CN102648414A

CN102648414A - 校准试剂及其用途

Info

Publication number: CN102648414A
Application number: CN2010800518294A
Authority: CN
Inventors: M·阿萨迪格尔; E·诺戈采克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-11-16
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-08-22
Also published as: BR112012011055A2; US20120220489A1; WO2011058136A1; CA2778866A1; EP2502072A1; KR20120116396A; MX2012005428A; JP2013511032A

Abstract

本发明提供了校准试剂及其用途，所述标准试剂包含通过接头与蛋白质载体缀合的肽，其中所述肽包含目的表位。

Description

校准试剂及其用途

在近年内开发和建立了反相蛋白质阵列（RPA）作为用于分析在微量生物学样品（例如细胞裂解物、组织裂解物或体液）中代表不同信号转导级联的关键分析物的聚焦的蛋白质组的便利方法。蛋白质表达的相对差异不仅代表特定关键蛋白质的丰度，而且代表这些关键蛋白质的活化的、翻译后修饰（例如磷酸化）形式，其可描述和分类例如对细胞培养物施加的药物化合物的特定处理效果，例如候选药物对激酶的抑制作用，或描述和分类不同疾病状态，例如肿瘤在其不同进展状态中的亚型。RPA可进行多个平行样品的比较测量，例如来自不同处理的细胞培养物的样品或来自不同疾病群体的样品。在不同样品组群中发现的蛋白质表达或蛋白质活化模式的显著改变将有助于例如鉴定最有效的候选药物，阐明处理诱发的作用模式方案，或发现新的诊断/预后疾病标记物。

免疫亲和测定，例如在反相蛋白质阵列（RPA）中使用的免疫亲和测定是基于亲和试剂和目的蛋白质之间的特异性相互作用。所述测定包括在阵列上固定生物学样品，形成样品点。将固定了样品的阵列与亲和试剂（即抗体）孵育，并通过产生的检测信号，例如发光信号测量随后形成的亲和试剂和目的蛋白质的复合物。使用分析物特异性亲和试剂对每个阵列染色，所述亲和试剂可被标记或与第二检测试剂孵育。通过多种手段（色度、荧光、化学发光等）检测形成的复合物。一般RPA测量不同样品之间的表达或活化信号的相对变化。

样品的定量分析需要使用校准试剂。目前用于蛋白质分析物的校准试剂是与分析物具有相同氨基序列的重组蛋白质。例如，专利申请WO2007/048436A1描述了用于反相蛋白质微阵列的校准曲线，其中对包含BSA或大鼠血清的点样缓冲液加入不同浓度的纯化目的蛋白质（Akt）。然而，产生呈现正确表位的重组蛋白质是费时的，且经常不成功。特别是对磷酸化的表位，目前没有可用的可靠校准试剂。

因此，需要设计提供具一般适用性的、对不同目的分析物表位具有可选择的特异性的试剂。所述试剂将允许校准例如在分隔的时间、由不同的实验室人员、在不同的设备或在不同的印记循环（print run）中构建的阵列上进行的实验结果。此外，可最佳地预定义由各个亲和试剂产生的蛋白质特异性RPA信号的线性范围。

因此，本发明提供了包含通过接头与蛋白质载体连接的肽的校准试剂，其中所述肽包含目的表位。优选地，所述目的表位是磷酸化的。

使用此校准试剂，可利用RPA或另一种亲和测定产生用于定量蛋白质的可靠的标准曲线。通常使用机器人微阵列点样仪（microarrayer）通过将小样品体积的例如细胞或组织裂解液沉积在高度结合性的基质表面上构建RPA。在基质上的每个裂解物点包含细胞蛋白质和分析物的全部成分（complement）。可在一个微阵列上平行点样数百个样品，以允许在同一测定中的样品的高通量交叉比较。因为每个点消耗的样品体积极低，可以从相同的最初体积的样品材料中容易地产生包含相同样品组的重复阵列。

本发明的校准试剂对定量包含磷酸化的目的表位的蛋白质特别有效。

术语“目的表位”指被目的亲和试剂识别的多肽部分。目的亲和试剂优选地对目的表位是特异性的。

如本文使用的术语“表位肽”指包含目的表位的肽。表位肽优选地为12至25个氨基酸之间的长度。更优选地，肽的长度是12至20，更优选地14至17个氨基酸的长度。

目的表位可被修饰，例如磷酸化。本文中使用的术语“磷酸化的表位”指包含至少一个具有磷酸基的氨基酸的表位。优选地，目的表位包含1至5个磷酸化氨基酸。优选地，修饰的氨基酸的位置大约在表位肽的中间。例如在15个氨基酸长度的肽中，修饰的氨基酸优选地在第7、8和/或9位（见图2C）。修饰氨基酸（例如磷酸化）的方法是本领域技术人员熟知的。

表位肽通过接头（见图1A）与蛋白质载体共价结合，其中所述表位肽与接头共价结合，接头与蛋白质载体共价结合。在一个优选的实施方案中，结合与BSA的游离的N-端半胱氨酸（Cys）基团共价结合，其中游离的Cys基团是未参与二硫键的半胱氨酸残基。

表位肽可基本在两步中与蛋白质载体连接：

步骤1）接头与表位肽缀合，其中所述接头优选用标签标记。接头可与肽的N-或C-端连接。优选地，接头与肽的N-端连接。

步骤2）接头的游离端与蛋白质载体缀合。

接头或间隔区是包含2至10，优选2至5，更优选3至4个天然或非天然氨基酸的肽。天然氨基酸是天然存在的氨基酸，例如特别是丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。非天然氨基酸是不天然存在的氨基酸。非天然氨基酸的实例是8-氨基-3，6-二氧辛酸（dioxa-octanoicacid）（Doa）和氨基氧乙酸。

接头是亲水，且可仅包含天然氨基酸，或仅包含非天然氨基酸，或包含天然和非天然氨基酸二者的混合物。优选地，接头包含一个或多个以下天然氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。接头也优选包含一个或多个Doa。更优选地，接头是半胱氨酸-Doa-Doa。

优选地，用Dabsyl（丹磺酰）标记接头。

产生具有特定氨基酸序列的肽的方法是本领域技术人员熟知的。合适的方法是，例如在Merrifield,Science 1986,232:341-347(方法)和Carpino等人,J.Am.Chem.1990,112:9651-52(试剂)中描述的固相合成。

蛋白质载体是非特异地结合至表面的蛋白质。优选地，蛋白质载体是至少20kDa的蛋白质，并与在亲和测定中使用的亲和试剂不显示或显示很低的交叉反应性。蛋白质载体优选地是白蛋白，更优选地血清白蛋白，例如牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白。优选的血清白蛋白是BSA。

“目的亲和试剂”是识别并结合目的表位的试剂。优选地，目的亲和试剂对目的表位是特异性和选择性的。亲和试剂可为抗体、适体或设计的锚蛋白重复蛋白质(DARPin)。优选地，亲和试剂是抗体。

“目的抗体”可为任意抗体。优选地，所述抗体是IgG抗体，更优选是单克隆抗体。目的抗体包括但不限于人源化抗体和啮齿类抗体。啮齿类抗体包括但不限于小鼠、兔和大鼠抗体。优选地，抗体是兔单克隆抗体。

“目的适体”是长15至60碱基的单链RNA或DNA寡核苷酸，其以高亲和力结合目的表位。

“设计的锚蛋白重复蛋白质”或称“DARPin”是包含至少一个锚蛋白重复的结合分子。锚蛋白重复是蛋白质中的一个基序，由2个通过环分隔的α螺旋组成，其可被选择用于特异性识别多种靶蛋白。锚蛋白重复的一般长度是33个氨基酸。不像抗体，锚蛋白重复不包含任何二硫键且在所有细胞区室中存在。

此外，本发明提供了如上所述的校准试剂在产生标准曲线中的用途。本发明提供了产生标准曲线的方法，其包括以下步骤：

a)在阵列上固定2个或多个浓度的上述校准试剂，

b)用可检测的目的亲和试剂孵育所述阵列，

c)对2个或多个浓度的校准试剂的每个浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，和

d)将信号强度和目的表位的量相关联。

标准或校准曲线是定量研究工具，将测定数据作图的方法，用于测定物质的浓度，即目的表位的浓度。

术语“结合的亲和试剂”指与包含目的表位的蛋白质或肽形成复合物的亲和试剂。通过多种手段例如色度、荧光或化学发光检测形成的复合物。

可通过与亲和试剂连接的可检测的标记物检测亲和试剂。优选地，所述标记物是荧光团，因此允许通过荧光强度测定结合的抗体量。其他合适的标记物是例如碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）。

也可通过第二检测试剂检测亲和试剂。第二检测试剂是选择性结合亲和试剂的标记分子。例如，通过使用标记的和识别亲和试剂的物种特异性表位的第二抗体或Fab片段检测微阵列上结合的亲和试剂。合适的标记物包括但不限于荧光团、生物素、辣根过氧化物酶和同位素。优选地，用荧光团标记第二检测试剂（例如第二抗体）。

优选地通过光学信号例如荧光信号检测与校准试剂结合的亲和试剂的量。

通过测量亲和试剂的可检测信号，并将每个信号与目的表位的浓度相对应，从而关联结合的目的亲和试剂的量和目的表位的量。这些结果展示在标准曲线中。可通过将各个目的表位浓度上的结合的目的亲和试剂的测定量（在Y轴上）对目的表位的浓度（在X轴上）作图绘制标准曲线。通常以检测信号的强度（信号强度）表示结合的亲和试剂的量。优选地所述信号是光学信号，更优选是荧光强度。一般，为了产生标准曲线的目的，在阵列上的点包含不同浓度的校准试剂，优选地为系列稀释（例如2倍稀释系列）。

通过测定肽:载体比（与一个蛋白质载体缀合的肽的数量）得到在已知浓度的校准试剂中的目的表位的浓度。

测定肽:载体比的方法是本领域技术人员熟知的。合适的方法是例如包含以下步骤的方法：

步骤1：通过例如吸光光度测量测定缀合的肽浓度，其中优选地用标签（例如Dabsyl）标记肽或与肽连接的接头；步骤2：通过Bradford试验测定缀合产物的总蛋白质浓度和步骤3：计算肽:蛋白质比。优选地，用允许测定肽:蛋白质载体比的标签例如Dabsyl标记接头。用于本发明的方法的合适的比例可达10和更高。优选地，所述比例低于3，更优选地，所述比例等于或低于1，最优选地所述比例在0.3和1之间。

目的亲和试剂在阵列上孵育至少30分钟，优选地超过1小时，更优选地孵育1至16小时，最优选地孵育约12小时（12小时±30分钟）。在测量信号强度前去除过量的亲和试剂并优选洗涤所述阵列。

阵列是具有疏水表面的固体支持物，允许蛋白质结合至表面。用于RPA和其他亲和测定的阵列是市售的并且是本领域技术人员熟知的。通过载体蛋白质与阵列表面的相互作用将校准试剂固定在阵列上。为了避免与疏水表面的非特异性结合，优选随后用非特异性蛋白质例如BSA包被点样的阵列。

在阵列上应用2个或多个浓度的校准试剂。优选应用的浓度形成稀释系列（例如1:2、1:5或1:10的稀释系列）。优选应用至少3个不同浓度的校准试剂。更优选，应用3至20个不同浓度的校准试剂，甚至更优选5至15个不同浓度。

可在阵列上的期望位置上以点的形式应用校准试剂。校准试剂一般溶解在缓冲液中。缓冲溶液是由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物组成的水溶液。合适的缓冲液是例如CSBL点样缓冲液（货号9020，Zeptosens,Witterswil,Switzerland）。在优选的实施方案中所述缓冲液包含基质蛋白质。优选的基质蛋白质是BSA，更优选基质蛋白质是乙酰化的BSA。一般在阵列与目的亲和试剂孵育以前，允许应用的校准试剂溶液干燥。

在阵列上的校准试剂点一般排列为域（fields）。阵列域可形成例如正方形、长方形、圆形和三角形的几何区域。在图1B和12中显示了阵列布局的实例。在2个域中的点可具有例如不同的稀释系列（不同浓度范围）。一般在与校准试剂不同的域中排列阳性和阴性对照。

使用标准曲线，可倒推计算以与校准试剂相同的方式进行的样品中目的蛋白质的浓度。

因此，本发明提供了定量生物学样品中包含目的表位的蛋白质的方法，其包括

a）在阵列上固定

i）2个或多个浓度的上述校准试剂，和

ii）1个或多个生物学样品，

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）对2个或多个浓度的校准试剂中的每种浓度和1个或多个生物学样品中的每一种测量结合的亲和试剂的信号强度，

d）关联信号强度和目的表位的量，和

e）定量1个或多个生物学样品中的包含目的表位的蛋白质。

生物学样品是生物学来源，是分子的复杂混合物。可例如由细胞裂解物、细胞提取物、体液（例如全血、血清、血浆、尿、组织液、滑液、眼泪、尿、唾液和淋巴）形成样品。样品可为分馏的（fractioned）或非分馏的。

和校准试剂一样，在阵列上的期望位置上以点的形式应用生物学样品。生物学样品可为用缓冲液稀释的或未稀释的。在优选的实施方案中，所述缓冲液包含基质蛋白质。优选的基质蛋白质是BSA，更优选基质蛋白质是乙酰化BSA。一般在孵育阵列和目的亲和试剂以前，允许应用的样品干燥。

在阵列上的生物学样品点和校准试剂一般排列为域。阵列域可形成例如正方形、长方形、圆形和三角形的几何区域。在图1B和12中显示了阵列布局的实例。优选，在校准试剂点以外的另一个域中排列生物学样品点。

优选，应用的校准试剂浓度形成稀释系列（例如1:2、1:5或1:10的稀释系列）。也优选应用至少3个不同浓度的校准试剂。更优选，应用3至20个不同浓度的校准试剂，甚至更优选5至15个不同浓度。本领域技术人员熟知如何在生物学样品中的目的肽的预期浓度附近和检测方法的工作范围内选择校准试剂的浓度范围。

目的亲和试剂在阵列上孵育至少30分钟，优选在阵列上孵育超过1小时，更优选1至16小时，最优选约12小时（12小时±30分钟）。在测量信号强度前去除过量的亲和试剂并优选洗涤所述阵列。

此外，本发明提供了上述标准曲线在通过测定目的亲和试剂的检测下限、灵敏度和动态范围从而表征亲和试剂中的用途。

术语“检测下限（LOD）”指使用亲和试剂可检测的目的表位的最低量。术语亲和试剂的“动态范围”指校准试剂的可测量的浓度范围。一般使用标准曲线测定动态范围，其中动态范围是与测量信号呈线性或基本线性相关的校准试剂浓度范围。术语“检测下限”和“动态范围”是本领域技术人员熟知的。

因此，本发明提供了测定目的亲和试剂的检测下限的方法，其包括

a）在阵列上固定2个或多个浓度的上述校准试剂，

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）对2个或多个浓度的校准试剂的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，

d）关联信号强度和目的表位的量，和

e）测定使用亲和试剂可检测的目的表位的最低量。

在优选的实施方案中，可通过倒推计算浓度测定可检测的目的表位的最低量，其对应于在空白时测量的信号加上空白的标准偏差的3倍。空白水平是不包含校准试剂、但在其他方面与包含校准试剂的样品相同的样品的检测信号。

如上所述应用校准试剂。优选，应用的2个或多个浓度形成稀释系列（例如1:2、1:5或1:10的稀释系列）。也优选应用至少3个不同浓度的校准试剂。更优选，应用3至20个不同浓度的校准试剂，甚至更优选5至15个不同浓度。

本发明提供了测定目的亲和试剂的灵敏度的方法，其包括

a）在阵列上固定2个或多个浓度的上述校准试剂，

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，其中所述目的亲和试剂，

d）关联信号强度和目的表位的量，由此产生标准曲线，

e）测定标准曲线的线性部分，和

f）测定标准曲线的线性部分的斜率。

本发明提供了测定目的亲和试剂的动态范围的方法，其包括

a)在阵列上固定2个或多个浓度的上述校准试剂，

b)孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，其中所述目的亲和试剂，

c)对2个或多个浓度的校准试剂的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，

d)关联信号强度和目的表位的量，由此产生标准曲线，

e)测定标准曲线的线性部分，和

f)测定标准曲线的线性部分的目的校准试剂的浓度范围。

此外，校准试剂可用于测定亲和试剂的特异性。本文中使用的术语“特异性”指亲和试剂对目的表位的选择性。低特异性的亲和试剂也结合目的表位之外的表位。

因此，本发明提供了测定亲和试剂的特异性的方法，其包括以下步骤：

a）在阵列上固定

i）上述包含目的表位的校准试剂和

ii）包含与蛋白质载体缀合的对照肽的至少一种样品，其中所述对照肽不包含目的表位，

b）孵育阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）测量在阵列上结合的亲和试剂的信号强度，和

d）比较与校准试剂的目的表位相关的信号强度和与对照肽相关的信号强度。

显著信号的检测表示目的抗体具有低特异性，因为其也识别目的表位以外的表位。本文使用的术语“显著信号”是显著高于背景信号的信号，其中背景信号是在没有样品时检测的信号（例如在点之间检测的信号）。显著高于表示与背景信号的差异是统计学相关的(p≤0.05,优选,p≤0.01)。

优选，在阵列上的每个点中应用的对照肽的浓度与表位肽的浓度接近(+/-5%)。校准试剂点和包含具有相似肽浓度的对照肽的样品点优选聚集在阵列上的域中，其中所述域可形成例如正方形、长方形、圆形和三角形的几何区域。在2个域中的样品的总蛋白质浓度可以不同（例如，在域1中为高表位浓度和在域2中为低表位浓度）。

对照表位不包含目的表位，但其包含与目的表位不同的表位。对照表位的此表位（对照表位）可例如为目的表位的修饰等价物（例如目的表位的非磷酸化等价物）。优选，在阵列上应用多于一种包含与蛋白质载体缀合的对照肽的样品。在这些样品中的对照肽可具有不同的浓度，或其可包含不同的表位。在一种样品中的对照表位可例如为目的表位的非磷酸化等价物，而在另一种样品中，对照表位具有与目的表位不同的氨基酸序列。

目的亲和试剂在阵列上孵育至少30分钟，优选至少1小时，更优选1至16小时，最优选约12小时（12小时±30分钟）。在测量信号强度前去除过量的混合物并优选洗涤所述阵列。

可选地，在步骤a）之前孵育可检测的目的亲和试剂和游离的目的表位肽，并在步骤b）中阵列与亲和试剂和游离肽的混合物进行。

因此，本发明也提供了测定亲和试剂的特异性的方法，其包括以下步骤：

a）孵育可检测的目的亲和试剂和游离的目的表位肽，

b）在阵列上固定

i）包含目的表位的上述校准试剂和

ii）包含与蛋白质载体缀合的对照肽的样品，其中所述对照肽不包含目的表位，

c）孵育阵列与步骤a）中的目的亲和试剂和游离表位肽的混合物，

d）测量在阵列上结合的亲和试剂的信号强度，和

e）比较与校准试剂的目的表位相关的信号强度和与对照肽相关的信号强度。

“游离的目的表位肽”是不与另一个分子连接的目的表位肽。特别是，游离肽不与蛋白质载体连接。

选择游离肽的浓度，使得目的亲和试剂被游离肽饱和。例如可通过以下方法测定此浓度：a）孵育可检测的目的亲和试剂和至少2种不同浓度的游离表位肽，b）在至少两个阵列上固定上述校准试剂，c）孵育阵列与步骤a）中的目的亲和试剂和游离表位肽的混合物，其中每个阵列与包含不同浓度的游离表位肽的混合物孵育，d）测量在阵列上结合的亲和试剂的信号强度，当亲和试剂被游离肽饱和时导致没有亲和试剂与阵列结合，这时测定游离肽的浓度。

游离肽优选与目的亲和试剂孵育至少30分钟，优选至少1小时，更优选1至16小时，最优选约12小时（12小时±30分钟）。

孵育目的亲和试剂和游离肽的混合物至少30分钟，优选在阵列上孵育至少1小时，更优选1至16小时，最优选约12小时（12小时±30分钟）。在测量信号强度以前去除过量的混合物并优选洗涤阵列。

现在已经大体描述了此发明，通过参考特定的实施例以及以下的图将更好的理解本发明，本文中包含的实施例仅是为了说明的目的而无意为限制性的，除非另外指定。

附图

图1A显示了标记的校准试剂的结构。（A）包含目的表位的肽，（B）亲水接头，（C）载体蛋白质，（D）用于校准试剂的浓度测定的标记物（例如Dabsyl）。肽与接头共价结合，接头与蛋白质载体共价结合。

图1B显示了示意的阵列布局。阵列被分为12个阵列域（方框中的数字1-12）和对照域（1-16）。每个阵列域包含完整的标准稀释系列（位置1-12）的12个样品位（3行x4位，每个为一式两份点=>24个点）。箭头指示递减浓度的方向。2个相邻的阵列域排列为镜像位置，以避免高标准浓度的点遇到低标准浓度的点。使用对照域共同排列（co-array）裂解物对照（16个样品位，每个为一式两份点）。

图2A和2B显示了人Erk1（图2A）和人Erk2（图2B）蛋白的肽序列。下划线标出在2个蛋白质中心的磷酸化位点附近选择的肽序列（对2种蛋白质是相同的）。用方框标出了对完整Erk1（BioSource抗体）选择的肽序列（包含表位的肽）。用箭头指示在Erk2蛋白质的对应序列中的不同氨基酸。图2C显示了在包含目的表位的肽中的优选的磷酸化氨基酸（A…(p)）的位置。图2D显示了标准曲线的示意图，其中指示了动态范围（dr）。C=校准试剂的浓度，S=信号强度。

图3显示了包含不同肽-蛋白质缀合比例并用针对表位的抗体标记的肽-BSA试剂的印迹的标准曲线的阵列的测定图部分。图3A：组蛋白H3-BSA，比例：0.7x(I),2.7x(II),13.4(III),抗体:1:5000Abcam ab1791。图3B:pRb-BSA,比例:0.25x(I),1x(II),10x(III),抗体:1:500CSTno 9308。图3C:pErk1/2-BSA,比例:0.7x(I),2.7x(II),13.4x(III),抗体:1:500CST no 9101。阵列布局(AL)：标准曲线被印迹为12条系列稀释曲线（2倍稀释），每个稀释物为一式两份的点。将不同肽-BSA试剂的起始浓度调整为统一的50nM的表位浓度（点1）。

图4显示了从印迹的组蛋白H3-BSA 2.7x试剂(组蛋白H3测定,1:5000)(图4A-C)和印迹的pErk-BSA 2.7x试剂(pErk1/2测定,1:500)(图4D-F)的标准曲线中分析的定量测定信号。实心圆代表以一式两份点的平均值测量的标准曲线信号，实线代表单位点结合模型的拟合曲线；方块指示对应的共同排列的裂解物对照的信号，裂解物的总蛋白质浓度：0.25mg/ml（neg=阴性和pos=阳性处理对照，数字指示裂解物的身份（见表1））。图4A和4D：线性-对数曲线；图4C和图4F：对数-对数曲线。图4B和图4E显示了具有特异性表位结合应答的测定图。标准曲线被印迹为12条系列稀释曲线（2倍稀释），每个稀释物为一式两份点。将不同肽-BSA试剂的起始浓度调整为统一的50nM的表位浓度（点1）。2种情况都显示了在一张图内的约4个数量级的浓度和信号范围的动态范围。

图5A显示了对标准曲线试剂的印迹溶液渐增加入基质蛋白(acBSA)的作用，显示了pErk1/2测定(1:500)的情况。（左侧a，b，c）印迹的pErk-BSA2.7x试剂；（右侧d，e，f）印迹的重组Erk1蛋白(Invitrogen)。（顶部a，d）在纯点样缓冲液中，（中间b，d）在添加50μg/ml acBSA的点样缓冲液中，和（底部）在添加100μg/ml acBSA的点样缓冲液中印迹的稀释系列。acBSA=乙酰化BSA。加入acBSA导致更均一的点形态。

图5B显示了加入印迹溶液中的基质蛋白的类型(acBSA对BSA)的影响，显示了组蛋白H3测定的情况。（左侧a，b）组蛋白-BSA 2.7x试剂的稀释系列；（右侧）重组组蛋白H 3蛋白(Roche)的稀释系列。没有检测到明显的信号差异，但acBSA的加入导致更均一的点形态。

图6显示了在抗体溶液中缺乏（正常测定：A）和存在（竞争测定：B至D）递增浓度（B:100nM,C:1000nM;D:10,000nM）的相应的游离表位肽时的组蛋白H3测定（ab1791抗体的1:10,000稀释）的阵列信号图。在最高浓度的游离肽(10000nM)下，正常测定中的标准物/裂解物对照的特异性抗体信号被竞争反应几乎完全/完全抑制。曝光时间：0.5秒和图像的显示范围（DR）：0…10000。

图7显示了来自组蛋白H3肽标准物组蛋白H3-BSA 2.7x（实心圆）和信号最显著的来自Upstate的组蛋白H3重组蛋白（实心三角）的12点稀释曲线的用于组蛋白H3测定(1:10000Abcam ab1791)的标准曲线。对肽标准曲线加入对照裂解物(250μg/ml)的信号用于比较（实心方块）；从信号倒推计算浓度。图显示了印迹的标准稀释物的平均信号（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应一式两份点的平均信号，误差条指示其标准偏差。LOD值是从拟合曲线倒推计算的浓度，为平均空白信号水平加3倍标准偏差（见右图中的点线：用于组蛋白H3肽标准物，用于来自Upstate的组蛋白H3重组蛋白）。图7A：测定1，线性-对数图，LOD(组蛋白H 3蛋白)=0.133nM,LOD(组蛋白H3-BSA 2.7x)=0.104nM.图7B:测定1,对数-对数图。图7C:测定2,线性-对数图,LOD(组蛋白H3蛋白)=0.178nM,LOD(组蛋白H3-BSA 2.7x)=0.141nM。图7D：测定2，对数-对数图。（相关系数r²>0.99）。

图8显示了来自pRb肽标准物（实心圆）和来自Active Motif的pRb重组蛋白（实心三角）的12点稀释曲线的用于pRb测定(1:250CST#9308)的标准曲线。对肽标准曲线加入对照裂解物(400μg/ml)信号用于比较（实心方块，pos=阳性，neg=阴性，数字指示裂解物的身份，见表1）；从信号倒推计算浓度。图显示了印迹的标准稀释物的平均信号（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应一式两份点的平均信号，误差条指示其标准偏差。LOD值是从拟合曲线倒推计算的浓度，为平均空白信号水平加3倍标准偏差（见右图中的点线：----用于Rb肽标准物，……用于来自Active Motif的Rb重组蛋白）。图8A：测定1的线性-对数图，LOD(pRb蛋白)=0.117nM,LOD(pRb-BSA 1x)=0.024nM。图8B:测定1,对数-对数图。图8C:测定2,线性-对数图,LOD(pRb蛋白)=0.077nM,LOD(pRb-BSA 1x)=0.026nM。图8D：测定2，对数-对数图。相关系数r²>0.99。

图9显示了来自pErk1/2肽标准物pErk1-BSA 2.7x（实心圆）和信号最显著的来自Invitrogen的pErk1重组蛋白（实心三角）的12点稀释曲线的用于pErk1/2测定(1:500CST#9101)的标准曲线。对肽标准曲线加入对照裂解物(400μg/ml)信号用于比较（实心方块，pos=阳性，neg=阴性，数字指示裂解物的身份，见表1）；从信号倒推计算浓度。图显示了印迹的标准稀释物的平均信号（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应一式两份点的平均信号，误差条指示其标准偏差。LOD值是从拟合曲线倒推计算的浓度，为平均空白信号水平加3倍标准偏差（见右图中的点线：----用于Erk1/2肽标准物，……用于来自Invitrogen的Erk1重组蛋白）。图9A：测定1（线性-对数图），LOD(pErk1蛋白)=0.058nM,LOD(pErk1-BSA2.7x)=0.028nM。图9B:测定1(对数-对数图)。图9C:测定2(线性-对数图),LOD(pErk1蛋白)=0.052nM,LOD(pErk1-BSA2.7x)=0.032nM。图9D：测定2（对数-对数图）。相关系数r²>0.99。

