一种高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰rna、其制备方法及其应用
CN103255172A (zh) 一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用
CN103215270B (zh) 具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的dna片段及其应用
CN102041270B (zh) 胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141001

Termination date: 20161221

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee