CN102634043B - 一种超分子水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种超分子水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种超分子水凝胶及其制备方法和应用，该超分子水凝胶的制备包括以下步骤：先合成聚乙二醇修饰的阳离子共聚物，然后与核酸溶液混合静置得到共聚物/核酸复合物溶液，最后与α-环糊精溶液混合静置得到可作用基因载体材料的超分子水凝胶。本发明的水凝胶的形成过程不存在化学交联反应，有效地避免了化学交联反应副产物对核酸活性的影响，具有高效的基因传递效果，转染效率比现有的凝胶材料有明显的提高，制备方法方便快捷，可以室温下成型，对浓度及温度要求较低，利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医用材料领域，具体涉及一种可用做基因载体的超分子水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗目的，是目前用于癌症以及先天性免疫***疾病治疗的一种有效方法。该技术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，进而使基因能够在细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。水凝胶作为一类可用作药物载体的生物医用材料，具有负载率高、可保护大分子药物免受生物体的降解或清除、以及对药物分子的可持续释放等特性，近年来已被研究用于基因的负载和控释。例如， Kasper等以聚乙二醇修饰的延胡索酸酯为原料、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过自由基聚合制备得到一类化学凝胶，该类凝胶通过溶胀作用负载基因，DNA的释放速率可通过聚乙二醇重均分子量的改变来调节（Journal of Controlled Release 2005 , 104: 521-539）。Shea等则通过光聚合反应，将DNA/PEI（聚乙烯基亚胺）复合物包埋于由双键修饰的聚乙二醇与透明质酸形成的水凝胶基质中，并通过改变原料配比调节凝胶强度和DNA的释放速率（Journal of Controlled Release 2007, 120: 233-241）。Hu等首先将DNA与PEI复合得到纳米复合物，然后再将该纳米复合物负载于葡聚糖基水凝胶基质中。由于凝胶基质的控释作用，该材料具有持续转染的效果，且在血清中仍保持了良好的基因传递能力（Journal of Materials Chemistry 2009, 19: 3189-3197）。然而，这些水凝胶基因载体的形成通常离不开高温、化学交联剂或光引发剂的使用，不利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。
中国发明专利（专利号为：ZL200910213939.5）公开了一种新型超分子水凝胶基因载体，以Pluronic F-68为引发剂合成得到线性聚乙二醇—聚赖氨酸嵌段聚合物，然后再与α-环糊精组装得到水凝胶载体材料。但是该凝胶材料的基因转染效率很低，其最高实施例不超过20%，实际应用价值不大；且材料的设计较繁琐，合成步骤较多。
综上所述，如何在温和条件下方便地构建高效水凝胶基因载体材料，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种超分子水凝胶的制备方法，其以α-环糊精为主体、通过主客体组装作用制备可用做基因载体的超分子水凝胶，制备条件温和、对温度和浓度要求较低、产品的转染效率高；另外，凝胶强度可通过聚合物浓度或者环糊精浓度来调节，操作方便，具有触变性，可作为一类新型的可注射凝胶应用于大分子药物的负载和释放。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种超分子水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
1）聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的合成；
2）将0.2～0.8 μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为8～20%的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为10～20%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。
优选地，步骤1）中核酸溶液的浓度为0.5μg/mL。
优选地，步骤1）中聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇类聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇类聚合物溶解于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；
b、聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物的合成
将聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸溶解于去离子水中，于40～50 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物为聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物。
优选地，步骤1）中聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇类聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇类聚合物溶解于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的合成
将聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于40～50 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物为聚乙烯亚胺枝聚乙二醇共聚物。
优选地，所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇的重均分子量为4000、6000、8000或10000，所述聚乙二醇单醚的重均分子量为1000、2000或5000。
优选地，步骤a中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1～2；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为3mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入3～5克；所述避光反应的时间为24～48小时；所述旋转蒸发操作时的温度为40～60℃。
优选地，步骤b中，所述聚赖氨酸的重均分子量为3万～7万；聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸的质量比为0.1～1：1；每100ml去离子水中含有10～15g聚赖氨酸；反应时间为48～72h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为5000～14000。
优选地，步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为10000或2500；聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.1～1：1；每100ml去离子水含有10～15g聚乙烯亚胺；反应时间为48～72h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为5000～14000。
优选地，步骤2）所述核酸的加入量按照与聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的N/P值为10～20加入，所述聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶液是将聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为15～30min；步骤3）所述的α-环糊精溶液是将α-环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为6～12h。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备的超分子水凝胶。
上述超分子水凝胶应用于制备可注射药物载体或可注射基因载体中。
本发明的原理是：
阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）具有较好的基因传递效果，聚乙二醇和环糊精皆具有良好的生物相容性，是少数被美国FDA批准可作为药品和食品添加剂的合成化合物之一；本发明首先利用聚乙二醇修饰阳离子聚合物，此共聚物通过聚赖氨酸或聚乙烯亚胺链段与核酸的静电相互作用，在溶剂中形成稳定的纳米复合物；然后再通过阳离子共聚物与α-环糊精的主客体组装相互作用进一步得到了原位包埋基因的超分子结构水凝胶；水凝胶形成的主要作用力为环糊精组装之后的结晶作用；聚乙二醇的引入不仅可降低阳离子聚合物的细胞毒性，还可与环糊精组装形成凝胶，具有双重作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、制备方法方便快捷，可以室温下成型，对浓度及温度要求较低，利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性；
2、水凝胶的形成过程不存在化学交联反应，有效地避免了化学交联反应及反应副产物对核酸活性的影响；
3、水凝胶的强度和凝胶化时间可通过聚合物浓度、环糊精浓度来调控；
4、聚合物在体系中起着基因载体和凝胶基质的双重作用，可简化凝胶配方，节省成本；
5、本发明的水凝胶为物理凝胶，其随着生物体中液体介质的不断冲刷溶蚀，会逐渐松散至完全溶解，对核酸的释放率高；
6、本发明的水凝胶具有高效的基因传递效果，转染效率比现有的凝胶材料有明显的提高；
7、本发明的水凝胶的成分简单、生物兼容性好、转染效果明显，具备良好的剪切变稀的特性，应用方便快捷，可作为生物医学工程材料，广泛应用于制备可注射药物载体或可注射基因载体中。
附图说明
图1为聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物的核磁氢谱图；
图2为聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的核磁氢谱图；
图3为超分子水凝胶F、G、H对大鼠成纤维细胞的转染效率数据图,对照组为PEI-25k（N/P = 10）；
图4为超分子水凝胶G转染大鼠成纤维细胞后的细胞的荧光照片图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例子对本发明一种超分子水凝胶及其制备方法和应用作进一步详细说明。
实施例1
1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在80℃条件下真空干燥24h。
2、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。
3、聚乙二醇－对甲苯酸酯的合成：
将15克干燥的聚乙二醇（重均分子量5000）溶解于100毫升二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，30摄氏度条件下避光反应48小时；反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用3克碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于60摄氏度条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯。
4、聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物的合成：
将上述得到的聚乙二醇－对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸溶解于去离子水中，聚乙二醇－对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸的质量比为1:1；该混合液于40 ℃条件下进行反应48小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为8000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物。
5、共聚物/核酸复合物溶液的制备：
将0.5微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为8%（w/w）的聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物溶液混合，N/P值为10；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。
6、超分子水凝胶的形成：
往上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为16%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置12小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶F。
实施例2
1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在80℃条件下真空干燥24h。
2、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。
3、聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的合成：
将15g干燥的聚乙二醇（重均分子量2000）溶解于100ml二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，25℃条件下避光反应36小时；反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用4克碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于50℃条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯。
4、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的合成：
将上述得到的聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量25000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为1:1；该混合液于40 ℃条件下进行反应72小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为14000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物。
5、共聚物/核酸复合物溶液的制备：
将0.5微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为10%（w/w）的聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物溶液混合，N/P值为10；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。
6、超分子水凝胶的形成：
向上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为12%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置8小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶G。
实施例3
1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在80℃条件下真空干燥24h。
2、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。
3、聚乙二醇－对甲苯酸酯的合成：
将15g干燥的聚乙二醇（重均分子量10000）溶解于100ml二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，25℃条件下避光反应48小时；反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用3g碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于60℃条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯。
4、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的合成：
将上述聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量25000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.5:1；该混合液于50 ℃条件下进行反应48小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为8000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物。
5、共聚物/核酸复合物溶液的制备：
将0.8微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为10%（w/w）的聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物溶液混合，N/P值为20；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。
6、超分子水凝胶的形成：
向上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为12%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置8小时，得到可作为基因材料的超分子水凝胶H。
实施例4