图10显示了来自Erk1/2肽标准物Erk1-BSA 2.7x（实心圆）和信号最显著的来自Invitrogen的Erk1重组蛋白（实心三角）的12点稀释曲线的用于Erk1/2测定(1:1000 Biosource 44-654G)的标准曲线。对肽标准曲线加入pErk对照裂解物(400μg/ml)的总Erk信号用于比较（实心方块，pos=阳性，neg=阴性，数字指示裂解物的身份，见表1）；从信号倒推计算浓度。图显示了印迹的标准稀释物的平均信号（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应一式两份点的平均信号，误差条指示其标准偏差。LOD值是从拟合曲线倒推计算的浓度，为平均空白信号水平加3倍标准偏差（见右图中的点线）。图10A：测定1的线性-对数图，LOD(Erk1蛋白)=0.059nM,LOD(Erk1-BSA2.7x)=0.045nM。图10B:测定1的对数-对数图。图10C:测定2的线性-对数图(底部):LOD(Erk1蛋白)=0.084nM,LOD(Erk1-BSA2.7x)=0.046nM。图10D：测定2，对数-对数图。相关系数r²>0.99。

图11显示了来自Erk1肽标准物Erk-BSA 2.7x（实心圆）和具有与来自Invitrogen的总Erk1蛋白具有相当的显著信号的来自Invitrogen的pErk1重组蛋白（实心菱形）的12点稀释曲线的用于Erk1/2测定(1:1000Biosource 44-654G)的标准曲线。对肽标准曲线加入pErk对照裂解物的总Erk信号用于比较（实心方块）；从信号倒推计算浓度。图显示了印迹的标准稀释物的平均信号（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应一式两份点的平均信号，误差条指示其标准偏差。LOD值是从拟合曲线倒推计算的浓度，为平均空白信号水平加3倍标准偏差（见右图中的点线）。图11A：测定1（线性-对数图），LOD(pErk1蛋白)=0.040nM,LOD(Erk1-BSA2.7x)=0.045nM。图11B：测定1（对数-对数图）。图11C：测定2（线性-对数图），LOD(pErk1蛋白)=0.047nM,LOD(Erk1-BSA2.7x)=0.046nM。图11D：测定2（对数-对数图）。相关系数r²>0.99。

图12显示了实施例5的掺加（spiking）实验的阵列布局。表7中提供了印迹的标准稀释系列的条件、应用的试剂和掺加的裂解物。

图13显示了组蛋白H3测定（ab1791抗体的1:10,000稀释）的阵列信号图。显示了两份重复测定1（A1）和测定2（A2）以及空白测定（B）。曝光时间：1秒，图的显示范围（DR）：300…15000。使用1:10,000稀释的组蛋白H3抗体(Abcam,ab1791)进行测定。

图14显示了用于组蛋白H3测定(1:10000Abcam ab1791)的标准曲线：在缓冲液中的组蛋白H3肽标准物（组蛋白H3-BSA 2.7x）的8点稀释曲线（实心圆）和掺加在对照组蛋白H3(-)裂解物6中的组蛋白H3肽标准物的7点稀释系列（实心三角）。用纯裂解物的组蛋白H3的内源浓度贡献的信号修正了显示的掺入曲线信号（在图中指示了起点（offset）（空白）信号值和倒推计算的内源蛋白质浓度）。图显示了测量的数据点（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应每个浓度上的N=5的重复点的平均信号，误差条指示其标准偏差。测定1（顶部）和测定2（底部）。线性-对数图（左侧）和对数-对数图（右侧）。相关系数是r²>0.99。

图15显示了pRb测定（CST#9308抗体的1:500稀释）的阵列信号图。显示了两份重复测定1（A1）和测定2（A2）以及空白测定（B）。曝光时间：16秒，图的显示范围（DR）：1500…30000。使用1:250稀释的pRb抗体(CST#9308)进行测定。

图16显示了pRb测定(1:250CST#9308)的标准曲线：在缓冲液中的pRb肽标准物（pRb-BSA 1x）的8点稀释曲线（实心圆）和掺加在pRB(-)裂解物12中的pRb肽标准物的7点稀释系列（实心三角）。用纯裂解物的内源pRb浓度贡献的信号修正了显示的掺入曲线信号（在图中指示了起点（空白）信号值和倒推计算的内源pRb浓度）。图显示了测量的数据点（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应每个浓度上的N=5的重复点的平均信号，误差条指示其标准偏差。测定1（顶部）和测定2（底部）。线性-对数图（左侧）和对数-对数图（右侧）。相关系数是r²>0.99。

图17显示了pErk1/2测定(CST#9101抗体的1:500稀释)的阵列信号图。显示了两份重复测定1（A1）和测定2（A2）以及空白测定（B）。曝光时间：2秒，图的显示范围（DR）：500…30000。使用1:500稀释的pErk1/2抗体(CST#9101)进行测定。

图18显示了pErk1/2测定(1:500CST#9101)的标准曲线：在缓冲液中的pErk1/2肽标准物（pErk1-BSA 2.7x）的8点稀释曲线（实心圆）和掺加在pErk(-)裂解物13中的pErk1/2肽标准物的7点稀释系列（实心三角）。用纯裂解物的内源pErk1/2浓度贡献的信号修正了显示的掺入曲线信号（在图中指示了起点（空白）信号值和倒推计算的内源pRb浓度）。图显示了测量的数据点（实心数据点）和单位点结合模型的拟合曲线（实线，Hill拟合）。数据点对应每个浓度上的N=10的重复点的平均信号，误差条指示其标准偏差。测定1（顶部）和测定2（底部）。线性-对数图（左侧）和对数-对数图（右侧）。

图19显示了Erk1/2测定(BioSource 44-654G抗体的1:1000稀释)的阵列图。显示了两份重复测定1（A1）和测定2（A2）以及空白测定（B）。曝光时间：2秒，图的显示范围（DR）：500…30000。

图20显示了Erk1/2测定(1:1000Biosource 44-654G)的标准曲线：在缓冲液中的pErk1/2肽标准物pErk1-BSA 2.7x的8点稀释曲线（实心圆）和掺加在pErk(-)裂解物13中的pErk1/2肽标准物的7点稀释系列（实心三角）。图显示了测量的数据点（实心点）和所有数据点的平均信号（实线）。如预期的，Erk1/2测定对于缓冲液中的pErk1/2肽标准物稀释产生了几乎0信号，和在掺加不同浓度的pErk1/2的所有裂解物点中产生了一致的显著信号。平均信号代表裂解物13的内源Erk1/2水平，不依赖于掺入浓度。关于pErk1/2测定定标信号轴（见图19）。数据点对应每个掺入浓度上的N=10的重复点的平均信号，误差条指示其标准偏差。测定1（左）：平均信号（标准曲线）=0.010±0.002RFI,平均信号(掺加曲线)=1.097±0.057RFI和测定2（右）：平均信号（标准曲线）=0.008±0.002RFI,平均信号(掺加曲线)=0.969±0.016RFI。

实施例：

除非另外指出，根据制造商的说明书使用在实施例中提及的市售试剂。

实施例1:材料和方法

裂解物样品

在修饰的Bradford试验(Coomassie Plus Protein Assay Reagent,no.23238,Pierce）中测定蛋白质浓度。在-70℃冰箱中储存裂解物样品，直至使用。

表1.对照裂解物样品。Rb=视网膜母细胞瘤抑制蛋白，Erk=细胞外信号调节激酶，p=磷酸化的氨基酸残基

为了在不同的工作组（working package）中印迹阵列，在CLB1（裂解缓冲液）(Zeptosens)中将裂解物样品调节至给定的蛋白质浓度，并在CSBL点样缓冲液(Zeptosens)中以1:10最终稀释。在各个区块中始终指示最终印迹的蛋白质浓度。

反相蛋白质微阵列的阵列印迹

在图1B中描绘了一般的阵列布局。每个阵列包含19x20(380)个点。使用320个点作为160个样品位，每个以一式两份点印迹。点直径为约150μm。点至点的距离在水平轴上为280μm和在垂直轴上为300μm。

将阵列分为12个阵列域。每个域包含12个样品位，每个位置印迹一式两份的点。12个样品位分别排列为3行，每行4个位置。以位置1（最高浓度=起始浓度）到位置12（最低浓度）的顺序印迹12点稀释系列（2倍稀释），见图1B。箭头指示递减浓度的方向。相邻阵列域排列为镜像位置。这样做以避免最高标准浓度点遇到最低标准浓度点。在对照域共同排列裂解物作为对照（16个位置，每个位置为一式两份点）。

用足够进行所有实验的数量以重复系列（每个芯片6个阵列）印迹用于不同工作组的阵列。通过液体操作机器人(Tecan Genesis RSP100)在384孔板上新鲜制备用于每个系列的印迹溶液。对每个标准曲线，制备起始浓度（例如50nM）的标准试剂的储液。在板的孔中制备系列稀释的不同样品（12x2倍稀释）。每孔体积为25μl。为了印迹对照裂解物，将样品调整为统一的起始浓度（例如1.5mg/ml）并在点样缓冲液CSBL中以1:10稀释（例如最终浓度=150μg/ml）。

使用商业的压电阵列点样仪(NanoPlotter NP2,GeS im GmbH,D-Groβerkmannsdorf)，将每个点以约400皮升体积的单个液滴排列。将由荧光标记的蛋白质组成的参考材料与稀释系列和裂解物样品一起共同排列在3个单独的界标（landing mark）行中（见图1B）。这些参考点（Ref）用于消除阵列发光可能出现的局部不均一，阵列至阵列和芯片至芯片的差异。在净室条件下产生阵列。

始终从冷冻的储液中新鲜制备稀释系列和裂解物对照样品。

点样后，用BSA封闭微阵列，用ddH₂0充分洗涤，在氮气流下干燥并在黑暗中和+4℃下储存，直至使用。为了测量，将射流结构（fluidicstructure）连接芯片以在各个测定条件下将分析物特异性的抗体溶液分别加入芯片的6个相同阵列中的每一个（每个阵列的小室体积为约15μL）。

抗体和测定试剂

表2列出了在此研究中使用的蛋白质和相应的抗体。

表2蛋白质分析物和抗体列表。

NMI-TT提供所有其他试剂，例如在反相蛋白质阵列（RPA）上进行测定所需要的标记的检测试剂、缓冲液。

使用抗物种Fab片段作为检测试剂，用于在微阵列上产生阵列信号。

●Alexa Fluor 647标记的抗兔IgG Fab片段分子(Z-25308,MolecularProbes)，用于检测与各个分析物结合的兔（rb）多克隆抗体

测定缓冲液（抗体）

用于RPA测量的测定缓冲液（测定缓冲液）是加入5%(w/v)BSA的50mM咪唑/HCl,150mM NaCl,0.1%Tween20,0.005%叠氮化钠,pH7.4。

印迹缓冲液（校准试剂）

印迹缓冲液是CSBL(Zeptosens-Bayer Schweiz AG的分部)。

使用以下试剂作为研究中的添加物：BSA(#T844.2,Roth)，乙酰化BSA(#05491,Fluka)。

反相蛋白质阵列——测定程序和数据分析

在直接的两步连续免疫测定中进行在阵列上的蛋白质分析物的检测。第一步包括将在测定缓冲液中的分析物特异性抗体加在微阵列上，并在25℃孵育过夜。在用测定缓冲液洗涤去除过量抗体后，在25℃和黑暗中孵育微阵列和荧光标记的抗物种Fab片段1小时。为了检测在此研究中应用的兔抗体，使用在测定缓冲液中稀释500倍的Fab片段。最后，洗涤阵列并在溶液（测定缓冲液）中用

成像仪(Zeptosens)成像。

进行另外的竞争实验以的检测溶液中和阵列点上抗体-抗原结合的特异性。为此，在阵列上孵育反应混合物以前，在测定缓冲溶液中混合游离的合成肽产物（各个应用的抗体的特异性结合表位序列）和第一抗体，并在室温孵育30分钟。在如上述正常测定的可比较条件下进行所有其他测定步骤。选择对于应用的抗体浓度摩尔过量的游离肽浓度（又见表2）。如果没有另外说明，一般选择1000nM,100nM和10nM的肽浓度用于竞争。

是用于微阵列的自动化高通量读出的实验室用（benchtop）溶液。简单地说，可在一个载体（MTP足迹形式）上安装多达36个微阵列（6个芯片）。整合存储器允许在单个运行中无人管理的读出多达360个微阵列（10个完全装载的载体）。可在532nm(绿色)和635nm(红色)处激发微阵列；使用通过547-597nm(绿色)和650-700nm(红色)的发射滤镜检测荧光发射。用于此研究，在红色检测通道以0.5-16秒范围的曝光时间对每个阵列拍摄一般为9个的一系列荧光图像，并使用ZeptoVIEW^TMPRO软件(Zeptosens)以16bit的tif格式存储以用于进一步分析。

微阵列分析

使用软件ZeptoVIEW^TM Pro 2.0(Zeptosens)分析微阵列图像。与微阵列对齐的阵列分析网格的点直径被设定为恒定的160μm。

如下进行每个测量的数据分析：

●选择曝光时间充足的一个分析物图像（所有点信号在图像饱和之下）。

●对每个单独的点计算背景修正的、经参考的平均信号强度（以RFI=参考荧光强度单位）。以局部样品和参考点信号的比例计算参考信号。

●对一个印迹条件的所有重复点（在大多数情况下为一式两份点），将每个一式两份点对的背景修正的、经参考的平均信号强度（RFI）取平均值。在图和表中的信号代表各平均信号，误差条对应标准偏差。指示了用于平均的应用的重复点（N）的数目。

此外，进行了无分析物特异性第一抗体的空白测定实验，作为第二检测试剂可能导致的非特异性结合的对照。所有空白图像的RFI信号很低，可忽略不计（对标准物以及裂解物样品），因此在数据分析过程中不予考虑。

使用Excel Add-in软件包XLfit v4.3.0(IDBS,Guildford UK)拟合稀释曲线的数据点（一式两份点的平均信号）。选择单位点结合位点模型用于拟合（拟合函数#251:y=D+((Vmax*(x^n))/((x^n)+(Km^n)))，其中D=信号起点，Vmax=饱和信号，Km=亲和常数，n=1个结合位点）。

检测极限（LOD）为从拟合回推计算的标准物浓度，为平均空白信号（4个最低的数据点）加3倍的标准偏差。

实施例2：校准试剂（肽-蛋白质缀合物）的产生

肽序列

选择了4种抗原进行研究。这些抗原是组蛋白H3、磷酸化Rb、磷酸化Erk1/2和Erk1。4种肽序列代表4种选择的抗原与相应的选择的抗体的线性结合表位。从抗体供应商处得到表位序列信息。抗原、表位氨基酸序列、长度、抗原的表位位置和相应的抗体信息总结于表3。

表3.抗原、表位肽序列和相应的抗体信息的列表

针对位于蛋白质中心的人Erk1(p44MAPK)和Erk2(p42MAPK)的磷酸化位点的抗体在氨基酸位置Thr202和Tyr204附近共有相同的表位氨基酸序列。本文中从BioSource选择的针对Erk1MAPK完整形式的抗体是针对位于蛋白质C-端的不同的线性序列区产生。此序列区也经常被其他供应商的抗体使用。2种蛋白质Erk1(SEQ.ID NO:5)和Erk2(SEQ.ID NO:6)的完整的肽序列显示在图2A和2B中。除了在3个位置上的氨基酸不同以外，在此研究中选择的用于Erk1蛋白的表位序列（位置317-339）与对应的C-端Erk2序列同源。

肽合成

对4种选择的抗原的每一种，在NMI-TT合成2种肽。这2种肽包含（i）在免疫测定中用作竞争试剂的游离肽形式，和（ii）用于和BSA蛋白缀合在RPA芯片上用作标准试剂分子的功能形式。使用加帽循环合成功能肽，其具有用于共价连接血清白蛋白的N-端Cys间隔区功能。选择Doa-Doa(Doa=8-氨基-3,6-二氧辛酸（8-Amino-3,6-Dioxaoctanoic acid）)作为C18长度等价物（PEG样）亲水间隔区。在合成中使用加帽循环以获得良好的特异性和用于蛋白质缀合的正确的靶序列的最终富集。在合成后，通过HPLC控制肽的质量以得到良好的纯度，通过质谱（MS）控制肽的质量以得到正确的分子量。具有相应的质量信息的合成的肽产物的序列信息和获得的纯度总结于表4。

表4.在NMI-Technologietransfer GmbH(Reutlingen,Germany)合成的8种肽产物的列表。对每种抗原，合成了游离形式的肽作为竞争试剂，和功能形式的肽用于共价缀合至BSA蛋白（标准试剂）。合成具有附加的N端间隔区Dabs-Cys(C)-Doa-Doa的肽的功能形式。Dabs=Dabsyl（吸光度标签）。Doa=8-氨基-3,6-二氧辛酸（亲水间隔区）。使用Cys（C）作为通过硫醇化学反应将肽共价连接至BSA的功能团。合成N-端游离(H2N)或乙酰化形式（Ac），和C-端游离(COOH)或酰胺形式(CONH2)的肽。用粗体字母标出磷酸化氨基酸。（funct.=功能化的，phospho,p=磷酸化的）

如指示的，所有肽达到>95%的高纯度（其中大多数>99%）和正确的分子量。在这些肽的合成期间没有遇到大的困难。

肽-蛋白质的缀合

以各个肽-蛋白质缀合物的形式产生最终的标准试剂。为此，以相对预活化的（马来酰亚胺活化的）牛血清白蛋白（BSA）的3种不同比例（在表5中指示了比例）的摩尔过量通过共价连接至其游离的N-端Cys基团缀合肽的各功能形式，每个连接反应使用2mg蛋白质。早先在Poetz el al.,Proteomics 5,2402-2411(2005)中描述了肽连接。简单地说，在100%DMSO中将固体肽溶解为浓缩的储液，并之后在最多包含20%DMSO的PBS pH7.4缓冲液中稀释为工作浓度。混合肽和活化的BSA溶液并在室温下于黑暗中孵育2小时。通过离心柱（大小排阻）去除未缀合的肽，并在PBS pH7.4中收集缀合蛋白质级分。随后，通过分光光度计在466nm处（最大Dabsyl光谱吸光度，消光系数33,000M^-1cm^-1，每个肽一个标签）的吸光度测量测定肽-蛋白质级分的（连接的）肽浓度。肽-蛋白质级分的吸光度颜色肉眼明显可见。