将实施例1制到的聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物溶于重水中，进行氢谱核磁表征，结果如图1所示，化学位移出现在4.22、2.92、1.63和1.36处的峰对应的是聚赖氨酸上的质子峰；3.62处的质子峰为聚乙二醇链段上的质子峰。图1的核磁结果证实聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物被成功合成。
实施例5
将实施例2制得的聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物溶于重水中，进行氢谱核磁表征，结果如图2所示，化学位移出现在3.65处的质子峰对应于聚乙二醇链段，2.5处的质子峰对应于聚乙烯亚胺。图2的核磁结果证实聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物被成功合成。
实施例6
将实施例1、2、3得到的超分子水凝胶F、G、H在磷酸盐缓冲溶液/PBS环境下进行体外释放实验，收集凝胶材料释放24小时时间段的释放产物，释放出的共聚物/pEGFP复合物定量后用于对大鼠成纤维细胞的转染实验，转染效率结果如图3所示。实施例2的超分子水凝胶G的释放液实施转染后的细胞的荧光照片如图4所示。阳性对照组PEI/pEGFP表现出较高的转染效率，达到约86%；而阴性对照裸DNA的转染效率近乎为0%。实施例1、2、3的超分子水凝胶F、G、H在第24小时释放出的共聚物/pEGFP复合物样品的转染效率分别为24%、46%和40%，表现出良好的转染效果，其转染效率明显好于同类型的水凝胶基因载体材料。
实施例7
1、聚乙二醇单甲醚的干燥：将聚乙二醇单甲醚在80℃条件下真空干燥24h。
2、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。
3、聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的合成：
将10g干燥的聚乙二醇单甲醚（重均分子量1000）溶解于100毫升二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，15℃条件下避光反应24小时；反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用5g碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于40℃条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯。
4、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的合成：
将上述聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量10000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.1:1；该混合液于50 ℃条件下进行反应72小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为5000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物。
5、共聚物/核酸复合物溶液的制备：
将0.2微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为20%（w/w）的聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物溶液混合，N/P值为10；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。
6、超分子水凝胶的形成：
向上述得到的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为20%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置6小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种超分子水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的合成；
2）将0.2～0.8 μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为8～20%的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为10～20%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料；
步骤1）聚乙二醇修饰的阳离子是通过线路一或者线路二合成的，线路一的具体步骤如下：
a、聚乙二醇类聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇类聚合物溶解于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；
b、聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物的合成
将聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸溶解于去离子水中，于40～50 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物为聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物；
线路二的具体步骤如下：
a、聚乙二醇类聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇类聚合物溶解于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物的合成
将聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于40～50 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到的聚乙二醇修饰的阳离子共聚物为聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇共聚物。
2.如权利要求1所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇的重均分子量为4000、6000、8000或10000，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为1000、2000或5000。
3.如权利要求1所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤a中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为2:1；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1～2；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为3mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入3～5克；所述避光反应的时间为24～48小时；所述旋转蒸发操作时的温度为40～60℃。
4.如权利要求1所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤b中，所述聚赖氨酸的重均分子量为3万～7万；聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚赖氨酸的质量比为0.1～1：1；每100ml去离子水中含有10～15g聚赖氨酸；反应时间为48～72h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为5000～14000。
5.如权利要求1所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为10000或2500；聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.1～1：1；每100ml去离子水含有10～15g聚乙烯亚胺；反应时间为48～72h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为5000～14000。
6.如权利要求1所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤2）所述核酸的加入量按照与聚乙二醇修饰的阳离子共聚物的N/P值为10～20加入，所述聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶液是将聚乙二醇修饰的阳离子共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为15～30min；步骤3）所述的α-环糊精溶液是将α-环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为6～12h。
7.一种权利要求1～6所述方法制备的超分子水凝胶。
8.权利要求7所述的超分子水凝胶在制备可注射药物载体或可注射基因载体中的应用。
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