根据Bradford测定缀合物级分的蛋白质浓度。总蛋白质浓度为约1.5mg/ml。测量的肽浓度、总蛋白质浓度和最终计算的形成产物的肽:蛋白质（染料：蛋白质）比例总结于表5。

表5.以肽-蛋白质缀合物的形式产生的12种标准试剂。对每种抗原制备了3种包含不同肽:蛋白质摩尔比例的肽-蛋白质缀合物变体。通过整合了肽的Dabsyl标签的吸光光度计测量测定缀合的肽浓度，使用活化的未标记的蛋白质（BSA）作为对照。通过Bradford实验测定缀合产物的总蛋白质浓度。以摩尔染料：蛋白质的比例计算肽:蛋白质比例，对加入的缀合的肽的质量进行修正。

通过SDS-PAGE(4-12%凝胶)进行肽缀合物的质量控制，使用纯的预活化的BSA作为参考。用Coomassie染色凝胶60分钟。凝胶图像显示了如预期的纯产物条带，具有对应不同的计算的肽:蛋白质连接比例的质量迁移。根据我们以前在其他肽上的经验，一般最终测定的连接比例达到最初制备的肽:蛋白质摩尔过量比例的17-40%。此变化可能是由于在应用的高起始浓度上的不同的溶解度和/或例如在水性连接缓冲液中的肽的不同的肽构象结构。

根据PAGE，所有4种肽-蛋白质缀合物标准试剂是纯的。

最后，冻干所有肽试剂：每种游离肽最少5mg（4种竞争试剂），和每种肽-蛋白质缀合物最少1mg（4种标准试剂，在选择的肽:蛋白质比例下）。

重组蛋白质和SDS-PAGE对照（组蛋白，Erk）

将8种来自不同供应商的重组蛋白质相互选为肽标准物的全蛋白质替代物（表6）。通过SDS-PAGE控制7种蛋白质（2x组蛋白H 3,5x Erk）的质量，使用BSA作为参考蛋白质。

表6.重组蛋白质列表

从凝胶电泳后的单个条带明显而见蛋白质的纯度很好。然而，当与作为参考加载的相同量的BSA相比时，单个条带的信号强度显示了很大差异，指示蛋白质的不同浓度。显然，在供应商的数据表中提供的浓度值是不可信的。因此，分析了蛋白质条带的整体信号强度以最佳地估计相对同时加载的BSA的正确浓度。因此，在以下印迹的所有标准稀释系列的样品制备中考虑了得到的修正因子（见表6）。

测定和印迹条件的优化——第一个标准曲线

在首批实验中，在不同阵列组上进行了测定，使用不同组成和条件的不同肽-BSA试剂的标准曲线印迹所述阵列，以检查其对随后检测的免疫测定性能的影响。检查了以下条件：

●具有不同肽:蛋白质缀合比例的肽-BSA试剂的标准曲线（检验了组蛋白H3-BSA,pRb-BSA和pErk-BSA）

●在缺乏和存在另外的蛋白质基质添加（BSA）下印迹的肽-BSA试剂的标准曲线

以12个系列稀释曲线（2倍稀释），每个稀释度上为一式两份点印迹标准曲线（如实施例1:材料和方法中描述）。用于印迹的不同试剂的起始浓度被调整为统一的50nM的表位浓度。此外，在相同的阵列上共同印迹阳性和阴性对照裂解物。以0.25mg/ml的总蛋白质浓度排列裂解物样品。在指示的抗体浓度下进行免疫测定。定性评估在阵列性能上观察到的差异，并基于这些结果和以前使用这类试剂的经验选择最佳印迹和测定条件。

包含不同肽:蛋白质缀合比例的肽试剂的标准曲线

大体上，印迹的不同肽:蛋白质比例的肽标准试剂的标准曲线在测定中提供了几乎相当的信号。测定图显示在图3中。然而，最低肽-蛋白质缀合比例（远低于1）的肽标准试剂倾向于显示更多的圆环样的点的形态，而最高缀合比例的试剂倾向于提供较低的测定信号应答（特别见pErk1/2测定）。后一种倾向可被解释为测定抗体对每分子BSA包含超过1个表位序列（在这里最高比例一般是3-6）的固定肽-BSA分子的较低的（低于线性）结合可达性。我们因此选择了中等缀合比例的试剂用于进一步的实验：组蛋白H3-BSA 2.7x(0.41肽:蛋白质),pRb-BSA 1x(0.41肽:蛋白质)和pErk-BSA 2.7x(0.89肽:蛋白质)。

信号和浓度的动态范围

在印迹的标准曲线上的测定展示了非常显著的信号和可从一张图的同一测量中提取的信号的高动态范围。图4显示了分析的代表组蛋白H3-BSA2.7x和pErk-BSA 2.7x的情况的定量信号。信号完全符合单位点结合模型的低端曲线(r²>0.99)，具有良好的线性度。信号的动态范围在一张图中（一个曝光时间）在4个数量级的浓度上覆盖了4个数量级。甚至可进一步将测定的动态范围扩充1-2个数量级（根据我们的经验），因为阅读器允许在不同的曝光时间上的图像记录和另外使用不同的灰度滤镜。

这些初始标准曲线的初始浓度被选为50nM。在与共同印迹的对照裂解物样品的信号比较中，发现标准曲线的测定信号和因此标准物的最高起始浓度远高于各个对照裂解物的固有值（水平），特别是磷酸化的蛋白质分析物。因此必须分别调整标准曲线的起始浓度。此外，阴性和阳性对照裂解物各自的表达水平的信号差异非常低，特别是磷酸化的分析物pErk和pRb（明显地，制备的细胞系的阳性处理是不是最优的）。因此制备和提供了新的对照裂解物（见表1）。

在缺乏/存在基质蛋白添加下的肽-BSA试剂的标准曲线

在另一组阵列中，在3种不同的缓冲液条件下印迹肽标准试剂和最初重组的蛋白质的标准曲线：（i）在缺乏任何另外的蛋白质添加，和存在（ii）50μg/ml和（iii）100μg/ml基质蛋白（乙酰化BSA=acBSA）时，如在图5A中所示。这样做是为了检测基质蛋白的添加对点形态的影响。在随后进行的测定中产生的标准曲线信号显示，与不添加基质蛋白相比，基质蛋白的添加一般导致更好的和更均一的信号分布（如从其他应用中预期的）。此效果在肽试剂以及重组蛋白质的标准点中观察到。同时，平均点信号几乎保持不变，指示蛋白质添加主要导致在点中的恒定数目的标准物分子的改组。添加的基质蛋白一般产生较大的点直径，比裂解物样品的点直径相比更好。这也使标准物和裂解物样品点的随后的数据分析更一致。对肽试剂而言，加入更高浓度的acBSA基质蛋白(100μg/ml)导致圆环形的信号点形态。进行了另一个实验以检测基质蛋白类型的影响：在标准曲线中直接比较了未修饰的和乙酰化形式的BSA的加入。结果描述在图5B中（显示了组蛋白H3）并显示acBSA具有较强的产生均一的点信号的能力，特别是对重组蛋白质的标准点。点的平均信号是相当的。从我们迄今的实验结论中，我们选择了印迹肽标准试剂以及重组蛋白质的标准曲线的最佳一致条件（CSBL缓冲液加50μg/ml acBSA）。

用于此研究的最佳选择的印迹和测定条件总结：

选择的用于所有标准曲线的一致印迹条件：

点样缓冲液CSBL加50μg/ml乙酰化BSA（acBSA）

选择用于稀释系列（肽标准物）的起始浓度：

10nM组蛋白H3

1nM pRb

2.5nM pERk1/2

5nM ERk1/2

选择的测定条件（抗体稀释）：

1:10000用于组蛋白H3测定

1:250用于pRb测定

1:500用于pErk1/2测定

1:1000用于Erk1/2测定(3种抗体)

印迹的参考点的信号一般调整为4秒图像曝光时间下的15000灰度水平。

实施例3：从与溶液中的游离肽的竞争实验推断的校准试剂的特异性

使用4种肽标准试剂(组蛋白-BSA 2.7x,pRb-BSA 1x,pErk-BSA 2.7x和Erk1-BSA 2.7x)以及所有可获得的用于比较的重组蛋白质的标准曲线印迹阵列（具有12点稀释曲线的12个标准曲线）。以400μg/ml和250μg/ml的总蛋白质浓度共同印迹对照裂解物样品对照（阴性和阳性对照，新递送样品）。在点样缓冲液CSBL中制备标准物和对照裂解物，标准物中加入50μg/ml acBSA。将标准曲线样品的起始浓度调整为达到阳性对照裂解物的最低测定信号。阵列布局和条件总结在表7中。

表7.用于竞争实验的阵列布局：印迹的标准曲线、应用的试剂和裂解物对照的条件。在第一列中的数字指在图1B中显示的阵列域或在对照域中的位置。

在缺乏（普通测定）和存在递增浓度的相应的游离肽（在阵列上孵育前将其与各个抗体溶液预混合）（竞争测定）的情况下在阵列上进行针对4种蛋白质分析物的每一种的测定。一般检测3种不同浓度的游离肽（1000nM,100nM和10nM，如果没有另外指出）与相应抗体复合、以抑制在阵列点上的特异性抗体-蛋白质分析物复合物形成的效率。此外，使用与相应的重组蛋白质预孵育的抗体溶液进行竞争测定，以比较其和游离肽试剂的竞争效率和特异性。进行空白测定（缺乏第一抗体）作为另外的对照，但其信号很低，可忽略不计，并因此在定量数据分析中不予考虑。

表8-11总结了根据最大标准曲线信号的定量结果。

Erk1/2测定的结果良好证明了不仅来自Biosource的Erk1/2抗体，而且2种另外选择的CST抗体（#4695兔单克隆和#9102兔多克隆）仅特异性识别Erk1-BSA标准物点（和具有相当的信号强度），而不识别pErk-BSA标准物点。这暗示在此项目中使用的来自3个不同供应商的所有3种抗体明显是针对在蛋白质C-端的非常相似的肽基序产生。这通过另外的早先的竞争实验（添加实验）进一步证实，这是使用来自CST的Erk1/2抗体(#9102)，在存在代表Erk1/2磷酸化位点（如在此项目中使用的）氨基酸序列但未磷酸化（去磷酸化肽，从NMI获得）的游离表位肽的情况下进行的。在其他方面与以前显示的条件相当的条件下进行的竞争测定中，此去磷酸化肽不能抑制在相应的Erk1/2普通测定中观察到的标准物和裂解物点的特异性信号（数据未显示）。因此表明，购自CST的Erk抗体使用不同的蛋白质表位序列，以区分Erk1/2蛋白的完整和磷酸化形式。

表8.组蛋白H3测定（1:10,000）的所有阵列域的标准曲线信号的信号值（最大）表。下划线为特异性标准曲线的信号。

表9.pRb测定（1:250）的所有阵列域的标准曲线信号的信号值（最大）表。用粗体指示特异性标准曲线的最大信号。

表10.pErk1/2测定（1:500）的所有阵列域的标准曲线信号的信号值（最大）表。用粗体指示特异性标准曲线的最大信号。

表11.用3种不同抗体以1:1000稀释进行的Erk1/2测定的所有阵列域的标准曲线信号的信号值（最大）表：（顶部）Biosource 44-654G,(中间)CST#4695兔单克隆,和(底部)CST#9102兔多克隆抗体。用粗体指示特异性标准曲线的最大信号。

实施例4：校准试剂的灵敏度——检测极限（LOD）

所有测定在与如图1B和表7所示的相同布局的阵列上进行。阵列包含所有4种肽标准试剂(组蛋白H3-BSA 2.7x,pRb-BSA 1x,pErk-BSA 2.7x和Erk1-BSA 2.7x)以及所有可获得的用于比较的重组蛋白质的标准曲线（具有12点稀释曲线的12个标准曲线）。肽标准曲线的最高浓度被调整为10nM用于组蛋白H3标准物,1nM用于pRb标准物,2.5nM用于pErk标准物和5nM用于Erk标准物。根据阳性对照裂解物产生的最高内源信号选择这些起始浓度。相应地制备蛋白质标准物的浓度并使用SDS-PAGE修正因子调整。以400μg/ml（对可得到≥4mg/ml蛋白质浓度的储液）和250μg/ml的总蛋白质浓度共同印迹对照裂解物样品（阴性和阳性对照，包括新的递送物）。在点样缓冲液CSBL中制备标准物和对照裂解物，标准物添加50μg/ml acBSA。

在缺乏（普通测定）和存在对完全竞争有效的最高浓度的游离肽（竞争测定）的情况下对4种蛋白质分析物的每一种进行测定。在一式两份测定中测量每种条件（普通测定，竞争测定）（每种条件2个阵列）。另外测量空白测定（缺乏第一抗体）作为对照。定量分析所有阵列图。对每个测定，通过用单位点结合模型拟合从印迹的12点稀释系列中的每一个提取的数据点产生每个阵列的12个阵列域中的每一个的标准信号曲线。从拟合曲线中测定检测极限（LOD），其为对应空白水平（4个最低数据点）的平均信号加3倍的相应标准偏差的倒推计算的浓度。

在图7至11中显示了一式两份测定的普通和竞争测定产生的标准曲线（数据点和拟合曲线，以及倒推计算的LOD值）。在图中提供了每条标准曲线的LOD。得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r²>0.99。

Abcam抗体特异性结合组蛋白H 3-BSA肽标准物，且Abcam抗体也特异性结合组蛋白H3重组蛋白，与来自Upstate的人蛋白质结合最显著。肽标准物和重组蛋白（Upstate）的标准曲线的信号强度差别很小（wellcomparable）。2个测定的再现性很好。信号CV一般对肽标准物为约12%，对组蛋白H3蛋白（Upstate）为约13%。平均LOD对肽标准物为0.123±0.019nM，对重组蛋白（Upstate）为0.156±0.023nM。LOD值在一式两份测定中可良好再现，并在肽标准物和蛋白质中相当（图7）。

CST抗体特异性结合pRb-BSA肽标准物，且CST抗体也特异性结合来自Active Motif的pRb重组蛋白。然而蛋白质标准曲线的信号强度明显较低，仅达到肽标准曲线的约10%。我们推测蛋白质没有磷酸化或仅部分磷酸化（注意：pRb和Rb注释在公共数据库中明显平行用于相同的蛋白质，我们不清楚这里使用的pRb是否指示磷酸化的蛋白质）。2个测定的再现性很好。信号CV一般对肽标准物为约7%，对pRb蛋白略高，为约12%。LOD值在一式两份测定中良好再现。平均LOD对肽标准物为0.025±0.001nM，对重组蛋白为0.097±0.020nM（图8）。

CST抗体仅特异性结合pErk1/2-BSA肽标准物，不结合Erk1-BSA标准物。CST抗体也显著地特异性结合pErk1重组蛋白(Invitrogen)并达到相应的pErk1/2-BSA肽标准物信号的约25%的信号强度。CST抗体也以低水平结合来自Active Motif的pErk（约12%）≥来自CST的Erk1（约11%）>来自Invitrogen的Erk1蛋白（约3%）。相对pErk1蛋白(Invitrogen)的信号以%提供信号。2个测定的再现性很好。信号CV一般对肽标准物为约2%，对pErk1蛋白(Invitrogen)略高，为约6%。LOD值在一式两份测定中可良好再现。平均LOD对肽标准物为0.030±0.002nM，对pErk1蛋白(Invitrogen)为0.055±0.003nM（图9）。

得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r²>0.99。

Biosource抗体仅特异性结合Erk 1-BSA肽标准物，不结合pErk1-BSA标准物。Biosource抗体特异性结合Erk1和pErk1重组蛋白（在可得到的不同蛋白质中最显著），并在这些蛋白质和Erk1-BSA肽标准物中产生差别很小的信号强度。Biosource抗体也以较低水平结合Erk2蛋白(Biosource)>pErk(Active Motif)>Erk1(CST)。2个测定的再现性很好。信号CV一般对肽标准物为约3%，对Erk1蛋白略高，为约8%，对pErk1蛋白为约5%。LOD值在一式两份测定中可良好再现。平均LOD对肽标准物为0.046±0.001nM，对重组Erk1蛋白(Invitrogen)为0.072±0.013nM，对重组pErk1蛋白(Invitrogen)为0.044±0.004nM（图10和11）。

得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r²>0.99。

实施例5：掺加至裂解物的标准曲线（5和10个重复点）

绝对蛋白质分析物浓度的测定

在下图12中显示的布局的阵列上进行测定。阵列包含3种肽标准试剂组蛋白H3-BSA 2.7x,pRb-BSA 1x和pErk-BSA 2.7x的稀释系列。以2倍稀释的8点系列印迹稀释系列。对每种肽试剂印迹2类稀释系列：在与实施例4类似的点样缓冲液（CSBL加50μg/ml acBSA）中印迹一个系列，应用在实施例4中使用的相同的起始浓度。以掺加至裂解物的7点稀释系列印迹另一个系列，所述裂解物对各个蛋白质呈阴性。在掺加稀释系列中应用的裂解物的总蛋白质浓度维持为恒定的150μg/ml。将掺加至裂解物的最高起始浓度选择为在缓冲液中的各个系列的起始浓度的一半。每个掺入系列的最后一个样品印迹纯的阴性裂解物（缺乏任何掺加浓度）用作空白对照。

表11:表1提供了印迹的标准物稀释系列的条件，应用的试剂和掺加的裂解物。阵列布局显示在图12中。

对4种蛋白质分析物中的每一种进行一式两份测定（在2个阵列上）。另外测量空白测定（无第一抗体）作为对照。定量分析所有阵列图。对每个测定，通过用单位点结合模型拟合从印迹的8点稀释系列中的每一个提取的数据点产生每个阵列的6个阵列域中的每一个的标准信号曲线。用在每个系列中可得到的最大数目重复点（N=5或N=10）平均数据点。为了比较，也计算一式两份点的平均信号（每个域的中间行）。如上述从拟合曲线中确定检测极限（LOD）。此外，用内源（空白）信号修正掺入系列的信号，并将修正的信号展示在缓冲液中的标准曲线中。

结果显示在图12至20。

组蛋白H3肽：测定显示了对组蛋白H3肽标准物的稀释曲线的特异性信号应答。空白测定显示0应答。掺加组蛋白H3的裂解物的信号和在缓冲液中的标准曲线的信号相当，但起点强度略低（在扣除了纯裂解物的内源组蛋白H3信号水平后）。2个测定的再现性很好。通过从标准曲线拟合中的裂解物的空白信号的倒推计算测定组蛋白H 3蛋白在纯裂解物中的内源浓度。平均浓度为0.063±0.005nM。其他裂解物点显示了略低的信号（图13和14）。得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r2>0.99。

pRB测定：测定显示了对pRb肽标准物的稀释曲线的特异性信号应答。空白测定显示0应答。掺加pRb的裂解物的信号和在缓冲液中的标准曲线的信号相当，但起点强度略低（在扣除了纯裂解物的内源pRb信号水平后）。2个测定的再现性很好。通过从标准曲线拟合中的裂解物的空白信号的倒推计算测定pRb蛋白在纯裂解物中的内源浓度。内源蛋白质的平均浓度为0.066±0.010nM。包含裂解物6（呈组蛋白H3阴性）和裂解物13（呈pErk1/2阴性）的其他点显示了不同强度的恒定信号，这显然代表了在这些裂解物中的pRb蛋白的内源水平。得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r²>0.99（图15和16）。

pERK1/2测定(CST#9101)：测定显示了对pErk1/2肽标准物的稀释曲线的特异性信号应答。空白测定显示0应答。掺加pErk1/2的裂解物的信号和在缓冲液中的标准曲线的信号相当，但起点强度略高（在扣除了纯裂解物的内源pErk信号水平后）。2个测定的再现性很好。通过从标准曲线拟合中的裂解物的空白信号的倒推计算测定pErk1/2蛋白在纯裂解物中的内源浓度。内源蛋白质的平均浓度为0.149±0.005nM。包含裂解物6（呈组蛋白H3阴性）和裂解物12（呈pRb阴性）的其他点显示了不同强度的恒定信号，这显然代表了在这些裂解物中的pErk1/2蛋白的内源水平。得到质量良好的拟合曲线，其相关系数r²>0.99（图17和18）。

pERK1/2测定(BioSource 44-654G)：如预期的，测定对所有应用的肽标准物的稀释曲线显示无信号应答。空白测定显示0应答。所有包含裂解物的点显示了不同强度的恒定信号，这显然代表了在这些裂解物中的Erk1/2蛋白的内源水平。

增加数目的重复点的影响的一般评论：

对所有4个测定，比较了分析数据以研究重复点的数目对变化系数（CV）的影响。从所有可用数目的重复点信号（每种条件N=5或N=10）和从N=2的重复点信号（选自每个阵列域的中间行）中形成所有分析物特异性信号的平均信号。在几乎所有情况下，一式两份点分析的CV与N=5或N=10的重复点分析相当或略小（注意这是在所有实验中一致的低水平的CV上观察到的）。

实施例6：一般评论

肽标准试剂的优势：

可以可再现的方式良好地制备分子组成（肽与蛋白质的比例）——通过在每个肽序列中引入吸光度小标签(Dabsyl)可良好测定每个分子的表位序列的浓度/数目。在RPA测定中没有观察到标签的不良作用。

合成的肽标准物的磷酸化程度是非常确定的且为100%。

相反地，市售的重组蛋白质制品的磷酸化程度可能是变化很大的且不易测定（见我们用不同供应商的若干候选蛋白质的结果，以Erk/pErk为例）。

肽-蛋白质缀合物使用BSA作为统一的载体蛋白（BSA是用于蛋白质阵列应用中经良好表征的分子）。我们预期不同表位肽标准物的信号应答受（相同的）载体蛋白性能的影响不大。

相反地，我们在不同供应商的重组蛋白质（例如Erk的情况）的测定信号应答中测量到显著差异，这可能也是由于不同的蛋白质制剂和特征（不同的表达***，±GST标签,±Hi s标签等等）。

竞争

——所有4种游离形式的合成肽实现了肽标准物信号的完全抑制。磷酸化肽倾向于在较低的浓度上达到完全竞争，这可能指示应用的抗体对磷酸化表位的更高的亲和力。我们没有观察到竞争肽对测定应答或阵列质量有明显影响或副作用。

——相反地，使用重组蛋白质作为竞争物在阵列上产生了另外的信号背景（部分由于比特异性点信号更高的因素，例如在组蛋白H3蛋白的情况下），这使阵列分析很困难或甚至无法分析。虽然如此，重组蛋白质似乎也抑制原始标准曲线的信号。然而，重组蛋白质不能抑制对照裂解物的信号，甚至在裂解物点上产生另外的信号，这可能是由于与裂解物中的其他蛋白质的非特异性结合。这暗示肽作为竞争试剂具有明显优势。

——在裂解物点上，使用肽的竞争可导致裂解物信号的完全抑制（例如对组蛋白H3裂解物），但也导致部分（不完全）抑制，甚至在应用的最高竞争物浓度上留下基础信号（例如对pRb,pErk裂解物），这可能是由于应用的抗体导致的某些非特异性结合。因此平行使用竞争和普通测定可能被提议用作所有未来的目的分析物测量的普遍想法。

标准曲线和测定的质量

——从RPA上印迹的稀释系列产生的标准曲线一般质量很高，其显示了重复点信号的低CV和对数据点的良好拟合，在所有情况下具有r²>0.99的相关系数。肽试剂的标准曲线比重组蛋白的标准曲线显示了更好的拟合相关性的倾向（更小的r²值）。

——一式两份点（N=2）和增加数目的重复点（N=5,N=10）的信号CV相当，指示来自印迹的一式两份点的标准曲线已经提供了最佳结果。

——如在平均标准物信号（阵列至阵列）的低CV中显示的，一式两份测定的再现性也非常好，CV为几至10个百分比的范围内。肽试剂的标准曲线比重组蛋白（平均CV=9%）显示了较低的CV倾向（平均CV=6%）。

——2种全蛋白质分析物（组蛋白H3和Erk1）的标准曲线的信号强度匹配得非常好。2种磷酸化蛋白质分析物（pRb和pErk）的标准曲线显示了对重组蛋白质的较低的信号，这可能是由于较低和较不确定的磷酸化程度。

图描述了一式两份测定的阵列图和在缓冲液中的肽标准曲线图，在修正了纯裂解物的内源蛋白质浓度后，掺加至各个裂解物的肽标准物的曲线图，在缓冲液中和掺加至裂解物的肽标准物的组合曲线的图。

Claims

1.校准试剂，其包含通过接头与蛋白质载体连接的肽，其中所述肽包含目的表位。

2.根据权利要求1的校准试剂，其中所述目的表位包含至少一个磷酸化氨基酸。

3.根据权利要求1或2的校准试剂，其中所述肽的长度为12至25个氨基酸。

4.根据权利要求1至3中任一项的校准试剂，其中所述蛋白质载体是牛血清白蛋白（BSA）。

5.根据权利要求1至4中任一项的校准试剂，其中所述接头包含半胱氨酸和8-氨基-3,6-二氧辛酸（8-amino-3,6-Dioxaoctanoic acid）。

6.权利要求1至5中任一项的校准试剂，其中所述肽:蛋白质载体比例在0.3和1之间。

7.产生标准曲线的方法，其包括以下步骤：

a）在阵列上固定2个或多个浓度的根据权利要求1至6中任一项的校准试剂，

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）对2个或多个浓度的所述校准试剂的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，和

d）关联信号强度和目的表位的量。

8.定量样品中包含目的表位的蛋白质的浓度的方法，其包括

a）在阵列上固定

i）2个或多个浓度的根据权利要求1至6中任一项的校准试剂，和

ii）1个或多个生物学样品，

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）对2个或多个浓度的所述校准试剂中的每种浓度和1个或多个生物学样品中的每一种测量结合的亲和试剂的信号强度，

d）关联信号强度和目的表位的量，和

e）定量1个或多个生物学样品中的包含目的表位的蛋白质。

9.测定目的亲和试剂的检测下限的方法，其包括

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）对2个或多个浓度的所述校准试剂中的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，

d）关联信号强度和目的表位的量，和

e）测定使用所述亲和试剂可检测的目的表位的最低量。

10.测定目的亲和试剂的灵敏度的方法，其包括

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

d）关联信号强度和目的表位的量，由此产生标准曲线，

e）测定标准曲线的线性部分，和

f）测定标准曲线的线性部分的斜率。

11.测定目的亲和试剂的动态范围的方法，其包括

b）孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂，

d）关联信号强度和目的表位的量，由此产生标准曲线，

e）测定标准曲线的线性部分，和

f）测定标准曲线的线性部分的目的校准试剂的浓度范围。

12.测定目的亲和试剂的特异性的方法，其包括以下步骤：

a）在阵列上固定

i）根据权利要求1至6中任一项的校准试剂和

b）孵育阵列和可检测的目的亲和试剂，

c）测量在阵列上结合的亲和试剂的信号强度，和

13.根据权利要求12的方法，其中所述可检测的目的亲和试剂在步骤a）前与游离的目的表位肽孵育，且其中在步骤b）中将阵列与亲和试剂和游离肽的混合物孵育。

14.根据权利要求7至13中任一项的方法，其中在基质蛋白存在下固定所述校准试剂。

15.根据权利要求1至6中任一项的校准试剂在产生标准曲线中的用途。

16.基本如本文前述的蛋白质、肽、方法和用途，特别是参考前述实施例。